Recherche fondamentale
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- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Oncologie
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- Système cardiaque
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
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- Système urogénital
Etude de mécanismes de l’allergie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sensibilisées puis soumises à un choc allergique, 60 souris reçoivent quatre injections et un prélèvement sanguin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées après prélèvement et imagerie. L'objectif déclaré porte sur les événements vasculaires de l'anaphylaxie, la perméabilité des vaisseaux et la perte de volume sanguin qui accompagnent les formes les plus graves. Le porteur mentionne que "la chirurgie peut causer des saignements", sans que le RNT décrive nulle part quelle intervention chirurgicale les souris subissent.
Objectifs
Selon l’Organisation mondiale de la santé, l’allergie est une réaction d’hypersensibilité systémique dont les formes les plus sévères peuvent mettre la vie en danger. Elle se manifeste par une apparition rapide de troubles respiratoires, circulatoires ou des voies respiratoires, potentiellement mortels, et s’accompagne généralement – mais pas systématiquement – de modifications cutanées ou des muqueuses. Il est donc essentiel d’en étudier les mécanismes afin d’améliorer la qualité des soins et la prise en charge des patients. Le système cardiovasculaire est l’un des principaux systèmes impliqués dans la physiopathologie de la réaction. Plus précisément, le système vasculaire joue un rôle clé car il est impacté par les médiateurs biologiques libérés par différents types de cellules impliquées dans la réaction allergique. L’altération des vaisseaux provoque une augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins et une perte conséquente du volume sanguin circulant vers l'espace extracellulaire entraînanant une hémorragie. L'objectif principal est d'étudier les événements vasculaires se produisant dans un modèle d'allergie chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de faire progresser la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans les réactions allergiques et anaphylactiques les plus sévères. L'objectif est de rechercher de nouvelles stratégies immunothérapeutiques pouvant être utilisées en pratique clinique et de rechercher des marqueurs de gravité permettant de personnaliser les traitements des patients afin d'améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’allergie réalisé sous anesthésie générale et analgésie systématique. Le protocole comporte quatre injections (incluant les traitements et l’analgésique), chacune durant environ 5 secondes. Les souris feront également l’objet d’un prélèvement sanguin, dont la durée est estimée à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur légère de courte durée. L’induction de l’allergie (sensibilisation) peut causer une réaction inflammatoire au site d’injection.. La chirurgie peut causer des saignements.
Devenir
Les souris seront mises à mort après prélèvements sanguins et analyse par imagerie.
Remplacement
À l'heure actuelle, il est impossible de réaliser des études sur les cellules pour atteindre les objectifs du projet, car il est obligatoire de disposer d'un système physiopathologique chez l'animal intact qui reproduit les conditions qui se produisent dans les cas d'allergie alimentaire, d'asthme et d'anaphylaxie pour transférer les conclusions à la situation clinique.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes expérimentaux ont été conçus de manière optimisée sur la base d’études antérieures, afin de garantir l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. L’analyse des résultats reposera sur des méthodes statistiques appropriées, assurant une interprétation rigoureuse des données tout en respectant le principe de réduction de l’usage des animaux
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur potentiellement liée au modèle, un traitement antalgique sera administré en amont des manipulations expérimentales. L’état de santé des animaux sera suivi de manière rigoureuse à l’aide d’une grille d’évaluation spécifique, incluant des points limites stricts et adaptés au projet. Ce dispositif permettra une détection rapide de toute souffrance, assurant une prise en charge appropriée. En cas de douleur, un traitement adapté sera mis en place, et si nécessaire, une mise à mort sera effectuée conformément à la réglementation en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge 10 semaines. C'est l’âge où le système immunitaire est mature.
Rôle des cellules dendritiques dans l’activité antitumorale des cellules NK
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules de lymphome dans la veine de la queue, sur animal vigile, puis jusqu'à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les cellules tumorales se disséminent dans tout l'organisme et peuvent se développer dans le foie ou le cerveau, ou provoquer une paralysie par atteinte de la moelle osseuse. Aucun médicament contre la douleur ne leur sera administré, ces substances modifiant le système immunitaire étudié et risquant de "fausser les résultats".
Objectifs
Le cancer est une maladie grave qui touche des millions de personnes chaque année dans le monde, et reste l’une des principales causes de décès. Ces dernières années, de nouveaux traitements appelés immunothérapies, qui utilisent les défenses naturelles de notre corps, ont permis de mieux soigner certains cancers et d’augmenter la durée de vie des patients. Ces progrès sont possibles grâce à une meilleure compréhension du système immunitaire, en particulier grâce à des études chez la souris dont le fonctionnement est proche de celui de l’humain. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (ou cellules NK) sont très importantes : elles sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement, dans beaucoup de cas, ces cellules deviennent moins efficaces au fil du temps, comme si elles s’épuisaient. Notre projet cherche à comprendre pourquoi les cellules NK perdent leur efficacité face au cancer. Dans un modèle de lymphome chez la souris que nous avons développé, les cellules NK réagissent d’abord bien aux tumeurs, mais finissent par devenir inactives. Nous pensons que certaines cellules du système immunitaire appelées cellules dendritiques (ou DCs), ainsi que d’autres cellules proches, produisent des substances (les cytokines) qui aident à maintenir l’activité des cellules NK. Mais, quand la tumeur grandit, elle perturbe ce soutien, ce qui rend ces dernières moins efficaces. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour étudier de plus près les échanges entre cellules NK et cellules dendritiques au cours du processus tumoral. Grâce à ces recherches, nous espérons mieux comprendre comment les cellules NK s’épuisent face à un cancer, quel rôle les cellules dendritiques jouent dans ce processus, et surtout, comment agir pour renforcer les cellules NK. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer les traitements contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les immunothérapies, qui stimulent le système immunitaire pour qu’il combatte le cancer, ont profondément changé la manière de traiter certains cancers. Malheureusement, ces traitements ne fonctionnent pas chez tous les patients, et beaucoup meurent encore prématurément de la maladie. Il est donc essentiel de mieux comprendre pourquoi ces traitements échouent parfois, pour les améliorer et sauver plus de vies. Notre projet s’inscrit dans cet objectif. Nous cherchons à comprendre pourquoi certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules NK, s’épuisent et deviennent moins actives face aux tumeurs. Nous étudions le rôle dans ce processus de leur dialogue avec un autre type de cellules immunitaires, les cellules dendritiques (ou DC). Les connaissances que nous allons acquérir dans ce projet pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour rendre les immunothérapies plus efficaces, et ainsi augmenter les chances de guérison des patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique des cellules tumorales dans la veine de la queue d’une durée de quelques secondes. La manipulation des souris pour les pesées ou la contention représentera un stress de courte durée pour les souris. Les animaux inclus dans les différentes procédures subiront au maximum 4 injections intrapéritonéales de courte durée.
Impact sur les animaux
Un inconfort temporaire sera induit par l’injection de cellules tumorales dans une veine de la queue, effectuée sur des animaux éveillés, pouvant entraîner un léger stress ou une petite douleur passagère. Les manipulations nécessaires pour peser les animaux ou les maintenir immobiles provoquent un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales de certains produits peuvent générer un léger stress ou une petite douleur passagère. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tout l'organisme, ce qui peut favoriser le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) ou entrainer une paralysie suite à l’atteinte de la moelle osseuse. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids ou une modification du comportement (prostration).
Devenir
A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. La quasi-totalité aura reçu une injection de cellules tumorales.
Remplacement
Dans ce projet, nous avons besoin de mesurer différentes réactions du système immunitaire pendant un développement de tumeur, directement dans un organisme vivant. Cela s’explique par la complexité du système immunitaire, qui repose sur de nombreuses interactions entre différents types de cellules. Ces échanges sont essentiels au bon développement des réponses immunitaires et à leur capacité de réagir face à une tumeur. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant complet, comme la souris, pour pouvoir observer ces mécanismes dans leur ensemble, dans des conditions proches de la réalité. Les modèles alternatifs dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre cellules immunitaires dans le développement tumoral du lymphome.
Réduction
Nous ferons tout pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet, tout en garantissant la qualité des résultats. Pour cela, nous travaillerons avec une souche de souris, qui a l’avantage de donner des résultats plus homogènes entre les individus. Cela nous permet de limiter le nombre de souris à 3 ou 10 par groupe, selon les expériences. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique garantissant la fiabilité des résultats obtenu. Chaque expérience sera reproduite plusieurs fois (jusqu’à 2 fois), car la croissance des tumeurs peut varier d’une souris à l’autre. Une première expérience, dite "pilote", nous servira à trouver la bonne dose de la molécule utilisée pour éliminer certaines populations de cellules immunitaires , et à vérifier son effet dans le temps. Cette étape sera faite seulement 2 fois maximum, et si elle fonctionne dès le premier essai, nous n’aurons pas besoin de la refaire, ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux utilisés. Enfin, si lors des expériences principales aucune différence n’est observée entre les groupes traités et les groupes témoins, nous pourrons réduire le nombre de répétitions pour ces derniers, ce qui contribuera encore à limiter l’utilisation d’animaux dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Pour éviter au maximum le stress des animaux, ils seront maintenus en petits groupes stables, composés de souris compatibles entre elles. Elles auront également du matériel pour faire des nids et se cacher, ce qui contribue à leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé chaque jour, en observant leur poids, leur apparence et leur comportement. Si des signes de souffrance ou de détresse apparaissent, des seuils d’alerte précis ont été définis pour intervenir rapidement, selon une grille d’évaluation adaptée à chaque type de procédure. Certaines injections seront faites sur des animaux éveillés, mais elles seront réalisées avec soin par du personnel formé et expérimenté, pour réduire au minimum la gêne ou le stress. Pendant les séances d’imagerie, les animaux respireront un gaz anesthésiant pour les endormir légèrement. Cela permet qu’ils ne bougent pas et qu’ils ne ressentent pas de stress pendant l’examen. Enfin, dans ce projet, nous ne pourrons pas utiliser de médicaments contre la douleur, car ces substances modifient le fonctionnement du système immunitaire et risqueraient de fausser les résultats. Nous veillerons donc à limiter l’inconfort et la souffrance au maximum par des mesures correctives adéquates.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus adapté pour ce type d’étude, car elle se reproduit rapidement, sa taille est pratique pour la recherche, et son patrimoine génétique est bien connu. Cela nous permet de réaliser des manipulations précises, y compris avec des souris génétiquement modifiées, indispensables pour nos expériences. Le fonctionnement de l’organisme de la souris est assez proche de celui de l’humain, en particulier pour ce qui concerne le système immunitaire. Étudier la souris nous aide donc à mieux comprendre les mécanismes immunitaires chez l’homme. Nous utiliserons des souris des 2 sexes âgées de 7 à 30 semaines, car, à cet âge, leur système immunitaire est arrivé à maturité. Pour éviter les différences liées à l’âge au sein d’un même groupe, nous veillerons à ce que les souris d’un même groupe aient au maximum 2 semaines d’écart, ce qui garantit une meilleure fiabilité des résultats.
Etude de la réponse immunitaire adaptative dans un modèle murin de colite
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Croisées pour être dépourvues de lymphocytes T et B tout en développant une colite chronique à partir de huit semaines, les souris de ce projet sont 1 764, dont 1 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une bague auriculaire et une biopsie de la queue pour le génotypage, et plusieurs centaines subissent des injections répétées de sérum, d'anticorps ou de cellules, avec prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur indique que l'inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou un prolapsus rectal, et que certains traitements testés pourraient l'aggraver. Les souris gardées pour la reproduction sont tuées à huit mois pour renouveler les accouplements, celles dont le génotype ne convient pas à six semaines.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies qui se traduisent par une inflammation durable du côlon, dont les causes exactes restent encore mal connues. Le système immunitaire pourrait jouer différents rôles dans ce contexte : il pourrait être responsable d’une réaction excessive contre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin, mais aussi, au contraire, contribuer à limiter leur passage dans les tissus lésés et à réguler l’intensité de l’inflammation. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires, en particulier des lymphocytes T et B, dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale. Pour cela, nous allons créer un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées. Objectif 1 : Développer des modèles de souris qui présentent une colite avec ou sans système immunitaire adaptatif. Cela permettra de comparer directement l’influence de ce système sur la maladie. Chez les animaux dépourvus de ce type de défense, il sera possible de réintroduire des éléments du système immunitaire (anticorps ou cellules) afin d’évaluer leur rôle. Objectif 2 : Étudier plus particulièrement le rôle des anticorps dans le développement de la colite et tester l’effet de traitements basés sur leur administration. Pour cela, des souris dépourvues de réponse immunitaire adaptative seront reconstituées avec différents composants issus d’animaux immunocompétents, et l’effet de l’injection d’anticorps sera analysé selon différents modes d’administration. Objectif 3 : Évaluer l’impact d’une réponse immunitaire dirigée contre les bactéries intestinales. L’expérience consistera à stimuler le système immunitaire des souris avec des éléments du microbiote afin de voir comment cela influence l’évolution de la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre le rôle du système immunitaire adaptatif dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin à travers la réalisation et l’exploitation d’un nouveau modèle expérimental murin. Ce modèle servira aussi à explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Par exemple, nous évaluerons l’effet de l’injection d’anticorps humains déjà utilisés en clinique dans d’autres maladies, afin de voir s’ils limitent le passage des bactéries et l’inflammation intestinale. Nous comparerons aussi leur efficacité selon différentes modalités d’administration. Enfin, nous testerons une stratégie vaccinale innovante visant à “éduquer” le système immunitaire contre des composants bactériens, dans l’objectif de réduire l’inflammation et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou de futurs marqueurs biologiques utiles pour le suivi des MICI.
Procédures
Tous les animaux (1764 souris) auront une bague auriculaire et une unique biopsie caudale pour le génotypage. Ces gestes, très courts (quelques secondes) sont réalisés sur animal vigile. Quatre-vingts souris recevront deux injections de sérum à 7 jours d’intervalle sous anesthésie légère. L’injection dure environ 5 minutes. Cent-vingt autres souris recevront pendant 5 jours consécutifs une injection d’anticorps sans anesthésie. Chaque injection dure 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés chez ces animaux vigiles. Ce type de prélèvement dure 5 minutes au maximum. Une injection de cellules sera réalisée sur 140 autres animaux légèrement anesthésiés. Un prélèvement sanguin sera aussi réalisé sur ces mêmes animaux vigiles. Deux cents autres souris recevront 3 injections de 200µl de composés à 4, 6 et 8 semaines de vie. Ces injections se feront sur animaux vigiles et durent 10 secondes. Deux prélèvements sanguins de 100µl seront réalisés avant l’immunisation et 1 semaine après la dernière injection chez tous ces animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris dépourvues de défenses immunitaires présentent un risque accru d’infections. Toutefois, elles seront élevées dans des conditions protégées et conformes à la réglementation, dans un environnement exempt de pathogènes, ce qui limite fortement ce risque et ne provoque pas de souffrance particulière dans ces conditions. En revanche, les souris utilisées pour mimer la maladie développent une colite chronique à partir d’environ 8 semaines d’âge. Cette inflammation intestinale peut entraîner un retard de croissance, une perte de poids, une déshydratation ou, plus rarement, un prolapsus rectal. Dans ces cas, les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections nécessaires au projet durent moins de 5 minutes et n’entraînent qu’une gêne légère et transitoire liée à la piqûre. Les traitements dureront de 10 jours à 16 semaines en fonction des procédures appliquées. Certains traitements testés pourraient améliorer l’inflammation, tandis que d’autres pourraient l’aggraver en accélérant son apparition et/ou en augmentant son intensité. Pour cette raison, les animaux recevant un traitement feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’intervenir en conséquence.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 5 « génotypage » restent en vie à l’issue de la procédure. A l’issue des procédures 1 et 2, les animaux ayant le génotype d’intérêt serviront pour la reproduction et l’entretien des lignées et pour certaines autres procédures. Les animaux en reproduction seront euthanasiés à l’âge de 8 mois afin de renouveler les accouplements. Les animaux de génotype inadéquats, donc inutilisables, seront euthanasiés à 6 semaines. Les animaux des autres procédures seront euthanasiés à la fin de l’étude pour réaliser les prélèvements.
Remplacement
Le système immunitaire adaptatif est un processus complexe impliquant différents types de cellules (par exemple, les lymphocytes T et B) qui interagissent entre elles et avec d’autres cellules pour déclencher ou réguler l’inflammation. Dans les maladies intestinales, cette inflammation résulte aussi de relations encore mal connues entre les bactéries naturellement présentes dans l’intestin (le microbiote), les cellules de la paroi intestinale et les défenses immunitaires. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites uniquement par des expériences en laboratoire sur cellules isolées ou par des modèles informatiques. La création d’une nouvelle lignée de souris combinant deux modèles existants offrira donc une opportunité unique pour analyser plus en détail le rôle du système immunitaire adaptatif dans le déclenchement et l’évolution de l’inflammation intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire grâce à une gestion rigoureuse des programmes de reproduction. Les croisements seront organisés de manière à obtenir prioritairement les génotypes utiles pour les expériences, tout en réduisant au maximum la naissance d’animaux porteurs de caractéristiques susceptibles d’altérer leur bien-être. Une attention particulière sera portée au suivi des nouveaux génotypes afin d’évaluer précocement leur état de santé et leur qualité de vie, conformément aux recommandations européennes. Pour les expériences, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 10. Ce choix correspond aux standards de la littérature scientifique et permet de tenir compte de la variabilité biologique naturelle, tout en garantissant une solidité statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Cette approche évite de multiplier inutilement le nombre d’animaux en cas d’études inconcluantes, et respecte ainsi le principe de réduction parmi les 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer).
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués progressivement à l’expérimentateur, grâce à une routine d’élevage et à des manipulations douces et régulières, afin de réduire leur stress. Leur hébergement sera enrichi de matériel pour la construction de nids, favorisant leur confort. L’élevage sera maintenu à l’état hétérozygote pour limiter l’apparition d’animaux présentant des caractéristiques potentiellement dommageables. Pour les souris immunodéficientes, un environnement protégé et conforme à la réglementation sera assuré. Les cages seront changées dans des conditions stériles afin de réduire le risque de contact avec des agents infectieux. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés pour garantir le maintien de ces conditions sécurisées. Chez les animaux développant une colite, une surveillance quotidienne sera effectuée par du personnel formé, avec une pesée bihebdomadaire et une observation attentive des signes cliniques (perte de poids, modifications du comportement, état du pelage, posture, cris ou blessures). Les cages de ces animaux présentant une colite seront nettoyées plus fréquemment pour préserver leur confort. Si des signes de souffrance apparaissent, des mesures adaptées de prise en charge de la douleur seront mises en place. En cas de mauvaise tolérance ou de souffrance importante, le protocole expérimental sera interrompu, et les animaux concernés seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car ses mécanismes immunitaires sont très proches de ceux de l’Homme. De plus, des lignées génétiquement modifiées ciblant des gènes clés impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et dans le développement de l’inflammation intestinale sont disponibles. Le croisement de ces deux lignées permettra d’obtenir des animaux dépourvus de lymphocytes T et B et susceptibles de développer une colite similaire à celle observée chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La souris est également l’espèce la mieux adaptée aux conditions d’élevage de notre animalerie, ce qui permet d’assurer leur bien-être tout en réalisant des expériences scientifiquement pertinentes. Les expériences seront menées sur des souris sevrées, âgées d’au moins 4 semaines. Au-delà de 4 semaines le système digestif et le système immunitaire sont suffisamment matures pour les études prévues. L’âge auquel les animaux seront euthanasiés pour l’analyse des résultats dépendra du type d’expérience réalisée. Cette décision sera basée sur les données de la littérature scientifique et/ou sur les observations préliminaires obtenues lors des procédures expérimentales, afin de garantir la pertinence scientifique tout en minimisant la souffrance animale.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques dans le modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 836 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à soixante-seize administrations de composés et jusqu'à soixante-dix-neuf injections au total sur une étude de vingt-quatre jours. 816 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 816 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélèvements. L'inflammation du système nerveux central qui leur est provoquée entraîne des douleurs pendant huit jours et un déficit moteur modéré à sévère selon le degré de paralysie, sur commande de laboratoires clients qui fournissent les molécules à tester. Le porteur indique que les études menées sous le projet précédent n'ont mis en évidence aucune molécule prometteuse dans cette pathologie.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central. Une inflammation liée à un mécanisme auto-immunitaire est à l'origine d'une dégénérescence progressive de la gaine de myéline entourant les fibres nerveuses des neurones. Ce phénomène est à l’origine du ralentissement ou de l’arrêt de la conduction nerveuse induisant une faiblesse musculaire, des troubles de la motricité, de la vision, etc. La sclérose en plaques représente la première cause de handicap sévère non traumatique chez les jeunes adultes. L’âge moyen de début des symptômes est en effet 30 ans. Environ 110 000 personnes sont touchées en France avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. D’une manière générale, les causes de la maladie ne sont pas bien identifiées et l’origine exacte de la pathologie reste inconnue. De même, aucune thérapie n’existe à l’heure actuelle pour soigner cette pathologie très invalidante. C’est pourquoi l’étude de nouvelles molécules thérapeutiques est nécessaire. Les molécules thérapeutiques en développement ont pour objectif d’agir sur 3 axes : optimiser la stratégie anti-inflammatoire, favoriser la remyélinisation et la neuroprotection. Pour le traitement de la poussée, l'activité anti-inflammatoire des corticoïdes (anti-inflammatoires) accélère la rémission et permet de réduire le taux de rechutes à court terme. La phase pré-clinique qui consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur est une étape essentielle dans le développement de médicaments. Ce projet fait suite au projet #21592 arrivé à échéance. Il a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire en comparaison avec une molécule de référence et d’obtenir une efficacité égale, voire supérieure à celle-ci.
Bénéfices attendus
Un traitement anti-inflammatoire permet de diminuer cette phase inflammatoire qui mène à la destruction des axones et gaines de myélines. Les traitements disponibles à ce jour ne permettent pas de guérir la maladie, des injections d'anti-inflammatoires permettent de traiter les symptômes et peuvent prévenir les poussées qui reviennent par intermittences. Ce type de forme évolue par poussées, avec des épisodes de rémission plus ou moins long entre celles-ci contrairement aux formes progressives qui évoluent de façon continue, indépendamment des poussées. Dans les formes progressives de la maladie, l’efficacité des traitements n’est pas définitivement démontrée et semble au mieux très partielle. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments à visée anti-inflammatoire permettant de diminuer ou d’inhiber le développement de la maladie. Les études réalisées sur la précédente DAP n’ont pas permis de mettre en évidence des molécules prometteuses dans cette pathologie.
Procédures
Administrations de composés: maximum 76/souris (30 secondes/souris); Prélèvements de sang: maximum 4 prélèvements/souris (3 prélèvements sur animaux vigiles 1x/semaine et 1 prélèvement sous isoflurane en terminal, 1 minute/souris); Induction de la maladie: 3 injections/souris (30 secondes/souris, injection du premier jour sous isoflurane). Cela représente au total maximum 79/souris injections au cours d’une étude de maximum 24 jours avec 14 jours de traitements préventifs.
Impact sur les animaux
Ce projet va permettre d’induire un modèle expérimental transitoire d’inflammation du système nerveux central chez la souris. Plusieurs injections seront nécessaires (solutions immunogéniques et molécules thérapeutiques à tester) et induiront des douleurs légères de courte durée. L’inflammation induite (mimant celle rencontrée chez l’homme lors de sclérose en plaque) sera à l’origine de douleurs de faibles à modérées (selon le stade de développement de la maladie) sur 8 jours et un déficit moteur (sur maximum 48h) de modéré à sévère (selon le degré de paralysie) selon l’efficacité ou non de la molécule thérapeutique testée. La douleur chez l’animal pourra induire malnutrition, faim, soif et stress même si des mesures seront mises en place pour limiter ces nuisances au maximum. Ces signes cliniques ont été observés chez moins de 5% dans la DAP précédente.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques et d’analyser l’effet des différentes molécules testées.
Remplacement
Nous proposons de mettre en place un modèle de sclérose en plaques chez la souris afin de tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies: une thérapie composée d’un seul médicament (monothérapie) ou de plusieurs molécules (combinaison thérapeutique). La dose du composé est choisie en fonction des études in vitro réalisées par le laboratoire donneur d’ordre. Nos clients s’engagent, par signature d’une clause du contrat, à ce que la toxicité des composés ainsi que le véhicule fourni soient validés in vitro sur des modèles pertinents. La dose optimale choisie correspond à la dose induisant un meilleur effet thérapeutique avec le moins d’effets indésirables. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires. Les études in vitro ne permettent pas l’étude du système nerveux/immunitaire intervenant dans la maladie. L’exploration des différentes fonctions physiologiques impliquées dans la pathologie demande l’étude d’un organisme complet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire (nombre validé par l’expérience acquise des dernières années sur ce modèle, il a été augmenté à 12 par groupe dû à la variabilité inter-individu observée), pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement pour limiter les nuisances au maximum et détecter les premiers signes de douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place, si des animaux présentent des signes de souffrance (surveillance renforcée) au cours de l'étude, un analgésique sera administré. La surveillance renforcée d’un animal implique 2 visites par jour (une visite en début de matinée et une autre l’après-midi). De plus, en cas de mobilité réduite ou de perte des poids des animaux, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifique, pratique et éthique : - Mammifères proches de l’Homme: plus de 90 % des deux génomes correspondent à des régions portant des gènes de même fonction et dans le même ordre. Seulement 1 % des gènes murins n’a aucun équivalent chez l’homme et il existe de grandes analogies entre les deux espèces dans les systèmes et leur fonctionnement . - C'est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. La méthodologie envisagée est aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Le modèle est basé sur les publications (protocoles d’induction, grille d’évaluation de la maladie) afin d'éviter de refaire des études préliminaires. De plus ce modèle est maîtrisé depuis plusieurs années au laboratoire. Les animaux utilisés seront âgés de 7 semaines à 10 mois afin d’avoir un système immunitaire développé et mature. La sclérose en plaque étant une maladie neuro-dégénérative qui peut se déclarer en majorité chez des individus âgés, il est pertinent de réaliser des études chez des souris à un âge avancé (de 4 - 10 mois).
Effets cardiaques du Tofacitinib dans un modèle murin de troubles de la conduction cardiaque – étude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Entre leur quarantième et leur quarante-huitième semaine de vie, elles reçoivent une injection cinq jours sur sept et passent deux fois un électrocardiogramme et une échocardiographie sous anesthésie générale. Cette étude pilote cherche à savoir si le tofacitinib, déjà utilisé en médecine humaine contre des maladies inflammatoires, freine la fibrose cardiaque. Le porteur écrit que ce modèle "mime parfaitement" la maladie génétique visée, tout en précisant que ces souris ne développent ni bloc de conduction complet ni tachycardie ventriculaire sévère, contrairement aux patientes et patients les plus atteints.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si un traitement chronique au tofacitinib, une molécule déjà utilisée en pharmacopée humaine pour le traitement de diverses maladies inflammatoires, permet de bloquer la survenue de fibrose cardiaque dans un modèle de souris transgénique. Ce modèle mime parfaitement une maladie génétique caractérisée par des troubles progressifs de la conduction cardiaque et la survenue de fibrose cardiaque au cours du vieillissement. A l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement préventif médicamenteux pour les patient.e.s affecté.e.s par cette maladie, dont les plus séverement touché.e.s doivent être implanté.e.s avec un stimulateur et/ou un défibrillateur cardiaque. Pour ce projet, 20 souris transgéniques, mâles et femelles, seront traitées chroniquement avec le tofacitinib, ou le véhicule, pendant 8 semaines à partir de l'âge de 40 semaines, qui correspond au début du remodelage fibrotique. L'effet du traitement sur la survenue de fibrose cardiaque (analyse histologique), ainsi que sur la fonction électrique (électrocardiogramme) et contractile (échocardiographie), sera évalué en fin de traitement.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une prévention, au moins partielle, du remodelage fibrotique cardiaque normalement observé dans le modèle transgénique à partir de 40 semaines.
Procédures
A l'âge de 39 semaines et de 48 semaines, les souris seront soumises à un enregistrement de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) et un examen échocardiographique (15-20 min) réalisés sous anesthésie générale. Entre 40 et et 48 semaines, les souris seront soumises à une injection 5 jours sur 7.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme pour les patient.e.s, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme chez les patient.e.s les plus sévèrement touché.e.s. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. Les examens électrocardiographiques et échocardiographiques ne sont pas des techniques générant de la douleur mais seront cependant réalisés sous anesthésie générale (anesthésie gazeuse) pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable, en contrôlant leur température corporelle. Sur la base de la bibliographie, aucun effet indésirable du tofacitinib n'est attendu à la dose utilisée. Les injections seront l'acte produisant le plus d'effets indésirables, en particulier de stess, lors de la manipulation.
Devenir
Les souris seront mises à mort à l'issue de l'étude, après la dernière échographie, afin de prélever leur coeur pour des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la structure et la fonction cardiaque. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots de souris a été déterminée à l'aide d'un logiciel de statistiques sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale à l’isoflurane. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 39 semaines, le traitement commencant à l'âge de 40 semaines, jusqu'à l'âge de 48 semaines.
Etude du filtrage de la lymphe par les cellules du ganglion lymphatique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
2 160 souris vont être utilisées, dont des nouveau-nés gavés deux jours puis trois jours après leur naissance, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour analyse post-mortem. Le génotypage impose une biopsie de tissu et sépare chaque portée de sa mère pendant une dizaine de minutes. Les résultats attendus portent sur la régulation du filtrage de la lymphe par le ganglion lymphatique, avec des retombées annoncées à long terme sur la vaccination des personnes âgées. Le porteur écrit que la biopsie se fait "sur animal vigile ou anesthésié en fonction de l'âge du prélèvement", sans dire à partir de quel âge l'anesthésie est jugée utile.
Objectifs
Le ganglion lymphatique est équipé de systèmes de filtrage de molécules apportées par la lymphe afin de générer des réponses immunitaires contrôlées, par exemple contre des virus. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre la régulation des deux filtres en place, un pour les petites molécules et un pour les grandes molécules. La capacité du ganglion lymphatique de laisser passer les petites molécules mais non les grandes est importante car les petites sont souvent inoffensives alors les grandes molécules sont des virus ou encore des bactéries contre lesquelles il faut se protéger.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation du filtrage de la lymphe apportant des molécules dans le ganglion lymphatique qui pourraient éventuellement nécessiter une réponse immunitaire protectrice. Ces résultats auront des retombées à long terme sur la vaccination, notamment chez les personnes âgées où le système de filtrage semble défectueux.
Procédures
Des souris nouveau-nés sont soumises à un gavage à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Une biopsie de tissu est effectuée sur animal vigile ou anesthésié en fonction de l’âge du prélèvement (durée < 1 min). Les souris sont soumises à une injection sur animal vigile (durée < 1 min).
Impact sur les animaux
Pour le génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors du prélèvement de tissu effectué sur animal vigile ou anesthésié en fonction de l'âge. Le gavage et l’injection sur animal vigile peuvent être source de stress et de l’anxiété pendant quelques secondes et une douleur légère peut être ressenti lors de l’injection.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire ou par les organoïdes.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre la régulation du système de filtrage de la lymphe vers le ganglion lymphatique et de mieux comprendre la fonction d’un récepteur dans création du filtre pour les petites molécules. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des ganglions lymphatiques. Chez la souris, les structures des ganglions sont bien connues et en plus semblent identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux intervenir dans le développement le du système immunitaire.
Stratégies thérapeutiques dans l’accident vasculaire cérébral hémorragique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour tester des candidats médicaments contre l'accident vasculaire cérébral hémorragique, 1 200 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. L'hémorragie est provoquée par une injection de collagénase dans le striatum, au cours d'une chirurgie d'une vingtaine de minutes, suivie d'un prélèvement sanguin à J1, J3 ou J7 et d'une évaluation neurologique. Le porteur indique que ce modèle peut provoquer des douleurs, de la prostration, des difficultés à se déplacer et une perte de poids. Il annonce des points limites stricts et une mise à mort si la souffrance se prolonge, sans indiquer les seuils retenus.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral hémorragique représente un problème de santé publique (20 à 30% de toutes les pathologies neurovascualaires) et ne disposent actuellement d’aucune thérapeutique efficace pour en réduire la gravité. Ils surviennent lorsque les vaisseaux sanguins dans le cerveau se rompent, entraînant une hémorragie. Le taux de mortalité est le plus élevé parmi les pathologies neurovasculaires. L’accident vasculaire cérébrale hémorragique déclenche une réponse immunitaire et inflammatoire qui aggrave les lésions cérébrales en favorisant l’expansion de l’hématome (épanchement de sang) et formant un oedeme autour de l’hématome. Ce dernier est associé à un mauvais pronostic neurologique. Actuellement, les mécanismes impliqués dans le développement de cet œdème sont complexes et mal compris. Les objectifs de ce projet seront d’une part de comprendre la physiopathologie de l’oedeme formé autour l’hématome et d’autre part d’évaluer la tolérance et l’efficacité de nouveaux traitements sur la résorption ou non de l’hématome et de l’œdème formé à la suite d’un accident vasculaire cérébral hémorragique
Bénéfices attendus
A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébrales hémorragiques. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral hémorragique et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.
Procédures
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) hémorragique, procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie. L’intervention chirurgicale dure environ 20 minutes. Chaque animal recevra deux injections (traitement et anesthésie profonde) ainsi qu’un seul prélèvement sanguin (réalisé à J1, J3 ou J7). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle d’AVC peut provoquer des douleurs anisi que prostration, difficultés à se déplacer et perte de poids. L’injection de collagènase dans le striatum cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection de médicament et d’analgesie peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques
Remplacement
Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique dans l’accident vasculaire cérébral hémorragique. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet thérapeutique bénéfique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral hémorragique chez l'homme
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une étude statistique préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse nous permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons conçu nos groupes de manière optimisée en nous basant sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral hémorragique que nous utilisons sest bien maîtrisés par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux.
Raffinement
Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie Nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.
Analyse du microenvironnement post-opératoire du glioblastome afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir les récidives
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées d'une tumeur cérébrale, opérées pour l'exérèse de cette tumeur, puis ponctionnées du liquide céphalorachidien, 197 souris sont toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La craniotomie et la résection peuvent provoquer des hémorragies locales et des douleurs post-opératoires, et la progression du glioblastome entraîne perte d'appétit puis perte de poids. Le projet vise à décrire le microenvironnement cérébral aux abords de la zone opérée, là où surviennent la plupart des récidives. Le porteur constate qu'aucun traitement local testé depuis quinze ans n'a donné de résultats cliniques cohérents, faute de modèles reflétant la complexité du glioblastome humain, et propose un nouveau modèle murin.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale très agressive, avec une survie médiane de 15 mois malgré les traitements combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Deux principaux obstacles limitent l’efficacité de ces traitements : la barrière cérébrale, qui empêche aux médicaments d’atteindre la tumeur, et les cellules tumorales résistantes aux traitements. Après l’opération, la majorité des récidives surviennent près des bords chirurgicaux, où le microenvironnement favorise la croissance des cellules cancéreuses. Une stratégie thérapeutique prometteuse est l’implantation intracérébrale de matériaux bioactifs dans le cerveau pour délivrer directement sur place des médicaments anticancéreux. Cet approche permet de contourner la barrière cérébrale et d’administrer les traitements de manière ciblée et prolongée. Cependant, bien que les résultats précliniques soient prometteurs, aucun traitement local testé ces 15 dernières années n’a donné de résultats cliniques cohérents, en partie à cause des modèles de recherche actuels qui ne reflètent pas suffisamment la complexité du glioblastome humain. Il est donc essentiel de développer des modèles expérimentaux qui reproduisent mieux le microenvironnement postchirurgical du glioblastome et d’identifier des cibles thérapeutiques dans le contexte post-opératoire et évaluer leur évolution au cours du temps. Ce projet visera à la caractérisation du microenvironnement cérébral à différents temps post-chirurgie dans un modèle préclinique de glioblastome et à tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mettre en évidence des cibles thérapeutiques au cours du développement des récidives post-opératoires de glioblastome afin de tester de nouveaux traitements pour cette tumeur. Les retombées de ce projet pourraient répondre à un besoin médical non satisfait dans le traitement des gliomes de haut grade, pour lesquels aucune innovation thérapeutique majeure n’a été introduite depuis 2005 (protocole STUPP : chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie au témozolomide). Ces tumeurs restent associées à un très mauvais pronostic, avec une espérance de vie médiane limitée à environ 15 mois après le diagnostic.
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1) acte chirurgical permettant la greffe tumorale ; 2) excision chirurgicale de la tumeur; 3) traitement post-chirurgical; 4) prélévement du liquide céphalorachidien. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie ne dépassera pas les 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet sont de courte durée et concernent la greffe, la pousse tumorale, l'excision chirurgicale de la tumeur et la douleur liée aux actes chirurgicaux. La manipulation, contention des animaux, les injections répétées d'anesthésiques, d'analgésiques et de traitements sont générateurs de stress de courte durée pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La résection peut induire des hémorragies locales et avec la craniotomie elles peuvent générer des douleurs post-opératoires minorées par l'administration d'antalgiques. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à des temps prédéfinis pour effectuer des analyses post-mortem.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de caractériser les réponses physiologiques suite à une chirurgie de résection chirurgicale du glioblastome afin d’identifier des cibles thérapeutiques et développer des nouvelles stratégies thérapeutiques. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement qui ont permis de définir des fenêtres temporelles auxquelles effectuer les analyses. Cette étape de caractérisation in vivo est indispensable afin de pouvoir mieux comprendre l’effet de la chirurgie dans les patients atteints de glioblastome. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les souris feront l’objet d’une observation quotidienne de leur état général, et leur poids sera contrôlé deux fois par semaine. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle souris représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles de tumeur que nous étudions vont nous permettre de mimer des mécanismes cellulaires et moléculaires des tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.
Nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie de Huntington : La régulation du transport rétrograde (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie du cerveau de vingt à trente minutes, ou une injection intraveineuse, puis deux semaines de tests comportementaux. 2 256 souris vont être utilisées, dont 1 278 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne survivant au projet. Le porteur écrit que les souris modèles de la maladie de Huntington ne montrent aucun signe de détresse en dehors des tests et qu'elles n'ont "pas besoin de traitement ou d'attention particulière", et ramène l'ouverture du crâne à une "légère douleur avec perte légère de poids". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus cérébraux, seule voie déclarée pour comprendre les mécanismes du traitement testé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires) puis inexorablement à leur décès. Lors de la maladie il y a un défaut de transport d'un facteur nécessaire à la survie des neurones. Il est démontré par des études au niveau cellulaire qu'il y a différents régulateurs de ce transport qui pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques. Il est maintenant crucial d'étudier le rôle de ces régulateurs dans un modèle animal, afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la maladie de Huntington.
Bénéfices attendus
Le déficit de transport d'un facteur essentiel à la survie des neurones est à la base de la dégénérescence des structures du cerveau lors de la maladie de Huntington qui touche 300000 personnes dans le monde. Ce projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soulager les patients.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie du cerveau de 20-30 minutes par souris, ou à une injection intra-veineuse de 5 minutes par souris. Des études comportementales de 2 semaines.
Impact sur les animaux
1) Des souris contrôle et des souris modèle de la maladie de Huntington seront utilisées. Chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales. En revanche, en dehors des tests comportementaux, ces souris ne montrent aucun signe de détresse correspondant à des points limites et n'ont pas besoin de traitement ou d'attention particulière. 2) Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à l'injection intra-veineuse n'a pu être observé. 3) Pour les individus qui vont subir une chirurgie du cerveau, cela peut générer une légère douleur avec perte légère de poids.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études biologiques qui permettront de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Le projet traitant de problèmes fonctionnels du cerveau, il est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle de simulation informatique. Il a été précédemment démontré sur un modèle cellulaire qu'il y a des régulateurs du transport d'un facteur nécessaire à la survie du cerveau, la seconde étape consiste donc à démontrer le rôle de ces régulateurs et leur effet sur la survie du cerveau, dans des conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Il est donc crucial de passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de reproduire les mécanismes de déclenchement des traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Pour cette procédure, le nombre d'animaux est réduit au maximum. Ces effectifs ont été calculées à l'aide de tests statistiques afin de pouvoir réaliser des analyses avec une puissance suffisante.
Raffinement
Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place surtout après la chirurgie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à des grilles codifiant le niveau de bien-être. Cela permettra une intervention immédiate et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent d'étudier la régulation du transport du facteur de survie des neurones dans les conditions physiologiques et lors de la maladie de Huntington. Les animaux seront tous en stade postnatal. Des études comportementales seront faites au stade prépuberté et si aucun effet n'est observé on gardera les souris jusqu'au stade adulte où il y aura progression des mécanismes de la maladie.
Etude du défaut de thermorégulation au cours du vieillissement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Tuées en fin d'expérimentation pour prélever leur peau, 240 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont dépilées à la crème sous anesthésie gazeuse, anesthésiées deux fois par injection intrapéritonéale pendant une cinquantaine de minutes, puis soumises à deux séances de chauffage du corps entier, dont une sur animal vigile immobilisé dans un tube de contention, la température interne étant relevée au thermomètre rectal. Trois âges sont comparés, jusqu'à plus de dix-huit mois, pour chercher pourquoi la peau vieillissante dissipe mal la chaleur. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la réactivité vasculaire cutanée, et annonce qu'il est "certain" que moins de 240 souris seront utilisées, sans dire combien.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de leur thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur corporelle et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les récepteurs à la chaleur exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle des récepteurs à la chaleur spécifiques de la peau au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction senseur et transducteur de l’information des récepteurs étudiés.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.
Procédures
Toutes les manipulations seront réalisées sur les 240 souris du projet. 1-Les 240 souris seront pesées vigiles au moment de leur arrivée à l’animalerie, tous les mois pour les souris de moins de 15 mois puis toutes les semaines après 15 mois jusqu’à la fin de l’expérimentation. Durée de la manipulation : 30 secondes. 2-Les 240 souris seront dépilées une seule fois durant toute la période de l’expérimentation. Afin d’éliminer les poils à la surface de la peau, les souris seront anesthésiées sous isoflurane pendant 5 minutes. 3-Les 240 souris seront anesthésiées à 2 reprises durant toute la période de l’expérimentation. Les anesthésies générales par injection IP dureront 50 minutes environ. 4- Pour finir, les 240 souris seront soumises à 2 reprises à un chauffage global : une fois en vigile (sans anesthésie et dans un tube de contention), et une deuxième fois sous anesthésie générale par voie IP. Ces mesures dureront maximum 20 minutes.
Impact sur les animaux
La pesée des souris pour le suivi de leur poids ou avant une anesthésie n’induira qu’un stress minime ; la manipulation des souris vigiles est effectuée par du personnel formé et expérimenté. La manipulation des souris lors de la dépilation est effectuée sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. La respiration des souris est suivie visuellement et le réveil est immédiat à la fin de la manipulation. Une table chauffante est utilisée pour éviter l’hypothermie. Une tondeuse adaptée aux rongeurs avec peu de risque de coupure sera utilisée suivie de l’application d’une crème dépilatoire la plus inodore possible. Le protocole de dépilation est précis, utilisé quotidiennement et permet d’éviter tout échauffement ou lésion (temps d’application de la crème dépilatoire de 30 secondes maximum, rinçage abondant et séchage minutieux). Les nuisances pour l’animal sont minimes. L’anesthésie générale est réalisée par du personnel expérimenté, la douleur générée est modérée au point d’injection. Une couveuse chauffée est utilisée pour éviter l’hypothermie des souris et un gel oculaire est appliqué pour éviter l’inconfort d’une sécheresse oculaire. Aucune nuisance n’est attendue lors des différentes mesures réalisées sous anesthésie durant l’expérimentation. Seule la réponse à l’application d’un faible courant au niveau du dos peut induire un léger inconfort durant la stimulation électrique ; cet inconfort est temporaire et se termine à l’arrêt de la stimulation (durée 20 secondes). Lors du chauffage global en vigile (sans anesthésie, dans un tube de contention), un stress dû au tube de contention est attendu. Afin de réduire ce stress, une habituation au tube de contention sera réalisée au préalable chez les 240 souris (2 essais dans les 7 jours qui précèdent leur manipulation). Lors du chauffage global (en vigile ou sous anesthésie), l’augmentation de la température interne sera mesurée avec un thermomètre rectal pouvant créer un léger inconfort.
Devenir
Il sera réalisé une mise à mort en fin d’expérimentations et un prélèvement des tissus cutanés. Cette étude vise à comprendre le rôle des récepteurs à la chaleur spécifiques de la peau dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la peau après des expositions à la chaleur.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires en in vitro.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 240. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, il est certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions biologiques sur ces mêmes modèles et en réalisant une étude statistique de nos résultats.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Pour les manipulations sous anesthésie générale, les souris seront placées dans une enceinte chauffée pour maintenir un confort thermique.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle des récepteurs à la chaleur spécifiques de la peau au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).
Processus neuroinflammatoires et interactions intestin cerveau : Rôle des acides gras polyinsaturés pour traiter l’alcoolodépendance – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune gavée quotidiennement pendant deux semaines et soumise à trois tests portant sur la mémoire, l'anxiété et la sociabilité. Les procédures impliquent des niveaux de souffrance légers à modérés. Le modèle repose sur une consommation d'alcool laissée au choix des souris, ce qui, écrit le porteur, augmente le stress et l'agressivité entre elles, et l'étude mesure ensuite si un régime enrichi en oméga-3 limite les effets du sevrage. Les géniteurs, gardés le temps de produire les cohortes, sont mis à mort à la fin des reproductions, et le bénéfice annoncé, une modification des pratiques cliniques pour les 23 millions d'Européens dépendants, est renvoyé à des travaux ultérieurs de partenaires cliniciens.
Objectifs
L'Europe est la région du monde où la consommation d'alcool est la plus élevée, avec environ 23 millions d'Européens dépendants à l'alcool. Cette dépendance constitue un trouble psychiatrique fréquent, pour lequel les traitements restent largement insuffisants. Pour combattre efficacement ce fléau, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie liée à la consommation d'alcool. En effet, le niveau de consommation d’alcool est un mauvais prédicteur du risque individuel à développer des atteintes graves. Par exemple, le risque de développer une cirrhose du foie chez les grands buveurs varie considérablement et ce indépendamment de la quantité d'alcool consommée. Cela reflète une grande variabilité dans les réponses individuelles à la consommation d'alcool au sein de la population. Cette vulnérabilité se manifeste particulièrement lors de la phase de sevrage chez les patients atteints de troubles liés à la consommation d'alcool (TCA). Elle se caractérise par une présence accrue de facteurs inflammatoires associés à une aggravation des lésions cérébrales, une rigidité cognitive accrue et un besoin compulsif de consommer de l'alcool. Ce projet cherche à comprendre pourquoi certaines personnes sont plus vulnérables aux effets de l’alcool que d’autres. Nous pensons que cette différence est liée aux interactions entre le système immunitaire, et le cerveau. L’objectif est d’analyser l’inflammation dans le cerveau et le reste du corps lors du sevrage et de voir si les oméga-3, connus pour leurs effets anti-inflammatoires, peuvent améliroer les effets du sevrage et réduire le risque de rechute. Pour cela, nous testerons ces effets sur des souris modèles de dépendance à l’alcool.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’identifier les facteurs de vulnérabilité associés à la rechute après une période d’abstinence dans les troubles liés à la consommation d'alcool. De plus, il a pour objectif de déterminer si les oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) peuvent limiter les risques de rechute chez les patients alcooliques. En l’occurrence il apportera des données objectivées quant à la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans les effets neuroprotecteurs des oméga-3, ce qui est nécessaire pour informer les professionnels de santé et modifier les pratiques cliniques. Ainsi, les oméga-3 pourraient être utilisés chez les patients en stratégie add-on (prévention primaire et secondaire) en association avec l’abstinence pour améliorer la résilience chez les patients. Nos partenaires cliniciens du projet mettront en œuvre les approches en s'appuyant sur nos résultats précliniques. Ainsi notre projet a une forte valeur translationnelle et de transfert de connaissances vers l'homme en plus de générer des nouvelles connaissances dans la physiopathologie de la vulnérabilité à la rechute après sevrage à l'alcool, qui concerne prêt de 60% des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à un gavage gastrique quotidien pendant 2 semaines. Le gavage gastrique est très rapide, il ne dure que quelques secondes. Une collecte de sang sera réalisée au début et à la fin de la période d’abstinence. La collecte de sang est très rapide, pas plus d'une minute. Les tests comportementaux seront réalisés à l'âge adulte pendant quelques minutes, avec 3 tests par animal. Le but de ces tests comportementaux est de regarder l'impact sur la mémoire, l'anxiété, et la sociabilité. Les animaux seront pesés une fois par semaine, pendant la procédure, cela dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Le modèle de choix de consommation d'alcool présente un risque d'augmentation de stress et d'agressivité sur les animaux, cependant aucune mortalité n'est documentée sur ce modèle. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entrainer des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes utilisés n'ont pas d'effets délétères sur la santé générale des animaux et ne sont pas toxiques. La contention et le gavage durent quelques secondes et engendre un stress léger sur les animaux, sans altération de leur état général.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les structures et /ou cellules nécessaires du cerveau et du corps pour réaliser les analyses post-mortem dans le cadre des questions scientifiques posées dans le projet. Les géniteurs sont conservés pour permettre de générer les cohortes. A la fin des reproductions, les géniteurs seront mis à mort.
Remplacement
L’étude du rôle de la neuroinflammation, et de l'axe intestin-cerveau dans l'hétérogénéité des troubles de consommation d'alcool nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et le rôle des oméga-3 dans les troubles de consommation d'alcool, pour ainsi mettre en place des approches nutritionnelles comme traitements préventifs pour améliorer la réussite du sevrage. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de consommation d'alcool reste une nécessité expérimentale majeure.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures cérébrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris et les transgéniques sont nécessaire par groupe pour générer des données robustes statistiquement par groupe.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement dans leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Ces données sur l'effet des oméga-3 (acides gras polyinsaturés n-3) sur le cerveau et la neuroinflammation chez la souris permettra d’affiner les données existantes en les croisant avec les nouvelles données générées. Par ailleurs, les cellules immunitaires du cerveau de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui conduit à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat, car notre laboratoire dispose de nombreuses lignées transgéniques, ce qui n’est pas le cas chez le rat. Ce choix s'inscrit dans une démarche de réduction d'animaux. L’utilisation des souris transgéniques est essentielle pour comprendre précisément le rôle des oméga-3 dans ces cellules cérébrales. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines, âge correspond à l’âge adulte chez l’homme, moment auquel débutera la consommation d’alcool. Les tests comportementaux débuteront ensuite sur des animaux âgés de 16 semaines. À partir de 21 jours, les souris transgéniques recevront un régime enrichi en oméga-3, correspondant à la période de sevrage où elles commencent à s’alimenter de manière autonome.
Identification guidée par imagerie des cibles thérapeutiques pour le trouble du spectre de l’autisme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Placées dans un dispositif qui déclenche des comportements dits excessifs pendant dix minutes, puis injectées dans le péritoine sur animal vigile, les souris de ce projet enchaînent jusqu'à quatre tests et quatre injections. 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le but déclaré est d'identifier les circuits cérébraux actifs pendant ces comportements, puis de les inhiber chimiquement pour voir si les traits mesurés comme autistiques s'atténuent. Les tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d'intérêts restreints sont nommés et chronométrés, mais le test central, celui qui révèle les comportements excessifs, n'est jamais décrit.
Objectifs
Il s’agit 1) d’identifier les structures nerveuses dont l’activité est liée à des comportements excessifs chez des souris modèles du trouble du spectre de l’autisme et 2) d’inhiber ces structures afin d’atténuer ces comportements excessifs ainsi que ceux caractérisant le trouble du spectre de l’autisme (sociabilité altérée, comportement répétitifs, intérêts restreints). Pour cela les souris modèles seront croisées successivement avec 2 autres lignées de souris. La première lignée permet d’induire l’expression d’une protéine rapportrice uniquement dans les neurones spécifiquement activés lors d’un comportement particulier. La deuxième lignée permet d’induire l’expression d’un récepteur inhibiteur exogène également dans les neurones activés lors un comportement particulier et, après injection du ligand spécifique au récepteur, de vérifier que l’inhibition de ces neurones modifie les comportements. En raison de l'émergence récente de techniques de stimulation cérébrale non invasives comme options thérapeutiques potentielles pour modifier l'excitabilité pathologique, il est crucial de déterminer si le dysfonctionnement d’une ou plusieurs structure(s) particulière(s) pourrait conduire à un trouble du spectre de l’autisme sévère. Il n’existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de lier activité neuronale et comportement. L’identification de telles structures par des techniques de neuroimagerie chez l'homme est limitée par les tâches pouvant être réalisées dans un scanner d’imagerie par résonnance magnétique. Elle est aussi limitée par la difficulté d'imager des patients avec un trouble sévère. Par conséquent, les données sur le trouble du spectre de l’autisme proviennent d'individus au repos avec un autisme de haut niveau. Malgré ces limitations, les résultats de neuroimagerie sont souvent contradictoires. Seule l’utilisation d’un modèle murin du trouble du spectre de l’autisme, exprimant une protéine rapportrice dans les neurones activés lors d’un comportement excessif, pourrait permettre d'identifier les structures/circuits dont le dysfonctionnement serait responsable de la sévérité du phénotype autistique. Ce modèle exprimant ensuite un récepteur inhibiteur dans les neurones précédemment identifiés devrait permettre de déterminer si l’inhibition de ces neurones permet d’atténuer les traits autistiques les plus sévères.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle murin du trouble du spectre de l’autisme, permettant l’expression d’une protéine rapportrice de l’activité neuronale dans les neurones activés lors de la réalisation de comportements excessifs, devrait permettre d'identifier les structures/circuits dont le dysfonctionnement pourrait être responsable de la sévérité du phénotype autistique. L’inhibition de ces structures/circuits chez les souris modèles, si elle atténue/normalise les comportements excessifs et ceux caractérisant le trouble du spectre de l’autisme, apporterait une preuve de concept que les formes humaines les plus sévères de ce trouble peuvent potentiellement être améliorées via des techniques de stimulation cérébrale non invasives inhibitrices.
Procédures
Le premier lot d’animaux réalisera le test permettant de révéler les comportements excessifs sur 10min suivi d’une injection. Le deuxième lot d’animaux réalisera deux fois ce test comportemental de 10min et recevra 2 injections, avec un intervalle de 4 jours entre le premier et le second test et leur injection. Le troisième lot d’animaux réalisera le test de 10min, permettant de révéler les comportements excessifs, suivi d’une injection. Après 3-4 jours, il sera soumis à 3 tests comportementaux différents, permettant de suivre les traits autistiques. Ces tests (intérêts restreints, 30min ; comportements répétitifs, 10min ; sociabilité, 30min) seront réalisés à 48h d’intervalle précédés chacun d’une injection.
Impact sur les animaux
La répétition de tests comportementaux pourrait engendrer du stress. Les injections en intrapéritonéal pourraient engendrer irritation et douleur au point d’injection et du stress car réalisées sur animaux vigiles.
Devenir
Afin d’analyser au niveau histologique les liens entre comportement et activité neuronale, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de lier activité neuronale et comportement. Seule l’utilisation d’un modèle murin du trouble du spectre de l’autisme, exprimant une protéine rapportrice dans les neurones activés lors d’un comportement excessif, devrait permettre d'identifier les structures/circuits dont le dysfonctionnement pourrait être responsable de la sévérité du phénotype autistique. Chez les souris modèles exprimant un récepteur inhibiteur dans les neurones activés lors de ces comportements excessifs, l’inhibition de ces structures/circuits, si elle corrige les comportements, apporterait une preuve de concept que les formes humaines les plus sévères du trouble du spectre de l’autisme peuvent être potentiellement améliorées via des techniques de stimulation cérébrale non invasives inhibitrices.
Réduction
Afin de révéler des différences pathologiques, 12 animaux par groupe sont requis. Des tests statistiques appropriés permettront de révéler la significativité de ces différences. Les expériences seront réalisées en aveugle et l’ordre de passage des individus pour les tests comportementaux se fera au hasard. Les groupes utilisés en premier permettront de déterminer s’il y a d’abord des différences 1) entre contrôles et modèles exprimant la protéine rapportrice, au repos ou après réalisation du test pour révéler les comportements excessifs (4 groupes) et 2) entre modèles exprimant le récepteur inhibiteur avant et après traitement avec le ligand ou son solvant (2 goupes). Les groupes suivants permettront de prouver la spécificité des différences observées. 19 groupes seront nécessaires à la réalisation de l’ensemble du projet. Le trouble du spectre de l’autisme affecte préférentiellement les garçons, les filles pouvant camoufler leur phénotype. Les mâles et les femelles seront testés en parallèle. Les analyses se feront en fonction du sexe afin de déterminer si les traits autistiques des femelles sont moins marqués que ceux des mâles et si cela peut être lié à l’activation d’un circuit différent permettant aux femelles de camoufler leurs traits autistiques. 228 souris par sexe seront nécessaires. Les différences d’activité entre contrôles et modèles seront modélisées afin d’identifier les structures dont l’activité devrait être modifiée pour normaliser les comportements excessifs. Cette modélisation devra être toutefois validée par les résultats expérimentaux de l’inhibition des neurones activés lors des comportements excessifs.
Raffinement
Les souris seront suivies régulièrement et des points limites spécifiques au projet seront appliqués. La semaine suivant l’habituation à la zone d’hébergement dédiée aux souris utilisées en comportement, les souris seront quotidiennement placées en pièce de comportement pendant au moins 1h puis entrainées à être manipulées par l’expérimentateur pendant une minute (maintien dans les mains de l’expérimentateur formant une coupe, prise de poids, marquage sur la queue). Le marquage sur la queue permet de repérer rapidement les animaux et de les manipuler toujours dans le même ordre, installant une routine et facilitant les interactions avec l’expérimentateur (i.e vers le 5ème jour, à chaque ouverture du couvercle, les souris peuvent se présenter dans l’ordre où elles vont interagir, les autres restant dans le nid). 48h après cet entrainement, les souris réaliseront selon les groupes de 1 à 4 tests comportementaux (test pour révéler les comportements excessifs ; répétition de ce test avant et après traitement à 3-4 jours d’intervalle pour les effets de l’inhibition des neurones responsables de ces comportements excessifs ; test pour révéler les comportements excessifs puis 3-4 jours après et à 48h d’intervalle les tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d’intérêts restreints). Ces tests ne devraient pas engendrer de stress chronique. Le poids des animaux sera régulièrement suivi lors de l’entrainement à la manipulation et avant chaque test comportemental. Les tests seront interrompus en cas de perte de poids pour laisser aux souris le temps de récupérer. Selon les groupes, les souris recevront de 1 à 4 injections. En cas d’injections répétées, elles seront suffisamment espacées pour ne pas provoquer d’irritation. Pour prévenir la douleur qui pourrait survenir suite aux injections répétées, un traitement antalgique de fond sera ajouté à l’eau de boisson durant toute la période de répétition des injections
Choix des espèces
La souris est la seule espèce où il est possible de modéliser le trouble du spectre de l’autisme, de suivre les neurones activés lors de comportements particuliers et d’inhiber ces neurones pour voir si les comportements peuvent être améliorés. Le trouble du spectre de l’autisme est un trouble neurodéveloppemental dont les symptômes comportementaux apparaissent dans la petite enfance, généralement avant 3 ans, et se maintiennent toute la vie. Il y a peu de tests comportementaux pouvant être réalisé avant sevrage chez la souris. Les expériences seront donc réalisées sur des jeunes adultes de 1.5 à 2,5 mois.