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Création de modèles pathologiques ou physiologiquement modifiés par chirurgie d’exérèse
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- Recherche fondamentale
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Rats : 2500
Ôter un rein, une thyroïde ou un autre organe pour fabriquer un animal malade, puis l'expédier au laboratoire qui l'a commandé : 4 000 souris et 2 500 rats vont être utilisés dans ce catalogue de modèles chirurgicaux. 200 d'entre eux seront opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 6 300 autres subiront une opération de dix minutes à une heure suivie d'un réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à six injections par jour et un isolement en cage pouvant durer douze jours. Une partie des animaux sert à former et à requalifier les chirurgiens, de trois à vingt-cinq individus par technicien pour une acquisition, jusqu'à dix pour un maintien de compétence. Les autres sont, selon les mots du porteur, "à la demande, expédiés chez les scientifiques", donc versés à des projets dont le RNT ne dit rien.
Objectifs
L’objectif du projet est d’opérer des animaux afin de leur enlever un organe. Cela permet de mimer des maladies humaines ou animales (par exemple, enlever le rein et mimer une défaillance du rein, enlever la thyroïde et mimer une absence de thyroïde,...) afin de pouvoir mieux comprendre comment elles évoluent. Ces modèles animaux opérés sont aussi très importants pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Des modèles de maladies sont créés chez le rat ou la souris pour aider la recherche à mieux comprendre certaines pathologies humaines et à tester de nouveaux médicaments. Ces modèles permettent d’observer comment un traitement agit dans le corps et d’étudier le rôle des organes ciblés. Les chirurgiens qui réalisent ces modèles suivent des protocoles précis et doivent être bien formés, afin de garantir des résultats fiables, de limiter la souffrance animale et de proposer des modèles standards, prêts à l’emploi pour les chercheurs.
Procédures
Tous les animaux analgésiés, anesthésiés et non réveillés ou analgésiés, anesthésiés puis réveillés, dans le cadre de ce projet, seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de dix minutes à une heure, sous anesthésie générale. Selon le modèle et en cas de besoin (besoin scientifique, douleur, récupération post opératoire difficile), les animaux pourront être soumis à des injections (maximum 6 injections par jour, comprenant les injections suite à la mise en place du protocole d’analgésie et de raffinements). Selon les besoins des scientifiques, un prélèvement sanguin maximum (durée de l’acte de maximum une minute) est possible. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 12 jours.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dus aux contentions, aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (48-72h). Hébergement individuel sur une partie ou sur toute la durée de la procédure si l'intégrité du modèle le nécessite.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite, acquisition ou maintien des compétences ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
Les modèles chirurgicaux créés dans le cadre de ce projet permettent de mimer des maladies humains ou animales par l’absence d’un organe dans leurs corps. Cela permet de comprendre les liens qu’il y a entre cet organe et le reste de l’organisme. Cela permet également de comprendre comment de nouveaux médicaments peuvent aider à soigner cette maladie. Ces interactions ne sont pas des phénomènes isolés et par conséquent ne peuvent pas être étudiées in vitro sur un seul type de cellule. Pour l’acquisition et le maintien des compétences techniques, avant tout entraînement sur un modèle animal, une formation théorique basée sur l’utilisation de supports papiers et vidéos est effectuée. Lorsque cela est possible, l’entrainement pour certains gestes techniques pourront être réalisés sur des supports inertes (mannequin de formation). Pour les différents modèles, la validation du chirurgien sera évaluée sur la technique dans un temps imparti, sur la viabilité et la fonctionnalité du modèle dans le temps : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Basé sur les expériences précédentes, le nombre d’animaux a été calculé le plus juste possible en fonction des chirurgies et permettant d’atteindre les objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux surnuméraires opérés est suivi, calculé et ajusté à la baisse autant que possible en fonction des lots précédents. Pour l’acquisition et le maintien des compétences, le nombre d’animaux défini dans notre procédure est basé sur la criticité et la technicité du modèle (faible / moyen / forte) ainsi que les expériences précédentes. Ce nombre est composé d’un minimum (3 pour l’acquisition, 1 pour le maintien) et d’un maximum (de 25 pour l’acquisition, 10 pour le maintien) afin de pouvoir qualifier le chirurgien lorsque la technique est maîtrisée, dès lors que le nombre minimum est atteint. Cela nous permet également d’avoir un nombre maximum au-delà duquel le technicien n’est pas considéré comme formé. L’acquisition ou le maintien des compétences s’arrête dès lors qu’un taux de réussite de 100% est atteint pour un lot de 3 ou 1 animaux respectivement, même si le nombre maximum d’animaux n’a pas été effectué. Lors d’une acquisition ou maintien des compétences sur cadavre ou sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé, nous pouvons utiliser un animal pour l’entraînement de plusieurs gestes techniques de plusieurs modèles, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces animaux peuvent être les surnuméraires non opérés de commandes ou surplus de stock, ce qui contribue aussi à la réduction. Pour l’acquisition des compétences des modèles, les premiers entrainements se feront sur cadavre puis sur animal analgésié, anesthésié et non réveillé. Dès lors que les gestes sont maîtrisés, la chirurgie est réalisée sur animal analgésié, anesthésié et réveillé. Pour le maintien des compétences, l’utilisation d’animaux supplémentaire n’est pas systématique. Les différents modèles ont été classé selon leur difficulté et leur criticité. Pour ceux dont la difficulté et la criticité est considéré comme faible, le maintien des compétences se fera sur animaux de lots demandés par les scientifiques, sous supervision du formateur et/ou du responsable du service, avec au préalable, une relecture de la procédure et/ou le visionnage d’une vidéo de la technique.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, et dans un milieu enrichi et les interactions se font selon les bonnes pratiques de manipulation. Des points limites spécifiques au modèle seront appliqués. Toutes les interventions sont réalisées sur animaux anesthésiés, qui sont préalablement préparés de manière aseptique. Les chirurgies sont réalisées selon des procédures standardisées et adaptées aux spécificités de souche, sexe, âge et poids. Après évaluation de la douleur possible induite par le modèle (paliers de douleur définis pour chaque modèle en collaboration avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin (signes de douleur individuelle, d’inconfort ou absence de fèces). L’utilisation complémentaire d’anesthésique local (Lidocaine 2%, 1 ml/kg, dilution par 4, posologie de 16.22 mg/kg) peut être réalisée selon le palier de douleur de la chirurgie (procédure interne de classification validée par l’équipe vétérinaire et la SBEA). Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux avant réveil. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience (si le taux de succès ou de survie est très bas par exemple sur le choix fait par le scientifique). Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec le modèle d’intérêt, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Evaluation de nouveaux médicaments dans le traitement de l’ischémie cérébrale néonatale en combinaison avec l’hypothermie thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés à l'âge de sept jours pour réduire l'afflux de sang à leur cerveau, puis placés quatre-vingt-dix minutes dans une chambre pauvre en oxygène, des ratons subissent une lésion cérébrale durable. Une partie passe ensuite trois heures en hypothermie contrôlée, reçoit des injections quotidiennes de J7 à J9, parfois pendant deux semaines, et enchaîne les tests moteurs jusqu'à J16 : redressement, marche, géotaxie, grille, suspension à un fil. 2 760 rats vont être utilisés, dont 2 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des déficits moteurs et cognitifs attendus et une prise de poids ralentie. Tous seront tués pour que leurs cerveaux soient prélevés et analysés.
Objectifs
Trois à cinq nourrissons sur 1 000 souffrent d'hypoxie-ischémie à la naissance. L’hypoxie correspond à un défaut d’apport d’oxygène et l’ischémie un défaut d’afflux sanguin au cerveau. Les causes courantes sont des complications pendant l’accouchement (cordon ombilical autour du cou, rupture utérine…), des problèmes chez la mère (hypertension, diabète gestationnel, infections) ou chez le nouveau-né (prématurité, infections…). Il se développe alors chez le nourrisson une lésion cérébrale. Cet événement est une cause majeure de handicap persistant, voire de mortalité périnatale. En effet, 40 à 60% des enfants ayant souffert d’hypoxie-ischémie néonatale meurent avant 2 ans de vie ou présentent des déficits neurologiques sévères. Ces déficits neurologiques à long terme sont principalement des troubles de l'apprentissage et des retards intellectuels mais également de l’épilepsie, des troubles de la vision ou de l’audition. Le seul traitement validé et utilisé en clinique est l’hypothermie thérapeutique. La température corporelle du nourrisson est réduite pour ralentir le métabolisme ce qui donne au cerveau une chance de récupérer. Malheureusement près d'un nouveau-né sur deux n'y répond pas favorablement. En plus de son efficacité partielle, l'hypothermie a une fenêtre d'action limitée puisqu’elle doit être initiée dans les 6 heures suivant la naissance et est responsable d’effets indésirables comme des troubles cardiovasculaires, respiratoires, des convulsions… Ces effets potentiels imposent une surveillance médicale étroite des nouveau-nés en hypothermie thérapeutique. Nous avons développé des candidats médicaments qui agissent sur plusieurs mécanismes neuroprotecteurs dans le cerveau. Nous avons déjà montré chez un modèle rongeur juvénile que nos composés réduisent les lésions cérébrales et les séquelles à long terme de l’hypoxie-ischémie du nouveau-né. Notre objectif est maintenant de démontrer, toujours chez le modèle rongeur juvénile, que nos candidats médicaments peuvent agir en synergie avec l'hypothermie thérapeutique afin d’augmenter la survie des nouveau-nés souffrant d’hypoxie-ischémie et diminuer les potentielles séquelles neurologiques.
Bénéfices attendus
Un traitement médicamenteux pour les lésions hypoxiques-ischémiques néonatales pourrait apporter plusieurs bénéfices significatifs : - réduction de l’incidence et de la gravité des séquelles neurologiques à long terme, telles que la paralysie cérébrale, les troubles cognitifs et les retards de développement ; - amélioration de la qualité de vie des enfants affectés et de leurs familles, en diminuant le besoin de soins spécialisés et de rééducation ; - élargissement de la fenêtre thérapeutique : Si le nouveau traitement peut être administré plus tardivement que l'hypothermie (qui doit être initiée dans les 6 heures suivant la naissance), il pourrait bénéficier à un plus grand nombre de nouveau-nés, y compris ceux qui ne peuvent pas recevoir immédiatement des soins spécialisés ; - Possible effet synergétique réduîsant la durée ou l’intensité de l’hypothermie et minimisant ainsi les effets secondaires comme les troubles cardiovasculaires ou respiratoires. - Personnalisation des soins qui pourraient être adaptés à chaque cas : le traitement médicamenteux pourrait être utilisé en complément ou comme alternative à l'hypothermie ; - Réduction des coûts pour les familles et les systèmes de santé, en diminuant la nécessité de soins intensifs prolongés et de rééducation à long terme ;. - Accessibilité dans les régions où les équipements pour l'hypothermie thérapeutique ne sont pas disponibles. En parallèle, le développement d’un tel médicament pourrait également contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de la pathologie, ouvrant la voie à d'autres innovations thérapeutiques.
Procédures
Certaines interventions concernent tous les animaux : - une procédure chirurgicale permettant de réduire l’afflux sanguin et d’oxygène au cerveau sera réalisée. L’acte chirurgical dure moins de 10 min par animal. Les animaux sont ensuite placés dans une chambre à hypoxie pour une exposition à un air faible en oxygène pendant 90 minutes. Cette procédure chirurgicale induit une lésion cérébrale localisée chez les animaux. D’autres interventions ne concernent que des groupes d’animaux : - Une hypothermie thérapeutique pratiquée pour mimer l’intervention réalisée chez les nouveau-nés : les animaux seront placés dans une chambre permettant d’abaisser leur température corporelle de façon contrôlée pendant 3 heures. - l’administration de l’un des candidats médicaments par injection. 3 schémas d’administrations seront réalisés : - Schéma 1 : une administration par jour pendant 3 jours soit à J7, J8 et J9. - Schéma 2 : une administration à J7 puis deux administrations par jour à J8 et J9 - Schéma 3 : schéma 1 ou 2 prolongé sur 2 semaines - Des tests moteurs: ces tests sont effectués de l’âge 8 jours à l’âge 16 jours. Le test de redressement est effectué quotidiennement entre J7 et J10 et prend moins d’une minute par animal. Le test de la marche est effectué quotidiennement entre J8 et J10 et prend 2 min par animal en deux sessions de 1 min. Le test de la géotaxie est effectué quotidiennement entre J8 et J16 et prend 1 min par animal en deux sessions de 1 min. Le test de la grille et de la suspension à un fil sont réalisés entre J14 et J16 et prennent une minute en deux sessions de 1 min. Une acclimatation préalable permettra de préparer les animaux afin de réduire leur stress lié à la manipulation par les expérimentateurs.
Impact sur les animaux
L’induction de l’hypoxie-ischémie cérébrale implique une procédure chirurgicale et donc un stress et de la douleur pour les animaux du fait de la procédure en elle-même, de l'isolement, de la gestion post-opératoire et des manipulations répétées, ainsi que de la gestion de la température (hypothermie ou réchauffement quand les animaux sont replacés avec la mère ou en groupe). Les animaux peuvent également souffrir de complications chirurgicales, d’infections ou douleurs post-opératoires. Les animaux souffrent de lésions cérébrales qui miment les lésions cérébrales observées chez les nouveau-nés. La durée et l’intensité des déficits dépendent de l’étendue des lésions cérébrales induites et des traitements administrés afin de réduire ces lésions. Les animaux présenteront donc des déficits moteurs et cognitifs ainsi qu’une prise de poids généralement moins rapide. Les déficits moteurs attendus sont un retard de l’ouverture de yeux, un retard d’acquisition de la marche, une perte de coordination musculaire et une difficulté à maintenir l’équilibre. Les déficits cognitifs sont des troubles de la mémoire spatiale et des troubles de l’apprentissage. En dehors de l’acte d’injection lui-même, l’administration d’un candidat-médicament n’a pas démontré d’effet indésirable dans nos études préliminaires aux doses qui seront utilisées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issus du projet afin de prélever les cerveaux qui seront utilisés pour des analyses permettant de caractériser les lésions cérébrales induites et les effets protecteurs de nos candidats médicaments
Remplacement
Différents modèles cellulaires ont permis de tester les candidats médicaments pour choisir les meilleurs candidats. Néanmoins, ils ne permettent pas de s’affranchir totalement de l’expérimentation animale car ces modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des mécanismes moléculaires, cellulaires, physiologiques, qui se mettent en place dans le cerveau et dans l’ensemble d’un organisme vivant, suite à une hypoxie-ischémie cérébrale et l’administration d’un candidat-médicament, ou d’évaluer la biodistribution ou bien la phamacocinétique des médicaments testés
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous avons choisi de faire des groupes de 30 rats (moitié mâles, moitié femelles) ce qui est le nombre minimum et suffisant pour aboutir à une étude statistique significative en nous basant notamment sur les données de la littérature ainsi que sur nos expériences antérieures utilisant ce modèle d’étude. Chez l’homme comme dans les modèles pré-cliniques, les mâles sont reconnus comme plus vulnérables face à l’hypoxie-ischémie cérébrale néonatale que les femelles. Cette différence de réponse nous impose d’évaluer le bénéfice thérapeutique dans les deux sexes séparément.
Raffinement
En ce qui concerne le raffinement, un suivi quotidien des animaux par les animaliers ainsi que par les expérimentateurs sera opéré afin de détecter tout problème. . Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place afin de réduire et prévenir la douleur chez les animaux, notamment lors de la procédure chirurgicale d’induction de l’hypoxie-ischémie cérébrale mais également dans les quelques jours après l’intervention. Des études sur la formulation de nos composés ont permis d’obtenir une solubilité dans du sérum physiologique, ce qui optimise leur tolérance. Des études de toxicologie ont été réalisées in vitro et in vivo et ont permis de démontrer l’absence d’effet toxique après 7 jours d’administration des candidats médicaments à la concentration à laquelle ils seront utilisés. Des points limites ont été fixés, c’est-à-dire que des signes cliniques ont été définis comme des indicateurs d’un état de stress ou de souffrance incompatibles avec la poursuite du protocole pour un animal. Des actions correctives ont été définies et seront mises en place dans l’éventualité de l’atteinte d’un point limite pour un animal (en premier lieu, retrait du protocole et observation renforcée de son état de santé).
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée en recherche translationnelle. L’étude préclinique de l’hypoxie-ischémie néonatale est largement documentée dans la littérature scientifique. Le modèle classiquement utilisé et que nous utiliserons dans ce projet est l’induction de l’hypoxie-ischémie chez le rat de 7 jours. Le rat de 7 jours est un choix particulièrement adapté car à cet âge, son cerveau est au stade de développement proche de celui d’un nouveau-né humain à terme. Cela permet de mieux reproduire les réactions biologiques et les mécanismes cellulaires qui se produisent lors d’une hypoxie-ischémie chez les nouveau-nés. Ce modèle bien établi chez le rat offre une approche scientifique rigoureuse et fiable, permettant de mieux comprendre la maladie et d’avancer dans la recherche de traitements efficaces pour protéger le cerveau des nouveau-nés victimes d’hypoxie-ischémie.
Etude de la manipulation des structures cérébrales qui sous tendent le maintien de la mémoire traumatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris est opérée du cerveau pendant une trentaine de minutes, puis soumise à un test de mémorisation où l'on mesure son temps d'immobilité, et à deux injections sous contention. 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour analyse de leur cerveau. Il s'agit de créer une mémoire traumatique puis de manipuler les zones cérébrales qui la maintiennent, pour voir s'il est possible de rétablir un souvenir normal de l'événement. Ni la nature de la chirurgie, ni le contenu des deux injections, ni le protocole du conditionnement ne sont précisés, alors que l'effectif de 768 souris repose sur des groupes d'au moins douze animaux.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier la participation de différentes structures cérébrales qui sont impliquées dans la formation de la mémoire traumatique et dans son maintien. Dans le cas des troubles de stress post-traumatiques, on assiste très souvent à une altération de la mémoire. Cette altération se caractérise par une amnésie des éléments du contexte où a eu lieu l'expérience traumatisante et par une hypermnésie d'élements plus anodins qui sont à la source de "Flashback" incontrolés. Chez l'homme comme chez animal, le maintien de la mémoire traumatique est associé à une sur-activation de certaines zones cérébrales ou au contraire à une sous-activation d'autres zones. Le but de ce projet est de manipuler l'activation de ces structures chez la souris afin d'évaluer si il est possibke de restaurer une mémoire normale de l'événement traumatique.
Bénéfices attendus
En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.
Procédures
768 souris seront soumises à une procédure de chirurgie d'une durée de 30 minutes environ sous anesthésie. Toutes ces souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation. Le test comportemental dure 5 minutes pour la séance d'apprentissage et 6 minutes pour le test de rappel de la mémoire au cours duquel nous mesurons le temps d'immobilité des animaux. Deux injections seront faites chez les 768 souris qui seront immobilisées par contention et dureront moins de 20 secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie est un acte expérimental de classe modérée. Les douleurs post-opératoires sont minorées par l'administration d'antalgiques. 768 souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation, qui peuvent induire un stress: un acte de classe modéré. Les injections nécessite d'immobiliser les souris (768) une minute et peut provoquer un faible stress: un acte de classe modérée
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour l'analyse des cerveaux.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine.
Réduction
Concernant la réduction, l’effectif de 768 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Notre expérience des approches comportementales indiquent que des effectifs d’au moins 12 animaux par groupe s’avèrent nécessaires pour atteindre le seuil de significativité des résultats. Un nombre inférieur de souris par groupe à la fin de l'étude comportementale pourrait impliquer une réplication de l'expérience.
Raffinement
Tout au long du projet, les animaux seront surveillés par du personnel qualifié, des points limites spécifiques seront établis et des critères d'arrêt seront prévus pour éviter toute souffrance inutile. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous couverture anesthésique et antalgique et des méthodes de raffinement (réchauffement, asepsie) adaptées. En cas de problème constaté, les animaux seront traités selon l'arbre décisionnel prévu.
Choix des espèces
La souris adulte (8 à 16 semaines): -est un mammifère proche de l'espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature, pour ce type d‘expérimentation et l’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte: Nous utiliserons des souris àgées de 8 à 16 semaines, âge qui correspond à l’état adulte de la souris. Pour une comparaison des résultats, l’étude des réseaux impliqués dans la formation de le maintien d'une mémoire implique l’utilisation de cette espèce. -permet d'accéder au niveau cellulaire grâce à des procédures de biologie réalisables en laboratoire.
Rôle d’une voie stimulant la survie cellulaire dans les maladies rénales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune recevant dix à vingt administrations orales sur deux à quatre semaines. Une partie subit une chirurgie qui prive le rein de circulation sanguine, d'autres reçoivent des molécules toxiques pour les reins, dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer une dénutrition, une prostration et une altération de l'état général. La mesure de la fonction rénale impose deux anesthésies à deux heures d'intervalle, l'une pour fixer un capteur sur le dos de l'animal, l'autre pour le retirer, et l'opération se répète plusieurs jours différents sur la même souris. Le bénéfice annoncé, des thérapies ciblant les cellules rénales lésées plutôt que le système immunitaire dans son ensemble, reste à l'état de projet, quand l'insuffisance rénale, elle, est bien induite chez les 436 souris.
Objectifs
Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Le rein est constitué d'unités fonctionnelles de filtration, appelées néphron. Le néphron comprend deux compartiments : le glomérule et le tubule. Nous avons mis en évidence que la voie de signalisation d’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) est activée dans les tubules et les glomérules de patients atteints de maladies rénales. Afin de caractériser le rôle de cette voie dans les maladies du glomérule, nous avons étudié les conséquences de la suppression d’un gène impliqué dans la signalisation de l’interleukine, dans cette structure rénale. Nous avons ainsi montré que ce gène favorise la survie des glomérules lors d'une agression rénale chez la souris, permettant ainsi de réduire les conséquences néfastes de cette agression. Nous devons maintenant caractériser son rôle dans les tubules, ce qui représente le premier objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de la suppression du gène d’intérêt dans les tubules rénaux sur le développement d'une maladie rénale chez la souris. Afin de confirmer que l'activation de la voie de l'interleukine est bénéfique dans le contexte des maladies rénales, nous avons utilisé une molécule qui active sa voie de signalisation. Comme nous l'espérions, cette molécule a réduit les conséquences d'une agression glomérulaire chez la souris. Nous devons maintenant montrer si ce rôle protecteur est médié ou non par le gène d’intérêt. C'est le deuxième objectif de notre projet. Nous étudierons pour cela les conséquences de l'administration de la molécule dans le développement d'une maladie rénale chez des souris produisant ou non le gène d’intérêt dans les glomérules ou les tubules.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie des cellules rénales conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie aigüe vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.
Procédures
(1) Administrations par voie orale ou injections : L’agent utilisé pour induire la modification génétique des souris sera administré par voie orale (pendant deux à quatre semaines, soit 10 ou 20 fois) à l’état vigile. L’administration orale dure 30 secondes. La molécule à tester sera injectée deux fois, diluée dans une solution non irritante. Cette injection est réalisée à l’état vigile. Pour l’induction des modèles expérimentaux, les animaux recevront une injection sous anesthésie gazeuse ou deux injections à l'état vigile. Chaque injection dure 30 secondes environ. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux au moment de l’euthanasie, sous anesthésie, sur un plateau chauffant ; durée entre 5 et 10 minutes. (3) Pesées : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (4) Mesure de la fonction rénale : une partie des souris du projet sera soumise à la mesure de la fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent être générées par : (1) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (2) Administrations par voie orale : Elles peuvent occasionner du stress, de l’inconfort, l’irritation de la gorge et des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes qui se traduire par un animal qui se met à gasper. Le composé administré peut entrainer une inflammation potentiellement douloureuse, d'intensité modérée. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : une de ces molécules peut entrainer une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).
Devenir
Tous les animaux (436) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.
Remplacement
En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de six ou dix animaux (mâles et femelles sauf pour un modèle) sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 436 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
(1) Raffinement hébergement et surveillance : Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes , de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour l’administration par voie orale : Ella aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables souples et plus ergonomiques. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Une pesée régulière permet de surveiller les points limites. (3) Raffinement injections : Toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Les volumes d'injection sont adaptés. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un gel ophtalmique est appliqué pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : Pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie : Les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux directement dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments chirurgicaux sont stérilisés.
Choix des espèces
Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Pour inactiver le gène d'intérêt, le composé est administré aux souris à l’âge de 5 semaines pour ne pas avoir des animaux trop vieux ensuite. Pour le reste des procédures, les souris seront âgées entre 9 et 11 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.
Etude de l’impact de NLRP3 sur le recrutement des lymphocytes T CD8 dans les tumeurs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une injection dans le ventre chaque jour, pendant toute la durée de l'étude, plus une greffe de tumeur sous la peau du flanc réalisée sous anesthésie : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du microenvironnement tumoral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit ces administrations comme non douloureuses et indique que le traitement peut accélérer la pousse tumorale, tout en jugeant que les tumeurs ne devraient pas entraver la vie des animaux. L'objectif reste de confirmer dans un corps vivant un mécanisme déjà identifié en culture cellulaire, la retombée thérapeutique étant renvoyée au plus long terme. Le choix de la souris tient à la modification génétique elle-même, le porteur affirmant qu'aucune autre espèce de rongeur ne la porte.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer. Parmi eux, les lymphocytes T CD8 ont un rôle majeur mais ils sont très souvent peu présents dans les tumeurs. Ce projet s’appuie sur des observations réalisées au cours desquelles nous avons observé qu’un gène particulier bloque la présence des CD8 dans les tumeurs. In vitro, nous avons identifié un mécanisme d’action et nous voulons aujourd’hui valider in vivo ce mécanisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de confirmer nos résultats préliminaires et apporterait des informations nouvelles et inattendues sur les CD8. De plus, Ces données permettront à plus long terme de proposer une nouvelle cible thérapeutique dans les cancers soit dans un contexte de thérapie cellules ou dans le développement de nouvelles molécules.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - des injections dans le ventre de quelques secondes - une injection sous cutanée de 30 secondes sous anesthésie afin de permettre le développement d’une tumeur
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à 1 injection de traitement dans le ventre (de quelques secondes) par jour sur toute la durée de l’étude. Ils seront également soumis à 1 injection sous cutanée (30 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane afin de mettre en place une tumeur. Ces administrations ne sont pas douloureuses mais la contention peut induire un peu de stress. Le traitement peut entrainer une pousse tumorale plus rapide. Mais la taille des tumeurs sera évaluée tous les jours. Les tumeurs se développerons sur le flanc des animaux. Du fait de leur faible taille et de leur localisation, elles ne devraient pas entraver la vie des animaux. De plus, ces tumeurs ne forment pas de métastases et ne nécrosent pas.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (80) pour analyse du microenvironnement tumoral.
Remplacement
Les expériences réalisées préalablement in vitro nous ont permis d’identifier un mécanisme d’action responsable de l’accumulation des CD8 dans les tumeurs. Néanmoins, les expériences in vitro ne peuvent pas mimer la complexité d’un organisme vivant. De ce fait, nous avons besoin de valider nos observations in vivo.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 10 animaux par groupe seront utilisés pour évaluer le recrutement des CD8 dans les tumeurs. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, nous réaliserons les expériences 2 fois de manières indépendantes pour augmenter la force statistique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en zone conventionnelle à 10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (tunnels, cachettes, matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Les injections SC (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. Les injections IP seront réalisées sur des souris vigiles. Lors des l’injections nous utiliserons des seringues à insuline, comportant les aiguilles les plus fines disponibles permettra de réduire la douleur chez l’animal. Chaque animal sera observé quotidiennement, tout le long de l’expérimentation. Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.
Choix des espèces
Ce projet nécessite des animaux transgéniques afin de pouvoir étudier le recrutement des CD8 dans les tumeurs. Les souris sont la seule espèce de rongeur existante avec cette modification génétique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 14 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature
Imagerie fonctionnelle du cerveau à différents états métaboliques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Maintenues éveillées une heure vingt dans un dispositif d'imagerie cérébrale, à deux reprises, 32 souris subissent aussi une chirurgie de trente minutes, six injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, quatre prélèvements de sang à la queue et un jeûne pouvant aller jusqu'à vingt heures. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet cherche à savoir si des changements métaboliques, jeûne ou régime pauvre en sucre, stabilisent l'activité cérébrale altérée dans les troubles liés au stress. Le RNT range l'habituation et les séances d'imagerie en "stress léger", sans dire quelle intervention chirurgicale les souris subissent ni comment elles sont immobilisées pendant une heure vingt d'examen sur animal vigile.
Objectifs
Les troubles liés au stress, comme la dépression, sont souvent accompagnés par des déséquilibres métaboliques. De plus ces troubles sont caractérisés par de l'instabilité dans l’activité du cerveau. Ces troubles peuvent être améliorés par des changement métaboliques, par exemple lors d’un régime spécial ou d’un jeûne. Le but de ce projet est de comprendre comment le métabolisme peut aider à stabiliser l’activité cérébrale
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment les changements métaboliques, en stabilisant l’activité neuronales, peuvent améliorer les troubles liés au stress.
Procédures
6 Injections intrapéritonéales (IP) et 2 sous-cutanées (SC). 1 Chirurgie sous analgésie et anesthésie (30 minutes). Habituation progressive (de 5 minutes à 45 minutes) au dispositif d’imagerie sur 10 jours. 2 séances d’imagerie d’une durée de 1h20 sur animal vigile. 4 prélèvements de sang caudal sur animal vigile. 1 jeune d’une durée maximale de 20 heures.
Impact sur les animaux
Injections : douleur légère de courte durée. Période de récupération post-chirurgie : douleur modérée. Habitation et séance d’imagerie : stress léger. Prélèvement de sang : douleur légère de courte durée. Jeune : stress léger.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour préserver leur cerveau et analyse post-mortem
Remplacement
Dans des modèles de culture de cellules nerveuses, on a observé que certaines substances produites par l’organisme lors du jeûne ou d’un régime très pauvre en sucre peuvent soutenir l’activité du cerveau. Cependant, pour comprendre comment ces substances contribuent à stabiliser l’activité cérébrale, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes plus complexes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toute la complexité du cerveau, ce qui rend les études chez l’animal indispensables.
Réduction
Nous menons des études dans lesquelles nous suivons chaque animal au fil du temps. Cela nous permet de comparer son état initial avec les différents stades métaboliques. Cette approche a l’avantage de réduire le nombre d’animaux tout en gardant des résultats fiables. D’après notre expérience, un groupe de 12 animaux est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement solides. Des tests statistiques spécifiques au projet seront utilisés pour l'analyse des résultats.
Raffinement
Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification (enrichissement). Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux. Des goutes pour les yeux sont appliqués pour prévenir l’assèchement des yeux pendant la chirurgie. Des séances progressives d’habitation au dispositif d’imagerie serons effectué pour réduire le stress.
Choix des espèces
L’imagerie fonctionnelle à ultrason chez l’animal vigile est établie chez la souris. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Chez l’Homme, les troubles liés au stress sont fréquents chez les jeunes adultes des deux sexes. Les animaux seront utilisés entre 6 semaines et 4 mois de vie, ce qui corresponds à ce stade. Les deux sexes sont considérés.
Rôle de la délétion vasculaire spécifique de CXCR4 dans le développement de l’arthrose post-traumatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
3 612 souris vont être utilisées, toutes tuées, chacune subissant après sa mort un prélèvement de sang, de colonne vertébrale, des quatre pattes, de la trachée, des poumons et de l'aorte. À dix semaines de vie, elles subissent une chirurgie du genou droit qui déstabilise un ménisque pour provoquer une arthrose, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant cinq jours. Le porteur décrit une prostration possible pendant trois jours, un isolement du groupe, l'arrêt du toilettage social, un risque d'infection des sutures et de péritonite. Les bénéfices annoncés se chiffrent en centaines de milliards d'euros d'économies européennes, quand le projet cherche d'abord à documenter, pour la première fois, le rôle d'une interaction moléculaire dans l'invasion vasculaire du cartilage.
Objectifs
L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliser une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.
Bénéfices attendus
Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle de l’invasion vasculaire du cartilage dans le développement de cette maladie. Dans un second temps, les résultats obtenus, nous permettront d’évaluer l’intérêt de cibler l’étape d’invasion vasculaire du cartilage pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’arthrose. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représente des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongé et aux intervention) exercées par l’arthrose sur notre société.
Procédures
A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections intrapéritonéales du composé d’intérêt quotidienne de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.
Impact sur les animaux
Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si des douleurs sont ressenties par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux de la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait notamment être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences potentielles multiples
Devenir
L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.
Remplacement
Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communication cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.
Réduction
Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientfique, les nombre de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe a été calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvement multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.
Raffinement
Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée en avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial
Caractérisation d’une mutation causale candidate influençant la qualité du cuir des agneaux Lacaune
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Améliorer la valeur marchande du cuir d'agneau : 200 agneaux de race Lacaune sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous gardés vivants et maintenus dans l'élevage à l'issue. Chacun subit une prise de sang à la veine jugulaire sur animal vigile, et 30 d'entre eux une biopsie cutanée à la croupe sous anesthésie locale. Le porteur indique que la douleur au site d'incision peut durer 24 à 48 heures et que le risque infectieux n'est pas exclu. Le défaut visé, de petites perforations appelées piqué de laine, dégrade un "co-produit de l'élevage ovin actuellement mal exploité".
Objectifs
Les cuirs des agneaux de race Lacaune peuvent présenter un défaut, appelé piqué de laine (petites perforations du cuir, semblables à des trous d’épingle), qui dégrade sa valeur. L’objectif du projet est de mieux caractériser, dans cette race, une région du génome qui influence positivement la qualité du cuir. Cette région du génome comporte un gène dont un variant, qui est retrouvé naturellement dans la population, semble expliquer la variabilité observée de la qualité des cuirs. Pour cela une étude spécifique des agneaux porteurs ou non de ce variant est nécessaire pour mieux connaitre leurs caractéristiques et pouvoir évaluer les impacts sur les autres paramètres zootechniques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle joué par la génétique sur la qualité du cuir, en analysant ses impacts sur la structure de la peau et sa composition protéique. Elle permettra de mettre en lien les différences de génotype et de composition de la peau avec la qualité des cuirs tannés mais aussi avec les caractéristiques de la laine, la morphologie et la croissance des animaux. A long terme, ces connaissances permettront d’établir de nouvelles pistes de sélection sur la qualité du cuir afin de mieux valoriser ce co-produit de l’élevage ovin actuellement mal exploité.
Procédures
200 agneaux feront l’objet d’un prélèvement sanguin à la veine jugulaire. La prise de sang sur animal vigile durera environ 30 secondes par animal. Enfin, 30 animaux parmi les 200 feront également chacun l’objet d’une biopsie cutanée au niveau de la croupe. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie locale et durera en tout une dizaine de minutes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous réalisons des prises de sang à la veine jugulaire et des biopsies cutanées. Les agneaux peuvent éprouver un stress associé à la contention nécessaire aux interventions. Ils peuvent aussi ressentir une douleur légère au moment de l’introduction de l’aiguille. La prise de sang peut engendrer un hématome localisé sur le site de la ponction mais sans aucune altération de l’état général des animaux. A la suite de la biopsie cutanée, les animaux pourront ressentir une douleur pendant 24 à 48h sur le site de l’incision. Une désinfection sera effectuée mais le risque infectieux n’est pas exclu. Le site de l’incision sera suturé avec du fil résorbable afin de faciliter la cicatrisation des animaux.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont gardés en vie et resteront dans l’élevage.
Remplacement
Bien qu’il existe des modèles cellulaires de peau, ils ne permettent pas de refléter avec précision les mécanismes moléculaires de la peau d’un agneau en croissance. De plus, l’utilisation de modèles cellulaires de peau ne permet pas de mettre en évidence l’effet de la mutation sur les autres caractères phénotypiques de l’animal : poids, morphologie et aspect de la laine.
Réduction
L’effectif de 200 agneaux nous permettra de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur le piqué de laine de 0.5 écart-type avec un risque de première espèce (faux positifs) de 5% et un risque de deuxième espèce (faux négatifs) de 20%. Parmi ces 200 agneaux, 30 feront l’objet de biopsies cutanées :15 agneaux double porteurs et 15 agneaux non porteurs de la mutation. A partir des biopsies cutanées, les deux groupes d’animaux seront comparés sur des critères d’histologie de la peau et d’expression génique. Nous ne connaissons pas la variabilité de ces observations. Cependant, si on se base sur la variabilité du piqué de laine (caractère gaussien final observé, écart-type de 1.14), l’effectif de 15 individus par groupe nous permettra de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés de 1 écart-type pour un critère gaussien avec un risque de première espèce (faux positifs) de 5% et un risque de deuxième espèce (faux négatifs) de 20%. Les caractères étudiés grâce aux biopsies cutanées représentent des mécanismes fins de régulation génique, et c’est la raison pour laquelle cette différence de 1 écart-type représente un seuil suffisamment fin quand on se place à l’échelle cellulaire. Les effectifs sont donc réduits au minimum pour prouver nos hypothèses.
Raffinement
Les agneaux sont élevés sur des aires paillées en bergerie avec leur mère jusqu’au sevrage (à 1 mois). Afin de respecter leur comportement grégaire, ils sont sevrés en lots dans la bergerie d’engraissement. Chaque aire paillée dispose de dispositifs d’enrichissements tels que des tables, des chaînes et des disques à mordiller. Le personnel de l’unité utilise les principes d’apprentissage pour favoriser les interactions positives avec les animaux. Le renforcement positif permet par exemple d’associer un renforçateur primaire – par exemple un aliment appétent - à l’expression d’un comportement approprié afin d’en augmenter la fréquence. En cas de développement d’un comportement inapproprié, le contre-conditionnement permettra de rectifier la réponse au stimulus. Ces conditionnements seront utilisés lors de chaque manipulation spécifique des animaux durant le projet. La répétition des interactions positives avec les animaux (lors des soins quotidiens, de l’alimentation, des déplacements), en dehors des procédures expérimentales, limite fortement les comportements de fuite, ou de stress des animaux lors de leur contention. De plus, la contention est effectuée à proximité, donc en présence des congénères pour éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
La mutation que nous cherchons à caractériser n’a pas été mise en évidence chez d’autres espèces que chez les ovins. Ses conséquences sur la qualité du cuir est une problématique spécifique à l’élevage ovin. Les prises de sang pour extraction d’ADN auront lieu à 2 mois d’âge. A cet âge le sang de l’agneau n’est plus contaminé par celui de sa mère et cet échantillon permet d’obtenir de l’ADN de qualité, indispensable pour les analyses génétiques plus poussées. Les biopsies cutanées auront lieu à l’âge de 2 mois, afin d’évaluer l’effet de la mutation sur les mécanismes moléculaires à un stade de développement précoce de l’animal et de détecter des différences moléculaires entre les agneaux porteurs ou non de la mutation.
Comment interagissent une hormone digestive et un facteur de croissance dans le contrôle du métabolisme musculaire et du comportement ? Le microbiote, acteur de ce contrôle ?
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Quatorze jours seule en cage pour mesurer son activité sur roue, quarante heures en chambre métabolique : 150 souris hypermusclées, privées de myostatine, et leurs frères et sœurs témoins subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 54 mâles sont mis en présence d'un congénère pendant un quart d'heure pour mesurer leur agressivité, avec des combats possibles, et 48 autres passent des tests d'anxiété, un jeûne de dix heures et une prise de sang. Le porteur déclare 78 souris replacées en élevage après les tests non invasifs, mais annonce aussi 96 mises à mort en fin d'expérimentation, deux comptes impossibles à concilier sur 150 animaux. Il explique avoir observé "fortuitement" une agressivité accrue chez ces souris et cherche à la relier à la ghréline, l'hormone de la faim.
Objectifs
Pour subvenir à ses besoins de manière discontinue, l’être humain organise sa prise alimentaire en une série d’événements périodiques répartis en trois phases : pré-ingestive, ingestive et post-ingestive. Chaque phase est associée à des sensations alimentaires physiologiques (faim et appétit, rassasiement et satiété) qui permettent de réguler la prise alimentaire. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. La ghréline est une hormone qui contrôle la prise alimentaire. La myostatine contrôle le développement musculaire. Les deux hormones peuvent avoir un rôle dans le comportement en particulier l’agressivité. L’absence de satiété, la faim, conduisent à une recherche de nourriture et une augmentation de l’activité motrice, qui peuvent s’accompagner d’agressivité. Notre projet a pour but d’étudier le comportement d’activité motrice et d’agressivité d’une lignée de souris hyper musclées, dépourvues de myostatine, et d’établir s’il y a un lien avec l’hormone de satiété Ghreline.
Bénéfices attendus
Plusieurs maladies humaines se traduisent par des modifications de la prise alimentaire et de l’activité motrice spontanée (ex : anorexie). Le comportement relationnel est aussi souvent altéré chez les patients. L’observation fortuite d’une agressivité plus importantes chez les animaux dont la myostatine est inactivée, nous a conduit à rechercher s’il pouvait y avoir un lien entre la ghréline, la myostatine et les enzymes qui modifient la ghréline. Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes pouvant être impliqués dans des pathologies humaines impactant le comportement alimentaire et moteur.
Procédures
48 animaux vigiles seront maintenus en contention lors de la mesure de composition corporelle (moins de 2min, 5 fois). Ils seront individualisés pour l’évaluation de l’activité spontannée sur roue et du métabolisme repiratoire (2 semaines et 40h). 48 autres animaux subiront des tests de comportement permettant d'évaluer leur anxiété (2 tests de 10 min) puis une mise à jeun de 10h et un prélèvement d'une goutte de sang lors de la mesure de glycémie (3 secondes). 54 mâles réaliseront un test de mise en présence avec un congénère pendant moins de 15 minutes pour évaluer leur comportement social. Enfin, au total, 96 animaux auront une contention et une injection d’anesthésique en fin d’expérimentation (moins de 5 secondes).
Impact sur les animaux
Les tests de comportements, les pesées, les mesures de composition corporelle et l’individualisation de certains animaux peuvent induire du stress. Les expériences de mise en présence de congénères de courte durée (15 minutes maximum) pourront induire un stress plus élevé et entrainer des combats si les animaux sont agressifs. Nous observerons en continu les animaux et appliquerons des points limites pour arrêter le test en cas de blessure. L’évaluation du métabolisme respiratoire, du comportement d’agressivité et de l’activité spontanée nécessitent l’individualisation des animaux (respectivement 40h, 10 jours et 14 jours). Ils garderont cependant le contact visuel et olfactif pour les durées les plus longues. Les animaux pourront présenter une légère perte de poids lors de la mise à jeun de 10 heures. En fin d’expérimentation les animaux ressentiront une légère douleur lors de la mesure de glycémie et lors de l’injection de l’anesthésique.
Devenir
Pour les procédures non invasives d’évaluation du comportement, 78 animaux seront ensuite replacés en élevage. Pour 96 animaux, nous réaliserons des euthanasies en fin d’expérimentation afin de réaliser des analyse moléculaires et histologiques sur différents tissus de façon à pourvoir vérifier notre hypothèse.
Remplacement
L’étude du rôle d'hormones sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, système endocrinien, flore intestinale). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (système digestif producteur de ghréline, muscle, cerveau), contexte qu’il n’est pas possible de recréer sans étude in vivo. Des variables sur l’organisme entier seront ainsi mesurées (poids corporel, composition corporelle, concentration d’hormone, comportement…).
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre minimum nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Les calculs ont été effectués avec un logiciel spécialisé. Lors de la production des lots expérimentaux nous utiliserons les individus porteurs de la mutation d'intérêt et comme contrôles, les individus non mutés frères et sœurs. Les 78 animaux utilisés pour l'évaluation du comportement et de l’activité spontanée ne seront pas euthanasiés et retourneront en élevage après les tests.
Raffinement
Pour nos expérimentations, nous avons fixé des points limites basés sur la bibliographie et nous ferons un premier essai de mise au point pour les préciser. Pour habituer les animaux au passage dans le tube d’analyse de composition corporelle, nous mettrons dans les cages un tunnel de plexi rouge. Celui-ci servira à la fois d’enrichissement et de tunnel de transport des animaux. Ce paramètre est particulièrement important lors des tests d’évaluation du comportement des animaux. Ce tunnel sera aussi utilisé lors du change pour le transfert des animaux. Pour l’évaluation de l’activité spontanée, nous avons développé des cages qui permettent d’héberger deux roues d’activités. Les animaux sont alors simplement séparés par une grille qui permet de garder le contact social. Comme développé pour chacun de nos protocoles expérimentaux, nous allons porter une attention particulière au bien-être de nos animaux. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (apathie, vocalise, mobilité, alimentation…). Le report hebdomadaire des poids corporels sera un paramètre intégré à nos protocoles. Lors de l'anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter le risque de refroidissement.
Choix des espèces
L’étude du rôle de la myostatine sur le comportement ne peut être réalisée sur des modèles cellulaires déconnectés des systèmes de communication (système nerveux, musculaire digestifs). Ce projet inclut des procédures sur des modèles murins génétiquement modifiés car il est important ici de préserver le dialogue entre les organes (muscle, cerveau, tube digestif, glandes surrénales). Ce projet est en continuité avec les nombreuses études déjà réalisées sur les souris dont le gène de la myostatine est inactivé. Les procédures concerneront des animaux âgés de 12 à 16 semaines (jeunes adultes). Nous utilisons des souris à l’âge adulte, âge auquel l'hypermusculation des souris myostatine est acquis.
Evaluation préclinique de produits de santé pour l’orthopédie – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 540
Chiens : 240
Chèvres : 330
Moutons : 660
Opérés sous anesthésie générale pendant trente minutes à trois heures pour recevoir un dispositif orthopédique à tester, puis parfois réopérés pour le retirer, 2 100 animaux non-humains vont être utilisés et tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Il s'agit de 660 moutons, 330 chèvres, 240 chiens, 540 lapins, 210 rats et 120 cochons d'Inde, exposés selon le porteur à un risque infectieux, à des hématomes ou des œdèmes pouvant entraîner un déficit sensitif ou moteur des membres postérieurs, dans des études qui peuvent durer plusieurs années. Les essais fournissent les données de tolérance et de performance exigées pour la mise sur le marché de produits de santé orthopédiques, et les tissus prélevés après la mise à mort sont analysés au microscope. L'effectif, indique le porteur, dépend "directement du nombre d'études signées avec les différents donneurs d'ordre".
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en orthopédie . Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en orthopédie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 0h30 et 3h00). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie . Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 00h30 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (nuisance modérée). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours (nuisance légère)- risque infectieux lié à la chirurgie (nuisance modérée à sévère)- hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur (exemple : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs) (Nuisance légère à modérée).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale ). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en orthopédie.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal. Le nombre d’études sur 5 ans est donc estimé à 36 (3 x 12 procédures expérimentales ; pour 660 ovins ; 330 caprins ; 240 chiens ; 540 lapins ; 210 Rats ; 120 cobayes).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques (structure des os, épaisseur du cartilage...), poids, propriétés mécaniques et régénération osseuse des ovins/caprins et des chiens - Caractéristiques anatomiques et mécaniques des lapins, des cobayes et des rats. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) - Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
15 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tuées à l'issue. Immunodéficientes, immunocompétentes ou dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisé, elles reçoivent selon les études des greffes de tumeurs humaines ou murines, des injections répétées de candidats médicaments, des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires, et pour certaines une castration, des prélèvements vaginaux quotidiens ou des séances d'imagerie. Parmi les risques de la chirurgie, le porteur cite le cas où "la souris se réveille en cours de procédure". 1 200 souris sont déclarées réutilisées, et le porteur prévoit que des souris n'ayant subi qu'une partie de la procédure puissent passer dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Il indique enfin qu'aucune approche statistique n'a fixé l'effectif, prévu pour 309 études de 50 souris et estimé d'après les années antérieures, avec une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.
Procédures
[MODIFICATION] Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les administrations de traitements ou de cellules seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour la castration, l’implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera environ 8 minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Concernant la castration, celle-ci durera moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
[MODIFICATION] -Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions, au développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. [MODIFICATION] Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.
Choix des espèces
90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.
Evaluation du potentiel allergique et de sensibilisation de novo de la graine de chanvre in vivo, en comparaison à un allergène fort et un allergène faible chez la souris Balb/cJRj
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris Balb/cJRj vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune est anesthésiée et rasée avant chaque sensibilisation, répétée quatorze jours de suite ou une fois par semaine pendant six semaines selon les protocoles. L'allergène, graine de chanvre, noisette ou épinard, leur est appliqué par un patch posé sur le dos ou après grattage de la peau du ventre, l'étude pilote évaluant l'usage du papier de verre. Trois à dix jours après la dernière sensibilisation, un gavage doit déclencher l'allergie, avec des tremblements, une chute de la température corporelle et des douleurs à l'estomac possibles. Le porteur écrit que ce travail "permettrait de pouvoir prédire ou bien d'avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre".
Objectifs
Les allergies alimentaires sont un problème de santé publique qui connait une augmentation en termes de prévalence et de sévérité ces dernières années. Les allergies sont répandues et ont été classées comme la quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ce projet prend part dans un contexte de transition de régime alimentaire visant à utiliser de nouvelles sources de protéines comme la graine de chanvre. Il est possible de rentrer en contact avec la graine de chanvre par le biais de deux voies majeures : orale et cutanée. La consommation de la graine de chanvre est en plein essor de par son fort intérêt nutritionnel et peut se faire au travers de la farine, de barres énergétiques, de pâtes, de biscuits, de boissons ou encore de yaourts. D’autre part, un contact cutané est possible à travers l’huile ou des crèmes à base de graine de chanvre, utilisées en cosmétiques. La recherche sur les allergies à la graine de chanvre est essentielle, d’une part car les allergènes déjà connus dans les fleurs et le pollen de chanvre peuvent se retrouver dans la graine et d’autre part par la présence de protéines de stockage dans la graine, connues pour leur fort potentiel allergène. Afin de prévenir les possibles allergies qui pourront être liées à la graine de chanvre, il est alors nécessaire d’évaluer son potentiel allergique par rapport à un allergène fort, ici la Noisette ainsi qu’un allergène faible, l’épinard. Dans le cadre de l’allergie, deux manifestations majeures peuvent avoir lieu, i) une sensibilisation de novo, ce qui veut dire devenir allergique à la graine elle-même ou ii) une réaction dite croisée par le biais d’une similarité entre les protéines de la graine de chanvre et d’autres protéines allergènes. La connaissance de la capacité de sensibilisation de novo des protéines est importante pour appréhender et anticiper les risques allergiques futurs. Actuellement, il n'existe aucune connaissance sur la capacité de sensibilisation de novo de la graine de chanvre dans une population générale Non Allergique, malgré l'exposition croissante de la population à la graine de chanvre par le biais des aliments et des cosmétiques. Ce projet sera donc tourné sur le potentiel de sensibilisation de novo de la graine de chanvre.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel allergénique et plus précisément de sensibilisation de novo de la graine de chanvre en comparaison avec un allergène fort, la Noisette connue pour induire des allergies et un allergène faible, l’Epinard qui n’est pas connu pour induire beaucoup d’allergies. Ceci permettrait de pouvoir prédire ou bien d’avoir une indication du niveau de risque encouru par les consommateurs de graine de chanvre ou de produits contenant des graines de chanvre et ainsi de prédire le risque de voir une personne devenir allergique à la graine de chanvre par la suite. De plus, ce projet permettra une compréhension plus approfondie des mécanismes immunologiques associés à une sensibilisation à la graine de chanvre.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées et rasées au préalable de chaque sensibilisation. Les souris seront sensibilisées quotidiennement avec la pose d’un patch, ou 1 fois par semaine pendant 6 semaines avec la pose d’un patch pendant 3 jours ou bien par grattage et application transdermale de l’allergène sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, respectivement 3, 10 ou 7 jours après la dernière sensibilisation. Pour un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’administration (soit environ 10 secondes). Pour les applications épicutanées avec la pose du patch ou transdermale avec le grattage sur l’abdomen, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie soit 15 à 20 minutes environ. Selon la procédure, les souris auront également un prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 6) soit 4 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes. Pour l’étude principale, les mêmes interventions que pour l’une des procédures de l’étude pilote seront réalisées et les temps d’interventions seront donc similaires.
Impact sur les animaux
Lors de ce protocole, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (14 jours consécutifs ou 1x par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch, un inconfort abdominal suite au grattage lors de la sensibilisation transdermale, des symptômes liés à la mise en place de l’allergie provoqués par le gavage oral (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), ainsi que les anesthésies gazeuses répétées. La prise de température par voie rectale peut également entrainer un inconfort pour les souris.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l’allergie et ainsi valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques complexes et en particulier le système immunitaire. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, l’allergie alimentaire est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.
Réduction
Des protocoles d’allergie alimentaire sont régulièrement réalisés au sein du laboratoire, mais aucun protocole utilisant la graine de chanvre ou la Noisette n’a encore été fait. De ce fait, il est impossible de faire un test de puissance. Néanmoins, en se basant sur des tests statistiques et sur la variabilité individuelle lors des anciens protocoles, le nombre de souris pour l’étude principale avec un allergène fort et un allergène faible a été déterminé à 12 souris par groupe soit 48 souris au total par sexe. Cette procédure sera répétée une deuxième fois avec les mêmes 4 groupes de 8 souris par sexe pour s’assurer de la reproductibilité du protocole. Pour l’étude pilote, le nombre de souris a été réduit à 10 par procédure soit 30 souris au total par sexe. Nous anticipons des écarts nets entre les différentes procédures testées, avec des réponses contrastées de type "tout ou rien". Cette amplitude attendue des effets justifie le recours à un effectif réduit, tout en permettant d’identifier le protocole le plus prometteur dès cette première phase. Pour l’étude principale, ce nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place des procédures expérimentales d’analgésie (avec notamment l'injection d'anti-inflammatoire) et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hébergées avec au moins 3 enrichissements (dôme, tube et coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi une étude pilote sera effectuée sur un nombre de souris restreint pour appréhender les méthodes de sensibilisation, l’effet de l’application du patch et l’utilisation du papier de verre et afin d’affiner et de choisir au mieux, le protocole qui sera appliqué par la suite ainsi que pour appréhender la prise en charge de la douleur le cas échéant. Une attention particulière sera portée à la détection précoce des signes de douleur ou de mal-être chez les animaux. Des points limites adaptés ont été définis pour garantir que tout changement significatif d’état de santé d’un animal déclenche une réévaluation. Un arbre décisionnel encadre les actions à mener : surveillance renforcée, tentative de soulagement, puis prise de décision, avec le responsable du bien-être animal et le vétérinaire si l’état de l’animal ne s’améliore pas. En cas de souffrance persistante ou jugée irréversible, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort. Cette approche vise à limiter la souffrance et à respecter les principes éthiques de l’expérimentation animale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée constitue un modèle de choix, reconnue dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette souche. Aujourd'hui, il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent pour le moment reproduire adéquatement. Ainsi, le modèle animal ici est un élément nécessaire pour modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système lors d’une allergie. Les souris auront 3 semaines de vie à la réception et 4 semaines de vie en début de procédure. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.