Recherche fondamentale

Jusqu'à vingt prélèvements sanguins par animal, cinq injections intraveineuses d'un virus sur lapin vigile, puis une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie. 60 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur ne retient de ces gestes qu'un léger stress lié à la contention et une possible montée de température, et écrit n'avoir constaté aucune autre nuisance importante en plusieurs dizaines d'années. La mise à mort vise à obtenir "le maximum de sérum" et à prélever des organes, le nombre de lapins étant fixé par la quantité de sérum attendue par le client.

Objectifs

Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement. Le but du projet est la collecte d’échantillon (notamment de sérum) après de multiples injections d’un virus afin d’étudier la temporalité de l’apparition d’anticorps spécifique.

Bénéfices attendus

Depuis sa création, notre entreprise se spécialise dans le développement d’anticorps polyclonaux de lapin, principalement destinés aux acteurs du monde académique. Chaque projet d’immunisation vise à créer un nouvel outil de recherche sur mesure, répondant à des besoins spécifiques. Bien que le marché propose déjà une large gamme d’anticorps standards, notre expertise en conception d’immunogènes nous permet d’atteindre un taux de réussite exceptionnel - supérieur à 95 %, tout en garantissant des anticorps polyclonaux de haute qualité et en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nos anticorps ont déjà contribué à des avancées significatives, avec des publications dans des revues prestigieuses comme Nature ou Science. Ils ont notamment permis d’explorer des pathologies variées, telles que la surdité infantile ou différents types de cancers. À terme, ces recherches visent à éclairer les mécanismes biochimiques du vivant et à poser les bases de nouvelles thérapies pour les décennies à venir. Ce nouveau projet représente une avancée majeure : il nous permettra d’étudier en détail l’apparition et l’évolution des anticorps dans le sérum après l’injection de virus Oncolytique. À l’issue de ce processus, nous pourrons récupérer plusieurs lots de sérum, offrant ainsi une ressource précieuse pour analyser la réponse immunitaire.

Procédures

- Injection intraveineuse sur animaux vigiles, environ 1 min, maximum 5 injections. - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Exsanguination en intracardiaque sous anesthésie, sans réveil

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une augmention de la température des animaux peux apparaitre après l’injection des virus. Avec l’expérience de notre société depuis plusieurs dizaines d’années, nous n’avons pas constaté d’autres nuisances importantes. Nous resterons néanmoins vigilants à tout effet imprévu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin, ne sont pas encore matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, il est déterminé par la quantité de sérum attendue par le client. Une précédente étude a permis de conforter le choix de cinq animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des toutes souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Dès que le serpent prend la posture enroulée typique du sommeil, une stimulation le réveille, et la privation se poursuit ainsi jour après jour, à chaque température testée. 6 serpents vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un programme de recherche comparative. Ils passent une IRM et un scanner sous sédation, subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes sous anesthésie générale, puis sont transportés sédatés dans un sac opaque entre deux établissements, pour caractériser un sommeil encore inconnu chez cette lignée de reptiles. Le choix s'est porté sur de grands serpents calmes, non venimeux et faciles à obtenir en élevage, les espèces protégées ou dangereuses ayant été écartées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le sommeil des serpents, dernière grande lignée de reptiles encore non étudiée dans l’évolution du sommeil. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Pour ce faire, nous allons enregistrer en télémétrie l’activité cérébrale et les paramètres physiologiques associés (tonus musculaire, fréquence cardiaque, respiration, activité des yeux) chez des serpents, et en les comparant aux états d’éveil calme et actif. Afin de déterminer si les animaux dorment, nous évaluerons leur seuil de réveil et leur réponse à la privation de sommeil. L’effet de la température sera aussi évalué du fait que le comportement de ces animaux est extrêmement lié à la température ambiante.

Bénéfices attendus

Ce projet aidera à mieux définir les critères comportementaux et physiologiques du sommeil chez des espèces qui ne présentent pas les signes typiques observés chez les mammifères. Il complétera aussi notre compréhension parcellaire sur l’évolution des états de sommeil et notamment du sommeil paradoxal. Les résultats de ce projet pourraient aussi avoir un impact sur le bien-être animal en identifiant les conditions favorables à un sommeil réparateur chez les serpents, ces données pourront ainsi améliorer les pratiques d’élevage, de détention et de conservation des reptiles, notamment pour les espèces menacées ou maintenues en captivité (zoos, centres de sauvegarde).

Procédures

Les animaux subiront une sédation pour passer une IRM et un scanner dans l’EU2 (1 journée). Ensuite, ils subiront une anesthésie générale permettant une intervention chirurgicale dans l’EU1 EU1 afin de mettre en place des électrodes d’enregistrement, suivie d’un traitement antalgique postopératoire. Après une phase de récupération (1 semaine), les animaux seront à nouveau sédatés pour passer un nouveau scanner (EU2) et vérifier la position des électrodes. Ils seront ensuite enregistrés dans l’EU1 en télémétrie dans leur propre terrarium à différentes températures, 4 jours par température. Après 1 jour d’acclimatation, ils seront privés de sommeil par une stimulation douce (dès que l'animal prendra une posture enroulée sur lui-même, typique d'une posture de sommeil) et sa récupération sera monitorée. Enfin, après 4 jours, une évaluation du seuil de réveil (à l’aide d’un micro-vibreur induisant des vibrations légères) sera réalisée pour estimer les latences de réveil et la profondeur du sommeil (4 jours). Pendant la durée des enregistrements, les animaux seront stabulés dans un terrarium adapté à leur taille et ne seront pas dérangés outre le remplacement des batteries du dispositif d’enregistrement entre chaque protocole.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues concernent l’intervention chirurgicale d’implantation d’électrodes et la phase expérimentale de privation de sommeil. L’implantation d’électrodes, bien que réalisée sous anesthésie générale, constitue une procédure invasive. Elle peut provoquer une douleur transitoire post-opératoire, une réduction temporaire de la mobilité, une perte d’appétit ou une altération du comportement. Un inconfort local (lié à la cicatrisation ou à la présence des électrodes) est également possible dans les jours suivant l’intervention. Chez les reptiles, ces effets sont souvent discrets mais seront systématiquement recherchés. La phase d’enregistrement, bien qu’exempte de contrainte physique, impose le port d’un dispositif fixé sur le crâne. Celui-ci peut gêner légèrement les mouvements ou induire un stress comportemental transitoire, notamment au moment de sa mise en place. Toutefois, les serpents étudiés étant peu mobiles et dociles, ces effets sont attendus comme modérés. La privation de sommeil, réalisée par stimulation douce manuelle en période de repos, peut entraîner une augmentation du stress, une agitation ponctuelle ou une altération du comportement exploratoire. Chez les reptiles, les effets secondaires restent généralement limités mais incluent une possible fatigue, une baisse de vigilance ou une altération temporaire des rythmes biologiques. Aucune douleur n’est induite par cette procédure. Des manipulations régulières sont nécessaires pour les soins post-opératoires, le changement de batterie et les tests de réactivité. Elles peuvent provoquer un stress ponctuel ou une réponse de défense, bien que les individus soient habitués au contact humain. Enfin, un risque faible de complications chirurgicales (infection locale, mauvaise cicatrisation, rejet du matériel) existe, bien qu’il soit réduit par l’expérience de l’équipe et le protocole appliqué. Ces effets sont rares mais potentiellement délétères pour l’individu concerné.

Devenir

Il est prévu que les animaux soient réutilisés après l’expérimentation dans un programme de recherche comparative.

Remplacement

Le sommeil est un phénomène à la fois comportemental, neurophysiologique et physiologique, impliquant de nombreuses fonctions intégrées telles que l’activité cérébrale, les rythmes circadiens, les régulations hormonales, métaboliques, cardiovasculaires et thermiques. Ces fonctions interconnectées ne peuvent pas être reproduites ni simulées de manière fiable à l’aide de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. De plus, l’étude de l’évolution des états de sommeil nécessite une approche comparative entre espèces vivantes, dans leur intégrité biologique, afin de caractériser les similitudes et différences entre groupes phylogénétiques. Chez les reptiles, et en particulier les serpents, aucun modèle substitutif n’existe aujourd’hui pour étudier les états de sommeil de manière complète (comportement, physiologie, activité cérébrale). Ainsi, l’utilisation de l’animal est indispensable et constitue la seule méthode permettant de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Il n’existe donc actuellement aucune alternative éthique ou technique permettant de se passer de l’animal pour ce type d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte à la fois des exigences méthodologiques et des principes de réduction. L’objectif principal est de caractériser un phénomène biologique présent dans une espèce : le sommeil. Pour cela, il est nécessaire d’observer ce phénomène chez plusieurs individus afin de démontrer sa constance et de contrôler les variations interindividuelles. Nos travaux antérieurs et ceux d’autres équipes ayant étudié les lézards ont montré que 6 individus étaient suffisants et nécessaires pour identifier et caractériser finement un état de sommeil, son homéostasie et son seuil de réveil associé. Le design expérimental a été rigoureusement conçu pour limiter le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse des données. Une étude pilote sur un python tapis a permis de déterminer notre capacité à obtenir des signaux de qualité en ciblant des structures cérébrales précises. L’utilisation de techniques d’imagerie pré- et post-opératoire (IRM/Scanner) pour guider l’implantation, ainsi que la maîtrise technique des interventions, permet de garantir un taux de succès élevé, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L'ensemble des procédures suit une logique intra-individuelle : chaque animal sert de témoin à lui-même avant et après privation, avant et après nourrissage, avant et après changement de température, ce qui permet de réduire considérablement le nombre total requis tout en augmentant la puissance des comparaisons.

Raffinement

Les études sur le sommeil nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés vivants dans de bonnes conditions psychophysiologiques. Le bien-être des animaux est donc une condition sine qua non de chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. L'environnement sera notamment enrichi de branches et de substrats adaptés pendant les périodes d’acclimatation et de récupération. Durant les enregistrements, l’animal est libre de ses mouvements dans son propre terrarium. Les animaux seront transportés entre les établissements, sédatés, dans un sac opaque, adapté au transport de serpent afin de réduire leur stress. Les mesures de raffinement lors du transport incluent le maintien d’une température stable et adaptée à l’espèce, la réduction des vibrations et du bruit, ainsi qu’une manipulation minimale pour limiter le stress et tout risque de réveil ou de blessure. Par ailleurs, une grille de suivi du bien-être animal, et des points limités adaptés et précoces, spécifiques à l’espèce ont été mis en place en consultant des spécialistes (vétérinaires, éleveurs, herpétologues). Les décisions relatives aux points limites sont prises en concertation avec le vétérinaire référent et des spécialistes des serpents, si un comportement inhabituel est identifié.

Choix des espèces

L’objectif est d’étudier le sommeil des serpents, dernière grande lignée de squamates encore peu étudiée dans l’évolution du sommeil. Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Toute espèce appartenant au sous-ordre des serpents pourrait donc être choisie. Cependant, beaucoup d’espèces de serpents ne sont pas adaptées à cette expérimentation, pour des raisons de statut de protection, de taille, de disponibilité en élevage et de dangerosité. Nous nous tournons ainsi vers des espèces de serpent de grande taille, calmes, non venimeuses et disponibles facilement en élevage. Les individus doivent avoir une tête de taille adaptée à l’implantation stable d’électrodes pour l’étude du sommeil. Leurs morphologies et leurs comportements moteurs doivent aussi faciliter les interventions, avec un risque minimal de blessure ou de stress durable. Phylogénétiquement, M. spilota, et B. constrictor sont tous les deux des représentants du groupe des serpents qui pourraient convenir. Les individus choisis, seront adultes (>5 ans) nés en captivité, et habitués aux manipulations . M. spilota, et B. constrictor par exemple, offrent un compromis optimal entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal. Par ailleurs, les deux espèces présentent le même mode de vie semi-arboricole et le même régime alimentaire, et ce sont deux espèces assez courantes en élevage. Elles constituent donc des modèles cible.

Trente-cinq minutes enfermés dans un tube de contention pour mesurer leur réaction au stress : 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Ils reçoivent une injection intracérébrale sous une anesthésie d'environ cinquante minutes, cinq injections d'un marqueur des nouveaux neurones, et passent un test de mémoire de dix minutes, à 3, 8, 12 et 18 mois. Le résumé cite le labyrinthe comme exemple de mesure de la mémoire spatiale, sans préciser quel test est employé ici. Le porteur retient le rat pour la continuité de vingt ans de travaux du laboratoire sur cette espèce et la possibilité de comparer les données déjà collectées.

Objectifs

Avec l’âge, notre mémoire peut se dégrader, ce qui peut nuire à notre santé, notre bien-être et notre qualité de vie. Ce déclin est souvent lent et naturel, mais il ne touche pas tout le monde de la même manière : certaines personnes gardent une bonne mémoire, d’autres non. Ce phénomène dépend notamment de l’hippocampe, une partie du cerveau importante pour créer et consolider les souvenirs. Dans certains cas, le cerveau arrive à compenser cette baisse grâce à des mécanismes internes, comme la neurogénèse, c’est-à-dire la création de nouveaux neurones. Cette production de neurones se fait surtout dans l’hippocampe, et elle semble favoriser une bonne mémoire, en particulier pour se repérer dans l’espace (comme dans les tests de labyrinthe chez les rats). Ce processus peut être influencé par le stress, qui agit sur un système du corps appelé l’axe corticotrope. Mais d’autres éléments, moins connus, peuvent aussi jouer un rôle dans le déclin de la mémoire. Par exemple, une barrière protectrice du cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique (BHE), peut devenir plus perméable avec l’âge ou en cas de maladies neurodégénératives. Quand cette barrière laisse passer trop de substances du sang vers le cerveau, cela peut dérégler son fonctionnement normal, et donc affecter la mémoire. Le but du projet est donc de mieux comprendre ces phénomènes en étudiant l’état de cette barrière chez des individus âgés, et voir comment les nouveaux neurones et d’autres cellules s’intègrent dans le réseau sanguin du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet est le premier à s’intéresser à la façon dont les vaisseaux sanguins du cerveau interagissent avec les nouveaux neurones produits à l’âge adulte, pour aider à préserver nos capacités mentales en vieillissant. C’est une approche innovante, car jusqu’à présent, on pensait surtout que le déclin de la mémoire avec l’âge venait uniquement des neurones eux-mêmes. En étudiant aussi la circulation sanguine dans le cerveau, ce projet pourrait mieux expliquer les mécanismes du vieillissement cérébral.

Procédures

Dans le cadre de l’étude, 4 types d’interventions seront réalisés sur les animaux. À différents âges (3, 8, 12 et 18 mois), ils seront brièvement placés dans un tube de contention afin d’évaluer leur réaction au stress. Cette situation provoque un stress modéré, pendant lequel des prélèvements sanguins seront effectués ; la durée totale de cette procédure est de 35 minutes par animal. Des injections cérébrales seront également réalisées sous anesthésie, pour une durée d’environ 50 minutes par animal. Par ailleurs, un marqueur permettant d’identifier les nouveaux neurones sera injecté à plusieurs reprises (cinq fois au total, chaque injection dure environ 4 minutes. Enfin, un test comportemental de 10 minutes sera mené afin d’évaluer leurs capacités de apprentissage et de mémoire.

Impact sur les animaux

Comme pour tout projet impliquant des injections et des opérations sur le cerveau, certains effets secondaires peuvent apparaître, même si nous faisons très attention et suivons des procédures adaptées. Par exemple, il arrive, même si c’est rare, que les zones où l’on fait les injections (sous la peau) ou les plaies liées à l’opération chirurgicale s’irritent. Cette opération est susceptible de provoquer des douleurs après l’opération qui seront traitées grâce à des anti-douleurs. Par conséquent, dans les deux jours qui suivent l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids (jusqu’à 5 % de leur poids de départ).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre l'étude poussée du cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, nous voulons comprendre comment le vieillissement agit sur le cerveau, en particulier sur la façon dont les cellules nerveuses et les vaisseaux sanguins communiquent entre eux. Pour cela, nous étudions directement des animaux vivants, car cela nous permet aussi d’évaluer leur mémoire. C’est une approche globale qui demande que l’animal puisse se comporter normalement. Nous ne pouvons pas faire ce type d’étude en laboratoire sur des cellules isolées ou par ordinateur. Enfin, pour bien comprendre les effets du vieillissement sur le système sanguin dans son ensemble, il est indispensable d’étudier un organisme entier. C’est pourquoi nous ne pouvons pas utiliser de méthodes de substitution.

Réduction

Ce projet vise à étudier le vieillissement à 3 étapes de la vie : jeune adulte (8 mois), milieu de vie (12 mois) et fin de vie (18 mois). Pour cela, trois lots d’animaux seront constitués, correspondant à ces âges. Dans chaque lot, les animaux seront répartis en trois groupes selon leurs performances à un test comportemental à 3 mois (groupe contrôle, groupe résilient et groupe vulnérable). Le nombre de rats a été estimé sur la base d’une approche statistique permettant de déterminer la taille des groupes, et en tenant compte de nos données précédentes ainsi que des pertes possibles liées à l’âge (problèmes de santé, décès naturel). Pour garantir des résultats fiables, 50 rats seront utilisés par lot (6 rats contrôles, 22 rats résilients, 22 rats vulnérables), soit un total de 150 animaux. Ce nombre pourra être réduit si les différences entre les groupes sont plus marquées que prévu et sans nuire à la qualité scientifique de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont laissés une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, avec des conditions favorisant leur bien-être (enrichissement, contact humain régulier). Une intervention chirurgicale est ensuite réalisée sous anesthésie pour injecter un virus traceur dans une zone spécifique du cerveau. Un traitement anti-douleur est administré durant cette intervention pour limiter l’inconfort lié à cette intervention. Les animaux reçoivent des soins adaptés avant, pendant et après l’opération, ainsi qu’une surveillance quotidienne. Durant le vieillissement des animaux, un suivi régulier est mis en place pour détecter d’éventuelles complications, avec un protocole pour exclure l’animal de l’étude si nécessaire. À différents âges, les animaux participent à des tests de comportement liés à la mémoire et au stress. Pendant ces tests, ils sont logés seuls mais restent en contact sensoriel avec leurs congénères. Un entraînement progressif permet de les habituer à la tâche. Leur comportement est observé en continu pour prévenir toute détresse, avec des mesures immédiates en cas de signes de mal-être.

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle choisi est le rat. Le système nerveux des mammifères est trop complexe pour être reproduit en laboratoire, que ce soit en utilisant des cellules en culture ou des animaux plus simples comme les insectes. Le rat est un modèle de référence en neurosciences, souvent utilisé pour des études comportementales comme celles réalisées dans notre laboratoire. De plus, la formation de nouveaux neurones dans l'hippocampe est un phénomène commun à plusieurs mammifères, y compris le rat, le singe et l'humain. Cette étude s'inscrit dans la continuité de nos recherches menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, et nous permet de comparer des données déjà collectées pour mieux contrôler les résultats. Les rats seront reçus à l'âge de 10 semaines pour être opérés à 12 semaines. Ensuite, les expériences auront lieu entre 5 et 15 mois après les injections dans leur cerveau. Nous étudierons des rats adultes à différents stades de vieillissement : 1) jeune adulte (8 mois) ; 2) milieu de vie (12 mois) ; 3) fin de vie (18 mois). Ces âges ont été choisis pour pouvoir suivre, sur le long terme, l'impact de l’intégrité de la barrière hématoencéphalique sur les nouveaux neurones formés à l'âge adulte sur l'apparition de problèmes de mémoire.

Déjà présents dans les installations du laboratoire, 20 poissons Astyanax mexicanus adultes, dix mâles et dix femelles, vont être génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, un morceau de nageoire caudale leur est prélevé et un marquage à l'élastomère leur est posé, avec un isolement de moins de 24 heures. Aucun n'est tué : les vingt sont élevés et reproduits pour constituer des lignées avec et sans le chromosome surnuméraire qui semble déterminer le sexe. Le porteur affirme que ce chromosome est trop propre à l'espèce pour être étudié chez le poisson zèbre et que la culture cellulaire ne rendrait pas compte des stades de développement.

Objectifs

La détermination du sexe reste une question centrale en biologie, et les poissons sont des modèles particulièrement intéressant dans ce contexte, en raison de la grande diversité de leurs mécanismes de détermination du sexe, souvent liés à des changements de leurs chromosomes sexuels. Les chromosomes B, sont des chromosomes surnuméraires et accessoires qui peuvent être impliqués dans divers processus biologiques dont la détermination du sexe. Chez la population d’Astyanax mexicanus de de surface, il existe un chromosome B qui contient un gène majeur déterminant du sexe. Cependant on a observé des mâles avec et sans chromosome B ains que de rares femelles avec un chromosome B. L'objectif de cette partie du projet est d'effectuer un génotypage des animaux présents dans nos installations afin de réaliser des lignées spécifiques pour comprendre le rôle de ce chromosome dans le déterminisme sexuel de cette espèce.

Bénéfices attendus

La création de ces lignées permet d'avoir des poissons modèles pour étudier le rôle te les mécanismes de transmission des chromosomes B.

Procédures

Nous prélèverons un morceau de nageoire caudale et marquerons à l'élastomère sous anesthésie sur 20 poissons géniteurs.

Impact sur les animaux

Les procédures de biospsie, de marquage et d’isolement (

Devenir

Les 20 animaux génotypés seront élevés et reproduits pour générer les lignées souhaitées.

Remplacement

La présence du chromosome B est très espèce spécifique et ne peut être étudié sur des poissons modèles type zebra fish. De plus le système de déterminisme du sexe chez les poissons par un chromosome B met en jeu des mécanismes complexes et encore inconnus. L’étude de ces systèmes en modèle in vitro par culture cellulaire ne prendrait pas en compte l’interaction des différents types cellulaires ni les différents stades de développement lors de la maturation et n’est pas pertinent dans le cadre de notre étude.

Réduction

Sur 20 animaux qui seront génotypés nous avons 10 mâles et 10 femelles ce qui constitue le minimum pour réaliser une fécondation et pour avoir les génotypes attendus.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes artificielles seront aussi installés dans les aquariums. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la biopsie de la nageoire, le marquage ou la mise en balnéation seront réalisées par du personnel compétant, sous anesthésie et le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement par des zootechniciens en suivant la grille Bien Être Animal qui permet de déterminer les points limites qui mèneraient à l’arrêt de l’expérimentation.

Choix des espèces

Les espèces et populations de poissons du groupe Astyanax seront utilisées comme espèces modèles dans cette étude du fait que les mâles possèdent un chromosome B qui, d’après des études préliminaires, semblent liées au sexe. De plus les Astyanax possèdent des qualités de poisson modèle (génome entièrement séquencé, petite taille, temps de génération réduit (maturation à 6 mois), reproduction toutes les 2 semaines, fécondation in vitro possible). Les 20 poissons de cette procédure seront utilisés à l'âge adulte et à maturité sexuelle pour réaliser des reproductions.

Tous tués en fin d'expérience pour prélever leur cerveau, destiné à des analyses moléculaires ou à l'enseignement universitaire de neuroanatomie, 673 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est implanté à demeure dans leur veine jugulaire, une partie subit en plus une chirurgie intracérébrale, puis ils consomment de la cocaïne quelques heures par jour, cinq jours par semaine pendant cinq semaines. Après quatre semaines de sevrage, ils sont replacés face aux signaux lumineux et sonores associés à la drogue pour mesurer leur comportement de recherche. Le porteur reconnaît que la douleur postopératoire résiste aux anti-inflammatoires et qu'un traitement aux opiacés est exclu dans une étude sur l'addiction, quand les cibles thérapeutiques annoncées sont renvoyées au moyen terme.

Objectifs

Le présent projet s'intéresse notamment à l'implication, dans le comportement de consommation et/ou de recherche de cocaïne, d'une voie de communication dans le cerveau qui participe de façon prépondérante au contrôle des processus liés aux émotions et à la motivation. Plus précisément, ce projet veut d'une part tester si des changements de l'activité de cette voie impactent la consommation volontaire de cocaïne puis sa recherche après sevrage, et d'autre part examiner si le comportement de consommation et/ou recherche de cocaïne peut lui-même modifier cette voie. A l'heure actuelle, la littérature est très pauvre concernant cette voie pourtant intéressante dans le domaine de l’addiction, et devient inexistante si on s'intéresse à des protocoles expérimentaux conduisant les animaux à développer un comportement de consommation de cocaïne mal contrôlé qui, ensuite après sevrage, génère un comportement de recherche de drogue exacerbé. L'hypothèse formulée ici est que la voie qui nous intéresse est fondamentale dans l'expression de ces comportements de consommation et de recherche de cocaïne exacerbés qui modélisent les difficultés rencontrées par les toxicomanes à contrôler leur consommation. Si elle est confirmée, elle participera à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux mis en jeu dans l'addiction. Le modèle utilisé ici est basé sur un test comportemental qui permet au rat de consommer lui-même volontairement la drogue. Cette approche présente l'avantage d'exposer l'animal à la drogue de façon très rapide (le passage au cerveau e fait en quelques secondes) et de façon dépendante du comportement volontaire de l'animal, qui a la liberté de ne pas consommer, ce qui lui confère une haute valeur de modélisation de la pathologie. Par ailleurs, nos modèles, qui soumettent les animaux à des protocoles d'accès particuliers à la drogue, peuvent les conduire à consommer des quantités importantes de drogue ou à la consommer de façon très intense, comme cela est observé chez les cocaïnomanes, et permettront ainsi de mettre en évidence des modifications tissulaires, notamment au sein de la voie cérébrale qui nous intéresse, susceptibles de se produire dans la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Les connaissances actuelles sur l’addiction sont considérables, mais force est de constater que les traitements actuels manquent d'efficacité, notamment en raison de l’utilisation de modèles animaux imparfaits. L'étude que nous proposons devrait permettre, de par la comparaison des modifications cérébrales induites chez des rats consommant la cocaïne de façon moins contrôlée que dans des conditions standard, de mettre en lumière, à moyen terme, des cibles de nouvelles approches thérapeutiques. Par ailleurs, la mise en évidence de l'implication potentielle d'une voie cérébrale nouvelle dans ces modèles de consommation et recherche exacerbées de cocaïne participera à susciter l'intérêt d'étudier une structure cérébrale jusqu'ici peu examinée et dont les caractéristiques neuronales ou moléculaires offriront peut-être, à long terme, de nouvelles approches pharmacologiques.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une intervention chirurgicale (45 min max) qui permet d'implanter, de façon définitive, un système de cathéter accessible de l'extérieur de l'animal et qui se termine dans la veine jugulaire. Certains animaux recevront également, par chirurgie intracérébrale (1h30 max) des administrations de séquences de gènes permettant ultérieurement l'expression locale d'un récepteur artificiel. Tous les animaux de ce projet sont soumis à un test comportemental, quelques heures / jour, 5 jours / semaines pendant 5 semaines, où ils pourront consommer la cocaïne de façon totalement volontaire par le biais du cathéter préalablement implanté. Cette phase de consommation doit être suivie d'une phase de sevrage de 4 semaines. L'expérience se termine par une évaluation du comportement de recherche de cocaïne (30 min) provoquée par l'exposition de l'animal à des signaux (lumineux et sonores) qu'il a pu associer aux effets de la drogues durant la phase de consommation. Cette séance est immédiatement suivie, chez une partie des animaux, par une évaluation du comportement de recherche de drogue par l'exposition de l'animal à la drogue elle-même (30 min).

Impact sur les animaux

1/ Chirurgies - La technique permettant la consommation volontaire de cocaïne nécessite une chirurgie vasculaire chez tous les animaux pour implanter à demeure un cathéter intraveineux. Une partie des animaux subit en outre une chirurgie intracérébrale pour, ultérieurement, pouvoir moduler l’activité de la voie cérébrale d’intérêt. Donc, une douleur post-opératoire (résistante aux anti-inflammatoires) pourrait être ressentie transitoirement, d'autant qu'un traitement aux analgésiques forts (opiacés) ne peut être envisagé dans le cadre d'une étude sur l'addiction. 2/ Isolement - Après implantation du cathéter, un isolement de maximum 24h est nécessaire pour protéger les cicatrices et optimiser la récupération de l'animal. 3/ Vulnérabilité infectieuse - Au-delà des actes invasifs nécessaires à la chirurgie vasculaire, les animaux sont ensuite connectés et déconnectés de façon quotidienne de l'appareillage permettant la consommation de solution de cocaïne. Ainsi, le milieu intérieur de l'animal est exposé à l'environnement extérieur de façon répétée. Malgré toutes les précautions qui pourront être prises en termes d'asepsie, il existe un risque d'infection par des agents pathogènes (surtout bactériens), essentiellement en raison de l'interdiction de traitement antibiotique préventif. 4/ Sevrage à la cocaïne - Suite à la phase de consommation de cocaïne, les animaux sont soumis à une phase de sevrage. Même s'il n'existe aucun syndrome reconnu de sevrage physique à la cocaïne, des symptômes psychologiques, comme un niveau accru de réaction aux stimuli anxiogènes, peuvent être mis en évidence. Même si nous nous appliquons à ne pas soumettre les animaux à des situations anxiogéniques, cette éventuelle nuisance n'est pas traitée car le sevrage et ses conséquences font partie intégrante des processus addictifs et leur traitement pharmacologique pourrait induire des biais d'interprétation des résultats. 5/ Modulation de la voie cérébrale d'intérêt - La voie de communication cérébrale qui nous intéresse est connue pour être inhibée par des stimuli récompensants et plutôt activée dans des situations aversives. Même s'il n'est pas démontré que l'activation de la voie est un médiateur du ressenti aversif, l'activation pharmacogénétique que nous envisageons est susceptible de générer transitoirement un état dysphorique.

Devenir

Tous les animaux de ce projet sont mis à mort à la fin des expériences car les cerveaux doivent ensuite être prélevés pour analyses moléculaires ou tissulaires ou bien pour utilisation dans le cadre d’enseignement universitaire de neuroanatomie (principe de réduction).

Remplacement

A l'heure actuelle, les études in vitro et in silico dans le domaine de l'addiction existent mais elles présentent les limites inhérentes à leur nature, c'est-à-dire l'impossibilité, pour les premières, d'envisager l'aspect intégré de la pathologie et, pour les secondes, une sur-simplification des systèmes biologiques associée à un manque de prise en compte de la variabilité interindividuelle due aux multiples facteurs mis en cause dans la pathologie. L'addiction étant un trouble psychiatrique qui nécessite le fonctionnement du cerveau en situation intégrée dans un organisme vivant et vigile doté de ses particularités propres, elle requiert aujourd'hui encore l'utilisation d'animaux dans sa modélisation préclinique. Notre projet visant à étudier l'implication, dans l'addiction à la cocaïne, d’une voie cérébrale mise en jeu dans les émotions et la motivation, processus hautement variables et sous l'influence de l'organisme entier, il nécessite donc l'emploi d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est calculé au plus juste pour pouvoir déterminer d’éventuelles différences statistiquement significatives avec un minimum d’animaux. Pour cela, des calculs mathématiques dédiés à l’estimation prospective d’effectifs nécessaires aux études scientifiques sont employés.. Dans la mesure du possible, chaque animal est son propre contrôle. Par ailleurs, chaque procédure expérimentale est réalisée sur plusieurs cohortes succesives d'animaux, de sorte que les cohortes initiales peuvent donner des indications pertinentes sur la suite des expériences à mener (réitérer ou arrêter), notamment en utilisant les tests statistiques les plus adaptés aux données recueillies pour déterminer les analyses avec le plus de puissance possible. L’utilisation de groupes témoins est réduite au strict minimum.

Raffinement

Les animaux sont soumis aux tests comportementaux durant leur période d’activité naturelle pour limiter au maximum la perturbation de leur sommeil. La manipulation des animaux commence une semaine après leur arrivée et est ensuite obligatoirement quotidienne. Seules les personnes assurant les expérimentations (maximum 2 personnes) manipulent les animaux. Les actes chirurgicaux sont réalisés dans une pièce dédiée, avec constitution de champs stériles et utilisation de matériel à usage unique ou stérilisable, et tant que possible en travail d’équipe permettant au chirurgien de ne pas s’extraire du champ stérile. La qualité de l’anesthésie est vérifiée fréquemment. La température interne des animaux est contrôlée. Dans la mesure du possible, les chirurgies seront regroupées en une seule intervention. Les cicatrices sont enduites d’une pommade cicatrisante qui, en outre, empêche le contact direct des agents pathogènes et irritants avec l’épiderme. Un isolement post-opératoire de quelques heures est appliqué afin de protéger les cicatrices de l’animal et de quantifier les comportements alimentaire et de boisson d’eau. L’analgésie pendant et après la chirurgie est couverte. Les animaux sont examinés quotidiennement avec, tant qu’elles sont apparentes, une attention particulière portée aux cicatrices, systématiquement désinfectées. Les conditions d’asepsie durant les tests et lors de la manipulation des animaux sont validées par la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le vétérinaire référent et scrupuleusement suivies pour éviter les infections. Les tests comportementaux sont réalisés dans une pièce dédiée à laquelle les animaux sont habitués. La première exposition de l’animal à la chambre de test est une séance d’habituation pour éviter un stress de l’animal combiné aux effets de la drogue. La passation des animaux dans les tests est organisée de sorte qu’aucun animal n'est isolé, en attente dans sa cage. La mise à mort est le plus souvent immédiate et sans aucune souffrance grâce à l'administration intraveineuse de l’agent euthanasiant par le biais du cathéter préalablement implanté. De façon générale, le bien-être des animaux est fréquemment vérifié à l’aide d’une grille d’évaluation individualisée indiquant les points limites de différents paramètres adaptés aux procédures (comportement, poids, pelage, cicatrices…). En cas d’altération, cela fait obligatoirement l’objet d’interventions adaptées.

Choix des espèces

Le Rat représente un choix intéressant pour la modélisation préclinique de l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs appartiennent à l’ordre des mammifères, parmi ceux disponibles en laboratoire, le plus proche de celui des Primates. Le Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données neuroanatomiques et comportementales solides sur les processus addictifs qui ont permis de mieux les comprendre chez l’Homme. Doté de capacités cognitives élaborées, le Rat développe facilement des comportements complexes permettant d’étudier des aspects précis de l'addiction. Enfin, sur un plan pratique, la durée de vie des cathéters intraveineux implantés à demeure est moins importante chez la Souris que chez le Rat et peut sérieusement compromettre la tenue des expériences sur le long terme (plusieurs semaines). Les rats arrivent au laboratoire âgés de 3 semaines. Débutant le comportement au moins 3 semaines plus tard, ils sont alors dans l'adolescence et entrent dans l'âge adulte. Cette période de vie chez le rat correspond à une période de vulnérabilité accrue de l'être humain (phase adolescence/post-adolescence) vis-à-vis de la dépendance aux drogues.