Recherche fondamentale

Soumises la nuit à six séries de sons de trente minutes espacées de trois heures, soit trois heures de stress sonore, certaines souris sont utilisées comme modèle de fibromyalgie. D'autres reçoivent jusqu'à dix injections d'une molécule qui déclenche la migraine chez les patients migraineux, avec application de filaments fins ou de jets d'air sur la face ou la patte toutes les trente minutes pendant quatre heures les jours d'injection. D'autres encore boivent pendant une semaine une eau contenant une molécule qui irrite l'intestin, et une partie subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sans réveil. 672 souris en tout, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin parce que les protocoles se terminent par un prélèvement d'organes.

Objectifs

Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, que sont la fibromyalgie, la douleur viscérale et la migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraine chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.

Procédures

Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins ou de jets d'air sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée. Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules qui durent moins d'une minute. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ou de jet d'air), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Les animaux seront âgés de 8-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les souris sont considérées comme de jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain. Les animaux génétiquement modifiés seront âgés de moins d’une semaine (injection virus) à 12-14 semaines (expérience d’imagerie calcique).

Chaque souris subit une ovariectomie puis la pose d'une capsule hormonale, avant une lésion électrique ou mécanique de la carotide. 540 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus prélevés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but déclaré est de mesurer la cicatrisation des artères après la chute hormonale, pour comparer différents œstrogènes censés protéger les vaisseaux après la ménopause. Le porteur résume les conséquences de ces trois interventions par animal, soit 1 620 opérations au total, en une seule phrase qui mentionne une douleur, une perte de poids et un stress.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux sont la première cause de décès chez les femmes. Pourtant, on ne comprend pas encore très bien comment la ménopause joue un rôle dans ce phénomène. Après la ménopause, le taux d’œstrogènes (les hormones féminines) chute, ce qui pourrait augmenter le risque de problèmes cardiovasculaires. Ce projet cherche à savoir si certains traitements à base d’œstrogènes, ou de substances qui agissent comme eux, peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, on utilise un modèle de souris dont on retire les ovaires, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (car les souris n'ont pas de ménopause naturelle). L’efficacité des traitements est mesurée en observant comment les artères se réparent après une petite blessure, ce qui permet de voir si les molécules testées aident à maintenir une bonne santé vasculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’œstrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 540 animaux 2-Pose de capsule à libération prolongée (5min) 540 animaux 3-Lésion életrique de la carotide (20min) 270 animaux 4- Lésion mécanique de la carotide (20-30min) 270 animaux. Les animaux subissant la lésion électrique de la carotide ne sont pas les mêmes que ceux subissant la lésion mécanique.

Impact sur les animaux

Les chirurgies sur la souris telles que l’agression de la carotide (mécanique ou électrique), l’ovariectomie ou la pose de capsule à libération prolongée peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation endothéliale. Ce processus implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires présentent dans le vaisseau « perdent » l’expression du récepteur des oestrogènes.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 5 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisament prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont sous fond génétique C57BL6 qui est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.

Pour tester des composés candidats contre l'arthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriasique, 434 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus. L'inflammation articulaire est provoquée par une injection intra-péritonéale ou par deux injections intradermiques espacées de dix-huit jours, suivies de traitements administrés par voie intraveineuse, sous-cutanée, orale ou topique, avec dépilation sous anesthésie. Raideur articulaire et douleur à la mobilisation sont attendues, et de la nourriture en gel est déposée dans la cage pour limiter les déplacements des souris arthritiques. Aucun antalgique ne leur sera administré, le porteur indiquant qu'il interférerait avec l'effet attendu des composés testés, la souffrance restant encadrée par une grille de score et un point limite.

Objectifs

Les maladies inflammatoires ostéo-articulaires sont parmi les pathologies douloureuses et invalidantes les plus courantes et les plus répandues dans le monde, dont la prévalence devrait augmenter principalement en raison de l'augmentation de l'espérance de vie. Ces pathologies sont le plus souvent difficiles à repérer, mais peuvent avoir des répercussions sur l’état psychologique des personnes affectées par les douleurs chroniques qu’elles engendrent, et à plus long terme sur la vie professionnelle. On estime que 25 % des personnes atteintes d’ostéo-arthrite sont incapables d'accomplir leurs activités quotidiennes. De plus en plus de références indiquent maintenant que l'inflammation, locale et systémique, est à l'origine de dommages aux articulations et aux os. L'objectif du projet est d'évaluer la pharmacocinétique et l'efficacité thérapeutique de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires ostéo-articulaires telles que l'arthrite psoriatique ou l'arthrite rhumatoide. Les propriétés immunomodulatrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques de ces nouveaux composés seront évalués afin de pouvoir les considérer comme nouvelles modalités de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques dans le contexte des pathologies inflammatoires ostéo-articulaires, telles que la polyarthrite rhumatoide ou la spondylarthrite ankylosante. L'objectif est d'analyser les effets des traitements candidats dans la résolution de la pathologie. Les résultats attendus pourraient avoir un impact direct sur la prise en charge des patients en offrant de nouvelles options thérapeutiques. Ces traitements pourraient non seulement réduire la douleur et l’inflammation, mais également prévenir la progression des lésions articulaires, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. L’identification de traitements plus efficaces permettrait également de limiter la dépendance des patients aux traitements traditionnels, souvent lourds et invasifs.

Procédures

Les souris recevront une injection intra-péritonéale pour induire le modèle sur souris vigile (

Impact sur les animaux

Ce projet, bien que conçu pour minimiser l'impact sur les animaux entraine des nuisances ou effets indésirables inhérents à la mise en œuvre de modèles d'arthrite psoriatique ou d'arthrite rhumatoide. Ces modèles peuvent entraîner une inflammation articulaire et des douleurs au niveau des membres. Les symptômes comprennent des signes cliniques dans ces modèles tels que la raideur articulaire et une douleur à la mobilisation. Chaque animal sera étroitement surveillé quotidiennement en aveugle tout au long de l'étude et leur état sera évalué d’après une grille de scores, selon des paramètres physiologiques, des critères d’apparence physique et de comportement général, afin d’intervenir tôt dans la prise de décision de la poursuite du protocole. Une grille de score est établie pour les deux modèles incluant un point limite pour chaque modèle. L’utilisation d’antalgiques n’est pas envisageable, elle interférerait avec l’effet attendu des outils thérapeutiques. Chez l’animal arthritique, nourriture et boisson seront apportées sous forme de gels placés dans la cage en cas de nécessité, afin de limiter les déplacements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo.

Remplacement

La recherche menée dans ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour traiter l'arthrite psoriatique et l'arthrite rhumatoïde. Les modèles in vitro et les simulations informatiques constituent des alternatives précieuses et seront exploitées dans les phases préliminaires. Ces méthodes contribueront à réduire le nombre d’animaux nécessaires en éliminant en amont les composés inefficaces ou potentiellement toxiques. Cependant, ces approches ne peuvent pas reproduire les processus biologiques complexes d’un organisme vivant, tels que les interactions immunologique ou l'inflammation ostéo-articulaire. Ce niveau de précision est indispensable pour garantir la robustesse et la transposabilité des résultats à un contexte clinique. Tous les efforts seront faits pour réduire leur nombre au strict minimum nécessaire et pour limiter leur inconfort par des soins appropriés et des critères d’arrêt clairs.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d’analyses statistiques rigoureuses. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe de traitement. Des pratiques spécifiques seront mises en œuvre tout au long du projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre les objectifs scientifiques : 1/ Études pilotes : Des expériences préliminaires seront réalisées sur un petit nombre d’animaux (24 pour la détermination des paramètres d’induction des modèles et 32 en incluant un traitement de référence pour chaque modèle) afin de tester la faisabilité des protocoles, valider les doses initiales des molécules et affiner les paramètres expérimentaux. Cela permettra d’optimiser les protocoles avant leur mise en œuvre à plus grande échelle. 2/ Modélisation informatique et études in vitro : Avant toute expérimentation in vivo, des approches in silico et des cultures cellulaires seront utilisées pour sélectionner les molécules ou formulations les plus prometteuses. Cette étape éliminera les composés inefficaces ou trop toxiques, réduisant ainsi les tests inutiles sur les animaux. 3/ Partage et réutilisation des tissus : Les prélèvements biologiques (sang, tissus, etc.) seront maximisés pour chaque animal afin de réaliser plusieurs analyses complémentaires. De plus, lorsque possible, les tissus prélevés pourront être partagés entre différentes études ou projets collaboratifs. 4/ Suivi longitudinal grâce à des techniques non invasives : L’utilisation de l’imagerie in vivo (bioluminescence, fluorescence) permettra de suivre l'inflammation au fil du temps, limitant la nécessité d’euthanasier des animaux à des points intermédiaires pour des analyses sanguines et histologiques. Les études seront conçues pour maximiser la qualité des données tout en limitant le nombre d’animaux : Les expériences pourront inclure des groupes de contrôle négatifs et positifs réduits, mais suffisamment représentatifs pour des comparaisons statistiquement valables. Une randomisation stricte des animaux dans les différents groupes sera appliquée pour minimiser les biais expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien être (alimentation, boisson, comportement général, grille de scores spécifiques au protocole...). Un enrichissement dans la cage (igloo et carrés de coton) permettra d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Dans le cadre de l’évaluation des seuils tactiles ou thermiques, les animaux seront apportés dans la salle d’expérimentation pour des séances d’habituation, se déroulant sur les deux journées consécutives précédent le début de la procédure. Durant ces sessions, les animaux seront mis en présence de l’expérimentateur et du matériel utilisé afin de les familiariser à cet environnement. Dans la mesure du possible, la même salle d’expérimentation sera utilisée tout au long de la procédure expérimentale. Leur poids sera évalué régulièrement, au minimum 3 fois/semaine, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. L'utilisation d'analgésiques n'est pas réalisable sur ces modèles car apporterait un biais expérimental mais des points limites ont été définis afin de limiter la souffrance des animaux. Afin de limiter le stress et la douleur des animaux, les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Approches de fin d’étude respectueuses : Utilisation de méthodes approuvées pour garantir une euthanasie rapide et sans douleur avec vérification systématique de l’absence de conscience avant toute analyse post-mortem. Maximisation des données par animal : Réalisation de multiples analyses sur les tissus collectés pour limiter le recours à des animaux supplémentaires. Tous les intervenants sont formés à l'expérimentation animale et aux techniques d’imagerie et standardisation des procédures pour garantir la reproductibilité des résultats et minimiser les variations entre opérateurs. Cette stratégie de raffinement vise à améliorer le bien-être animal à chaque étape du projet, tout en maximisant et fiabilisant les données obtenues par animal. Elle repose sur des techniques avancées, une gestion rigoureuse des conditions expérimentales, et une surveillance constante du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle expérimental de choix pour l'étude des maladies inflammatoires comme l'arthrite rhumatoïde et psoriasique. Les souris possèdent un système immunitaire bien caractérisé et similaire à celui des humains, permettant une extrapolation pertinente des mécanismes immunologiques étudiés. La disponibilité de lignées consanguines facilite l’exploration des réponses immunitaires spécifiques et des mécanismes d’action des traitements testés. Elles permettent de reproduire les caractéristiques cliniques, histopathologiques et immunologiques de ces pathologies, facilitant l’étude des mécanismes sous-jacents et l’évaluation de traitements thérapeutiques. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~7-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction d’une inflammation menant au développement de maladies ostéo-articulaires chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.

Ligature de l'artère fémorale, injection d'une toxine dans le muscle de la patte, irradiation des pattes postérieures sous anesthésie : 180 souris subissent ces interventions, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection de cellules souches musculaires humaines, associées ou non à un biomatériau, pour évaluer une thérapie cellulaire de l'ischémie chronique des membres inférieurs. Les atteintes décrites comprennent une perte de poids de 10 %, un poil ébouriffé, une paupière fermée, une posture anormale et une mobilité réduite dans les vingt-quatre heures. Le porteur affirme pourtant qu'aucun signe de souffrance n'est observé après l'irradiation des pattes postérieures, la moelle osseuse étant selon lui parfaitement conservée.

Objectifs

L’ischémie chronique des membres inférieurs est la forme la plus grave de maladie vasculaires périphérique.s Elle est associée à une faiblesse et des douleurs musculaires qui ne peuvent s'expliquer uniquement par une réduction du flux sanguin. Le muscle squelettique adulte possède une forte capacité de régénération grâce à des cellules souches musculaires résidentes. Leur fonction réparatrice est étroitement régulée par leur environnement. Plusieurs études ont montré l’existence d’interactions entre les cellules souches musculaires et les cellules vasculaires environnantes lors de la réparation du muscle squelettique. Les signaux contrôlant ces interactions dans le contexte de l'ischémie des membres inférieurs ne sont pas connus. De même, les mécanismes du remodelage tissulaire et la contribution des cellules souches musculaires au développement des lésions musculaires post-ischémiques restent peu explorés. Nous avons observé qu’une exposition chronique à un faible taux d’oxygène altère la fonction des cellules souches musculaires et par conséquent la régénération musculaire chez la souris. Étant donné l'importance du tissu musculaire comme support biomécanique et biologique de la revascularisation, une altération fonctionnelle des cellules souches musculaires pourrait participer à l'aggravation des lésions musculaires et au défaut de perfusion des membres inférieurs chez les patients atteints d’ischémie des membres inférieurs. Dans ce contexte, nos objectifs sont 1) de caractériser l’altération des propriétés cicatricielles des cellules souches musculaires issues de patients atteints d'ischémie des membres inférieurs in vivo, et 2) d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la restauration d’un tissu musculaire viable par des approches de thérapie cellulaire associant des cellules souches musculaires humaines de muscle sain et des biomatériaux innovants, sur la revascularisation et la régénération des membres ischémiés in vivo.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables des lésions musculaires post-ischémiques chez les patients et offrira une nouvelle approche de thérapie cellulaire innovante pour le traitement de l'ischémie des membres inférieurs, en fournissant un support biomécanique favorable à la revascularisation des muscles ischémiés chez les patients.

Procédures

Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de quatre : 1. Injection d'une toxine dans le muscle de la patte sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Modèle de lésion musculaire par injection d'une toxine dans le Tibialis Anterior sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 3. Modèle de lésion musculaire par ligature de l'artère fémorale (modèle d’ischémie des membres inférieurs) sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min) 4. Injection de cellules souches musculaires humaines associées ou non à un biomatériaux dans le Tibialis Anterior sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min). Les procédures non invasives sur animal anesthésié sont au nombre de une : irradiation des pattes postérieures de la souris sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés à la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux liés à la récupération post-irradiation ou post-chirurgie (modèle de lésion musculaire) ; pouvant conduire à une perte de poids dans les 24 premières heures (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite). De notre expérience, les signes de souffrance interviennent dans les 24h suivant l’induction des lésions musculaires (que ce soit par un agent chimique ou à la suite de la ligature de l’artère fémorale) mais ne perdurent généralement pas au-delà. De même, aucun signe de souffrance n'est observé chez des animaux qui ont subi une irradiation que des pattes postérieures (la moelle osseuse étant parfaitement conservée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des deux procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à notre question biologique.

Remplacement

Afin de caractériser l’atteinte des capacités régénératrices des cellules souches musculaires (MuSCs) issues de patients atteints d’ischémie critique des membres inférieurs (ICMI) comparativement à des patients contrôles, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment, afin de tester in vitro leur capacité de prolifération, de différenciation et de fusion. Mais pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier et notamment entre les MuSCs et les cellules vasculaires. Notamment, l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’ICMI et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques innovantes dans le muscle ischémié. Enfin, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes des systèmes de réparation du muscle squelettique humain. Ainsi, le modèle de ligature de l’artère fémorale permet de reproduire les lésions ischémiques retrouvées chez les patients atteints d’ICMI, offrant une pertinence clinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette pathologie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés et grâce à l’utilisation de la patte opposée non injectée que nous utiliserons comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=10 animaux par groupe expérimental et par temps sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité inter-individuelle dans nos deux modèles chirurgicaux de régénération musculaire.

Raffinement

Les animaux importés qui arriveront de la zone d’élevage à la zone expérimentale sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 5 premières jours suivant la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé et établir la grille de score des points limites. En cas des signes de souffrance déinfis par la grille de score des points limites, des mesures graduées et adaptées (analgésie, mise à mort compassionnelle, ...) seront prises. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie et la réparation post-lésionnelle du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Elle a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées rendant possible la greffe de cellules d’origine humaine et permettant en déplétant les MuSCs de l’hôte de tester l’efficacité d’une thérapie cellulaire à base de MuSCs humaines sur la revascularisation et la réparation musculaire dans un modèle murin d’ICMI. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de limiter ainsi le nombre de cellules humaines à greffer in vivo. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 7 à 10 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules souches musculaires résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous maitrisons les modèles chirurgicaux de lésion musculaire pour lesquels nous n’avons aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous maitrisons les outils permettant les évaluations structurelles et moléculaires du muscle squelettique et le suivi des MuSCs humaines greffées chez la souris.

Tous les rats de cette lignée naissent homozygotes pour une mutation qui leur fait développer une polykystose rénale, avec des kystes dans les reins et parfois le foie, une hypertrophie rénale et une insuffisance rénale chronique. 650 rats vont naître de ces accouplements et être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la seule intervention déclarée étant la mise en accouplement. Le porteur écrit que les élever sur place réduit les coûts d'acquisition et permet d'adapter la production à l'avancement de ses projets. Il annonce que 100 % des animaux seront replacés dans l'élevage ou utilisés dans d'autres projets du laboratoire, tout en indiquant qu'aucun ne sera gardé au-delà de six mois et qu'ils seront mis à mort à cet âge, avant que la maladie n'entre dans sa phase sévère.

Objectifs

La polykystose rénale (PCK) autosomique est la maladie héréditaire rénale la plus fréquente, et généralement liée à des mutations des gènes. La polykystose rénale autosomique se caractérise aussi par des atteintes cardiaques et vasculaires, lesquelles sont potentiellement impliquées dans la progression de la dysfonction rénale. Ce sont des animaux génétiquement altères (AGA) car Ils portent une mutation spontanée ou induite dans un gène impliqué dans la polykystose rénale autosomique récessive (ARPKD). Cette mutation est héréditaire et stable, transmise selon un mode autosomique récessif. Elle provoque la formation de kystes rénaux et parfois hépatiques, mimant la maladie humaine.

Bénéfices attendus

La polykystose rénale autosomique est la maladie héréditaire rénale la plus fréquente, caractérisée par un déclin lent et progressif de la fonction rénale. Malgré les traitements actuels, cette pathologie évolue inévitablement vers une insuffisance rénale terminale. L’élevage de ces rats directement au laboratoire présente plusieurs avantages. D’une part, cela permet de réduire les coûts d’acquisition ; d’autre part, disposer des animaux sur place nous offre la possibilité d’adapter la production en fonction des besoins spécifiques et de l’avancement de chaque projet. En outre, ces animaux étant généralement produits aux États-Unis, leur élevage local permet d’éviter le stress lié à un transport prolongé, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être. Nous élevons des rats PCK homozygotes (génotype PCK/PCK), un modèle reposant sur une mutation autosomique récessive. De ce fait, tous les descendants expriment systématiquement le phénotype pathologique. Nous avons choisi d’utiliser cette lignée car elle développe spontanément une polykystose rénale autosomique récessive, la maladie que nous souhaitons étudier dans le cadre de nos deux projets scientifiques. Ce modèle présente l’avantage de développer rapidement une insuffisance rénale chronique, caractérisée par l’apparition de kystes corticaux et médullaires, ainsi qu’une hypertrophie rénale progressive. Cela nous permet de réduire le temps de maintien des animaux en animalerie et de les utiliser rapidement dans nos expérimentations.

Procédures

Mise en accouplement

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement. Dans le cas éventuel d’observation d’effets indésirables dus au génotype, nous utiliserons une grille d’évaluation du bien-être animal, sous forme d’un tableau. Le suivi clinique des rats révèle une progression caractéristique de la polykystose rénale au fil du temps. Jusqu’à l’âge de 4 à 5 mois, les animaux restent généralement asymptomatiques, bien que les kystes rénaux se développent progressivement de manière silencieuse.Les animaux seront mis à mort à l'âge de 6 mois avant que ne se déclarent des déficites sévères.

Devenir

Sur la totalité des animaux, 100% sont attendus pour avoir le bon génotype et seront replacés dans l’élevage ou utilisés pour d’autres projet du laboratoire. Nous élevons des rats PCK homozygotes (génotype PCK/PCK), ce modèle reposant sur une mutation autosomique récessive. Ainsi, tous les descendants expriment systématiquement le phénotype pathologique.

Remplacement

L’utilisation des animaux est obligatoire, car le développement de la dysfonction rénale et de la dysfonction cardiaque lors de la polykystose rénale autosomique est multifactoriel et aucune approche in silico, in-vitro ou ex vivo ne permet d'établir l'implication/interaction de tous les mécanismes impliques. Cependant dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in-vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules) pour étudier les mécanismes impliqués dans les effets observés..

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires au maintien de la lignée les couples initiaux seront réceptionné, plus accouplé, et des animaux des deux sexes seront replacés dans d’autres projet du laboratoire, afin d’utiliser l’intégralité des animaux générés à l’animalerie. Afin d’éviter la surproduction d’animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont spécifiquement adaptées : litière douce, enrichissement de l’environnement (abris, objets à ronger), et accès illimité à l’eau. Les animaux ne sont pas maintenus au-delà de 6 mois, afin d’éviter l’apparition de la phase terminale de la maladie. Étant donné que l’état pathologique commence à se dégrader de manière significative à partir de 6 mois, aucune mesure spécifique supplémentaire ne sera mise en place, puisque les animaux issus de notre reproduction ne dépasseront pas cet âge. Nous resterons cependant très attentifs à tout signe de perte de poids ou de déshydratation. Une surveillance rigoureuse de la consommation d’eau sera assurée, et des précautions particulières seront prises pour garantir un bon suivi. Des pesées régulières seront effectuées afin d’adapter l’alimentation, notamment par l’ajout de nourriture enrichie dans les cages si nécessaire.

Choix des espèces

Les effets de l’anticorps neutralisant la vasopressine seront déterminés en utilisant la souche de rats. Cette souche a la particularité de développer spontanément un polykystose rénale comparable à la polykystose rénale humain. De plus seul l'utilisation des animaux vivants permettent pour comprendre les interactions entre les différents organes (rein, cœur, foie...) et les altérations neuro-humorales, immunitaires, métaboliques. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles jeunes seront randomisés dès l'âge de 4 semaines renterrons dans le protocole scientifique à l’âge de 6 semaines. Les animaux ne seront pas maintenus au sien de notre animale au-delà de 6 mois. Nous effectuerons nous même au sein de notre animalerie les reproductions nécessaires pour obtenir les 400 pck/pck Les deux sexes seront utilisés. Il n’y aura pas de mise à mort précoce liée au sexe, puisque mâles et femelles seront intégralement inclus dans les deux projets scientifiques.

Nées avec une mutation qui réduit leur poids dès le sevrage, des souris modèles d'une maladie mitochondriale deviennent apathiques entre un mois et un mois et demi, et certaines perdent brutalement du poids puis s'isolent entre quatre et sept mois. Une échographie cardiaque sous anesthésie générale, un test sur tapis roulant et cylindre rotatif, une IRM cérébrale de trente à soixante minutes, deux administrations orales par jour pendant deux mois et trois prélèvements de sang à la veine submandibulaire jalonnent le protocole appliqué à 2 720 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range en sévérité modérée les seules nuisances liées aux gestes expérimentaux et décrit à part la dégradation due à la mutation, tout animal isolé dans sa cage ou ayant perdu plus de 20 % de son poids étant mis à mort. Les reproducteurs sont gardés pendant leur phase reproductive, de deux à six mois, puis tués comme tous les autres.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration par voie orale par pipette du médicament supplémenté d’une solution appétante ayant pour but que les souris viennent spontanément prendre le médicament (gavage si nécessaire à l'aide d'une sonde adaptée dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par la technique d’administration orale par pipette ou si la solution appétante ne faciliterait pas le processus) (2 fois par jour pendant 2 mois) et un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale submandibulaire (5 minutes maximum) à 1.5 mois, 2.5 mois et 3.5 mois (1 fois à chaque temps).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles, présentant une mutation que nous allons utiliser, sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Les effets indésirables de cette mutation sur le modèle se traduit par un poids plus faible dès le sevrage et un comportement apathique qui apparaît entre 1 et 1,5 mois pour le modèle KI/KO et entre 2,5 et 4 mois pour le modèle KI/KI. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale et un isolement dans la cage. Les jeunes souris peuvent également parfois présenter une dépilation transitoire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale submandibulaire sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquences sur le bien être de l'animal. Dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par administration par voie orale par pipette, le gavage remplacera cette technique. Celle-ci, si utilisée régulièrement, pourrait entraîner un stress chez l'animal, lié au geste de contention et du geste de gavage, et une irritation de l’œsophage lié à la répétition de l'administration.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite. Pour les procédures de traitements des animaux, nous utiliserons au maximum, à la place du gavage, la technique dite MDA (micropipette-drug administration) qui consiste à donner oralement par pipette le médicament supplémentée d’une solution appétant pour habituer les souris à venir boire spontanément d’elle-même le médicament. En utilisant cette technique, nous évitons le stress et les irritations possibles par le gavage au niveau œsophage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 1.5 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.