Recherche fondamentale
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Étude de l’impact de l’inflammation sur la sévérité du trouble du spectre autistique (TSA) chez des souris SHANK3 : Effet du LPS et intervention anti-inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatre injections d'un agent inflammatoire pour 315 souriceaux, huit jours de gavage pour 180 autres, trois jours de test comportemental de dix minutes, puis l'exsanguination à quatorze ou trente-cinq jours de vie. 495 souris porteuses d'une mutation du gène SHANK3 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 315 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si des anti-inflammatoires atténuent les symptômes comportementaux associés à l'autisme dans ce modèle, mesurés par un test que le porteur ne nomme pas. Aucune souris ne dépasse cinq semaines de vie.
Objectifs
Le trouble du spectre autistique (TSA) est une pathologie neurodéveloppementale qui provoque des déficiences dans l’interaction sociale et des comportements répétitifs. En Europe, la prévalence des TSA est en augmentation, avec environ 1 enfant sur 100 recevant un diagnostic. Cette augmentation a des répercussions sociétales et financières majeures, le coût annuel des TSA dans l’Union européenne étant estimé à 258 milliards d’euros. Les programmes de santé européens, ainsi que des initiatives telles qu’ERA-NET et EURAS, mettent un fort accent sur le traitement des TSA. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement neurophysiologique et à la physiopathologie des TSA est l’objectif principal du projet pour ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En premier lieu on souhaite étudier les effets protecteurs des anti-inflammatoires dans un contexte pathologique, l’autisme. L’étude cherchera à savoir dans un deuxième temps si ces traitements anti-inflammatoires peuvent atténuer les symptômes comportementaux induits par l’inflammation comme l'autisme Cette étude permettra non seulement de tester une approche préventive contre l’aggravation des symptômes liés à l’autisme, mais aussi d'identifier les mécanismes par lesquels la modulation de la réponse inflammatoire peut corriger ou réduire les anomalies synaptiques et comportementales. Des mesures seront effectuées pour suivre l'évolution des marqueurs inflammatoires cérébraux et étudier la physiologie des neurones avec des mutations identifié dans le trouble du spectre de l'autisme
Bénéfices attendus
Le développement de modèles expérimentaux, tels que les souris portant des modifications génétiques SHANK3, pour tester l'effet des anti-inflammatoires, apporte des retombées significatives tant sur le plan scientifique que sur celui de la santé publique. Sur le plan scientifique, ces modèles permettent de mieux comprendre comment la modulation de l'inflammation peut influencer les symptômes associés à des mutations génétiques spécifiques. Les résultats de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les processus inflammatoires, avec un potentiel pour améliorer les traitements existants pour les patients atteints de troubles du spectre autistique (TSA). Ces avancées pourraient mener au développement d'interventions pharmacologiques innovantes, offrant des options supplémentaires, particulièrement pour les patients dont les symptômes sont exacerbés par l'inflammation. En matière de santé publique, l'amélioration de l'efficacité des traitements pourrait réduire les coûts de prise en charge des TSA en diminuant la nécessité de soins intensifs et en améliorant la qualité de vie des patients. Une meilleure gestion des symptômes permettrait également de soulager considérablement les aidants qui s'occupent quotidiennement des patients atteints de TSA, réduisant leur charge mentale et physique, et contribuant ainsi à un mieux-être global, tant pour les patients que pour leurs familles. Ces progrès entraîneraient des économies substantielles pour les systèmes de santé.
Procédures
315 souriceaux auront 4 injections et 180 souriceaux auront 8 jours de Gavage (10 secondes par injection/gavage). Le test comportementale dure 3 jours avec un essai de 10 min par jour. Tous les animaux seront prélevés après exsanguination pour les études sur tranches aigues ou histologiques soit à P14 ou P35.
Impact sur les animaux
Les étapes du gavage et l'induction de l'inflammation par injection entraînent des effets indésirables sur les animaux : douleurs, inflammation du site d'injection. Le test comportemental chez la souris induit un peu de stress lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel parfois renforcé par la présence d’odeurs et de signaux sociaux. Les nuisances sont réduites grâce l’habituation et des conditions expérimentales adaptées qui sont mises en place
Devenir
Euthanasie pour étude histologique ou electrophysiologique
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations synaptiques sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. Ce choix permet une analyse statistique robuste et adaptée à la complexité du plan expérimental. Le nombre d’animaux (n = 14–16 par condition expérimentale, en moyenne n=15) est basé sur des études antérieures de l’équipe montrant que ce nombre permet de détecter des différences d’au moins 20 % avec une puissance statistique ≥ 80 % et un seuil α = 0,05. Cette estimation tient compte de la variabilité biologique attendue dans les enregistrements électrophysiologiques et/ou les mesures comportementales. (3)Les deux sexes sont inclus pour assurer une meilleure représentativité biologique des résultats. Chaque groupe expérimental comprendra 7 à 8 mâles et 7 à 8 femelles, analysés séparément puis comparés pour évaluer les interactions liées au sexe
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur. Des critères de bien-être seront évalués : maternal care, état des souriceaux allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures d'injection/gavage seront décrits dans les procédures. Si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous-cutanée une injection quotidienne d’Inflacam ou morphenique jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale dans un contexte pathologique. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux durant le développement et à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Impact de la mutation du gène responsable de la maladie rare de l’aniridie sur la cornée
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une éraflure volontaire de la cornée, que le porteur compare à un grain de sable dans l'œil, attend une partie des souris de ce projet. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, l'autre modérée. Elles portent une mutation qui les prive d'iris ou leur donne des yeux anormalement petits, et dont la cornée s'opacifie avec l'âge, pour étudier une maladie humaine qui touche une personne sur 100 000. Le porteur conclut qu'"aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l'animal", tout en décrivant des douleurs passagères après l'abrasion et l'administration systématique d'antidouleurs.
Objectifs
L’aniridie est une maladie génétique très rare qui touche environ 1 personne sur 100 000. Une des caractéristiques principales de la maladie est l’absence partielle ou totale de l’iris, la partie colorée de l’œil. Elle peut aussi entraîner une sécheresse oculaire et une opacification progressive de la cornée, la couche transparente à l’avant de l’œil. Cela peut provoquer une baisse importante de la vision au fil du temps. Chez les personnes atteintes d’aniridie, la cornée est souvent plus fine, moins bien protégée et moins bien "innervée", c’est-à-dire moins bien reliée aux nerfs. Cela peut entraîner une perte de sensibilité et, dans les cas avancés, une opacification qui rend la vision floue. Beaucoup de patients deviennent malvoyants à partir de la soixantaine, même s’ils gardent souvent une perception de la lumière et des couleurs. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement pour guérir cette maladie. C’est pourquoi il est important de mieux comprendre comment cette mutation affecte l’œil, en particulier la cornée et son environnement. Dans notre laboratoire, nous étudions l’aniridie à l’aide d’un modèle animal (la souris) mimant ou reproduisant la maladie humaine. Nous allons analyser différents éléments de l’œil de ces souris : la composition des larmes, la pression à l’intérieur de l’œil, et l’état des fibres nerveuses de la cornée. Ces analyses nous aideront à mieux comprendre comment l’aniridie perturbe le fonctionnement normal de l’œil et à identifier, à terme, de nouvelles pistes de traitement.
Bénéfices attendus
Dans l’aniridie, la perte de vision s’aggrave lentement au fil du temps. Cela donne une chance précieuse d’intervenir avant que les dégâts ne deviennent irréversibles. Malheureusement, les traitements disponibles aujourd’hui sont très limités. À un stade précoce, certains collyres (gouttes pour les yeux) peuvent soulager les symptômes. Mais lorsque la maladie est plus avancée, la seule option est souvent une greffe de cornée. Or, cette opération est lourde, comporte des risques de rejet, et n’apporte parfois qu’un soulagement temporaire. Face à ce manque de solutions, notre projet de recherche a pour but de mieux comprendre ce qui ne fonctionne pas dans la cornée dans le cadre de cette maladie. Ainsi, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour développer des traitements innovants, plus efficaces et moins invasifs. Nous cherchons notamment à comprendre en détail les réactions en chaîne, au niveau moléculaire, qui mènent à la dégradation de la cornée. Ce travail devrait aussi donner lieu à des publications scientifiques, et peut-être à des dépôts de brevets, contribuant ainsi à faire avancer la recherche dans ce domaine encore peu exploré.
Procédures
Les souris seront manipulées pour permettre la mesure de certains paramètres importants, comme la sensibilité de la cornée ou la pression à l’intérieur de l’œil. Ces examens sont similaires à ceux réalisés régulièrement chez l’humain lors de consultations ophtalmologiques. Nous effectuerons une éraflure volontaire et contrôlée de la cornée, dans le but d’étudier l’étape de cicatrisation chez les souris malades. Cette blessure est légère, équivalente à un grain de sable dans l’œil, et guérit spontanément en trois jours. Durant toute cette période, les animaux sont suivis, et des antidouleurs leur sont administrés en cas de nécessité afin de garantir leur bien-être.
Impact sur les animaux
L’aniridie est une maladie génétique rare qui touche principalement les yeux. Pour mieux l’étudier, nous utilisons un modèle animal (la souris) qui mime cette maladie. Elle est caractérisée par une absence de l’iris, la partie colorée de l’œil et/ou par des yeux d’un volume anormalement petit. Ces animaux développent progressivement une opacification de la cornée due à la maladie, entraînant une diminution de leur acuité visuelle. Cela n’impacte pas leur comportement ni leur espérance de vie. Tout comme les patients, ces animaux ne présentent pas de signes de douleur liés à la maladie. Pendant les expériences, certaines manipulations sont nécessaires, comme mesurer la sensibilité de la cornée ou réaliser une blessure sur celle-ci. Cette blessure, appelée abrasion cornéenne, est faite sous anesthésie générale. Chez l’Homme, l’abrasion de la cornée est la première étape des traitements de la myopie au laser. L’abrasion est un modèle de blessure pouvant induire des douleurs passagères équivalente à une irritation dû à un grain de sable dans l’œil. Elle est superficielle et guérit spontanément en trois jours. Des médicaments antidouleur sont systématiquement administrés après chaque intervention, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les souris seront manipulées par les expérimentateurs, ce qui pourra générer du stress. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie générale répétée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’effet de la maladie sur les structures de l’œil : la cornée, les larmes, l’iris et le cristallin.
Remplacement
Les méthodes en laboratoire sur des cellules seules ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organe entier comme l’œil, avec toutes ses parties et son fonctionnement. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, en particulier des souris porteuses d’une maladie rare comme l’aniridie. Ce modèle nous aide à mieux comprendre la maladie et ses effets sur l’ensemble de l’œil, un organe complexe.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à cette étude a été rigoureusement déterminé à l’aide de logiciel permettant de calculer statistiquement le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Sur l’ensemble de la durée du projet (5 ans), un maximum de 252 souris sera utilisé. Parmi les animaux utilisés, la moitié sera porteuse de la maladie et l’autre moitié sera saine afin de comparer les résultats.
Raffinement
Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe de 2 individus minimum, environnement adapté et enrichi. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée de l’intervention, avec l’utilisation d’antidouleurs et anesthésiques adaptés. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal.
Choix des espèces
Le système visuel de la souris ressemble beaucoup à celui de l’humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier l’aniridie, une maladie rare de l’œil. Nous travaillons sur des souris adultes de 12 semaines, âge auquel l’œil a fini de se développer. Pour compléter, nous étudions aussi l’impact de la maladie au cours du développement, donc sur des souris plus jeunes : de 2, 3 et 4 semaines.
Etude d’une protéine impliquée dans l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin pour que leur cerveau soit prélevé, 774 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 346 d'entre elles inhalent un agent convulsivant cinq jours de suite, 146 reçoivent des injections pendant cinq jours, l'ensemble servant à créer deux lignées génétiquement modifiées pour étudier une protéine liée à l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'accompagne les crises, par analogie avec la perte de conscience décrite chez l'humain, tout en signalant que les souris épileptiques meurent subitement dans moins de 5 % des cas et que les crises provoquées pourraient augmenter cette fréquence. Il conclut que le recours à des animaux vivants est "absolument nécessaire".
Objectifs
L’épilepsie est une maladie cérébrale qui se manifeste par des crises soudaines et répétées. Ces crises sont causées par une activité électrique anormale dans les neurones. L’objectif de ce projet est de générer deux modèles de souris génétiquement modifiée afin d’étudier les mécanismes neuronaux impliqués dans cette pathologie à différents moments de la vie et lors des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Cette recherche pourrait aider à mieux comprendre les causes de l’épilepsie afin de développer de nouveaux traitements qui restaureraient l'excitabilité neuronale normale et atténueraient l'activité épileptique.
Procédures
Une injection sera faite pendant 5 jours sur 146 animaux. 346 animaux seront soumis à l’exposition répétée (5jours consécutifs) à un agent convulsivant par inhalation.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les injections peuvent entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute, suivi d'une période d’immobilité d’environ 1 minute. Les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement avec une fréquence faible (moins de 5%). Les inductions artificielles de crises pourraient augmenter la fréquence des morts soudaines. Aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place (épileptogenèse) peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardio-vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes cellulaire et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. En effet, il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques dans les modèles murins d'épilepsie. Les schémas d’accouplement ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales ; Le nombre minimum d’animaux nécessaires a été calculé pour utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique.
Raffinement
Les animaux seront stabulées avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées et éviter toute souffrance ou inconfort. Une grille d'observation est utilisée par le personnel pour surveiller attentivement l'état des animaux pendant l'expérimentation. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement est notée. Les animaux concernés sont alors suivis chaque jour et peuvent recevoir un traitement contre la douleur si nécessaire. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont l’épilepsie. Les crises peuvent être induite sans limite à partir du 19eme jour postnatal jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge de 3 semaines pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes ainsi qu’a l’âge adulte.
Etude du rôle de la vitamine D sur le bien-être de ouistitis hébergés en animalerie confinée
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des lampes UV doivent corriger la carence en vitamine D de primates enfermés en animalerie sans accès à la lumière du soleil, l'enfermement lui-même restant hors du champ du projet. 48 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, tous gardés en vie et réutilisés ensuite dans d'autres protocoles. Ils sont capturés, transportés jusqu'à la salle de prélèvement, anesthésiés quinze à trente minutes pour deux prises de sang, et deux prélèvements de poils. Le porteur indique que la réduction du nombre d'individus est "difficilement applicable" ici, et attend des résultats qu'ils garantissent "des données de haute qualité lorsque ces animaux seront impliqués dans des projets de recherche".
Objectifs
Aujourd'hui, l'utilisation des ouistitis en recherche biomédicale est en pleine expansion et la nécessité d'une gestion adaptée des conditions d'hébergement de colonies de ouistitis requiert une attention accrue. Parmi d'autres paramètres, la nutrition est un aspect majeur de l'élevage moderne ; les besoins nutritionnels individuels doivent être satisfaits à chaque étape de la vie, pour la santé et le bien-être des animaux en élevage. Ces bonnes pratiques contribuent également à réduire et à limiter le risque de résultats de recherche erronés ou variables dus à une mauvaise gestion. L'alimentation des animaux tout au long de leur vie influence les risques de morbidité et de mortalité dues à diverses maladies. L'alimentation des jeunes animaux influence également le phénotype des ouistitis, notamment leur croissance et leur développement. Il est à noter également que la plupart des centres d'élevage de ouistitis et de recherche actuelles sont situées en intérieur. Le manque d'accès à la lumière UV naturelle chez cette espèce est susceptible de provoquer des maladies osseuses métaboliques. De plus, de nombreux autres aspects potentiels du bien-être pourraient ne pas être satisfaits dans ce contexte. Par exemple, sans lumière naturelle et rayons UV, les ouistitis pourraient ne pas être capables de synthétiser la vitamine D3. Outre une supplémentation alimentaire en vitamine D3 (utilisée dans certains centres d'élevage et de recherche), l'accès à la lumière directe du soleil et/ou aux rayons UV en animalerie limiterait, voire préviendrait, la carence en vitamine D chez ces animaux. C'est pourquoi ce projet comporte plusieurs objectifs que sont: (i) évaluer les effets de la mise en place de lampe UV sur le maintien des niveaux de vitamine D3 dans 4 établissements utilisateurs de ouistitis, (ii) raffiner les meilleurs indicateurs de bien-être pour cette espèce et (iii) valider scientifiquement la vitamine D3 comme indicateur de bien-être pour les ouistitis.
Bénéfices attendus
Les données acquises permettront d'aider au management de la colonie de ouistitis en termes de gestion des besoins vitaminiques. Les techniques d’amélioration qui seront validées et les nouveaux indicateurs de bien-être animal qui seront acquis permettront d’obtenir ultérieurement des données de haute qualité lorsque ces animaux seront impliqués dans des projets de recherche. Aussi, il s’agira de s’assurer que les ressources mises en œuvre permettent de répondre non seulement au bien-être de ces animaux, mais aussi de déployer des études et des projets de recherche cohérents et solides sur le plan scientifique. De plus, notre approche pourrait être ajustée ultérieurement et testée sur d'autres espèces de primates non-humain. Nous menons cette étude sur quatre sites différents afin de renforcer la fiabilité et la portée de nos résultats : chaque établissement pouvant présenter des conditions de lumière UV, de supplémentation en vitamine D ou de gestion des animaux légèrement différentes, en comparant ces contextes variés, nous nous assurons que nos conclusions ne sont pas spécifiques à un seul environnement. Grâce à un échantillon plus large et diversifié, nous obtiendrons des données plus solides et représentatives, ce qui nous permettra de valider que les effets observés (positifs ou négatifs) sont vraiment liés aux interventions étudiées et non à des variations locales. Travailler sur plusieurs établissement utilisateurs favorise en outre la standardisation des protocoles, la vérification croisée des pratiques et l’échange d’expertises, ce qui garantit des résultats plus robustes, applicables à d’autres colonies de marmosets dans divers environnements.
Procédures
L'ensemble des interventions seront menées chez le ouistiti et mise à part les observations comportementales, toutes les interventions de prélèvements de substrat seront réalisées sous anesthésie. Les interventions sur les animaux seront les suivantes : (1) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale, anesthésies d’une durée de 15 à 30 minutes max, durée du prélèvement de 5 minutes max, (2) deux prélèvements de poils pendant l’anesthésie (durée 2 minutes max).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des effets bénéfiques sont attendus tels qu'une amélioration du bien-être animal sur le long terme du fait d’une meilleure métabolisation de la vit D. Toutefois des nuisances sont également attendues telles qu'un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture des animaux, le transport de la zone d'hébergement à la pièce de prélèvement, l'injection de l'anesthésique avant la réalisation des prélèvements sanguins, conséquences potentielles du prélèvement sanguin (hématome localisé).
Devenir
Tous animaux seront gardés en vie à la fin du projet, l’obtention de résultats dans ce projet ne nécessite pas la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’objectif de l’étude est l’amélioration du bien-être des ouistitis hébergés en captivité dans nos colonies et une amélioration de leurs conditions de vie. Le ouistiti constitue ici l’objet même du projet et pas seulement le modèle utilisé pour atteindre l’objectif. Il n’est pas possible de remplacer l’espèce étudiée par des alternatives non-animales dans ce contexte.
Réduction
Ce projet visant l'amélioration des conditions d'hébergement sur le bien-être des ouistitis de nos colonies. Le principe de réduction est difficilement applicable dans ce contexte puisque les mesures s'appliquent à l'ensemble des individus.
Raffinement
L'ensemble des animaux sont hébergés dans une animalerie confinée pour laquelle l'ensemble des conditions réglementaires sont appliquées et respectée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ou en famille en volières ou en cages avec des enrichissements structuraux (hamac, tunnel, branche, etc.) et alimentaires favorisant les comportements naturels (insectes vivants, gomme arabique). Les animaux impliqués dans ce projet proviennent de notre élevage et sont habitués dès tous petits à la présence humaine. De plus, les animaux qui participeront au projet sont régulièrement entraînés par conditionnement opérant et sont nourris à la main quotidiennement par ces mêmes personnes en charge de leur bien-être. Lors des phases expérimentales et l'observation, les captures et manipulation seront effectuées par les personnes assurant leur suivi au quotidien de manière à limiter le stress lié à la manipulation. Lors des phases de prise de sang les animaux seront anesthésiés et leur réveil sera surveillé tout comme les interactions sociales seront monitorées dans les heures et jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera initiée. Nous envisageons de réaliser des prélèvements sanguins et de poils pour permettre de comprendre et de confirmer le prélèvement de poils comme méthode de remplacement pour déterminer certaines hormones (cortisol et ocytocine) et le taux en vitamine D. Les résultats obtenus pourraient permettre à termes de réduire et limiter le nombre de prélèvements sanguins nécessaire pour suivre des paramètres hormonaux étudiés .
Choix des espèces
Le projet a pour objectif l’amélioration du bien-être d'animaux d'une colonie de ouistitis hébergés en animalerie intérieure n'ayant pas d'accès extérieur et par conséquent aux rayons solaires. La pertinence de l'espèce animale est ainsi en lien avec les besoins spécifiques de l'espèce en termes de conditions d'hébergements, amélioration du bien-être et besoins vitaminiques. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés pour obtenir des résultats sur des classes d’âge différentes chez des adultes. Nous exclurons de l’étude les femelles adultes gestantes ou allaitantes puisque le niveau de vitamine D change également avec l’état physiologique de l’animal.
Rôle de l’inflammation microcristalline dans l’athérosclérose expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois millilitres d'air injectés sous la peau du dos pour former une poche, puis des cristaux injectés dans cette poche, subissent l'ablation de la rate au cours d'une opération de trente minutes, jusqu'à vingt-huit gavages quotidiens et huit semaines de régime gras. Le porteur annonce l'identification, "à moyen terme", de cibles thérapeutiques contre les lésions cardiovasculaires liées à la goutte et à la chondrocalcinose, et une amélioration des soins "à long terme". Sur le remplacement, il décrit des tests sur lignées cellulaires qui servent à caler les doses avant le passage aux souris.
Objectifs
Les maladies à dépôts de microcristaux de pyrophosphate de calcium (PPC) et d’urate de sodium (UMS) sont les rhumatismes inflammatoires les plus fréquents de l’adultes, responsables respectivement de la chondrocalcinose et de la goutte. Ces cristaux déclenchent des arthrites aiguës récidivantes qui dépendent de médiateurs inflammatoires comme l'interleukine (IL)-1β. Les crises inflammatoires déclenchées par ces 2 types de cristaux sont associées à un risque accru d’événements et d’accidents cardiovasculaires (CV). L’élévation persistante de l’urate sanguin et l’inflammation modifient la réponse immunitaire et stimulent des changements des précurseurs des cellules immunitaires dans la moelle osseuse en stimulant la formation de cellules plus inflammatoires. Cette modification de la réponse immunitaire, appelée immunité innée entraînée peut accélérer l’athérosclérose et contribuer à l’augmentation du risque CV observée chez des patients goutteux ou souffrant de la maladie à dépôts de cristaux de PPC. Dans les modèles expérimentaux d’athérosclérose, un régime riche en gras en alternance accélère les lésions vasculaires et favorise les ruptures de plaque qui dépendent de l'IL-1β, cytokine clé de l’inflammation microcristalline. Les objectifs de ce projet sont, d'une part, de caractériser l’impact des crises inflammatoires microcristallines dans le changement des cellules immunitaire de la moelle, d'autre part, d'étudier l’implication de cette mémoire entrainée sur le développement de l’athérosclérose expérimentale, et enfin, d’en identifier les mécanismes physiopathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à moyen terme : 1. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour réduire les lésions d'athérosclérose liées aux crises inflammatoires microcristallines, 2. L'identification de cibles thérapeutiques pour prévenir les lésions cardiovasculaires, 3. L'identification des mécanismes de régulation épigénétique et métabolique liés aux crises inflammatoires microcristallines et 4. L'identification des mécanismes de régulation inflammatoire par l'urate soluble. A long terme, il permettra l'amélioration des soins chez des patients en identifiant des cibles thérapeutiques permettant de mieux contrôler les conséquences de l'inflammation microcristalline et de réduire les risques cardiovasculaires et donc la mortalité.
Procédures
Création d'une poche à air par injection dans la région dorsale de 3 ml d'air sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 2 fois, 30 secondes par geste. Injection dans la poche à air de cristaux sur animaux anesthésiés par inhalation d'isoflurane: 1 fois, 30 secondes. Injection d'agent pharmacologique sur animaux vigiles: 1 fois, 30 secondes. Prélèvement sanguin sur animal endormi : 1 à 4 fois, 1 minute ; Splénectomie sur animaux anesthésiés : 30 minutes. Gavage quotidien pendant 1 à 4 semaines. Un gavage par jour, nombre de gavage maximal par animal: 28. Régime riche en graisse pendant 8 semaines
Impact sur les animaux
Dans le modèle de splénectomie des douleurs sont attendues durant au maximun 3 jours avec possiblement une perte de poids et une réduction de l'activité. De plus, la répétition de manipulation des animaux peut engendrer un stress notamment pour les injections répétées d’anticorps. Les injections et prélèvements pourraient également entrainer des douleurs locales très légères. La technique de gavage pourrait également entrainer une gêne chez l’animal du fait d’une contention serrée durant le passage de la canule
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. L'évaluation finale nécessite la mise à mort de l'animal car les analyses sont effectuées sur des tissus de plusieurs compartiments
Remplacement
Des tests in vitro seront utilisés au maximum pour déterminer les conditions optimales des études in vivo : tests sur des lignées cellulaires pour déterminer la dose thérapeutique efficace d'un agent pharmacologique avant son utilisation chez l'animal; tests in vitro pour identifier le meilleur modulateur de l'immunité entraînée avant de l'étudier chez l'animal : blocage de médiateurs inflammatoires par exemple et tests in vitro pour valider les mécanismes cellulaires avant validation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses de l’inflammation dans les liquides de lavage des poches à air, analyses anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et composition cellulaire de l’aorte, analyses métabolomiques dans le sang et transcriptomes des cellules de la moelle.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages enrichies en cotons, maisons, bois, papiers dans les conditions standardisées d'hébergement et d'élevage. Pour limiter la souffrance et l’angoisse, une surveillance quotidienne et/ou hebdomadaire sera mise en place. La réalisation de la splénectomie sera effectuée en plaçant les animaux sur une plaque chauffante thermorégulée à 37°C après anesthésie générale. Les animaux recevront deux doses d’analgésique en pré (30 min) et post opératoire (6 heures). Une 3ème injection peut être réalisée le lendemain si l'animal est douloureux. Une anesthésie locorégionale sera réalisée en péri-opératoire sur les plans cutanés et musculaire . Une surveillance quotidienne renforcée sera mise en place après les injections, le gavage et la splénectomie. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été établis et en cas de douleur ou comportements anormaux les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous sédation préalable.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux reproduisent les maladies humaines et sont reconnus sur le plan international : modèle de poche à air pour étudier l’inflammation, modèle génétiquement modifié et régime WD pour étudier l’athérosclérose Les souris génétiquement modifiées développent, sous régime riche en matières grasses, des lésions d’athérosclérose similaires aux plaques d’athérosclérose humaines. Ces souris développent sous régime riche en matières grasses une hypercholestérolémie principalement sur la fraction des LDL, comme chez l’homme. Ces 2 modèles (inflammation dans poche à air et athérosclérose chez souris génétiquement modifiées) sont nécessaires dans l’exploration des mécanismes physiopathologies impliqués dans le développement de l’athérosclérose lié à l’inflammation microcristalline. Les souris génétiquement modifiées (Gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. Jeune adulte entre 2 et 5 mois permettant 1/ d’éviter la modulation de la réaction inflammatoire liée au vieillissement et 2/ d’avoir des souris avec un système immunitaire et inflammatoire compétent.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès quatorze jours de vie, une moitié reçoit des électrodes implantées dans le crâne au cours d'une opération de quatre-vingts minutes, d'autres une mini-pompe sous la peau renouvelée chaque mois, et tous subissent trois ponctions lombaires, des injections et des tests moteurs, de réflexes et de mémoire. Un test dit de dépression leur impose quatre jours de restriction alimentaire. Le projet teste des esters de cétones et du lactate comme sources d'énergie de remplacement, chez des rats porteurs d'une mutation qui prive leur cerveau de glucose. Le porteur explique avoir écarté la souris parce qu'elle ne fait pas de crises d'épilepsie, et parce que l'IRM donne une meilleure image sur un animal plus gros.
Objectifs
Le glucose est la principale source d’énergie du cerveau. Pour qu’il puisse atteindre les cellules cérébrales, il doit traverser certaines barrières naturelles grâce à des protéines spécialisées, notamment une appelée transporteur de glucose de type 1. Lorsque ce transporteur ne fonctionne pas correctement, le cerveau ne reçoit pas assez d’énergie. Cela provoque une maladie rare appelée syndrome de déficit en transport de glucose de type 1. Cette maladie débute généralement dans l’enfance et entraîne des crises d’épilepsie difficiles à traiter avec les médicaments classiques, un développement cérébral ralenti, de possibles malformations du crâne, et des troubles du mouvement comme des raideurs, des troubles de l’équilibre ou des mouvements involontaires. Actuellement, le traitement repose sur un régime alimentaire très particulier, appelé régime cétogène, qui fournit une autre source d’énergie au cerveau : les corps cétoniques. Mais ce régime ne fonctionne pas pour tous les patients, et il ne corrige pas les effets du manque d’énergie pendant les premières étapes du développement cérébral. Ce projet de recherche a pour objectif de tester de nouvelles sources d’énergie plus efficaces et plus faciles à administrer. Il s’agit notamment : d’esters de cétones, ajoutés dans l’eau de boisson, qui permettent d’atteindre rapidement un état favorable au fonctionnement du cerveau, et du lactate, administré de façon continue par une petite pompe implantée sous la peau. Ces traitements seront testés sur des rats porteurs d’une mutation qui réduit fortement l’expression du transporteur de glucose, afin de mieux comprendre leur efficacité et leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de démontrer un effet protecteur sur le cerveau grâce à l’administration d’esters de cétones ou de lactate, en alternative au régime cétogène. Ce régime, bien que thérapeutique, est très contraignant et souvent mal toléré par les patients. Si ces nouvelles approches s’avèrent efficaces, elles pourraient représenter une solution plus simple et mieux acceptée. Cela ouvrirait la voie à l’élaboration de protocoles d’administration adaptés, avec pour objectif une amélioration significative de la qualité de vie des patients atteints du déficit en transport de glucose.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement électroencéphalogramme, sous anesthésie gazeuse: procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 80 min - implantation des mini-pompes permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse :procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 60 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes -ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours)
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue, réalisée pour le génotypage, provoque une douleur légère et de courte durée. L’implantation des mini-pompes ou des électrodes pour l’électroencéphalogramme, qui permet d’enregistrer l’activité électrique du cerveau, peut entraîner une douleur modérée. Les anesthésies nécessaires à ces enregistrements peuvent provoquer une variation du rythme cardiaque et, si elles sont prolongées, un risque de déshydratation. Les tests comportementaux peuvent induire du stress ou de l’anxiété. Enfin, lors du test évaluant des comportements de type dépressif, une restriction alimentaire est appliquée, pouvant entraîner une perte de poids et être une source d’inconfort pour l’animal (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Le recours à l’IRM, une technique d’imagerie non invasive, permet d’étudier les animaux sans avoir à les sacrifier, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Grâce à cette méthode, nous pouvons suivre l’évolution des mêmes animaux au fil du temps, tout en réalisant aussi des tests comportementaux sur eux. Le nombre d’animaux a été calculé à l’avance pour qu’il soit le plus faible possible, tout en assurant que les résultats soient fiables. Pour analyser les différences entre les groupes, nous utiliserons des méthodes statistiques reconnues.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement EEG, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les IRM sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'IRM est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 60 jours. Les dispositifs d'EEG (la moitié des aniamux) seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 60 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Carence en vitamine D chez la souris mâle et conséquences sur la descendance.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souris mâles seront privées de vitamine D pendant dix semaines, accouplées, et leur descendance tuée à quatre jours de vie, après le sevrage puis à l'âge adulte. 60 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Elles sont isolées une demi-heure pour un recueil de fèces, mises à jeun la veille de leur mort, puis tuées par dislocation cervicale après anesthésie au sévoflurane. Le porteur affirme qu'aucune souffrance n'est attendue du régime carencé, et annonce que les données serviront à formuler des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer. Il mentionne aussi une anesthésie lors d'un prélèvement de sperme, geste absent de la description des procédures.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant d’évaluer l’impact d’insuffisance en vitamine D chez la souris mâle, sur les trajectoires métaboliques de la descendance. Des souris mâles seront nourris pendant 10 semaines avec un régime contrôle ou un déficient en vitamine D. Les mâles carencés seront étudiés (suivi de l'evolution pondérale, prise alimentaire, impact sur le microbiote). Ces males seront ensuite accouplés avec des souris femelles nourries avec une alimentation contrôle. Ceci permettra de générer une descendance issue de pères carencés ou non. L'étude portera ensuite sur cette descendance. Des groupes de 10 animaux de chaque sexe sont utilisés. Au total, l'etude sur la descendance portera donc sur 6 groupes d'animaux étudiés à différents stades de leur vie (4 jours post naissance; post-sevrage et age adulte), repartis de la façon suivante : mâles après naissance, femelles après naissance, mâles post-sevrage, femelles post-sevrage, mâles adultes, femelles adultes. Sur la descendance, à l'exception des animaux mis à mort 4 jours apres la naissance, un suivi de croissance sera réalisé par pesée toutes les semaines ainsi que la quantification de la consommation alimentaire. Les animaux seront euthanasiés à différents stades afin d'etudier l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux. A noter qu'il est prévu de réaliser 3 cohortes de géniteurs sur la période des 3 années sur laquelle va se dérouler ce projet.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l'impact d'une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommendations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Durant toute la durée du protocole, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : À 9 semaines d'alimentation contrôlée, un prélèvement de fécès nécessitant de les héberger individuellement pendant ~30 minutes sera réalisé, une fois. Enfin, après 10 semaines d'alimentation contrôlée, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie au sevoflurane 6% dans une cage d'induction.
Impact sur les animaux
Les animaux mâles seront soumis à un régime carencé en vitamine D, aucune souffrance ni nuisances n'est attendue. Les animaux seront également maintenu en isolement lors des recueils de fécès ce qui peut constituer une source de stress (nuisance de gravité légère, courte durée). Les animaux seront mis à jeûn la veille de la mise à mort (nuisance de gravité légère, durée modérée). Enfin l'induction de l'anesthsie peut constituer une source de nuisance (nuisance de gravité légère, courte durée).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d’une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Une anesthésie et une analgésie sont prévues lors du prélèvement de sperme.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Implications des circuits du BNST dans le comportement d’anxiété en situation physiologique et pathologique: Etude éléctrophysiologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées du crâne pour recevoir une injection de virus, implantées, puis maintenues sous anesthésie pendant quatre à huit heures pour l'enregistrement de leurs neurones, 2 176 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines sont isolées de leurs congénères dès le sevrage à trois semaines et gardées seules jusqu'à l'âge adulte, d'autres soumises à un stress par contention. Le projet cartographie les circuits d'une structure cérébrale impliquée dans l'anxiété, chez des souris suivies jusqu'à dix-huit mois. Un animal encore douloureux trois jours après l'opération sera tué. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la thématique d’une dissection des circuits neuronaux à l’origine de l’anxiété. Les troubles de l’anxiété représentent un enjeu de société majeur. Aujourd’hui encore, le diagnostic des troubles de l’anxiété reste compliqué à poser notamment quand ces troubles sont associés à différentes comorbidités telles que la maladie de Parkinson rendant le diagnostic et la prise en charge des symptômes encore plus complexe Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’anxiété et potentiellement développer des stratégies pour diminuer les troubles de l’anxiété. Une de ces stratégies est de définir dans quelles circonstances les structures impliquées dans le contrôle de l’anxiété s’activent. Le noyau du lit de la strie terminale (BNST) joue un rôle central dans l’anxiété. Notre projet sera conduit chez des souris C57B6/J et des souris transgéniques afin de manipuler sélectivement différentes populations neuronales. De plus, le facteur « sexe » sera partie intégrante de notre projet puisqu’un dimorphisme sexuel dans le BNST chez l’homme et le rongeur ont pu être observé. Notre projet s’articulera autour de quatre objectifs pour étudier le fonctionnement et le rôle des différentes sous-populations du BNST dans le contrôle de l’anxiété et des comportements moteurs en situation physiologique et pathologique
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique des circuits du BNST, structure clef dans le contrôle de l’anxiété en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération d’une sous-population ou d’une afférence spécifique du BNST pourrait être à l’origine de troubles anxieux notamment observés dans la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à améliorer le diagnostic des troubles anxieux et favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes anxieux des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1H et 2H, Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié entre 4h et 8h, Electrophysiologie in vivo sur tête restreinte: 30 min de chirurgie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire , 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants , 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 4/ un stress induit par notre protocole de stress par contention ou d’isolement social. Les expérimentateurs ont une solide expérience dans l'exécution des procédures décrite. L'effet indésirable attendu sur les animaux transgéniques restent néanmoins modéré sur cette lignée transgénique mimant les stade précoces de la maladie de Parkinson avec une présence de constipation et une baisse de coordination motrice à partir de 18 mois. Pour notre projet, nous étudierons cette lignée a différents âges (étude longitudinale jusqu’à 18 mois).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements pour des études histologiques
Remplacement
Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du noyau du lit de la Strie terminale (BNST) et du reste de son circuit dans le contrôle de l’anxiété. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de faire exprimer des protéines capables d’activer ou d’inhiber l’activité neuronale combinées avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo sur souris anesthésiée ou en tête restreinte et in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits du BNST.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 2176 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris males et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés. La taille des groupes a été déterminée à l'aide d'analyses statistiques basées sur des calculs de puissance (power analysis). Ces analyses permettent de garantir que les groupes sont suffisamment grands pour détecter des différences significatives entre les conditions expérimentales tout en limitant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des surexpressions de la protéine alpha synucléine. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives (approches pharmacologiques, optogénétiques, pharmacogénétiques, électrophysiologiques et imagerie cellulaire) permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété et les phénomènes synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. Pour ce projet les chirurgies stéréotaxiques auront lieu sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal sera plus à même de récupérer après les protocoles de chirurgie. Leur poids et leur taille sont stabilisés, la taille du cerveau homogène assurant une bonne reproductibilité des sites d’injection. Les enregistrements électrophysiologiques, les manipulations chémo/optogénétiques et l'imagerie calcique seront réalisés entre 15 et 49 jours après la dernière chirurgie. Pour les expériences d’interactions sociales, nous utiliserons des souris jeunes comme stimulus social entre P28- P35. Pour le protocole de stress, nous réaliserons un protocole de stress développemental que nous détaillerons ci-après où les souris expérimentales seront isolées après leur sevrage à P21 puis les souris seront utilisées à l'âge adulte (12 semaines) Pour l’étude longitudinale du phénotype anxieux chez les souris, nous utiliserons des souris âgées de 6 mois, 12 mois et 18 mois. Pour les expériences de comportement, d'enregistrement électrophysiologique et calcique, les souris seront adultes, au moins 11 semaines.
Etude de l’effet de traitements pharmacologiques sur le foie de souris ayant une maladie métabolique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Issues des mêmes croisements que les souris témoins, les souris mutantes de ce projet naissent avec un retard de croissance et une hypoglycémie inscrits dans leur génome. 621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. À 48 heures de vie, certains nouveau-nés reçoivent une toxine injectée dans l'estomac, tous subissent une coupe du bout de la queue pour génotypage, puis les juvéniles reçoivent gavages et injections intrapéritonéales chaque jour pendant quatorze jours, avec une coupure hebdomadaire de la queue pour mesurer la glycémie. Les adultes reproducteurs sont tués eux aussi, après les mois d'accouplement imposés pour obtenir les portées.
Objectifs
La malformation des voies biliaires est une maladie rare du foie (chez les nouveaux nés et les jeunes enfants). Son origine est à l'heure actuelle inconnue c'est pourquoi nous devons comprendre les mécanismes moléculaires impliqués afin de développer de nouvelles thérapies. Le but de ce projet est de tester des traitements pharmacologiques dans des souris génétiquement modifée et servant de modèle préclinique de la maladie.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de définir de nouvelles thérapies dans un modèle de maladie métabolique rare et sans réel traitement. De plus ces thérapies seront testées à différentes doses afin d’avoir une dose thérapeutique efficace transposable à l’Homme. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie avec l’utilisation de toxines en complément du facteur génétique pour le déclenchement de la maladie.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de sera prélevé pour le génotypage. Certains nouveaux nés recevront une toxine par injection (quelques secondes) dans l'estomac 48h après la naissance. Les animaux juvéniles auront des administrations de molécules par gavages et par injections intrapéritonéale (quelques secondes) répétées tous les jours pendant 14 jours. Pour mesurer la glycémie les animaux seront prélevés d'une goutte de sang drainée de la pointe de la queue une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Notre modèle de souris génétiquement modifiée présente un phénotype dommageable qui doit être pris en compte lors de l’élevage de ces souris. Notamment le retard de croissance, le poids en dessous de la norme à 5 semaines d'âge et une hypoglycémie pour les souris mutantes. Egalement l’extrémité de la queue des souriceaux sera coupée pour avoir une biopsie permettant le génotypage des animaux (douleur légère et de courte durée). Lors des procédures le gavage est un mode d’administration stressant et peut entraîner une douleur modérée. De même l’injection intrapéritonéale entraine une douleur légère et passagère. Certains nouveaux nés recevront une toxine par injection dans l'estomac 48h après la naissance qui entraine une douleur légère. La prise de la glycémie se fait par prélèvement d’une goutte de sang à la base de la queue et nécessite donc une légère coupure entraînant une douleur légère.
Devenir
Les animaux qui recevront les injections et les gavages seront mis à mort à la fin de la procédure. Les animaux adultes des croisements seront mis à mort après les plusieurs mois d'accouplement nécessaires pour générer les souris utilisées dans les procédures.
Remplacement
Nous utilisons des cellules de foie issus de patients en parallèle de nos modèles de souris pour ce projet. Néanmoins les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études sur souris qui sont indispensables pour les essais précliniques pour évaluer la réponse thérapeutique aux traitements pharmacologiques.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les souris contrôles et mutantes proviennent des mêmes croisements. Nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour ces souris. Nous analyserons de multiples paramètres pour chaque souris. Sur la base de nos études précédentes nous estimons que 10-20 animaux par génotype et par conditions seront suffisants au niveau statistique pour les analyses. Afin de vérifier que nos résultats sont statistiquements significatifs nous utiliserons des tests adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour notre lignée à phénotype dommageable nous avons des points limites adaptés et spécifques. L’injection sera faite avec une aiguille adapté à la taille et au poids de l'animal. De plus en cas d'inflammation locale due à la répétition des injections les animaux recevront une crême anti-inflammatoire. Le gavage chez les animaux sera effectué avec des sondes adaptées à la taille de l’animal. Des aiguilles de taille adaptées seront utilisées lors des injections intragastrique. Pendant toutes nos procédures des points limites ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi du poids des souris deux fois par semaine et de leurs glycémies une fois par semaine en plus de suivi journalier des animaliers qui préviennent le responsable de projet lorsque qu’une souris présentes des symptômes de souffrance ou de perte de poids. Une perte de poids rapide ou une glycémie trop basse, si prolongées, conduiront à une mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation du métabolisme du foie entre l'humain et la souris. En particulier,le développement du foie et des canaux biliaires sont similaire entre les deux espèces. Les souris juvéniles (5-7 semaines) seront utilisées car c’est à cet âge que notre modèle de souris génétiquement modifiée à les symptômes les plus prononcés reproduisant la maladie humaine. Les traitements seront faits durant cette période afin d’évaluer les différentes thérapies. Les souris à 48h après la naissance seront utilisés pour la maturation du système biliaire et étudier l’effet de toxines dans notre modèle génétique.
Impact des fongicides sur le neurodéveloppement (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes sont gavées chaque jour pendant sept semaines pour être exposées à un fongicide, et 72 souris reçoivent à 7 semaines une puce sous la peau, sous anesthésie, puis passent des tests d'anxiété, de fonctions sensori-motrices, de coordination motrice, d'apprentissage et de mémoire, dont un d'une heure au plus par jour pendant deux semaines, de force musculaire, d'activité circadienne sur 32 heures et d'interactions sociales. Le fongicide n'est pas nommé. Les résultats "pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité" avant la commercialisation de ces fongicides, écrit le porteur.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons leur comportement, leur motricité et leurs capacités cognitives, tout en analysant les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées.
Bénéfices attendus
L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de comportement, de motricité et de cognition, dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). 72 animaux seront soumis à une chirurgie mini-invasive à l’âge de 7 semaines pour l'insertion d’une puce radio-fréquence sous la peau (5 min sous anesthésie gazeuse avec un anti-douleur local). Ces animaux seront également soumis à des tests comportementaux permettant d’évaluer l’anxiété (5 minutes, deux fois par animal), les fonctions sensori-motrices (30 minutes, deux fois par animal), la coordination motrice (deux tests de 5 minutes chacun, deux fois par animal), l’apprentissage et la mémoire (un test de 30 minutes, une fois par animal, ainsi qu’un test de moins d’une heure par jour pendant deux semaines), la force musculaire (5 minutes, une fois par animal), l’activité circadienne (32 heures, une fois par animal) et les interactions sociales (50 minutes, une fois par animal).
Impact sur les animaux
Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'oesophage. La chirurgie mini-invasive entrainera une légère douleur. L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.
Raffinement
Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée quotidienne lors du gavage et hebdomadaire pour les animaux expérimentaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Lors de la pose de puce radiofréquence nécessaire au suivi des animaux, une anesthésie et une analgésie seront mises en place pour prévenir tout stress et douleur. MODIFICATION : De plus, nous avons ajouté une étude pilote (PE3) dans le but de vérifier que le gavage pendant la gestation et la lactation n'affecte pas la gestation ni la survie des portées, et que l'administration du fongicide permet une gestation normale ainsi qu'une bonne survie des portées. Si nous devions constater un impact important sur cette étude pilote, le projet serait suspendu afin d’adapter la suite des procédures expérimentales (PE1 et PE2).
Choix des espèces
Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques et comportementales pertinentes pour évaluer la toxicité. Une partie des animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation et seront utilisés à 8 semaines. Les souris issues de cette gestation seront analysés à partir de 3 semaines d'âge jusqu'a 18 semaines.
Prévention de l’épilepsie dans un modèle de souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souriceaux sont biopsiés à la queue entre 4 et 7 jours de vie pour leur génotypage, des femelles gestantes reçoivent une injection par jour pendant trois jours et une chirurgie de 45 minutes sous anesthésie générale, et des embryons sont injectés. D'autres souris subissent une chirurgie d'une heure avec points de suture, une injection de 20 minutes sous anesthésie générale ou sept injections intrapéritonéales en deux semaines, et un test d'induction de l'épilepsie peut provoquer, selon le porteur, une "détresse". 2 494 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère. Les souris de la première procédure sont gardées en vie pour des accouplements, celles des autres procédures sont tuées pour des prélèvements, et 52 femelles doivent passer par la quatrième procédure. Il s'agit de comprendre le rôle d'une population transitoire de neurones dans la survenue des crises et de tester un nouveau traitement préventif. Le porteur ne précise ni la méthode d'induction des crises, ni le traitement testé, ni la répartition des 2 494 souris entre les procédures.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement de crise d’épilepsies. Nous voulons également tester un nouveau traitement potentiel pour protéger des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de tester un nouveau traitement contre l’épilepsie et d’étendre nos connaissances sur le rôle de nos cellules neuronales d’intérêt sur leur survenance.
Procédures
- Les souriceaux, immobilisés pendant quelques secondes, subiront une biopsie à la queue (moins d'une seconde). - Les femelles gestantes subiront une injection d’une durée de 5 secondes une fois par jour pendant 3 jours et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale. - Les embryons subiront une injection d'une durée de 5 secondes. - Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection pendant 20 minutes. - Des animaux subiront une intervention chirurgicale de 1 heure sous anesthésie générale et des points de sutures. - Des animaux subiront une injection (1x10 sec). Des animaux subiront 7 injections intrapéritonéales pendant 2 semaines (7 x 10sec).
Impact sur les animaux
- La biopsie à la queue provoque une douleur modérée. - Les injections peuvent induire une douleur légére et brève. - Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. - Le test d’induction de l’épilepsie peut provoquer une détresse chez l’animal.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 sont gardés en vie pour des accouplements ultérieurs et 52 femelles subiront la Procédure4. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. Le développement cérébral et l’épilepsie ne peuvent être étudiés qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors des chirurgies, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'antidouleurs avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. Pour la biopsie, les souriceaux ont entre 4 et 7 jours ce qui permet de connaitre leur génotype avant le sevrage et le traitement commençant au 10ème jour. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.
Criblage pharmacocinétique de composés de thérapies ciblées anticancéreuses chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les souris qui atteignent un point limite de la grille de score sont mises à mort avant la fin. 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 d'entre elles réutilisées ensuite. Elles reçoivent un candidat médicament puis subissent des prélèvements sanguins répétés, veine caudale, saphène ou sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal de grand volume qui peut provoquer un arrêt cardiaque. Le projet mesure le devenir sanguin de composés anticancéreux, afin de caler les doses des futurs essais chez l'humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole sont "reformées" vers l'entraînement aux gestes techniques, puis mises à mort.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser les paramètres pharmacocinétiques (PK), c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme et son temps de demi-vie dans la circulation sanguine. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), une stratégie d’échantillonnage ainsi que des groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) optimisés seront mis en œuvre. Celle-ci permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe pour un suivi PK à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.
Bénéfices attendus
La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance ainsi qu'à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.
Procédures
1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : #Lors de l’injection par intraveineuse ou par d’autres voies d’administration (par exemple : intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, per os…) des candidats médicaments (t-0). # Lors de chacun des prélèvements sanguins. Pour tous les types de prélèvements envisagés (e.g. veine caudale, saphène, submandibulaire, Sinus rétro orbital (SRO)…), l'anesthésie générale n'est pas nécessaire, mais une contention efficace est requise, excepté pour les prélèvements SRO. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, ou surdosage d’anesthésique (maximum 1 minute).
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) éventuelles anesthésies (fixe ou gazeuse s'il y a lieu pour prélèvement terminal). # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection des candidats médicaments et (2) de chacun des prélèvements sanguins aux différent temps (par exemple, 10 minutes, J1, J7, J14, J21 et /ou J28 post traitement). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. Ici, des volumes toujours inférieurs à 7,5% du volume sanguin circulant sur une semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes pourront ainsi être prélevé en toute sécurité pour l‘animal. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.
Devenir
Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation) avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Remplacement
S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.
Réduction
Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie (données générées in vitro, propriétés physico-chimiques), permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux a été choisi en fonction des statistiques adaptées au petit nombre ainsi que de nos connaissances sur la classe thérapeutique de ces candidats médicaments, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés (micro-échantillonnage ou volumes standards dans la limite des 7,5 % hebdomadaires, ou 10% sur deux semaines glissantes), ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions aseptiques. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période minimale de 5 jours dans le but de limiter leur stress. Afin de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque prélèvement. Les animaux seront également pesés avant chaque manipulation ainsi qu’au minimum deux fois par semaine en suivi régulier. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Pour le prélèvement à l’œil une anesthésie gazeuse ainsi qu’une crème anesthésique locale permettra de diminuer la douleur liée au prélèvement. En fonction des besoins, une exsanguination terminale pourra être effectuée (en fin d’expérience ou en cas d’atteinte de point limite), par ponction intracardiaque ou incision sous-claviculaire de l’artère subclavière ou prélèvement à l'oeil, sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. A la fin du prélèvement, la mort sera assurée par dislocation cervicale ou surdosage d’anesthésique afin de conserver les organes intacts en cas de besoin. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation ainsi qu’en cas d’atteinte des points limites. Les analyses statistiques seront appliquées sur l’ensemble de la courbe et non uniquement sur chaque temps indépendamment, augmentant ainsi considérablement la robustesse de ces statistiques. Les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement à des gestes (DAP_FormationHabilitation) permettant la formation du personnel. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Choix des espèces
Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (abacs permettant une allométrie comparative de ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Nous utiliserons préférentiellement la souche CD-1, plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Cependant d’autres souches de souris (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) pourront être utilisées en fonction des modèles utilisés lors des études d’efficacité anticancéreuse, ainsi qu’en fonction de la structure et du profil des candidats médicament qui seront testés. Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Les souris CD1 seront préférentiellement utilisées. A titre d’exemple le poids de ces animaux sera compris entre 30 g et 37 g au moment de l’inclusion. Cette échelle de poids permet un prélèvement sanguin compris entre 157 µL et 222 µL par semaine (soit un maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pouvant être prélevé en toute sécurité par semaine glissante). Si d’autres souches (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) sont utilisées, le volume de sang prélevé sera toujours déterminé selon les recommandations internationales.