Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Evaluation de l’effet thérapeutique de la surexpression de la cavéoline-3 dans deux modèles murins de myopathie (Modification)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Deux lignées de souris obtenues par croisements présentent les atteintes musculaires de deux myopathies rares, et la moitié des petits nés de ces croisements n'ont pas le génotype recherché. 691 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester une thérapie génique injectée dans leur première semaine de vie ou après l'apparition des symptômes. Elles passent selon les groupes des courses d'endurance sur tapis, des tests de suspension, des mesures de force des pattes arrière et des examens cardiaques sous anesthésie, ainsi que douze heures d'isolement pour mesurer leur activité spontanée, et le porteur cite "l'angoisse et la douleur durant la course". Les souris testées sont tuées à la fin pour prélever muscles et organes, et les petits sans le génotype recherché le sont aussi, sauf ceux gardés pour renouveler les croisements.
Objectifs
Ce projet s'intéresse à deux maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces myopathies. Le but de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une potentielle thérapie commune pour ces deux maladies. Modification : Dans la première maladie, des atteintes musculaires et cardiaques sont décrites. L’objectif était donc de cibler ces deux types d’organes avec une seule injection de traitement. Cependant, le cœur s’avère beaucoup plus ciblé que les muscles. La modification de projet porte donc sur un changement de voie d’injection. Cette optimisation de délivrance du traitement, s’accompagne également d’une optimisation de la dose à injecter. Enfin, des tests cardiaques légers sont ajoutés pour le groupe qui recevra cette nouvelle stratégie d’injection.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait fournir une preuve de concept commune pour soigner deux myopathies. En outre, cette étude nous permettra de mieux comprendre ces maladies et les acteurs impliqués.
Procédures
Dans ce projet, il y aura 4 groupes d’animaux : les groupes 1 et 3 (Myopathie 1) et les groupes 2 et 4 (Myopathie 2), qui seront soumis à différents tests musculaires et cardiaques. Groupes 1 et 2 : Les animaux recevront la thérapie génique durant la première semaine après la naissance avant l'arrivée des symptômes (prévention de la maladie). Les tests seront réalisés à l’âge attendu d’arrivée des symptômes. Groupe 1 : Les capacités cardiaques seront évaluées par deux tests cardiaques effectués consécutivement au cours de la même anesthésie (30 mins) une fois durant la vie de la souris. Les capacités sportives seront testées une fois par test d’endurance sur tapis de course (moins d’une heure). L’activité spontanée sera également surveillée sur 12h. Groupe 2 : Les capacités sportives seront testées une fois par semaine pendant 1 mois par deux tests de force (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs sous anesthésie générale) durant chacun moins d'une heure. L’activité spontanée sera surveillée sur 12h, une fois durant la vie de la souris. La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin de la caractérisation sous anesthésie générale. Groupes 3 et 4 : Les animaux recevront la thérapie génique après l’apparition du phénotype (réversion de la maladie). Groupe 3 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, mesure de force des membres postérieurs et endurance sur tapis de course) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (activité spontanée et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Groupe 4 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, test de suspension et mesure de force des membres postérieurs) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Modification:Le groupe 3 sera divisé pour améliorer la délivrance du traitement. Les capacités cardiaques seront mesurées deux fois dans la vie de la souris : avant et après traitement. Le groupe 5 recevra des injections, et la force sera évaluée un mois plus tard pour certains animaux.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont le stress dû à l'isolement durant la mesure d'activité spontanée, l'angoisse et la douleur durant la course, ainsi que la douleur lors des injections de traitement ou d'anesthésiants. Il est possible que les animaux ressentent une fatigue physique due aux anesthésies répétées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles et organes nécessaires aux analyses moléculaires, et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies. La moitié des animaux issus des croisements ne possèderont pas les génotypes d'intérêt et seront euthanasiés s'ils ne sont pas nécessaires pour renouveller des croisements.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique d'une thérapie sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisamment proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant peu invasifs, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre et un tube pour permettre la préhension des animaux avec un minimum de stress. En cas de fatigue ou difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Les animaux seront pesés une fois par semaine et observés. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour limiter son stress. Lors des tests sous anesthésie une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Le bien-être global des animaux sera surveillé quotidiennement après injection du traitement pendant une semaine. Pour les nouveau-nés, la poche de lait sera observée, car une diminution de l'alimentation peut indiquer un mal-être, et les animaux seront pesés. Des analgésiques pourront être administrés sur avis du vétérinaire si les animaux montrent des signes de douleur persistante. La zone d'injection du traitement sera surveillée et dès l'apparition de rougeurs, elle sera nettoyée avec une solution antiseptique douce. En cas d'infection importante, l'animal pourra recevoir des antibiotiques ou être euthanasié sur avis vétérinaire.
Choix des espèces
Les deux modèles de souris récapitulent le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et permettent donc d'évaluer correctement l'efficacité des traitements. Les défauts locomoteurs du premier modèle sont établis à 12 semaines après un exercice forcé et le phénotype cardiaque léger peut être détecté à 7 semaines. Pour les souris injectées avec le traitement dans les premiers jours de vie, les tests seront réalisés entre 7 et 12 semaines. Pour les souris injectées à 12 semaines, les tests seront réalisés de 11 à 16 semaines. Le deuxième modèle est plus précoce, bien que toujours léger, les tests seront donc effectués de 6 à 8 semaines ou de 6 à 12 semaines en fonction de l'injection du traitement (en prévention ou après l'apparition des symptômes). Modification : L'étude pilote pour l'optimisation des doses d’injection sera faite sur des animaux de 12 à 20 semaines, pour permettre la réduction du nombre de souris, mais aussi pouvoir comparer les données avec des données standards du modèle.
Etude des mécanismes corticaux d’intégration somatosensori-motrice chez la souris, en contexte normal et pathologique.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à 105 sessions d'enregistrement par animal, une restriction d'accès à l'eau pouvant durer quatre mois, et pour 90 souris l'amputation d'un membre antérieur à l'articulation de l'épaule. 1 993 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 112 d'entre elles étant enregistrées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. 1 881 subissent une chirurgie de 45 à 120 minutes pour fixer une pièce sur le crâne, y poser une fenêtre optique ou une électrode. Le porteur reconnaît que l'amputation entraîne une perte de fonction et un abaissement durable des seuils de douleur, pour un objectif, des prothèses reliées au cerveau dans les deux sens, qu'il place lui-même au rang de promesse.
Objectifs
Le but de ce projet est de comprendre comment, au niveau du système nerveux central, les informations somatosensorielles (toucher, proprioception) sont traitées, mais aussi prises en compte dans la production du mouvement d'un membre, et pour l'appropriation corporelle. Au-delà d'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral, ce projet participe à l'effort pour concevoir des prothèses reliées de façon bidirectionnelle (incluant un retour sensoriel tactile) à des interfaces cerveau-machine. En effet, le développement d'interfaces bidirectionnelles promet de rendre le contrôle des prothèses plus précis et rapide, et d'améliorer leur sensation d'intégration au corps des patients.
Bénéfices attendus
Au-delà d'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral, ce projet participe à l'effort pour concevoir des prothèses reliées de façon bidirectionnelle (incluant un retour sensoriel tactile et ou proprioceptif) à des interfaces cerveau-machine. En effet, le développement d'interfaces bidirectionnelles promet de rendre le contrôle des prothèses plus précis et rapide, et d'améliorer leur sensation d'intégration au corps des patients.
Procédures
Les expériences prévues nécessitent l'enregistrement de l’activité cérébrale de souris. - Enregistrements sous anesthésie générale : une seule intervention, sans réveil, durant quelques heures, sur un maximum de 112 souris. - Chirurgies sous anesthésie pour mettre en place le dispositif d'enregistrement (pièce de fixation, fenêtre optique ou électrode) : durée de 45 à 120 minutes, sur un maximum de 1881 souris (une fois par animal). - Injections systémiques (intraveineuses) sous anesthésie, pour introduire des gènes permettant d’observer ou de modifier l’activité cérébrale : environ 20 minutes, sur 510 souris maximum (une fois par animal). - Injections intracérébrales sous anesthésie, pour cibler l'expression de ces gènes sur des régions précises du cerveau : environ 60 minutes, sur 150 souris maximum (une fois par animal). - Imagerie fonctionnelle sous anesthésie générale pour localiser les régions cérébrales d'intérêt : environ 20 minutes, sur 1881 souris maximum (une fois par animal). - Enregistrements chroniques chez l’animal éveillé et habitué : sessions de 20 à 60 minutes, répétées 5 à 15 fois par souris, sur un maximum de 206 souris. - Enregistrements chroniques chez l’animal éveillé, tête fixée ou en liberté (fibroscopie) : sessions de 20 à 60 minutes, répétées 10 à 105 fois par souris, sur un maximum de 1675 souris. Ces expériences nécessitent un contrôle de l’apport en eau, pouvant durer jusqu’à 4 mois. - Chirurgie d’amputation d’un membre antérieur sous anesthésie : environ 1h30, sur 90 souris (une fois par animal). Les expériences qui suivent pourront durer jusqu’à 3 mois.
Impact sur les animaux
Les souris impliquées dans le projet seront soumises à des procédures susceptibles de s’accompagner d'effets indésirables : Dépression respiratoire ou cardiaque, hypothermie, impact sur le tractus digestif liés à l’anesthésie, réactions inflammatoires ou infectieuses liées à l’implant d’électrodes ou de fenêtres optiques. Certains groupes de souris feront l’objet d’injections de constructions virales non pathogènes dans le sinus rétro-orbitaire réalisées sous anesthésie générale, qui lorsque le geste est maitrisé ne s'accompagne pas de complications. Certaines souris seront impliquées dans des tâches de conditionnement opérant, souvent associées à des enregistrements d’activité neuronale réalisées soit « tête-fixée », soit en comportement libre, mais connectées à un système d’enregistrement par le biais d’un faisceau de fibres optiques flexibles. Les effets indésirables liés à ces expériences sont principalement : Stress lié à la privation hydrique, perte de poids, stress et inconfort lié au maintien par la tête. Certaines souris, dans le cadre du développement de neuroprothèses seront soumises à l'amputation d'un membre antérieur au niveau de l'articulation gléno-humérale (épaule). Cette amputation, bien que réalisée dans des conditions réduisant au maximum le stress et la douleur, constituera une nuisance pour l'animal avec une perte de fonction, et une diminution des seuils de douleur sur le long terme.
Devenir
A la suite de nos expériences nous devons, pour interpréter de manière pertinente les résultats obtenus, prélever le cerveau des animaux et réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Dans le domaine des neurosciences, les alternatives à l’usage de modèles animaux sont les approches in silico, ex vivo, et in vitro. Dans le cadre de notre projet, notre objectif est de comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans le traitement des informations somatosensorielles et leur perception, la motricité et l’apprentissage moteur. Les approches in silico évoluent, diverses initiatives sont menées à l’échelle mondiale pour collecter massivement des données de manière à raffiner les modèles mimant le fonctionnement du système nerveux, en y intégrant notamment la grande diversité des propriétés intrinsèques des neurones qui constituent les réseaux corticaux, mais aussi les spécificités régionales du cortex cérébral en termes de connectivité. Mais les modèles actuels sont encore bien trop simplifiés pour se substituer aux études sur des animaux vivants. Le but de notre étude est justement d’approfondir la compréhension des mécanismes qui régissent l’intégration somatosensori- motrice corticale, pour pouvoir ensuite conduire à une modélisation des processus étudiés.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre d'animaux impliqués dans nos expériences, nous avons adopté une stratégie de multiplication des mesures sur les mêmes animaux. Nous travaillons avec des implantations chroniques d’électrodes et de fenêtres optiques qui permettent de réaliser des mesures chroniques répétées durant de multiples sessions consécutives chez le même animal. Nous associons méthodes d’imagerie, d’analyse du comportement, d’électrophysiologie et d’optogénétique sur le même animal. Cette stratégie nous permet de collecter un grand nombre de données à partir d’un nombre réduit d’animaux.
Raffinement
Nous mettrons en œuvre de nombreuses mesures visant à assurer le bien-être des animaux impliqués dans notre projet. Cela commence par l’utilisation d’une anesthésie et analgésie adaptés à chaque type d’intervention. A l’issue des procédures chirurgicales, les animaux seront placés dans une enceinte chauffée dédiée au réveil et la surveillance post-opératoire afin de minimiser leur stress. Une fois complètement réveillés, ils seront réintroduits dans leur cage habituelle pour éviter qu’ils ne se sentent isolés. Un suivi quotidien consciencieux sera mis en place pour observer leur poids, leur état de santé général, leurs expressions faciales et leur comportement, pendant plusieurs jours après l’intervention. En dehors de la phase post-opératoire, nous habituerons les animaux à l’environnement des sessions d’enregistrement pour limiter leur stress. Lorsque les animaux seront soumis à une restriction d’accès à l’eau dans le cadre d’un apprentissage comportemental, leur poids et leur apparence seront contrôlés quotidiennement pour garantir leur bien-être. Par exemple, en cas de perte de poids trop importante, un complément en eau leur sera accordé. Une grille d’évaluation du bien-être animal sera utilisée pour définir les seuils d'intervention spécifiques à chaque individu. En cas de signes de douleur, un traitement approprié sera administré. Enfin, dans ce projet, nous veillons à ce que les animaux soient logés en groupe dans des cages spacieuses, enrichies, et adaptées à leurs besoins comportementaux et physiologiques. Ces mesures sont essentielles pour assurer le bien-être des animaux dans nos expériences et diminuer la variabilité de nos résultats.
Choix des espèces
Le cortex cérébral de la souris est doté d’une structure laminaire, comparable à celle des primates tout en étant dépourvu de circonvolutions. Il offre un accès direct privilégié aux aires sensorimotrices, y compris un accès optique. C’est un atout très précieux à l’heure où les méthodes optiques sont devenues des outils incontournables pour enregistrer et contrôler l’activité d’assemblées de neurones. En outre, la souris est un modèle privilégié pour l'étude du système somatosensoriel, grâce à la masse de connaissances acquises concernant le système des vibrisses, auxquelles correspondent des structures bien définies au niveau du cortex somatosensoriel primaire. Le laboratoire maîtrise très bien ce modèle, un facteur important pour la réussite des expériences envisagées et pour la minimisation du nombre d'animaux impliqués dans les expériences. Également, le modèle souris bénéficie d'outils optogénétiques particulièrement performants, qui sont facilement mis en œuvre grâce à la commercialisation de nombreuses lignées transgéniques dédiées. La grande majorité de nos expériences seront réalisées sur des souris adultes (> 8 semaines), car nous souhaitons étudier les principes de fonctionnement des circuits somatosensori-moteurs corticaux, au sein d’un système nerveux bien développé et établi. Les animaux adultes sont plus faciles à entraîner à des tâches comportementales où les courbes de poids sont utilisées pour gérer la restriction hydrique des animaux. Cela facilite la mise en œuvre de nos expériences, et l’adoption de protocoles longitudinaux impliquant la collecte répétée de données chez un même animal.
Role de la protéine TRIM47 dans l’unité neuro-vasculaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Deux heures de chirurgie sous anesthésie pour implanter un dispositif d'observation du cerveau, puis un mois de traitement quotidien, deux séances d'imagerie et deux semaines de tests d'apprentissage, de mémoire et d'orientation spatiale à raison de vingt minutes par jour. 666 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que les modèles transgéniques employés ne présentent aucun effet indésirable connu sur le bien-être des animaux non-humains, alors que les mêmes souris privées du gène Trim47 présentent, selon la partie scientifique du texte, des troubles cognitifs et une perméabilité accrue de la barrière hémato-encéphalique. Toutes sont mises à mort en fin d'expérimentation pour prélever leur sang et leurs tissus.
Objectifs
La démence vasculaire est responsable de 45% des déclins cognitifs et de 25 % des AVC. L’une des premières causes de démence est la maladie des petits vaisseaux cérébraux (MPV) entrainant des lésions cérébrales et in fine des déficits cognitifs, des troubles de l’humeur et moteurs chez l’homme. Des études d’associations pangénomiques réalisées sur des cohortes de patients atteints de la MPV ont identifié de nouveaux déterminants génétiques potentiellement causatifs du développement de cette pathologie. Ainsi, une étude du laboratoire a permis d’identifier la protéine TRIM47 comme un nouvel acteur de la MPV. Les souris dans lesquelles le gène Trim47 a été désactivé pour étudier sa fonction présentent des troubles cognitifs, associés à une augmentation de la perméabilité de la barrière hémato- encéphalique (BHE) dues à diminution de la voie antioxydante. Ces travaux suggèrent que le ciblage de la voie de signalisation TRIM47 pourrait être une stratégie prometteuse pour la prévention ou le traitement de la MPV et des démences vasculaires. L’objectif scientifique du projet est ainsi étudier le potentiel thérapeutique de 2 interventions activant la voie antioxydante sur les fonctions cognitives, la perméabilité de la BHE et le couplage neurovasculaire dans notre modèle de souris Trim47 mutantes. Deux stratégies thérapeutiques seront testées : un traitement pharmacologique et une stratégie utilisant un oligoantisens.
Bénéfices attendus
Cette étude fournira le premier examen complet de la corrélation entre fonction neuronale et de la fonction vasculaire sur animaux vigiles présentant des troubles de comportement / maladies vasculaires. A terme, ce projet vise à accélérer le développement de nouvelles thérapies pour améliorer la prise en charge des troubles cognitifs chez les patients atteints de démences vasculaires.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie (2h), 2 injections sous anesthésie (2 x 5 minutes), 2 séances d’imagerie (2x15 minutes). Traitement avec molécule (1 fois par jour sur un mois, durée totale 60 minutes) ou injection de molécule sous (2 x 5 minutes). Tests de comportements : 20 minutes/jour sur 2 semaines (3h d’intersession minimum) pour évaluer les fonctions cognitives des animaux telles que l’apprentissage, la mémoire, la capacité à s’orienter dans l’espace ou la prise de décision.
Impact sur les animaux
Les modèles transgéniques utilisés dans cette étude sont bien caractérisés et ne présentent aucun effet indésirable connu sur le bien-être des animaux. Modèle d’hypertension modéré et de courte durée : aucune nuisance attendue. Pour la chirurgie d'implantation, les nuisances/effets indésirables attendus sont : inflammation durant la première semaine ainsi qu’’une douleur post chirurgical possible et un inconfort. Pour les tests de comportement et l’imagerie sur animal vigil, un léger stress dû à la manipulation ou au changement d’environnement et un inconfort dans les premières séances d’imagerie sont attendus.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce protocole sont euthanasiés en fin d'expérimentation pour des prélèvements de sang et de tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale capable de reproduire fidèlement le fonctionnement du cerveau, notamment les interactions entre l’activité des neurones et la circulation sanguine (couplage neruovasculaire). Ces mécanismes complexes impliquent de nombreux types de cellules qui doivent être organisés de manière très précise, ce qui n’est pas possible dans des systèmes simplifiés comme des modèles de cultures cellulaires. Les fonctions cognitives (mémoire, apprentissage…) dépendent de réseaux de neurones répartis dans tout le cerveau, qu’on ne peut pas recréer en dehors d’un organisme vivant. Les modèles animaux restent aujourd’hui indispensables pour mieux comprendre ces phénomènes et l’impact de nouvelles molécules sur ces processus.
Réduction
L’utilisation d’imagerie longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux puisque ceux-ci ne sont pas euthanasiés à chaque temps d’étude. Chaque animal étant son propre contrôle de façon longitudinale permet de réduire les différences inter-individuelles et de réduire le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Des jouets/tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. La mise en place de points limites permet d'assurer une surveillance rigoureuse de l’état de santé des animaux par le personnel et d’interrompre l’expérience si nécessaire (l’expérimentateur est alerté).
Choix des espèces
La souris est à ce jour la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles d'études de maladies humaines. En outre, c’est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale des barrières hématoencéphaliques et du réseau vasculaire présentent de fortes ressemblances avec l'homme. Les modèles de modification de flux sanguin ont été développés et validés pour cette espèce et montrent leur pertinence pour créer des altérations cognitives et des altérations du tissus neuronal. Nous utiliserons des souris adultes de 4 mois, ayant un réseau vasculaire mature dans les organes notamment le cerveau. Pour l’implantation des lentilles, des souris adultes âgées de 3 mois d'un poids autour de 24-29g seront inclues.
Réalisation d’un atlas anatomique de l’utérus et du fœtus ovins en cours de gestation par imagerie
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Construire un outil de réalité virtuelle pour former les inséminateurs suppose ici d'imager l'utérus de brebis gestantes. 10 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes retourneront à l'élevage pour mettre bas puis entrer dans de nouveaux protocoles. À quatre reprises, aux 30e, 50e, 90e et 120e jours de gestation, chacune subit une échographie sur animal vigile puis une anesthésie générale avec intubation orotrachéale pour cinquante minutes d'IRM. Le porteur reconnaît ne disposer d'aucune référence sur l'effet de quatre anesthésies répétées sur le développement du fœtus, et évoque un retard de croissance possible ainsi qu'une inflammation de la trachée des brebis.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un programme sur le thème de la reproduction ovine et plus précisément de l’insémination artificielle. L’insémination artificielle (IA) chez les ovins consiste à déposer la semence d’un bélier dans le vagin d’une brebis, à l’entrée du col de l’utérus (cervix). Ce geste, appelé IA cervicale, nécessite une bonne connaissance de l’anatomie du tractus génital ovin (vagin, cervix, utérus), et est réalisé par des inséminateurs agréés, formés (théorie et pratique) sur animaux vigiles. Nous souhaitons développer un outil de réalité virtuelle de l’anatomie de la brebis basé sur l’inclusion d’images échographiques de brebis dans un outil existant, qui permettra de proposer une formation pratique virtuelle à l’insémination avant la mise en pratique sur animaux vivants.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’obtenir des données anatomiques de référence sur la morphologie du tractus génital et du fœtus au cours de la gestation chez la brebis. L’imagerie IRM du fœtus au cours du développement permettra de constituer une banque de données de référence sur le développement du fœtus (dimensions, orientation, impact de la gemellité). Le projet réalisera des images en simultané par échographie et IRM à différentes étapes du développement. Cela permettra d’évaluer par IRM l’efficacité de l’échographie pour les diagnostics de gestation, le dénombrement des fœtus (simples, jumeaux, triplés) et éventuellement mesurer des paramètres de normalité du développement (taille du crâne par exemple). L’outil permettra aux éleveurs d’anticiper le nombre d’agneaux à naitre et d’améliorer les conditions d’élevage. Toutes les données seront incluses dans un modèle virtuel de développement fœtal ovin. Un outil virtuel du tractus génital de brebis sera développé à l’aide d’un casque de réalité virtuelle. Cet outil sera utilisé par différentes organisations : - universitaires : les universités et écoles vétérinaires pourront former les étudiants à l’anatomie de la brebis sans utiliser d’animaux, former les vétérinaires à des gestes opératoires sur un modèle virtuel avant de pratiquer sur animaux vivants. Cette méthodologie de création d’outils virtuels d’insémination / opération / traitement thérapeutique pourra ensuite être appliquée à d’autres espèces. - professionnelles : les structures de formation des inséminateurs pourront former les inséminateurs à l’IA cervicale et intra-utérine sur un modèle virtuel avant de pratiquer sur animaux.
Procédures
A quatre reprises au cours du protocole (30ème, 50ème, 90ème et 120ème jour de gestation), les animaux seront soumis à une échographie de l’utérus en étant vigile (5 min) puis à une anesthésie générale suivie par une acquisition IRM pour imager le tractus génital et le fœtus (50 min).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation pour chaque anesthésie et échographie, ainsi que pendant le transport de l’élevage vers la plateforme (et le retour). Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse. Nous ne disposons pas de références sur l'effet que les 4 anesthésies répétées pourraient avoir sur le développement du foetus. Un retard de développement pourrait être une conséquence. Les intubations orotrachéales répétées à 30 jours d'intervalle peuvent entraîner une inflammation de la trachée des brebis.
Devenir
Toutes les brebis retourneront à l'élevage pour achever leur gestation, mettre bas, et entrer dans de nouveaux protocoles.
Remplacement
Le développement fœtal est un processus complexe qui ne peut pas, à ce jour, être remplacé par des modèles in vitro.
Réduction
La morphologie du tractus génital et du fœtus ovin varie entre individus. De plus, les gestations sont simples, jumellaires ou, plus rarement, triples. Pour avoir a minima 3 animaux par condition, nous avons retenu un nombre de 10 brebis pour tenir compte de cette variabilité.
Raffinement
L’IRM est un outil de choix pour investiguer de façon précise et non invasive des questions au niveau de l’organe ou du tractus entier. Les animaux expérimentaux feront l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de l’anesthésie pour l’imagerie. Pendant toute la durée de l’expérimentation, ils seront maintenus en groupe au sein d'un environnement social stable, dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Ils seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec abreuvement adlibitum. Le protocole d'anesthésie sera adapté afin de s'adapter au statut gestant des brebis, et de limiter au maximum les effets potentiels sur le foetus. Prémédication et induction par injection, Intubation orotrachéale puis inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène 100%, et maintien de l'anesthésie par perfusion pendant l’imagerie. Les animaux seront perfusés avec du glucose pendant la durée d'acquisition à l'iRM. Ils seront maintenus sous oxygène à la fin de l’anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.
Choix des espèces
Le modèle ovin est retenu comme modèle animal de gestation multiple et pour des raisons agronomiques (diagnostic de gestation). Les brebis seront adultes et gestantes pour étudier le développement fœtal.
Effets sublétaux des produits phytosanitaires sur les passereaux dans les villages au sein d’une zone atelier : apport de l’agriculture biologique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Capturés au filet dans 80 jardins répartis sur huit villages, maintenus moins de cinq minutes en main pour une prise de sang, un écouvillonnage cloacal et des mesures, puis bagués et relâchés sur place, 8 640 passereaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole porte sur douze espèces, dont la mésange charbonnière, le moineau domestique, le rouge-gorge familier et le rossignol philomèle, et compare la contamination par les pesticides entre jardins entourés d'agriculture conventionnelle et jardins en agriculture biologique. L'effectif se déduit d'un plan d'échantillonnage à trois individus par sexe, par âge, par espèce et par jardin, étalé sur quatre ans. Chaque oiseau ne subit la procédure qu'une fois, et les individus recapturés sont relâchés sans nouvelle manipulation.
Objectifs
Depuis plusieurs décennies, l’utilisation massive et croissante de pesticides de synthèse dans l’agriculture conventionnelle a permis une augmentation considérable des rendements agricoles mais elle a également eu des effets sur la biodiversité et notamment sur les populations d’oiseaux, même si la magnitude de ceux-ci reste l’objet de controverses. La conversion à l’Agriculture Biologique, dans le cadre de la politique agricole commune et soutenue par l’État français, permet de proposer un ensemble de mesures permettant la restauration des écosystèmes agricoles et ainsi de promouvoir la biodiversité. A ce jour, beaucoup d’études se sont intéressées à la comparaison entre l’agriculture conventionnelle et biologique avec pour résultats principaux que les densités et abondances des espèces et des individus sont plus importantes dans les paysages en agriculture biologique. En revanche, un effet positif sur la dynamique des populations évoluant en agriculture biologique, reste encore à démontrer, d’autant qu’identifier les processus et mécanismes impliqués reste aussi à l’ordre du jour. Une des hypothèses principales serait que l’absence d’utilisation de produits phytosanitaires en agriculture biologique améliorerait la santé des individus. L’objectif de ce projet est d’apporter des connaissances cruciales au regard de la contamination et des effets sublétaux (c'est à dire des effets n’entraînant pas directement la mort de l'individu mais une dégradation de son état de santé général) de l’agriculture conventionnelle par rapport à l'agriculture biologique, sur 12 espèces de passereaux nichant dans 80 jardins de 8 villages (10 jardins par village) au sein d’un agrosystème, en comparant en conditions naturelles le taux de contamination des oiseaux par les pesticides ainsi que plusieurs marqueurs de leur « santé ». Ces 8 villages seront choisis selon un double gradient de pression en pesticide. Le premier gradient sera obtenu en choisissant des villages qui sont plus ou moins entourés d’agriculture biologique. Le second gradient sera obtenu en fonction de l’éloignement du jardin à la plus proche parcelle en agriculture conventionnelle.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal attendu de ce projet sera de comprendre comment l’agriculture biologique peut être un levier pour préserver la biodiversité aviaire en diminuant l’exposition aux pesticides des individus et de savoir/comprendre/déterminer si l’état de santé des oiseaux et de leurs populations s’améliore par rapport à des paysages dominés par l’agriculture conventionnelle.
Procédures
Les individus seront capturés dans la nature et un prélèvement de sang, de fiente et un écouvillonnage seront réalisés. Le temps de manipulation ne durera pas plus de 5 minutes.
Impact sur les animaux
1) Tout d’abord, il y aura un stress léger lié à la capture. En effet, la capture par des filets maillants est la procédure habituelle pour capturer des passereaux et n’engendre pas de traumatisme ni de mortalité quand elle est réalisée dans des conditions météorologiques favorables. 2) Il y aura ensuite un stress léger lié à la contention des oiseaux pendant les mesures (mesures de comportement, mesures morphométriques, mesure du parasitisme) qui durera moins de 5 minutes. 3) Il pourra y avoir une gêne légère et passagère lors du prélèvement cloacal et lors de la prise de quelques microlitres de sang avec effraction. Chacun de ces gestes (écouvillon et sang) durera moins d'une minute (compris dans les 5 minutes).
Devenir
Tous les individus seront bagués et relachés sur le site de capture après les manipulations et chaque individu ne subira qu'une seule fois la procédure. Si un individu est recapturé, il sera relaché.
Remplacement
S’agissant de suivi populationnel pour comprendre des mécanismes complexes en milieu naturel, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de remplacer les animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'individus est réduit à son maximum et est celui qui permettra de réaliser des analyses statistiques avec une puissance suffisante pour détecter des effets sublétaux. Notre projet se focalisera sur 12 espèces différentes afin de pouvoir relier l'écologie de l'espèce à l'exposition aux pesticides, il faut un nombre suffisant d'individus capturés dans les différents villages et jardins. L’étude sera réalisée sur 3 individus par sexe (mâle versus femelle), âge (adulte versus jeunes volants de l’année), espèce (12 espèces) et jardin (10 jardins). Au total, des prélèvements et des mesures seront réalisés sur 8640 oiseaux sur les 4 ans du projet au maximum.
Raffinement
L’ensemble des manipulations est réalisé dans le respect de l’animal aussi bien pour les adultes que les jeunes à l'envol. Les manipulations sont faites de façon à minimiser le stress, dans un temps limité et toujours à proximité du site de capture. Les oiseaux seront relâchés sur le site précis de capture. Les expérimentations sont réalisées avec des conditions météorologiques optimales (température supérieure à 10°C, absence de pluie et de vent) afin de minimiser le stress et l'impact de la manipulation. Les manipulations seront réalisées par des personnes expérimentées uniquement et des points limites stricts ont été déterminés préalablement afin de préserver le bien-être de l'animal pendant la durée de la capture. Les manipulations seront réalisées dans le respect du protocole sanitaire. Le matériel de prélèvement sera stérile et à usage unique. En cas de stress marqué, l'expérience sera immédiatement arrêtée et l'animal sera isolé dans son sac jusqu'à retour au calme avant d’être relâché. Les individus recapturés sur deux années différentes rentreront dans deux procédures différentes. Les sacs seront nettoyés entre chaque session.
Choix des espèces
Les passereaux sont un modèle parfaitement adapté à notre questionnement puisque pendant la période de reproduction, ils restent à proximité de la haie et du jardin où ils nidifient (dans un rayon de 150 mètres pour la plupart des espèces) nous permettant ainsi d'être certains que les individus seront confrontés à une exposition aux pesticides en agriculture conventionnelle ou en absence de pesticides pour les jardins entourés d'agriculture biologique. Les différentes espèces de notre projet seront les plus abondantes dans notre site d’étude afin de disposer d'un échantillon statistique suffisant et ce seront les espèces les plus grosses nous permettant de pouvoir prendre un échantillon de sang sans dommage. Nous travaillerons sur 12 espèces : l'accenteur mouchet, le bruant zizi, la fauvette à tête noire, la fauvette grisette, l'hypolaïs polyglotte, le merle noir, la mésange charbonnière, la mésange bleue, le moineau domestique, le pinson des arbres, le rossignol philomèle et le rouge-gorge familier. Les études seront faites sur les adultes et sur les jeunes volants (c'est à dire les individus ayant quitté les nids et qui seront donc déjà autonomes au même titre que les adultes)
Impact des microplastiques alimentaires sur la réponse inflammatoire intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles boivent pendant 78 jours une eau chargée en microplastiques, et la moitié d'entre elles reçoit en plus un agent chimique qui déclenche une colite, quatre fois cinq jours à quinze jours d'intervalle, avec douleurs, saignements rectaux et perte de poids. Le dernier jour, 180 souris subissent une coloscopie sous anesthésie, puis toutes reçoivent une ponction de sang dans le cœur avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le porteur écrit que ce traitement est "sévère mais nécessaire" pour étudier les mécanismes de l'inflammation intestinale, et annonce qu'il baissera la dose au cycle suivant si elle s'avère trop forte.
Objectifs
Les microplastiques sont de minuscules particules, environ 70 fois plus fines qu’un cheveu, que l’on retrouve sous diverses formes (fragments, fibres, films, billes…) et compositions chimiques. Présents partout dans l’environnement, ils s’accumulent dans tous les écosystèmes, entraînant une ingestion involontaire par l’Homme évaluée à environ 52 000 particules par an. Notre projet vise à comprendre comment les microplastiques ingérés affectent le système immunitaire et l’inflammation intestinale. Nous évaluerons leur capacité à induire une inflammation intestinale, seuls ou en combinaison, dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce travail permettront de mieux comprendre par quels mécanismes, les microplastiques affectent la santé de l’intestin et dans quelle mesure ces derniers sont responsables de l’aggravation de l’inflammation de l’intestin. Les résultats nous permettront aussi de déterminer si certains microplastiques sont plus néfastes que d’autres. De tels résultats sont indispensables pour comprendre comment la pollution environnementale influence notre santé digestive et pour proposer de nouvelles approches thérapeutiques aux patients chroniques afin de freiner la progression de la maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Ce projet comporte 4 interventions : (1) L’administration des microplastiques via l’eau de boisson dans les biberons, pendant toute la durée du projet (78 jours) sur 320 animaux (tous sauf les contrôles), (2) le traitement pro-inflammatoire pour induire l’inflammation intestinale sera réalisé sur la moitié des animaux (200) avec un agent chimique administré dans l’eau de boisson 4 fois, à raison de 5 jours tous les 15 jours. (3) La coloscopie, examen de quelques minutes (10 maximum), sera réalisé sur 180 animaux le dernier jour du protocole sous anesthésie générale. (4) Un prélèvement de sang intracardiaque (3 minutes) sera réalisé sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’administration des microplastiques via l’eau de boisson ne devrait pas induire de nuisance pour les animaux et ne pas provoquer de perturbation au niveau de la faim et de la soif des animaux. Le traitement pro-inflammatoire (200 animaux) induit des inconforts, de la douleur, une perte de poids liée à une diminution de la prise alimentaire et/ou des saignements rectaux. Ce traitement est sévère mais nécessaire pour étudier les mécanismes de l’inflammation intestinale. Ce modèle est maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps et le protocole proposé a été validé dans un projet précédent. Nous savons repérer les symptômes rapidement afin de limiter la souffrance des animaux. La coloscopie (180 animaux) et le prélèvement sanguin intracardiaque (tous les animaux) seront réalisés sous anesthésie générale suivis immédiatement de la mise à mort par d’une dislocation cervicale. Il n’est pas attendu d’effets indésirables de ces interventions pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la dernière intervention afin de récupérer les différents organes.
Remplacement
La toxicité des microplastiques a été étudiée in vitro sur des modèles de cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Néanmoins, ces modèles in vitro ne permettent pas, actuellement de reproduire entièrement le processus d’inflammation intestinale. En effet, la complexité de la physiologie intestinale implique plusieurs systèmes cellulaires distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant tous les organes liés ou non au tube digestif dont les ganglions lymphatiques et la rate. Ainsi, aucun modèle in vitro ne peut actuellement se substituer aux modèles animaux pour étudier de manière fiable et intégrée les mécanismes sous-jacents à notre question de recherche.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre de souris par groupe, à savoir 40 souris par groupes réparties dans 10 groupes, soit un total de 400 souris, pour obtenir la puissance statistique suffisante pour toutes les analyses prévues, conformément aux exigences éthiques en expérimentation animale. Sur la base des données issues de la littérature scientifique et de nos données précédentes, les test statistiques réalisés ont donné un nombre d'animaux à 40 par groupe afin d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour réaliser à la fois les analyses in vivo (colite expérimentale, endoscopie rectale) et post mortem (profil immunitaire par cytométrie en flux, analyses transcriptomiques, microbiote intestinal, histologie, dosages biologiques) aux deux points finaux prévus dans le projet. Les expériences ont été conçues afin de réaliser un maximum d’analyses différentes compatibles sur les mêmes animaux afin d'en réduire le nombre tout en ayant suffisamment de matériel pour réaliser les différentes analyses. Cette approche intégrée vise à maximiser les données obtenues par individu et à limiter au strict minimum le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec à disposition des copeaux de bois, des cabanes en métal pour se cacher et grimper, et des buchettes de bois pour usure des dents. Pour éviter toute source extérieure de contamination en plastique, les enrichissement en carton et plastiques ne seront pas utilisés. Les coloscopies et prélèvements intracardiaques se feront sous anesthésie générale (isoflurane 4% à l’induction puis réduite à 2% en maintien), sans réveil. Une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place en amont. Pendant la colite, l’activité de la maladie sera scorée quotidiennement. De plus, les animaux seront surveillés deux fois par jour pour détecter des signes éventuels de mal-être (prostration/mouvements, yeux fermés/grimace, dos voûté, aspect du pelage, déshydratation). Le point limite est fixé selon ce score et les signes éventuels de mal-être (Annexe 3). A la fin de ce protocole, les animaux seront mis à mort et les organes prélevés permettront des analyses biologiques. Le modèle de colite expérimentale est un modèle maîtrisé par le laboratoire depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement pro-inflammatoire est aussi très dépendante de l’environnement (microbiote intestinal). Si la dose s’avère trop sévère au premier cycle, elle sera réduite pour les cycles suivants. Grâce à notre expertise, nous sommes en mesure de repérer très rapidement les signes cliniques de la maladie afin d’intervenir sans délai et de limiter au maximum la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin. Le modèle d’inflammation par agent chimique est très largement utilisé en raison de sa simplicité d'administration (dans l'eau de boisson), de la facilité de contrôle du dosage (pour déterminer la gravité) et de la durée courte d’analyse du processus inflammatoire et de « récupération ». En matière d’étude préclinique, ce modèle reste le modèle de choix couramment décrit dans la littérature. Les souris utilisées auront 8 à 9 semaines. Le projet démarrera après deux semaines d’acclimatation. Ce stade correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au passage au stade « Jeune Adulte», ce qui correspond aux besoins du projet, les patients étant majoritairement de jeunes adultes.
Réalisation de biopsies d’oreilles pour le génotypage chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
L'extrémité de l'oreille est coupée sur chaque animal au sevrage, entre trois et quatre semaines, en même temps que la pose d'une puce électronique. 10 000 souris vont être soumises à ce prélèvement dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes seront gardées en vie pour être utilisées dans d'autres expériences. Le porteur présente l'opération comme un gain pour les souris elles-mêmes, puisqu'elle évite les contentions répétées qu'imposait le génotypage sur poils. Il invoque dans le même paragraphe les gestes posturaux du personnel et le coût économique et écologique du doublement des analyses moléculaires.
Objectifs
L’animalerie réalise l’identification des lignées de souris par l’injection d’une puce électronique nécessaire au suivi des animaux et aux expérimentations. Un échantillon au niveau de l’oreille est prélevé sur l’animal afin de procéder au génotypage. En effet, le génotypage sur poils n’a pas permis de donner des résultats robustes et fiables, notamment pour des triples lignées à génotyper, ainsi que pour des gènes situés dans des parties condensées du génome moins accessibles. De plus l’utilisation de la méthode de génotypage sur bulbes pileux engendrent également des contaminations éventuelles qui n’est pas observé pour des biopsies d’oreilles. Cela entraîne de devoir reprélever parfois plusieurs fois les animaux, ce qui va à l’encontre du principe de raffinement (nouvelle contention des souris), des gestes posturaux répétés pour le personnel, et le doublement des techniques moléculaires de génotypage ayant un coût économique et écologique notamment. Le nombre total d’animaux dans ces expériences sera de 10000 souris.
Bénéfices attendus
Nous réduirons le stress des souris en leur évitant de multiples contentions et prélèvement de poils.
Procédures
Une biopsie de l’extrémité de l’oreille sera prélevée à 3-4 semaines pour le génotypage de tous les animaux. La durée du prélèvement est de maximum 10 secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de l’oreille afin de pouvoir réaliser le génotypage de façon robuste entraîne un léger stress lors de la contention et une douleur légère de courte durée .
Devenir
La totalité des animaux parentaux seront gardés en vie à l’issu de cette procédure pour des fins expérimentales
Remplacement
Le prélèvement de poils ou de biopsie d’oreilles ne peut être remplacé pour génotyper les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum, puisque certains accouplements issus d’accouplements homozygotes ne seront pas prélevés.
Raffinement
Le milieu est enrichi avec entre autres, une cabane en carton et des frisotis en papier kraft pour optimiser le maintien de leur chaleur corporel et de leur bien-être. Les animaux seront habitués au contact du personnel, et les prélèvements sont les plus brefs possibles. Au sevrage, des bouchons d’aliments seront placés directement dans la cage pour favoriser la prise alimentaire des jeunes sevrés. Des points limites ont été mis en place pour limiter la douleur pour chaque procédure et seront appliqués.
Choix des espèces
Les biotechnologies de création de lignées transgéniques sont très développées chez la souris et permettent d'obtenir des modèles rapidement et à moindre couts. De plus, la souris se reproduit vite et exprime divers comportements publiés dans de nombreux articles scientifiques depuis très longtemps ce qui permet l'étude de mécanismes de la reproduction et des comportements qui sont les thèmes principaux de recherche abordés par les utilisateurs. Tous les animaux auront donc une biopsie de l’extrémité de l’oreille qui est peu innervée et irriguée à 3-4 semaines au moment du sevrage qui est réalisée en même temps que le puçage des animaux. Le stade choisi permet d'exercer une seule contention brève pour le puçage et le génotypage.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la cytokine IL-34 humaine dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques chez la souris NSG humanisée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel par construction génétique, les souris NSG utilisées ici reçoivent des cellules humaines qu'elles ne peuvent pas rejeter. 280 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Irradiation sur animal vigile, injection intraveineuse de cellules humaines, prélèvements sanguins derrière l'orbite de l'œil toutes les deux semaines, instillation intra-rectale d'un mélange de produits, pose de mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale, le suivi courant de la cinquième à la vingtième semaine de vie. Le porteur conclut que le passage à ces animaux dits humanisés est "indispensable" pour évaluer une molécule dont les essais sur cellules humaines ont déjà donné, selon lui, des résultats prometteurs.
Objectifs
L'objectif est d’étudier l’effet thérapeutique d’une molécule régulatrice afin d'approfondir notre compréhension des mécanismes d’action de cette molécule sous sa forme native et de les comparer à des formes modifiées dans des modèles de maladies inflammatoires, dont la composante immunitaire est bien décrite. Ce projet fait suite à de précédents travaux au sein de notre équipe et vise ici à tester la meilleure molécule modifiée et ses versions améliorées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule humaine dans de nouveaux modèles de maladies inflammatoires, ainsi que de confirmer les résultats obtenus précédemment par l’équipe en testant notre molécule modifiée favorite ainsi que ses formes améliorées et optimisées pour une possible utilisation en clinique.
Procédures
Irradiation des souris vigiles (1 fois, 3 minutes/souris) ; Injection des cellules humaines par voie intraveineuse sur souris vigiles (1 fois, 5 minutes/souris) ; Prélèvements sanguins des souris sous anesthésie gazeuse (2 fois les 3-4 premiers mois puis tous les deux semaines, 5 minutes/souris) ; Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes/souris) ; Injection des traitements en intraveineuse (1 fois, 5 minutes/souris) ou en intra-péritonéale (1 fois/jour pendant 10 jours, 2 minutes/souris) sur souris vigiles ; Mise en place des mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. À l'injection de cellules humaines (douleur) ; 2. A l’injection intra-rectale d’un mélange de produits (douleur) ; 3. Intervention chirurgicale pour la mise en place de mini-pompes sous la peau (douleur, saignement) 4. Injection des traitements en intraveineuse ou intra-péritonéale ; 5. Au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l'œil (douleur, saignement). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) et/ou analgésie (pré et post-opératoire pour les mini-pompes) pour pallier aux différentes douleurs rencontrées par les animaux, même si elles peuvent néanmoins conduire à une douleur légère et de courte durée, ainsi qu'à un stress.
Devenir
A la fin de l’expérience, tous les animaux seront autopsiés afin d’effectuer des prélèvements d’organes/tissus ce qui justifie l’euthanasie de chaque souris.
Remplacement
Malgré des résultats prometteurs dans les études fonctionnelles in vitro de la molécule native et des molécules modifiées sur cellules humaines, ceux-ci sont limités par l'absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire. Le passage aux modèles in vivo chez des animaux dit « humanisés » (proche de l’homme, car mimant le système immunitaire humain) est indispensable pour évaluer l’effet de cette molécule humaine et de ces nouvelles formes modifiées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimum d’animaux sera utilisé et analysé par le biais de tests statistiques, permettant d’obtenir des résultats robustes et significatifs. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 280 animaux répartis sur 3 protocoles différents. Si nous n’observons pas d’effet in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des souris ne sera donc pas utilisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux maximum et auront des formes d’enrichissements à leur disposition (Sizzle nest, tube, dôme) afin de réduire leur stress. Dans tous les protocoles mis en œuvre, les interventions invasives et les interventions chirurgicales plus longues seront effectuées sous anesthésie gazeuse et analgésie ou sous anesthésie générale associée à une analgésie pré et post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement dès le début du protocole, au niveau du poids et de l’apparition de signes cliniques. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués en cas de souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d’étudier une molécule humaine dans une perspective thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal capable d’accueillir des cellules humaines. Nous avons choisi la souris car certaines lignées particulières n’ont pas de système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines sans qu’elles soient rejetées. La souris est également un animal couramment utilisé en recherche, car elle se reproduit facilement, son hébergement est bien maîtrisé et sa manipulation est relativement simple. Les souris recevront les cellules humaines lorsqu’elles auront 4 à 5 semaines, un âge où elles sont assez robustes pour supporter la procédure. Elles seront ensuite suivies jusqu’à environ 16 à 20 semaines, âge auquel leur croissance est terminée et leur poids est stable. Cela facilite les manipulations, comme l’injection des traitements ou les prélèvements d’échantillons, tout en assurant un suivi attentif de leur bien-être.
Etude du rôle de l’IL10 dans l’augmentation des NK après traitement par anti VEGFR2 chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une greffe de cellules tumorales puis une injection de traitement, chacune d'une minute, résument à elles seules les procédures décrites pour 60 souris. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue. La tumeur ainsi implantée peut réduire leur mobilité et leur capacité à se nourrir, et provoquer des nécroses cutanées que le porteur qualifie de très rares, ce qui laisse le protocole tenir en deux minutes de manipulation par animal quand la croissance tumorale, elle, court sur toute la durée de l'étude. Les 60 souris sont mises à mort pour analyser le microenvironnement de leur tumeur.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer et d’autres études ont montré que la chimiothérapie pouvait moduler les proportions des différentes populations de globules blancs. L’immunothérapie est une catégorie de traitement très prometteur, notamment dans le cancer colorectal mais les conséquences de tels traitements sur les globules blancs restent à déterminer précisément afin de potentiellement améliorer leur efficacité. Le but de ce projet est d’étudier comment l’interaction entre 2 acteurs immunitaires impacte le reste de la réponse immunitaire au sein de la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - 2 administrations de 60 secondes chacune pour administrer un traitement unique et afin de permettre le développement d’une tumeur
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à 2 injections de 1 minute chacune. L’administrations du traitement n’est pas connue pour être particulièrement douloureuses, particulièrement sous anesthésie. L’injection des tumeurs pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. Il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées mais elles sont très rares dans le modèle choisi pour cette étude et cette durée d’étude. Les injections sur animaux vigiles pourront entrainer du stress. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (60) pour analyse du microenvironnement tumoral.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 10 animaux par groupe seront utilisés pour évaluer l’impact ou non de ces différents traitements sur le système immunitaire. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être importantes, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine, tout le long de l’expérimentation. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. L’injections de cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. L’injection de traitement sera réalisée sur des souris vigiles. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 14 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature
Modulations pharmacologiques des mécanismes communs dans les différents types d’accidents vasculaires cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 980
Soixante minutes d'interruption de la circulation dans une artère cérébrale, sans qu'aucun analgésique ne soit administré ensuite. 1 260 souris et 980 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, une partie étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. D'autres subissent une hémorragie intracérébrale provoquée chirurgicalement, une injection intra-artérielle destinée à créer des microhémorragies, ou un drainage d'hématome, auxquels s'ajoutent des traitements quotidiens, des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, des prélèvements sanguins mensuels et des tests de mémoire, d'anxiété et de motricité étalés sur plusieurs semaines. Le recours à deux espèces de rongeurs, le porteur l'appuie sur les recommandations STAIR, un ensemble de critères établis par des experts du domaine.
Objectifs
L’objectif global du projet est de moduler pharmacologiquement les mécanismes communs entre les différents types d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral) afin d'en contrer les effets néfastes ou les complications, à court terme ou à long terme.
Bénéfices attendus
Concernant les hémorragies cérébrales, à la phase aiguë (c’est-à-dire jusqu’à 7 jours), ce projet permettra de proposer plusieurs pistes thérapeutiques pour l’évacuation de l’hématome. Au-delà de 7 jours, ce projet permettra de proposer une piste anti-inflammatoire pour contrer les effets délétères de l’œdème présent autour de l’hématome résiduel. En ce qui concerne les ischémies cérébrales, des modulations pharmacologiques à court et et à long terme par des médicaments aux multiples effets permettra d'évaluer les bénéfices de ces traitements sur les troubles de la mémoire et la récupération fonctionnelle post AVC.
Procédures
Les animaux vont être soumis respectivement et de manière unique à - une intervention chirurgicale afin d'induire un accident vasculaire ischémique (interruption de la circulation sanguine dans une artère cérébrale d'une durée de 60 min) - une intervention chirurgicale afin d'induire d'une hémorragie intracérébrale (d'une durée de 30 minutes) - une injection intra-artérielle de molécules permettant la constitution de microhémorragies cérébrales (d'une durée de 10 minutes) - une intervention chrirugicale post hémorragique et drainage de l'hématome (d'une durée de 60 min). Pour l'ensemble de ces procédures, les animaux recevront des traitements pharmacologiques innovants quotidiennement (par voie orale ou par injection d'une durée de 5 minutes par administration), en parrallèle d'évaluations comportementales visant à tester la mémoire, l'anxiété et la motricité (tests s'étalant de quelques heures à plusieurs semaines), de séances d'imagerie (d'une durée de 45 minutes/séance) et de prélèvements sanguins mensuels (5 minutes/prélèvement).
Impact sur les animaux
L'induction des AVC ischémiques et des HIC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De plus, la principale nuisance attendue dans le modèle d'AVC ischémique repose sur le fait qu'aucun analgésique ne sera administré et que cela peut entrainer une douleur. Une perte de mobilité transitoire peut également être observée dans les 72h qui suivent l'intervention. De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés, même si les doses sont non toxiques (troubles digestifs, nuisance liée à la piqure). Une douleur peut être générée lors du prélèvement rétro-orbital. Aucune nuisance n'est attendue lors des tests comportementaux, hormis la légère restriction alimentaire lors d'un test comportemental. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gênes potentielles (voir document associé).
Devenir
A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort après différents temps d'intérêt, entre 24h et 6 mois post chirurgie, pour des études du tissu cérébral qui nécessitent d'avoir accès à l'organe.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqués dans la survenue d'un accident vaculaire cérébral. Il s’agit de l’étude d’un trouble physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 2240 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au mieux (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les mesures spécifiques seront la mise à disposition de gel nutritif enrichi lors d'une perte importante de poids, de la désinfection en cas de plaies et d'un ajout d'enrichissement en cas de comportement aggresif anormal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure du bien-être animal ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
En accord avec les données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité et la fiabilité des résultats obtenus, nous avons choisi de travailler sur des animaux (rats et souris) jeunes adultes nous permettant d'envisager des études à long terme. Le choix de 2 espèces de rongeurs repose sur les recommandations STAIR (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) qui rassemblent des critères expérimentaux définis par des experts internationaux et adaptés à l’évaluation expérimentale.
Création et maintien de lignées de poissons zèbre génétiquement modifiés pour l’étude des protéines contrôlant l’architecture des neurones
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tués dès la fin de la procédure pour les uns, gardés jusqu'à douze mois puis mis à mort pour les géniteurs et génitrices, 16 950 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet consiste à créer et maintenir des lignées génétiquement modifiées pour étudier les protéines qui structurent les neurones. Chaque poisson subit à quatre mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale destiné au génotypage, geste que le porteur décrit comme sans dommage tout en reconnaissant qu'il peut induire du stress et de la douleur. L'effectif reste sans justification statistique, le porteur indiquant qu'aucune méthode n'a pu servir à le déterminer puisque aucune expérience n'est menée sur les poissons adultes.
Objectifs
Notre programme de recherche porte sur l’étude de neuropathies héréditaires humaines caractérisées par des atteintes neurologiques sensitives et motrices. La prise en charge clinique des patients est actuellement symptomatique et aucun traitement curatif n’existe à ce jour, ce qui pose l’urgence de développer des modèles animaux précliniques pour la mise au point des thérapies. Nous nous intéressons aux protéines qui forment l’architecture du neurone et qui sont mutées dans nombre de maladies neurologiques. Notre programme de recherche vise à comprendre le rôle physiologique de ces protéines structurelles et leur régulation. Afin de mener ce projet à bien, nous avons choisi le modèle du poisson zèbre, qui constitue un modèle/outil de choix pour l’étude du système neuromusculaire, similaire à celui de l'Homme et déjà fonctionnel dès le stade larvaire précoce. En outre, la transparence de l'animal durant le développement nous permet de capturer les processus dynamiques qui nous intéressent par imagerie dans un modèle in vivo. Pour réaliser ce projet, nous créerons et maintiendrons des lignées poisson zèbre transgéniques. Ces lignées nous permettront de générer des embryons dans le but d’étudier les protéines structurelles des neurones par des techniques de microscopie ou de biochimie à des stades larvaires (
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre les fonctions des protéines contrôlant l'architecture des neuroneset leur implication dans des mécanismes pathologiques. L’objectif à long terme (>5ans) est de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.
Procédures
La création et le maintien de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux transgéniques. Cette procédure d'identification nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Ce prélèvement, d’une durée inférieure à 5 minutes, sera réalisé sous anesthésie une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Classiquement, cette technique ne génère pas de dommages ni de mortalité. Il s’agit la du seul geste invasif qu’auront à subir les poissons zebres une fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à ce que les protéines étudiées induisent des nuisances dans les lignées transgéniques créées. Seule les formes mutées, avec des mutations retrouvées chez les patients, ont le potentiel de générer un phénotype dommageable (défauts sensorimoteurs). Ces défauts pourraient induire un défaut de nage chez ces poissons n’entrainant pas, au vu de la littérature sur les patients, de mortalité ou de conditions d’hébergement particulières. Nous porterons une attention particulière aux déficits moteurs en évaluant la qualité de la nage des poissons générés (notamment observable lors du nourrissage) et à l’apparition de signes de souffrance. Pour les autres lignées transgéniques, un suivi des poissons zebres sera réalisé afin de s’assurer qu’aucun d’entre eux ne développe de phénotype dommageable dans le temps. Lors de la création de ces lignées, un certain nombre de poissons zebres seront amenés à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification qui peut induire du stress et de la douleur.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 12 mois puis mis à mort. Les autres seront mis à mort dès la fin de chaque procédure afin de ne pas garder d’animaux génétiquement modifiés , non nécessaires à la conduite de ce projet et ne pouvant pas être replacés (adoption ou autre projet).
Remplacement
Le projet vise à acquérir une meilleure compréhension fondamentale des protéines controlant l'architecture des neurones. Bien qu'il existe des systèmes d'étude de cellules in vitro, ces modèles sont fortement limités car les neurones ne sont pas matures et ne permettent pas d'étudier complètement les fonction de ces protéines. Par conséquent, il n'existe actuellement aucun système in vitro qui réponde aux deux critères de complexité et de transparence des tissus, nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cela nous rend dépendants de l'utilisation de systèmes in vivo. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents, qui est déjà fonctionnel au stade larvaire et qui a une transparence tissulaire ce qui en fait un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques. Nous souhaitons établir des lignées poisson-zèbre transgéniques afin de disposer d’outils pour étudier la biologie des neurones.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des techniques utilisées sera réalisée sur des oeufs de poisson zèbre sauvages à 24-48h heures post fécondation. Nous limiterons également au maximum le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification en réalisant les prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres. Ainsi, dès lors que le nombre d’animaux nécessaires à la génération des lignées sera obtenu, les prélèvements seront stoppés. Pour le maintien des lignées créées, seul le nombre de poissons zèbres nécessaire au maintien de chaque lignée sera conservé, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Étant donné qu'aucune expérience ne sera réalisée sur les poissons adultes, aucune méthode statistique n'a pu être utilisée pour déterminer le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a donc été déterminé sur la base du nombre de couples reproducteurs requis.
Raffinement
Tous les poissons adultes seront élevés en aquarium en conditions d’hébergement standard, avec une surveillance hebdomadaire. Les individus devant subir la procédure d'identification par prélèvement de nageoire caudale seront placés sous analgésie avant la procédure. Pendant cette procédure, l'exposition à l'anesthésique sera minimisée en effectuant rapidement les manipulations tout en s'assurant que le poisson est suffisamment sédaté pour ne pas sentir les manipulations. Une sédation adéquate sera confirmée en vérifiant l'absence de réaction de fuite provoquée par le toucher. Le plus petit morceau de nageoire possible sera prélevé afin de faciliter la cicatrisation et minimiser l’impact de cette procédure sur les animaux. La récupération de l'anesthésie sera étroitement surveillée : si le réveil n'est pas observé dans les 10 minutes, l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous réduirons au minimum le temps d'isolement des animaux (24h à 48h maximum). Les animaux seront traités par lots de 16 ce qui permet de former des bancs réduisant ainsi le stress des poissons. Les poissons ayant subi la procédure seront surveillés pendant 15 jours soit le temps minimum de cicatrisation afin que tout comportement ou aspect anormal puisse être évalué lors des contrôles de routine effectués par les soigneurs. Des points limites précoces et adaptés aux modèles d'étude ont été définis (points limites d'altération de la morphologie ou de comportement). En cas d'atteinte d'un seuil limite, les poissons seront euthanasiés.
Choix des espèces
Grâce à la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme, le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier les fonctions des gènes et des protéines qui sont pertinentes pour la physiologie et la pathologie humaines. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents pour nos questions biologiques. En outre, la transparence des embryons de poisson zèbre permet de suivre des processus dynamiques dans un contexte d'organisme entier à l'aide de techniques non invasives.
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par l’administration de Lipopolysaccharide chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tester les candidats médicaments d'un client donneur d'ordre suppose ici de provoquer une inflammation pulmonaire aiguë par administration de lipopolysaccharide bactérien. 1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trente administrations du composé testé et deux prélèvements sanguins sur animal vigile, une partie subissant en fin d'étude une pléthysmographie invasive sous anesthésie profonde, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer les candidats médicaments sur un "organisme vivant entier", et précise que le client s'engage par contrat à avoir eu recours en amont à tous les modèles "nécessaires".
Objectifs
Les lésions pulmonaires aiguës (ALI : Acute Lung Injury) sont considérées comme une sorte de syndrome clinique critique. Le lipopolysaccharide (LPS) est le composant majeur de la membrane des bactéries Gram négatif. De nombreuses études ont indiqué que les infections à ces bactéries sont parmi les causes les plus importantes des lésions pulmonaires aiguës, et que le LPS peut entraîner des lésions pulmonaires et une réponse inflammatoire. Des études ont démontré que l'administration de LPS peut induire la production de médiateurs inflammatoires. Par conséquent, le but de ce projet est de tester de nouveaux traitements contre l'ALI induite par le LPS. Ce projet est un renouvellement, par conséquent le modèle est bien connu et maitrisé.
Bénéfices attendus
Il n’existe pas encore de pharmacothérapie spécifique aux lésions pulmonaires aiguës (ALI) ayant un effet significatif et uniforme sur le développement de la maladie et la mortalité, bien que les essais précliniques aient montré des résultats prometteurs. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie en réduisant l’inflammation pulmonaire. Nous avons pu identifier, dans notre précédent projet, l'effet bénéfique d'une molécule sur la résistance pulmonaire. Grâce à ce nouveau projet, nous espérons pouvoir en identifier de nouvelles ayant également des effets anti-inflammatoires.
Procédures
Administrations de composé: maximum 30 administrations (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 2 prélèvements (30 secondes/souris, maximum 1 prélèvement par semaine) durant l'étude sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal (30 secondes/souris). Dans certains cas, les animaux vont être soumis à la pléthysmographie invasive sous xylasine/kétamine (anesthésie profonde) (durée: 15 minutes, analyse en terminale sans réveil). Une étude d'efficacité de composés durera au maximum 21 jours dans cas d’un traitement préventif ou maximum 6 jours dans le cas d’un traitement curatif.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie (pic inflammatoires situé de 3.5h à 24h post administration). La douleur pourra générer une perte de poids (2-5% sur 24h) et être quantifiée par des scores attribués quotidiennement (pesée quotidienne). Aucune nuisance n’est attendue lors de l’induction mis à part un léger stress dû à la manipulation. L’administration de traitement par injections répétées (1 à 2x /j ou 2x/semaine pour les i.v.) pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage (1 à 2x /j), aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires). Sur les études réalisées lors de la DAP précédente, 99% de animaux étaient en gravité réelle légère et 1% en gravité modéré. Aucune nuisance n'avait été relevée. Lors de l’analyse de la capacité respiratoire, la douleur sera prise en charge par l’ajout d’un analgésique en plus du cocktail de l’anesthésie général. Le rythme cardiaque est régulier et monitoré durant tout l’enregistrement. De plus les animaux seront mis à mort avant réveil, n’engendrant par conséquent aucune douleur post-opératoire
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation pulmonaire chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire, les organoides ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidats médicaments. Les études in vitro ne permettent pas l’étude des intéractions systémiques (inflammatoires, immunitaires) intervenant dans la maladie. Il est indispensable d’évaluer les candidats médicaments sur un organisme vivant entier. Les effets d’un médicament relèvent en effet de mécanismes extrêmement complexes, qui impliquent la plupart du temps de nombreux organes, interagissant les uns avec les autres. Ces tests permettront notamment de déterminer la dose optimale à administrer lors des essais cliniques qui suivront. Le client donneur d’ordre s’engage sur le contrat signé auprès de notre EU à avoir eu recours à tous les modèles nécessaires, s’ils existent, en amont de l’étude afin de limiter l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (n=12/groupe maximum, nombre validé par l’expérience acquise des dernières années), dû à la variabilité individuelle observée pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés seront: - le test de Kruskal-Wallis non paramétrique (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable) - ainsi que la 2way ANOVA (comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables)
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. De plus, si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré. Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un matelas chauffant. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux pour lesquels les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenue. Ces souris sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Notre modèle a été initialement mis au point et développé à partir de données de la littérature. Ce projet est un renouvellement, le modèle est maintenant parfaitement maitrisé, et nous a permis de réaliser des études avec succès lors du précédent projet. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un poumon avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).