Recherche fondamentale

Hébergés seuls quarante-six heures en cage à métabolisme et nourris pendant vingt et un ou cent jours d'un régime dont seule la forme du fer change, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements du côlon. 240 d'entre eux reçoivent en plus une injection intrapéritonéale d'azoxyméthane, un cancérogène, pour déclencher les premiers stades d'un cancer colorectal. L'objet réel est d'évaluer si un substitut végétal de viande riche en fer, dont la mise sur le marché européen est envisagée à court terme, produit les mêmes effets sur le côlon que la charcuterie. Le porteur écrit que les régimes n'ont pas d'effet attendu sur le bien-être des rats et que la formation des phases précoces du cancer du côlon n'induit aucune douleur, tout en déclarant les 400 animaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La consommation excessive de viande rouge et de charcuteries est associée chez l’Homme à une perturbation du fonctionnement de l’intestin, et à un risque augmenté de développer un cancer du côlon. Des études scientifiques ont permis de démontrer que ces impacts sont liés au fer présent dans les viandes. Ainsi, ce fer va pendant la digestion arriver au niveau du côlon et favoriser la formation de molécules toxiques. Les recommandations nutritionnelles actuelles sont donc de limiter la consommation de produits carnés riches en fer. Dans ce contexte, plusieurs produits alternatifs à la viande sont proposés aux consommateurs. Plus précisément, certaines de ces alternatives misent sur la ressemblance parfaite avec les produits carnés en utilisant une forme de fer végétale proche de celle apportée par les viandes afin de provoquer une couleur et un goût similaires aux viandes. La mise sur le marché d’une alternative à base de ce fer d’origine végétale est envisagée à court terme en Europe. Au regard de sa proximité avec le fer des viandes, se pose donc la question de savoir si ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est susceptible d’engendrer des effets néfastes sur le côlon et le cancer du côlon. En termes de santé publique, l’objectif de cette étude est d’évaluer si un apport en fer d’origine végétale risque ou non d’induire les mêmes effets délétères sur le côlon qu’un apport en fer d’origine animale. Étant donné que chez l’Homme, aucune étude interventionnelle n’est envisageable, une évaluation pré-clinique chez le rat identique à ce qui a été mis en place par le passé pour alerter les politiques publiques sur la consommation des viandes rouges et le risque de carcinogénèse colorectale est proposée.

Bénéfices attendus

À l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si le fer d’origine végétale peut engendrer ou non la formation dans le côlon de produits toxiques en comparaison avec d’autres formes de fer d’origine animale. Ainsi, ces études permettront de (i) évaluer le risque de pathologies associées à la consommation humaine de ces substituts, et en conséquence, selon les résultats obtenus (ii) alerter les pouvoirs publics, pour qu’ils puissent à terme proposer des messages de recommandation nutritionnelle adaptés spécifiquement à ces substituts riches en fer végétal.

Procédures

400 rats recevront un régime expérimental dont seule la nature du fer sera modifiée selon le groupe expérimental pendant 21 jours pour 160 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 240 autres. Ces 400 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 240 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane d'une durée de moins d'une minute, le temps de la préhension et l'injection, pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.

Impact sur les animaux

Les régimes n’ont pas d’effet attendu sur le bien-être ou la croissance des rats. L’hébergement en cage individuelle d’une journée peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les rats seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures destinées à caractériser l’effet des régimes administrés sur la muqueuse colique, et engendrant éventuellement des perturbations de l’homéostasie des tissus environnants ou d’organes plus distants.

Remplacement

Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation de fer des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. La reproductibilité sera assurée par une répétition indépendante des études. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.

Raffinement

Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urines et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études chez l’Homme mais aussi des approches qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à celui chez l’Homme. De plus, ce modèle chez le rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeur, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les études se feront sur des rats adultes de 5 à 6 semaines à leur arrivée. À cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maîtrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas par chirurgie de trente minutes, un gavage quotidien pendant trente jours, jusqu'à deux injections par semaine durant cinq semaines et deux échographies hebdomadaires sous anesthésie pendant quatre semaines. La chimiothérapie peut provoquer une nécrose de la queue, une perte de poids et des douleurs. Les probiotiques ou antibiotiques censés améliorer le pronostic des patients restent une espérance, alors que le porteur affirme que les organoïdes et les tumeurs sur puce ne permettent pas d'étudier les interactions avec le système immunitaire et qu'il faut donc "travailler avec des animaux vivants".

Objectifs

Nous travaillons sur le cancer du pancréas qui a un pronostic très sombre car il ne répond pas bien aux traitements (chimiothérapie, immunothérapie). Le but de ce projet est de comprendre comment certaines bactéries naturellement présentes dans notre organisme (microbiote) favorisent la résistance de ce cancer aux traitements. Il a été démontré que certaines bactéries du microbiote, naturellement présentes dans l’intestin ou la cavité orale pouvaient se retrouver dans les tumeurs au sein même du pancréas. Certaines de ces bactéries lorsqu’elles étaient présentes dans les tumeurs étaient même corrélées à un mauvais pronostic. Le but de notre projet est de comprendre comment les bactéries migrent du système digestif jusqu’à la tumeur et comment elles interagissent avec la tumeur. Nous cherchons à comprendre comment ces bactéries interagissent avec les cellules tumorales mais aussi les cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels du cancer du pancréas sont décevants car bien souvent la tumeur est résistante aux traitements. Et lorsqu’elle est initialement sensible aux traitements, elle développe petit à petit des résistances. La résistance aux traitements est une des clefs pour traiter cette maladie. Une partie de la résistance aux traitements vient des bactéries naturellement présente dans notre organisme. : le microbiote. En comprenant comment ces bactéries migrent dans la tumeur et comme elles interagissent avec les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire, il sera possible d’agir à la fois sur leur mécanisme d’action voir directement sur les bactéries à l’aide de probiotiques et d’antibiotiques. Nous espérons à terme améliorer l’efficacité des traitements et donc le pronostic des patients.

Procédures

Pour la chirurgie (greffe des cellules tumorales) : Celle-ci n’a lieu qu’une fois par animal, d’une durée de 30 minutes. Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Pour les injections de traitements Dans cette étude, un traitement est donné par la bouche (gavage) aux souris pendant 30 jours (moins de 30 secondes). Les animaux pourront recevoir jusqu’à deux injections par semaine pendant cinq semaines maximum (3 à 5 minutes). Pour les échographies : Elles sont pratiquées pendant 4 semaines, à raison de 2 fois par semaine sur un animal sous anesthésie générale. Chaque échographie dure environ 10 min (de l’endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Les traitements de chimiothérapie peuvent induire une nécrose de la queue de la souris. Le développement de tumeur ainsi que le traitement par chimiothérapies peuvent s’accompagner d’une perte de poids, et de douleur. L’administration des traitements peut rajouter du stress à l’animal ansi qu’une douleur modérée ou un inconfort lors de leur réalisation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de procéder à l’analyse des tissus. En effet, nos recherches nécessitent l’analyse des organes des animaux. Les expériences sont conçues pour permettre la récupération de la tumeur ainsi que des organes de métastases. Les tumeurs seront collectées soit pour des analyses histologique, soit pour l’analyse des cellules immunitaires présentes dans la tumeur.

Remplacement

L'identification des phénomènes de résistances aux thérapies ne peut être réalisée que directement chez l’animal car il met en jeu des interactions entre de nombreuses populations cellulaires (interactions cancer / microenvironnement (réaction fibreuse) / réaction de l’hôte) qui ne peuvent pas encore être mimées in vitro, notamment le rôle complexe du système immunitaire. Les modèles précliniques classiques, comme les organoïdes ou les tumeurs sur puce, ne permettent pas d'étudier efficacement les interactions complexes entre les organes et le système immunitaire. Cependant, dès que possible, nous remplacerons les études faites sur les modèles murins par des expérimentations réalisées sur des cultures de cellules isolées de nos modèles murins, qui peuvent être maintenues plusieurs semaines en culture et permettront de tester nos hypothèses. Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le cancer du pancréas. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie et dans l'immuno- et chimiorésistance.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, reproductibles et statistiquement interprétables est de 6 souris par groupe, avec deux répétitions indépendantes de chaque expérience afin de valider la robustesse des résultats. Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant la qualité des données : 1-maximisation des analyses par animal en réalisant plusieurs types d’analyses sur un même animal afin d’optimiser chaque inclusion expérimentale, incluant des analyses histologiques sur plusieurs tissus atteints (pancréas, foie, poumon, péritoine), des analyses immunologiques multiparamétriques par cytométrie en flux pour caractériser la nature, le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires post-mortem, ainsi que des analyses sanguines ; 2-optimisation du design expérimental, avec un protocole conçu pour limiter la variabilité inter-individuelle, permettant ainsi d’avoir un nombre réduit d’animaux par groupe tout en conservant une puissance statistique suffisante ; 3-réutilisation de données biologiques, les mêmes échantillons biologiques (sang, tissus) pouvant dans certains cas être utilisés pour plusieurs types d’analyses complémentaires. Le nombre total d’animaux a donc été défini en tenant compte d’un équilibre rigoureux entre nécessité scientifique, réduction des effectifs animaux et qualité des données attendues d’un point de vue scientifique.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d’acclimatation lors de leur arrivée à l’animalerie. Ils sont pris en charge par le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement afin de détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Un enrichissement adapté est disposé dans les cages des souris avec alternativement des dômes en plastique, morceaux de bois, sopalin. Les souris sont regroupées par lot de 5 animaux maximum et en groupe homogène si le nombre est inférieur. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Afin de préserver le bien être animal, nous avons mis en place pour chaque procédure qui pourrait engendrer du stress ou de la douleur des procédures afin de les dmininuer au maximum. Les animaux seront habitués à chaque nouvel environnement, nous réaliserons des injections d’antalgique avant et après chaque procédure douloureuse. Nous surveillerons de près le poids de l’animal, anticiperons les pertes thermiques lors de l’anesthésie générale, anisi que le déssèchement occulaire et la potentielle deshydratation de l’animal. Pour chaque procédure, nous avons établi un système de « scoring » de la douleur et une procédure à appliquer en fonction de celui-ci. Le système de scoring prend notamment en compte les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (au moins 2 fois par semaine), signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisants ou bien collés et gras, etc…), volume tumoral (suivi par échographie). Lors de l'apparition des symptômes, les souris seront scorées pour évaluer la gravité de la pathologie. En cas de perte de poids trop importante, de volume tumoral ayant dépassé les limites ou de douleur non soulagées par les antalgiques, nous procéderons à la mise à mort de l’animal. Toutes les procédures seront réalisées par un personnel diplômé et entrainé aux gestes.

Choix des espèces

Lors de notre étude, nous cherchons à comprendre comment le microbiote agit sur le système immunitaire et comment cela entraîne une résistance aux traitements d’immunothérapie. Pour comprendre cela, nous avons besoin de travailler avec des systèmes entiers (être vivant). En effet, les autres modèles qui existent, tumeurs sur puce, organoïdes ne peuvent pas reproduire le système immunitaire d’un être vivant. Les souris ont l’avantage de pouvoir à la fois reproduire la pathologie cancéreuse pancréatique mais aussi le système immunitaire complexe qui entre en jeu. Les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Cinq injections en une semaine déclenchent chez des souris transgéniques adultes des néoplasies prostatiques, laissées ensuite évoluer vers des tumeurs de taille importante aux points de cinétique les plus tardifs. 6 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la prostate et d'autres organes. S'y ajoutent jusqu'à trois prélèvements sanguins par animal, des traitements deux fois par jour pendant une semaine, des injections de radiomarqueur suivies de trois anesthésies et des palpations abdominales répétées tout au long de leur vie. Le porteur décrit une douleur abdominale reconnaissable à une posture inhabituelle, au poil hérissé et au dos voûté, et annonce que toute souris dans cet état sera sortie de l'étude, alors que le protocole prévoit d'observer ces tumeurs jusqu'aux stades tardifs.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020 . Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables . Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l'activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d'inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme . À noter que l'inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d'adénocarcinomes et favorise l'apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l'expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d'information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l'efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L'objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection, dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN (néoplasie prostatique intraéphithéliale), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l'anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l'homme ne sont pas ethique puisqu'elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l'hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d'imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids et par palpations abdominales. Les premières cohortes d’animaux, injectés et divisés en sous-groupes de cinétique (précoce, intermédiaire et tardive) seront palpées afin d’établir la corrélation la plus précise entre la palpation et l’histologie de la tumeur au moment de la mise à mort de l’animal. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intrapéritonéales. Lors des examens d'imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl 0.9% à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l'isoflurane . La durée d'analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d'assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). Des points limites sont mis en place sont une perte de poids supérieure à 20%, paralysie des membres, absence de toilettage, prostration et respiration difficile.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.

144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une biopsie de la queue à trois semaines puis, à huit semaines, une injection de cellules tumorales, avant huit injections supplémentaires étalées sur quatre semaines. Une partie reçoit ces cellules par voie intracardiaque sous anesthésie gazeuse, d'autres dans la glande mammaire au cours d'une chirurgie, et la croissance des tumeurs se mesure au pied à coulisse à chaque manipulation. Le porteur indique que les tumeurs pourraient causer une douleur et une perte de poids, et que les souris sont tuées en fin de procédure ou à l'atteinte d'un point limite pour récupérer des échantillons. Le bénéfice annoncé, identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition au cancer du sein et les valider comme cibles thérapeutiques, reste formulé au conditionnel.

Objectifs

Nous avons fait la découverte surprenante que les ostéoblastes (les cellules qui synthétisent les os) sont capables de stimuler à distance la croissance de tumeurs mammaires ainsi que leur dissémination métastatique dans l’ensemble de l’organisme. Nous avons découvert que les ostéoblastes sécrètent des molécules pro tumorales qui circulent dans le sang et stimulent la croissance des tumeurs partout où elles se trouvent. Nous avons identifié une molécule sécrétée par les ostéoblastes potentiellement responsables de ces effets : RANKL. Notre hypothese est que la secretion de RANKL par les osteoblastes puisse etre un facteur pro-tumoral direct favorisant la croissance tumoral a distance de l'os, supprimer ca secretion nous informera du role de RANKL issu des osteoblastes. Cependant, les données de la littérature indiquent que RANKL produit dans l'os pourrait egalement réguler la production cellules immunosuppressives provenant du lignage lymphocytaire B qui produisent de l’IL10. Nous supposons alors que le RANKL, lorsqu’il est produit par les ostéoblastes, exerce un contrôle négatif sur la production de ces cellules immunodépressives, de manière directe ou indirecte. Ainsi, lorsque la production de RANKL est interrompue, ces cellules deviennent plus nombreuses et favorisent la croissance du cancer du sein. Le premier objectif est de tester le rôle de RANKL produite par les ostéoblastes dans la progression du cancer du sein, à l’aide de modèles génétiques murins où la formation osseuse est augmentée par la réduction de la résorption osseuse du a labsence de RANKL, facteur d'osteoclastogenese. Notre deuxième objectif est de tester l’hypothèse selon laquelle RANKL produite par les ostéoblastes participent au contrôle systémique de la progression du cancer du sein en modulant la réponse immunitaire antitumorale via les cellules B IL10+. Ces travaux sont nécessaires afin de déterminer si le ciblage des molécules produites par les ostéoblastes est capable de limiter, voire prévenir le développement des cancers du sein.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d’identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition aux cancers du sein et de valider ces marqueurs en tant que cibles thérapeutiques. Ceci pourrait permettre de prévenir l’apparition, ou du moins de limiter la progression de tumeurs mammaires métastatiques. Ce travail pourrait notamment permettre d’améliorer les traitements visant à activer l’immunité antitumorale.

Procédures

À l’âge de trois semaines, chaque souris subira une biopsie de la queue afin de permettre l’identification des modifications génétiques présentes chez l’individu. À huit semaines, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules tumorales. L’intervention dure environ dix minutes par individu et n’est réalisée qu’une seule fois. Au cours de la croissance tumorale, les souris pourront être injectées à une fréquence de deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant d’être euthanasiées. La mesure de la croissance tumorale se fait à l’aide d’un pied à coulisse, ne dure que quelques secondes et est réalisée en même temps que les injections durant la phase de croissance.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des tumeurs ce qui pourrait causer une douleur et une perte de poids. Les manipulations successives des animaux (anesthésies, injections, mesures des tumeurs au pied à coulisse) peuvent engendrer un stress chez les animaux

Devenir

En fin de procedure ou lors d'atteinte de point limite, euthanasie des souris, et recuperation d'echantillions biologiques.

Remplacement

Le tissu osseux comprend de nombreux types cellulaires en plus des cellues qui fabriques l'os, qui interagissent et s’influencent mutuellement. Des travaux visant au développement de modèles synthétiques capables de récapituler l’environnement osseux sont en cours, mais les versions existantes restent très rudimentaires. De plus, notre projet vise à évaluer les effets directs et indirects des ostéoblastes sur la croissance de tumeurs primitives et la dissémination de la tumeur. Tous ces processus sont d’une grande complexité et ne peuvent être reproduits de façon fidèle synthétiquement.

Réduction

La principale méthode de réduction du nombre d’animaux utilisés dans notre projet repose sur un calcul statistique de taille d’effectif nécessaire pour chaque expérience afin d’avoir une puissance d’au moins 80 % pour détecter une différence correspondant à une taille d’effet estimée pour chaque expérience, grâce aux données préliminaires disponibles. Nos expériences sont réalisées séquentiellement avec des groupes relativement petits de souris contrôles et mutantes (2 à 5 animaux/groupe) car il nous est impossible de générer des groupes importants d’animaux du même âge en une seule fois. Ceci permet éventuellement de réduire en cours de projet le nombre de souris impliquées dans une expérience donnée, en arrêtant plus tôt que prévu cette expérience, une fois que le test statistique démontre que la/les différences observées sont significatives. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo permet d’éviter de devoir euthanasiés...

Raffinement

Les injections intracardiaques se feront sous anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide, moins impactant que l’anesthésie par injection. Les animaux inoculés dans la glande mammaire subiront une chirurgie mineure et seront anesthésiés ayant des propriétés analgésiques. Un gel oculaire sera appliqué sur ces animaux afin d’éviter l’assèchement durant la phase de sommeil. Le lendemain de la chirurgie, les animaux présentant des signes de souffrance recevront une dose d’analgésique. De la nourriture gélifiée sera en outre ajoutée dans les cages concernées. Tous les animaux seront observés pendant les deux heures suivant la procédure afin de confirmer une activité cardio-respiratoire normale et une bonne reprise de la mobilité. Dans tous les cas, un examen clinique et comportemental sera réalisé quotidiennement lors de la première semaine après l’intervention, puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à la fin de la procédure, afin de détecter tout signe de souffrance animale. La croissance tumorale est monitorée par bioluminescence, permettant d’évaluer l’état des animaux et de surveiller les points limites par une méthode non invasive. Au cours de cet examen, les animaux sont anesthésiés par gaz, ce qui permet un réveil plus rapide et moins stressant que l’anesthésie chimique. Des points limites précis ont été définis et seront surveillés tout au long des procédures. En cas d’atteinte d’un point limite, les mesures décidées seront mises en place immédiatement.

Choix des espèces

L’influence des ostéoblastes présents dans notre squelette sur la croissance et la dissémination métastatique de tumeurs mammaires doit être étudiée dans un modèle animal vertébré (présence d’un squelette) et mammifère (présence de glandes mammaires). De plus, notre projet requiert l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris est le mammifère de choix pour cela. Il est relativement facile d’évaluer les troubles comportementaux et les signes de souffrance de la souris du fait des nombreuses études préalables réalisées avec ce modèle animal (recherches en cancérologie notamment). Nous possédons une expérience importante de l’utilisation de la souris en recherche et les protocoles que nous prévoyons d’utiliser ont été mis au point pour cette espèce. La souris constitue donc l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques et éviter la souffrance de nos animaux du fait de l’expérience que nous avons déjà acquise. Toutes nos expériences seront réalisées à partir d’animaux âgés de 8 semaines, stade auquel le phénotype osseux des animaux mutants est bien marqué et où les glandes mammaires et le système immunitaire sont correctement développés.

192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, une injection dans le cerveau et l'implantation d'un dispositif d'enregistrement qu'elle gardera dans sa cage, avec un risque d'infection et une gêne liée à l'encombrement. Les enregistrements durent jusqu'à deux heures et demie par jour, y compris chez des femelles en lactation, ce que le porteur reconnaît susceptible de provoquer un rejet de la portée. Il écrit qu'il n'existe "malheureusement pas d'alternatives", tout en indiquant que son projet global comporte un modèle numérique du circuit neuronal étudié.

Objectifs

Notre projet vise à explorer comment l’activité des neurones producteurs d’ocytocine (ou neurones ocytocinergiques) est modulée par certains récepteurs spécifiques dans deux régions d’intérêt du cerveau. Ces neurones jouent un rôle central dans la régulation de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales, notamment le stress, la reproduction et les interactions sociales. La modulation de leur activité par des récepteurs spécifiques pourrait constituer un mécanisme essentiel pour ajuster finement la libération d’ocytocine. Nous étudierons, chez des souris génétiquement modifiées ou non, comment les récepteurs modulent l’activité des neurones ocytocinergiques dans le cerveau adulte, et l’impact de cette modulation sur l’activité du cerveau. En clarifiant ces mécanismes, notre objectif est de mieux comprendre le rôle des récepteurs étudiés dans la régulation de l’ocytocine, ainsi que leur impact potentiel sur les comportements sociaux et émotionnels dépendants de cette neurohormone.

Bénéfices attendus

Les troubles neuropsychiatriques et neuroendocriniens affectent profondément la qualité de vie des patients, avec des conséquences sur leur bien-être émotionnel, leurs interactions sociales, leur autonomie et leur santé physique. Ces affections représentent un enjeu majeur de santé publique, tant sur le plan humain qu’économique. Malgré les progrès récents, les bases neurobiologiques de ces pathologies restent encore mal comprises, ce qui limite le développement de traitements efficaces. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux qui régulent l’activité neuronale dans les circuits impliqués dans la régulation des émotions, du stress, de la reproduction et des comportements sociaux. Parmi ces circuits, les neurones ocytocinergiques occupent une position centrale. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre le lien entre une dysrégulation de circuits spécifiques au niveau du cerveau et des altérations du comportement social et émotionnel. À long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques, avec l’ambition d’améliorer la prise en charge des patients atteints de certains troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques.

Procédures

Tous les animaux auront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réaliser une injection dans le cerveau et implanter un dispositif d’enregistrement de l’activité cérébrale (45 minutes maximum par animal). Pour une partie des animaux des enregistrements (animal vigile) de l’activité cérébrale seront ensuite réalisés au cours de sessions d’habituation (4 séances d’une heure chacune, réparties sur 4 jours) puis lors de sessions d’enregistrements de l’activité cérébrale chez des femelles pendant la lactation et après la lactation (2.5h maximum par enregistrement, une fois par jour répété sur 4 jours répartis sur une période de 8 jours pendant la lactation puis 4 jours consécutifs après la lactation). Pour l’autre partie des animaux ils auront des enregistrements (animal vigile) de l’activité cérébrale réalisés au cours de sessions d’habituation 4 séances de 0,5h, 4 jours consécutifs) suivis d’enregistrements réalisés au cours de tests comportementaux visant à représenter divers types de stimuli connus pour activer les neurones ocytocinergiques : 4 tests comportementaux seront réalisés avec 5 jours de repos entre chaque test. Le premier test consistera en une session quotidienne de 15 minutes pendant 3 jours consécutifs, le deuxième en deux sessions quotidiennes de 15 minutes pendant 2 jours consécutifs, le troisième test en deux sessions quotidiennes de 15 minutes pendant 3 jours consécutifs, et enfin le quatrième test en une session quotidienne de 6 minutes maximum pendant 3 jours consécutifs. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque de douleur et un inconfort pendant quelques jours. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque de difficultés cardiaques et respiratoire. De plus, après l'implantation du dispositif sur sa tête, l'animal devra vivre dans la cage avec, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel, et présenter un risque d’endommagement de l’implant. Cet implant sera également associé à un risque d’infection. Les enregistrements réalisés chez les femelles pendant la lactation pourront entraîner un stress chez la mère et provoquer un rejet de la portée. Les tests comportementaux pourront générer un stress lié au changement d’environnement et au test en lui-même.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses post-mortem pour répondre à notre objectif scientifique.

Remplacement

Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale : l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (192) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’Union Européenne) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, bâtonnet de bois à ronger et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire qui apportent conseils et recommandations pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention pour limiter la douleur. Nous maintiendrons la température des animaux au cours de toute la durée de l’anesthésie pour éviter toute hypothermie et appliquerons un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Pour les séances d’imagerie, afin de réduire le stress, nous prévoyons une d'habituation des animaux au dispositif. Nous prévoyons également des périodes de repos entre les sessions d’imagerie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures, car les interventions chirurgicales requises ne peuvent être réalisées que sur des sujets adultes (8 semaines minimum). Une partie du projet nécessitera également d’utiliser des femelles après une chirurgie et après une période de gestation dès la naissance des petits car nous nous intéresserons spécifiquement à l’activité des neurones ocytocinergiques pendant la lactation.