Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de pathologies immunitaires chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 200 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir six à dix prélèvements sanguins mensuels et trente injections en deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nés sont maintenus en contention pour une biopsie de queue d'un à deux millimètres, puis séparés de leur mère cinq minutes au plus. Les souris développent la pathologie immunitaire recherchée, dont le porteur attend un stress ou une douleur légère à modérée. Aucune n'est déclarée gardée vivante à l'issue, le porteur indiquant que "l'ensemble des animaux devront être utilisés pour arriver à une conclusion statistiquement valide", et le bénéfice attendu tient à un "savoir crucial au développement de traitements thérapeutiques adaptés".
Objectifs
Ce projet vise à étudier le rôle d'un gène dans le contrôle de la réponse immunitaire à l'état physiologique ainsi qu'à déterminer les mécanismes par lesquelles des mutations de ce dernier entraînent la maladie chez la souris. Pour ce faire, nous étudierons la réponse immunitaire au sein de modèles de souris dans lesquels ce gène d'intérêt est soit non-fonctionnel, soit muté. Les connaissances apportées par cette étude permettront d'approfondir la compréhension de ces maladies ainsi que leur traitement.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d'approfondir les connaissances sur les mécanismes de la réponse immunitaire à l'état physiologique et comment leur altération peut conduire au développement de maladies immunitaires. Un savoir crucial au développement de traitements thérapeutiques adaptés.
Procédures
- des prélèvements sanguins d’une minute seront effectués sur des animaux tous les mois jusqu'à leur 6-10 mois pour un total de 6-10 prélèvements par animal . - des traitements par injection de quelques secondes seront administrés à des animaux vigiles tous les 2 jours sur une durée de 2 mois = 30 injections. - les nouveau-nés subiront une contention courte d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé.
Impact sur les animaux
- La piqûre de l'aiguille peut provoquer un léger stress/douleur chez l'animal. - La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress/douleur léger chez l'animal. - Le développement de pathologie immunitaire peut provoquer un stress/douleur léger à modéré chez l'animal. – La piqûre et la contention liée à l’injection de traitements peut provoquer un stress léger à modéré chez l’animal.
Devenir
L'étude a été optimisée de telle sorte que l'ensemble des animaux devront être utilisés pour arriver à une conclusion statistiquement valide.
Remplacement
La mise en place de pathologies immunitaires décrit un mécanisme complexe d'interaction entre le système immunitaire et les autres systèmes de l'organisme qui nécessite des expériences in vivo. Toutefois, des expériences préliminaires nous ont permis d’axer et planifier judicieusement cette étude.
Réduction
Les stratégies d'accouplement et le nombre d'animaux utilisés ont été calculés à partir de nos expériences antérieures afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des tests statistiques fiables et valides.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après génotypage pour vérifier qu’ils soient bien acceptés par leur mère. - Des points limites ont été prédéterminés minutieusement en tenant compte des différents phénotypes des souris. Un système de score associé permettra une prise en charge adaptée des souris notamment via un plus grand enrichissement de l'environnement et l'utilisation d'antalgiques/analgésiques. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par un personnel formé et compétent. Les prélèvements sanguins seront espacés dans le temps et avec des volumes faibles et des aiguilles fines. Les injections de traitements avec des aiguilles fines, des volumes faibles.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour étudier le développement du système immunitaire et ses pathologies associées, en particulier parce que son système immunitaire est proche de celui de l'Homme. En effet, le système immunitaire murin et humains partagent les mêmes sous-populations cellulaires. De plus, il est à noter qu'un grand nombre de mutations identifiées chez l'Homme comme causant la maladie immunitaire, lorsqu'introduites chez la souris entrainent la mise en place de pathologies similaires, confirmant leur proximité biologique dans des contextes aussi bien physiologiques que pathologiques. Les animaux seront utilisés à un stade de développement adulte permettant d’atteindre un stade de maturité immunitaire suffisant.
Validation pré-clinique d’un nouveau système de monitorage continu du débit cardiaque dans un modèle porcin de circulation extra-corporelle. EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Dix cochons adultes d'environ 50 kg reçoivent une assistance circulatoire par ECMO, puis une sonde de mesure du débit cardiaque placée sous radioscopie, avant trois heures de modulations du débit de la machine et du cœur. Ils sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Le porteur juge leur réhabilitation "éthiquement inenvisageable", la finalité étant de valider une sonde déjà commercialisée pour le suivi de patients sous ECMO. La rubrique raffinement décrit pourtant un placement en salle de réveil et une surveillance continue des paramètres vitaux après l'intervention, alors qu'aucun de ces cochons ne se réveille.
Objectifs
En réanimation, il est souvent nécessaire de mesurer en continu la quantité de sang pompée par le cœur (débit cardiaque) car cela permet d’assurer que l’oxygène circule bien et que les organes reçoivent ce dont ils ont besoin. Cette mesure devient particulièrement difficile quand les patients sont sous ECMO, une machine qui prend le relais du cœur et/ou des poumons. Il existe deux types d’ECMO : ECMO VA (veino-artérielle) : remplace à la fois le cœur et les poumons (utilisée quand le cœur est en défaillance) et ECMO VV (veino-veineuse) : remplace uniquement les poumons (utilisée quand seuls les poumons sont défaillants). Jusqu’à présent, les techniques de mesure du débit cardiaque reposaient sur une méthode appelée thermodilution, mais cette méthode perd en fiabilité chez les patients sous ECMO, car la circulation artificielle perturbe les mesures. Une nouvelle sonde est apparue sur le marché qui mesure le débit cardiaque d’une façon différente : en analysant directement les ondes de pression à l’intérieur du cœur. Cela permet d’éviter les limites de la thermodilution et d’obtenir un suivi plus fiable, que ce soit sous ECMO VA ou VV. L’objectif de cette étude est donc de tester cette nouvelle sonde pour vérifier : Si les mesures qu’elle fournit sont cohérentes avec celles des méthodes classiques (thermodilution et échographie). Comment elle réagit quand on modifie le débit de l’ECMO. Comment elle réagit quand le débit du cœur lui-même change.
Bénéfices attendus
Cette étude sur modèle porcin serait la première à confirmer la validité d'une mesure continue du débit cardiaque par une méthode invasive s'affranchissant de la thermodilution. - Elle permet de valider dans une étude pré clinique une nouvelle génération de sonde de débit dans une population sous ECMO - Elle apportera une solution pour le monitorage continu des patients sous ECMO (qui était jusqu'alors considérée comme impossible). Jusqu'ici le monitorage du débit cardiaque sous ECMO imposait la réalisation d'une echocardiographie au lit du malade ce qui imposait (i) d'avoir cette compétence (échographie) et (ii) prenait un temps de mesure. Au total, la mise à disposition d'un outil validé pour le monitorage du débit cardiaque sous ECMO VA et VV permettra d'optimiser la prise en charge des malades, de mieux titrer les thérapeutiques.
Procédures
Les cochons auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation (durée 2 minutes) à l'animalerie (établissement 2). Les expérimentationsont lieu dans l'établissement 1 :une perfusion intraveineuse sera posée (2minutes) afin de permettre une anesthésie générale. A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde. L'assistance circulatoire sera installée (durée 30 minutes) sans chirurgie. La sonde de monitorage du débit cardiaque sera placée sous radioscopie (30min). Les modulations du débit d'ECMO et du débit cardiaque seront réalisées sur une période de 3h. L'animal est sous anesthésie générale durant toute l'étude.
Impact sur les animaux
Les injections intra-musculaires d'anxiolytiques peuvent induire un stress léger et une courte douleur (quelques secondes). La contention de l'animal et l'installation d'une voie veineuse périphérique peut induire un stress modéré et une douleur légère. Une perte de sang modérée peut avoir lieu lors de la pose des canules.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure car leur réabilitation serait éthiquement inenvisageable.
Remplacement
Ce catheter nouvelle generation offre une nouvelle modalité de mesure du débit cardiaque par analyse du contour de l'onde de pouls intra cardiaque. Cette méthode innovante s'affranchit de la thermodilution et apparait être une solution pertinente pour le monitorage du débit cardiaque en continu des patients sous ECMO. Les modèles in vitro ou informatiques ne permettent pas de reproduire de manière fidèle ces interactions systémiques. L'intérêt du modèle porcin est qu'il reproduit fidèlement le débit système cardiovasculaire de l'homme et que sa taille est compatible avec l'implantation du système ECMO.
Réduction
Le modèle d'ECMO est déjà maitrisé par notre équipe ce qui permet de s'affranchir d'une mise au point du modèle. Le nombre d'animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, il ressort que 5 animaux par groupe seront nécessaires
Raffinement
Les animaux sont hébergés en petits groupes pour réduire leur stress et leur angoisse. Leur environnement est aménagé avec des jouets (balles, cordes) pour les stimuler et favoriser leur bien-être. Avant le début de l'expérience, ils ont une période d'acclimatation d'au moins sept jours pour s'habituer à leur nouveau cadre de vie et réduire le stress. Avant l'intervention, on leur donne des médicaments pour les détendre et pour soulager la douleur afin de les manipuler sans qu'ils aient peur ou soient soumis à des traitements douloureux. Durant l'expérience, les animaux sont sous anesthésie et analgésie profonde, et leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, respiratoire, pression artérielle) sont surveillés en continu. Si un signe de douleur ou de réveil apparaît, les médicaments sont ajustés immédiatement pour garantir leur confort. Après l'intervention, les animaux sont placés en salle de réveil où ils sont surveillés de manière continue. Leur état et leurs paramètres vitaux sont suivis de près pour détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse. Des points limites à chaque étape du protocole ont été établis.
Choix des espèces
Le choix du porc comme modèle animal et le stade préclinique de cette étude sont justifiés par la nécessité de pouvoir mettre en place une assistance circulatoire et le modèle de détresse respiratoire. Les cochons adultes présentent en effet un volume de sang circulant et une anatomie cardio-pulmonaire comparables à celle de l'humain, ce qui nous permettra de valider nos observations pour envisager des études randomisées chez l'humain par la suite. Cette démarche est essentielle pour faire progresser la recherche médicale, améliorer les traitements et garantir la sécurité des thérapies avant leur application clinique. Un animal adulte de 50kg a été choisi afin de reproduire la prise en charge d'un patient adulte à l'hôpital.
Etude de l’effet de l’inflammation sur l’expression du gène Fkrp
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des injections intramusculaires quatre jours de suite sous anesthésie, des injections intrapéritonéales deux à cinq fois par semaine sur animaux éveillés, des prélèvements sanguins deux fois par semaine : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et leurs organes. Les molécules injectées sont pro-inflammatoires. Le porteur décrit la réaction locale ou générale qu'elles provoquent comme transitoire, résolue en moins de 76 heures, et situe l'objet du projet dans la compréhension du lien entre inflammation et aggravation d'une myopathie des ceintures, les retombées pour les patients tenant à des "perspectives d'amélioration". Il retient la souris adulte parce que son muscle est assez volumineux pour recevoir la quantité de produit voulue, et affirme avoir "besoin" d'un modèle animal parce que les cultures cellulaires n'intègrent pas les interactions avec le système immunitaire.
Objectifs
Les dystrophies des ceintures sont des maladies génétiques qui affectent principalement les muscles proches du tronc, comme ceux des épaules et des hanches. Ces maladies entraînent une dégradation des muscles, ce qui cause une perte de mobilité des bras et des jambes. Parmi les différentes formes existantes, notre laboratoire étudie particulièrement la LGMD-R9 (Limb Girdle Muscular Dystrophy R9 en anglais ou Myopathie des Ceintures de type R9 en français), causée par des mutations dans le gène responsable de la production de la protéine FKRP. Une des options pour traiter cette maladie est la thérapie génique. Cela consiste à utiliser des virus modifiés pour introduire une version saine du gène FKRP (Fukutin Related Protein) dans les cellules malades. Cependant, même si cette méthode a montré des résultats prometteurs, elle pose encore des défis importants. Par exemple, les doses nécessaires pour traiter les muscles sont très élevées, ce qui peut provoquer des réactions immunitaires et des inflammations. Le but de notre projet est de comprendre comment l'inflammation est liée à l'aggravation des symptômes de cette maladie. En comprenant mieux ce lien, nous espérons développer de nouvelles méthodes de traitement pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permet d’approfondir nos connaissances fondamentales sur l’expression du gène FKRP. Les approches thérapeutiques destinées aux patients atteints de LGMD-R9 pourraient directement bénéficier des résultats générés par cette étude. Ces résultats pourraient contribuer aux perspectives d’amélioration des traitements de thérapie génique dans le cadre de cette maladie.
Procédures
Des injections sont réalisées par voie intramusculaire au maximum 1 fois par jour pendant 4 jours, ou en une seule fois sur la durée de l’étude, sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. D’autres injections seront faites par voie intra-péritonéale (durée d’injection : moins de 1 minute), sur animaux vigiles. Dans ce cas les molécules seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Des prélèvements de sang seront faits au maximum deux fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères à modérées. Certaines sont liées à la nature des différents actes réalisés : douleur de l’injection pour administration de molécules en intramusculaire ou intra-péritonéale (classe légère). Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie (classe légère). Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. D’autres nuisances sont liées à la nature des molécules injectées. Il s’agit de molécules pro-inflammatoires induisant une réaction inflammatoire systémique ou locale (classe modérée). Il s’agit de réactions transitoires qui sont résolues en moins de 76h.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes.
Remplacement
Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doit prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire. Pour poursuivre l’étude et en tirer des conclusions potentiellement applicables à l’espèce humaine, nous avons donc besoin d’utiliser un modèle animal.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôles pour les différentes conditions évaluées. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour pouvoir tirer des conclusions à partir des expériences.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi et sont observés quotidiennement. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de molécules. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité suffisante pour mesurer l’efficacité du traitement administré.
Ciblage des Glioblastomes par transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2 exprimant OAcGD2-CAR
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Deux passages d'IRM par semaine sous anesthésie générale, pendant jusqu'à quatre-vingts jours, attendent chacune des 404 souris du projet. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées pour récupérer leur cerveau. Après l'implantation d'un glioblastome humain dans le cerveau, 192 reçoivent une irradiation cérébrale de 15 Gy en une séance et 288 une injection intracrânienne de lymphocytes T modifiés, le porteur attendant une perte de poids, de motricité et de sensibilité. Les souris NSG sont choisies pour leur absence d'immunité, qui permet la greffe de cellules humaines et évite les réactions contre le traitement, et le porteur ajoute que le laboratoire partenaire maîtrise déjà ce modèle.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne dont l’hétérogénéité et l’agressivité limitent l’efficacité du traitement. Parmis les nouveaux enjeux thérapeutiques, l’immunothérapie constitue une piste intéressante. A ce jour, la meilleure approche d’immunothérapie réside dans le transfert cellulaire adoptif, basé sur l’administration d’effecteurs cellulaires immunitaires spécifiques aux antigènes tumoraux afin de stimuler et promouvoir la prolifération, l’expansion et le maintien des fonctions effectrices immunitaires anti-tumorales. L’utilisation de cette technique avec des cellules T modifiées par des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) représente une piste thérapeutique pertinente contre les GBM. Ce projet a ainsi pour but d’évaluer l’efficacité préclinique d’un transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2-CAR (LTgd) expriment un CAR dirigé contre la forme acétylée du disialoganglioside GD2 (CAR-OAcGD2), cible prometteuse pour la thérapie par cellules CAR T contre les GBM. Le protocole d’injection du traitement par CAR-LT (ou solution saline) correspond à une injection intracrânienne intratumorale à un débit de 0.6µL/min. Cette procédure d’administration fait suite à une précédente saisine.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (GBM).
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : implantation de tumeurs cérébrales sous anesthésie générale, 20 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 404 animaux sont concernés. - imagerie IRM : pour suivie de la croissance tumorale : sous anesthésie générale, 10 minutes par animal maximum, réalisée deux fois par semaine jusqu’à 80 jours. 404 animaux sont concernés. - radiothérapie : irradiation cérébrale (15 Gy en une fraction) sous anesthésie générale, 15 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 192 animaux sont concernés. - injection intracrânienne du traitement sous anesthésie générale, 30 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 288 animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
L’établissement du modèle de tumeur cérébrale est permis grâce à une procédure chirurgicale sévère qui peut induire des douleurs. Les animaux recevront une prise en charge analgésique pré- et post-opératoire et seront surveillés jusqu'à leur réveil, puis replacés dans leur cage et remis à l'animalerie. Les animaux seront surveillés quotidiennement. D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à observer une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les aniamux ayant développé un GBM, suite à l'injection (procédure sévère). Les séquences d’imagerie par IRM (procédure légère) n’induisent pas de douleur, de perte de poids ou de perturbation du comportement, mais elles peuvent induire un autre point limite qui est défini pendant l’acquisition IRM : c’est la diminution de la fréquence respiratoire en deçà de 30 respirations par minutes. S’il est atteint et que la diminution du pourcentage d’isoflurane ne suffit pas à augmenter la fréquence respiratoire, la procédure sera arrêtée. A chaque sortie des animaux de la zone EOPS, lors des séquences d'imagerie par IRM, un risque d'infection ou de contamination par les autres animaux n'ayant pas de phénotype dommageable existe. D'après l'expérience du laboratoire, la radiothérapie cérébrale (procédure légère) induit une perte de poids transitoire chez les animaux.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer le cerveau pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs de type GBM sont connues pour être multi-compartimentales, hétérogènes et caractérisées par une immunosuppression forte. Au-delà du compartiment tumoral, d’autres composantes jouent un rôle essentiel dans la réponse au traitement, telles que la vascularisation, l’hypoxie et l’immunité. Leurs interactions réciproques avec les cellules tumorales influencent la réponse au traitement et la survie des patients. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de GBM afin de déterminer le comportement des cellules de ces lignées de GBM. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation de méthodes d’imagerie non-invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chaque temps. Chaque animal constitue dans ce cas son prorpre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Pour pouvoir obtenir des analyses statistiques robustes, ces simulations ont été faites à l’aide d'un l’outil statistique en ligne et selon des données préliminaires acquises dans l’unité, pour lesquelles la survie du modèle murin de glioblastome du 1er groupe (tumeur) est de 28 jours et celle du 2ème groupe (tumeur + radiothérapie) est de 10 jours. Les paramètre saisis sur BiostaTGV sont les suivants : valeur de variabilité = 14 (écart type commun σ), risque de première espèce α = 0.05, puissance 1-β = 0.8, avec un test de nature bilatéral. Un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement est donc nécessaire afin d'obtenir une différence significative avec une valeur statistique de 5 % pour un effet de 80 % du traitement. Ce nombre d’animaux est considéré comme maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Nous justifions également le nombre d’animaux par sous-groupe d’après l’expérience du laboratoire et la DAP issue du laboratoire collaborateur au projet.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de quatre individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéfécieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, craft). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. La mesure du poids sera faite trois fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les différences procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés ainsi que par le choix de points limites cohérents. A chaque sortie des aniamux de la zone EOPS, une désinfection au phagospray est réalisée sur chaque matériel utilisé avant chaque expérimentation et pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris immunodéprimées NSG. Notre traitement étant constitué de CAR-T, l’absence d’immunité de ces souris évitera les réactions croisées et dirigées contre les CAR-T. Ce modèle permettra donc la croissance de cellules tumorales humaines et la survie des cellules immunitaires humaines, permettant ainsi d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine et reflétant l’hétérogénéité moléculaire des GBM observée en clinique. Le choix de la souris NSG est idéal car ce modèle étant déjà maîtrisé dans le laboratoire partenaire, il permettra d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Nous utiliserons des souris mâles et femelles, en lien avec les recommandations actuelles pour mieux représenter la réalité clinique car, si le sexe ratio du GBM est de 1.6 (en faveur des hommes), il touche aussi bien des femmes que des hommes. L’ensemble des animaux utiliés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. Il sera possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps plus longs.
Évaluation de la biodistribution et de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules dans les maladies inflammatoires de l’intestin MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 95
Une partie des animaux témoins sera réintégrée en hébergement pour être réutilisée dans une autre phase du projet, dont le porteur demande la prolongation après une suspension imprévue des expériences. 1 293 souris et 95 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour collecter des organes ou vérifier la tolérance des produits. Les nanoparticules sont administrées par gavage, par voie rectale ou dans la veine de la queue, une même souris pouvant passer onze fois en une semaine sous anesthésie gazeuse pour l'imagerie, tandis qu'une colite est provoquée chez d'autres, avec perte de poids et troubles digestifs. Le porteur classe la nuisance des nanoparticules comme "inconnue a priori" et présente le choix du rat, dont on peut prélever davantage de sang, comme une mesure de raffinement.
Objectifs
L’objectif du projet est la mise au point d’un outil thérapeutique innovant, afin d’accroitre l’arsenal thérapeutique et d’améliorer l’efficacité de prise en charge des MICI. Pour répondre à cet objectif, trois nouveaux systèmes d'ingénierie constitué des nanoparticules capables de cibler la muqueuse intestinale enflammée ont été développés. Dans le cadre de notre projet d’expérimentation animale initial, nous souhaitons solliciter une extension de sa durée afin de poursuivre nos travaux dans des conditions optimales. Les résultats obtenus jusqu’à présent sont prometteurs et nécessitent une prolongation pour approfondir nos analyses et garantir la robustesse des données. Cette demande est motivée par un imprévu indépendant de notre volonté, ce qui a entraîné une suspension complète des expérimentations et un bouleversement du planning initial. Afin de garantir la cohérence et la qualité scientifique de l’étude, il est essentiel de prolonger la durée du projet pour achever les manipulations prévues et recueillir les données nécessaires. Cette extension ne modifiera pas le protocole expérimental et s’inscrit dans le respect strict des principes éthiques en vigueur, notamment ceux des 3R (Réduction, Raffinement, Remplacement), et n’engendrera pas d’augmentation du nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer un outil thérapeutique innovant pour améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), pathologies pour lesquelles les options thérapeutiques actuelles restent limitées et associées à des effets secondaires importants.Ce projet vise à développer un outil thérapeutique innovant pour améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), pathologies pour lesquelles les options thérapeutiques actuelles restent limitées et associées à des effets secondaires importants.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis aux interventions suivantes, selon les phases expérimentales : Administrations des produits : les systèmes testés seront administrés par voie orale (gavage), rectale ou intraveineuse (injection dans la queue). Chaque administration dure entre 1 et 2 minutes. Ces interventions peuvent être répétées une ou plusieurs fois sur quelques jours. Imagerie in vivo (souris uniquement) : certaines souris recevront des produits marqués afin de permettre des acquisitions d’imagerie sous anesthésie gazeuse, d’une durée de 5 à 15 minutes. Un même animal pourra être suivi jusqu’à 11 fois sur une semaine, ou faire l’objet d’une acquisition unique juste avant euthanasie. Prélèvements sanguins (rats uniquement) : jusqu’à 2 à 3 prélèvements par animal seront réalisés, d’une durée de 1 à 2 minutes chacun. La durée globale de participation des animaux varie selon les phases, allant de quelques heures à environ dix jours, avant un retour en hébergement ou une euthanasie planifiée selon les objectifs de l’étude.
Impact sur les animaux
Certaines interventions prévues dans ce projet peuvent entraîner les nuisances suivantes : Gavage oral : nuisance légère, liée à une contention courte et un inconfort transitoire. Administration rectale : nuisance légère à modérée, en fonction de la sensibilité individuelle. Injection intraveineuse (queue) : nuisance modérée, due à la contention et au geste technique. Imagerie sous anesthésie répétée (jusqu’à 11 fois/semaine) : nuisance modérée, liée à l’exposition répétée à l’anesthésie gazeuse. Modèle inflammatoire intestinal : nuisance modérée à sévère, associée à une perte de poids, troubles digestifs et altération de l’état général. Prélèvements sanguins chez le rat (2 à 3 fois) : nuisance légère à modérée, selon le volume prélevé et la fréquence. Administration de produits faiblement radioactifs : nuisance légère, sans effet clinique attendu. Administration de nanoparticules expérimentales : nuisance inconnue a priori, potentiellement modérée en raison de leur formulation, nécessitant une surveillance adaptée.
Devenir
À l’issue de chaque phase expérimentale, les animaux seront traités comme suit : Animaux ayant reçu des administrations (orale, rectale, intraveineuse) : → Euthanasiés en fin d’étude pour collecte d’organes, sauf si réutilisation possible dans une phase compatible du projet. Souris incluses dans les phases d’imagerie : → Euthanasiées en fin de suivi pour analyses ex vivo ou histologie. Souris incluses dans le modèle inflammatoire : → Euthanasiées à la fin de la période de suivi, pour analyses tissulaires et/ou dosages. Rats ayant reçu des prélèvements sanguins : → Euthanasiés en fin de protocole, une fois les prélèvements terminés, pour analyses complémentaires ou vérification de tolérance. Animaux témoins non traités ou inclus dans des phases courtes sans effet attendu : → Réintégrés en hébergement si leur état est jugé compatible et s’ils peuvent être réutilisés dans une autre phase du projet, conformément à la réglementation.
Remplacement
Le développent des nouveaux médicaments à base des nanoparticules nécessite une évaluation in vivo chez le petit animal en complément des études in vitro, pour déterminer leurs affinités pour la cible et pour étudier leurs comportement/devenir in vivo (biodistribution), ses paramètres pharmacocinétiques, son éventuelle toxicité ainsi que leurs efficacités. En outre, l’acquisition de donnes précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. Le modèle de pathologie d'inflammation d'intestin sur souris est déjà bien établi, mime au mieux les pathologies ciblées et nous permettra d’acquérir les données nécessaires pour faire la preuve de l’efficacité thérapeutique et la non-toxicité de nos candidats médicaments
Réduction
Le projet a été conçu de manière à limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse et la pertinence des résultats scientifiques. La stratégie expérimentale repose sur une organisation séquentielle des procédures, permettant une prise de décision éclairée à chaque étape du projet. Ainsi, si une étape révèle une absence de ciblage, une toxicité inattendue ou une efficacité insuffisante, les phases suivantes ne seront pas engagées, ce qui permet d’éviter l’utilisation inutile d’animaux. La phase 1, qualitative, vise notamment à identifier les temps pertinents pour les phases ultérieures. En sélectionnant a posteriori un nombre réduit de points temporels (maximum 8) pour les phases 2 et 3, cela permet d’éviter un design trop exhaustif et d’éliminer les temps peu informatifs. Le recours à l’imagerie non-invasive (CCD et SPECT/CT) dans les phases 1 et 2 permet également de suivre la distribution des systèmes chez un même animal au fil du temps (phase 1), réduisant ainsi le nombre de sujets nécessaires à l’analyse cinétique. Dans les phases quantitatives (phases 2 et 3), le recours à l’espèce rat a été privilégié pour les études pharmacocinétiques. Cette espèce, mieux adaptée aux volumes de prélèvements sanguins, permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des courbes précises, en regroupant plusieurs temps sur un même individu, là où cela est autorisé par les recommandations éthiques. Par ailleurs, des outils statistiques ont été utilisés en amont pour calculer le nombre d’animaux nécessaires à la détection d’un effet significatif, sur la base des écarts-types obtenus lors d’études pilotes et des modèles cellulaires. Des effectifs minimums par groupe ont ainsi été définis, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs du projet. Enfin, aucun doublon n’est prévu entre les études : chaque phase répond à des objectifs distincts (profil de distribution, cinétique, efficacité), ce qui évite les redondances expérimentales et limite l’usage excessif d’animaux.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales prévues dans ce projet a été élaboré en tenant compte des principes de raffinement, afin de minimiser la douleur, le stress et la détresse des animaux tout au long de l’étude. Chaque technique d’administration a été choisie et adaptée pour limiter les nuisances : la voie orale est peu invasive, la voie rectale est réalisée avec des volumes modérés, et la voie IV est pratiquée uniquement par des opérateurs formés pour garantir rapidité et efficacité, évitant les manipulations prolongées. Les anesthésies nécessaires aux acquisitions d’imagerie (CCD et SPECT/CT) seront réalisées à l’isoflurane, un agent à induction et récupération rapide. Un plateau chauffant à 37°C sera utilisé pendant toute la durée de l’imagerie pour éviter l’hypothermie, et les yeux des animaux seront protégés par un gel ophtalmique. Après chaque anesthésie, les animaux seront placés en cage chauffée et surveillés jusqu’au réveil complet. Les modèles pathologiques sont bien maîtrisés et les signes cliniques (perte de poids, selles, comportement) seront suivis quotidiennement. Une grille d’évaluation clinique et des critères d’arrêt stricts permettront d’euthanasier rapidement tout animal présentant des signes de souffrance excessive. Les conditions d’hébergement, l’enrichissement en cage, et l’habituation des animaux aux manipulations avant les procédures permettront également de réduire le stress. Les prélèvements sanguins réalisés chez le rat tiendront compte des volumes maximaux autorisés et seront espacés pour garantir le confort et la récupération des animaux. Le choix de cette espèce, plus tolérante aux volumes de sang nécessaires à l’analyse, participe directement à une approche plus éthique. Enfin, les protocoles seront ajustés de façon dynamique à chaque phase, en fonction des résultats obtenus, permettant d’éliminer les conditions ou temps expérimentaux non pertinents. Cette approche itérative permettra de réduire la souffrance animale en optimisant en permanence les procédures.
Choix des espèces
La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies inflammatoires de l’intestin survenant chez l’homme et permet d’objectiver l’apparition d’une colite en moins de 10 jours chez un animal non transgénique et non immunodéprimé. Pour la détermination de la pharmacocinétique (PK), les rats sont l’espèce animale de prédilection et sur laquelle un maximum de données historiques est disponible. Les rats ont été choisis pour des raisons de raffinement. Nous avons choisi les rats parce que les méthodes d'étude de nos produits nécessitent des volumes importants de sang que nous ne pouvons atteindre en utilisant des souris. En effet, les volumes prélevés peuvent être plus important que chez la souris nous permettant ainsi de réaliser des analyses plus précises et de réduire le nombre d’animaux utilisés. Il est important de noter que les rats utilisés lors de cette procédure seront des rats sains. Le modèle a été développé et validé sur des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ainsi, les souris seront toutes âgées de 8 à 10 semaines lors de leur inclusion dans les procédures. Pour les études de pharmacocinétique sur les rats, ces derniers seront tous âgés de plus de 8 à 10 semaines.
Implications des circuits du BNST dans le comportement d’anxiété en situation physiologique et pathologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Un animal encore en souffrance trois jours après son opération est tué, le porteur prévoyant de renouveler l'antalgique à vingt-quatre heures puis d'attendre. 1 560 souris vont être utilisées sur cinq ans, dont 1 152 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses histologiques. Elles subissent des injections de virus dans le cerveau, la pose d'implants crâniens pendant une à deux heures, des enregistrements électriques allant jusqu'à huit heures sous anesthésie ou tête maintenue immobile, ainsi que des protocoles de stress par contention et d'isolement après le sevrage. L'objet est de cartographier les circuits cérébraux de l'anxiété, y compris chez des souris modifiées pour reproduire un stade précoce de la maladie de Parkinson, et le porteur écrit que tous les animaux produits par ces lignées seront utilisés.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la thématique d’une caractérisation des circuits neuronaux à l’origine de l’anxiété. Les troubles de l’anxiété représentent un enjeu de société majeur. Aujourd’hui encore, le diagnostic des troubles de l’anxiété reste compliqué à poser notamment quand ces troubles sont associés à différentes comorbidités telles que la maladie de Parkinson rendant le diagnostic et la prise en charge des symptômes encore plus complexe Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’anxiété et potentiellement développer des stratégies pour diminuer les troubles de l’anxiété. Une de ces stratégies est de définir dans quelles circonstances les structures impliquées dans le contrôle de l’anxiété s’activent. Notre projet sera conduit chez des souris afin de manipuler sélectivement différentes populations neuronales. De plus, le facteur « sexe » sera partie intégrante de notre projet puisqu’un dimorphisme sexuel au niveau de certaines zones du cerveau chez l’homme et le rongeur ont pu être observé. Notre projet s’articulera autour de quatre objectifs pour étudier le fonctionnement et le rôle des différentes régions du cerveau dans le contrôle de l’anxiété et des comportements moteurs en situation physiologique et pathologique.
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique de structures clefs du cerveau dans le contrôle de l’anxiété en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération de ces zones cérébrales pourrait être à l’origine de troubles anxieux notamment observés dans la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à améliorer le diagnostic des troubles anxieux et favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes anxieux des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1H et 2H, Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié entre 4h et 8h, Electrophysiologie in vivo sur tête restreinte: 30 min de chirurgie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire , 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants , 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 4/ un stress induit par notre protocole de stress par contention ou d’isolement social. Les expérimentateurs ont une solide expérience dans l'exécution des procédures décrite. L'effet indésirable attendu sur les animaux transgéniques restent néanmoins modéré sur cette lignée transgénique mimant les stades précoces de la maladie de Parkinson avec une présence de constipation et une baisse de coordination motrice à partir de 18 mois. Pour notre projet, nous étudierons cette lignée a différents âges (étude longitudinale jusqu’à 18 mois).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements pour des études histologiques
Remplacement
Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du noyau du lit de la Strie terminale (BNST) et du reste de son circuit dans le contrôle de l’anxiété. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de faire exprimer des protéines capables d’activer ou d’inhiber l’activité neuronale combinées avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo sur souris anesthésiée ou en tête restreinte et in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits du BNST.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 1560 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris males et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des surexpressions de la protéine alpha synucléine. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives (approches pharmacologiques, optogénétiques, pharmacogénétiques, électrophysiologiques et imagerie cellulaire) permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété et les phénomènes synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. Pour ce projet les chirurgies stéréotaxiques auront lieu sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal sera plus à même de récupérer après les protocoles de chirurgie. Leur poids et leur taille sont stabilisés, la taille du cerveau homogène assurant une bonne reproductibilité des sites d’injection. Les enregistrements électrophysiologiques, les manipulations chémo/optogénétiques et l'imagerie calcique seront réalisés entre 15 et 49 jours après la dernière chirurgie. Pour les expériences d’interactions sociales, nous utiliserons des souris jeunes comme stimulus social entre P28- P35. Pour le protocole de stress, nous réaliserons un protocole de stress développemental que nous détaillerons ci-après où les souris expérimentales seront isolées après leur sevrage à P21 puis les souris seront utilisées à l'âge adulte (12 semaines) Pour l’étude longitudinale du phénotype anxieux chez les souris, nous utiliserons des souris âgées de 6 mois, 12 mois et 18 mois. Pour les expériences de comportement, d'enregistrement électrophysiologique et calcique, les souris seront adultes, au moins 11 semaines.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Opérées sous anesthésie pour déclencher un sepsis, transportées vers un second établissement, anesthésiées de nouveau une demi-heure pour recevoir un radiotraceur et passer à l'imagerie cérébrale, 200 souris au maximum vont être utilisées, dont 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris portent des modifications génétiques qui leur font développer une maladie neurodégénérative et des déficits cognitifs, le sepsis étant déclenché à six ou à douze mois d'âge. Le porteur décrit un poil hérissé, une posture voûtée, une baisse d'activité et des diarrhées dans les vingt-quatre à quarante-huit heures qui suivent, et une anesthésie profonde qui expose à un arrêt cardiorespiratoire. Les souris utilisées pour produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, les autres après l'imagerie, pour récupérer leurs tissus.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Étude de la résistance à la colonisation dans un modèle d’infection poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
La mort par infection est retenue comme point limite, le porteur indiquant que les signes de souffrance sont mal connus et peu observables au stade larvaire. 42 282 poissons zèbres vont être utilisés, dont 38 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Les larves sont plongées trois ou vingt-quatre heures dans une eau contenant une bactérie pathogène, chacune seule dans deux millilitres d'eau au fond d'un puits, la mort survenant en vingt-quatre à quarante-huit heures quand la flore ne protège pas. Le porteur écrit que la douleur et le stress liés à l'infection ne sont pas quantifiables à ce stade, tout en concluant qu'ils restent de courte durée puisque la mort arrive vite.
Objectifs
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine et contribue notamment à la protection contre l’infection, plus communément appelé l’effet probiotique. Cependant, ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-pathogène. L’objectif de ce projet est ici de caractériser les mécanismes moléculaires responsables de la protection conférée par la flore contre un pathogène en utilisant un modèle de colonisation par immersion chez la larve de poisson-zèbre. Pour cela, trois aspects seront étudiés : (i) la réponse de l’hôte face au pathogène ainsi que l’influence d’un microbiote, protecteur ou non, sur celle-ci (ii) le pathogène et ses potentiels facteurs de virulence, et (iii) l’établissement et la dynamique de la flore commensale, les interactions entre les différents membres, la composition minimale permettant la protection et les facteurs moléculaires impliqués.
Bénéfices attendus
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote-pathogène sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. Dans ce contexte, notre projet vise à caractériser les facteurs de protection développés par le microbiote et l’influence de l’hôte, et permettra ainsi de mettre en lumière des bactéries probiotiques capables de protéger les poissons-zèbre contre une infection par des pathogènes invasifs. L’étude du rôle protecteur de ces potentiels probiotiques contre des pathogènes de poissons pourrait être ensuite envisagée chez des poissons économiquement importants en aquaculture tels que la truite. Enfin, l’identification de mécanismes moléculaires responsables de l’effet protecteur aboutira, de manière plus générale, à une meilleure compréhension du rôle du microbiote dans la santé de l’hôte.
Procédures
Les larves de poisson-zèbre vigiles seront exposées une fois à un pathogène par balnéation pendant 3 ou 24 heures selon la procédure. Cela pourra entrainer le développement d’une infection, notamment en l’absence d’une flore protectrice. L’infection est probablement associée avec un certain niveau de douleur et/ou stress non quantifiables à ce stade de développement de la larve, qui peut aboutir à la mort de l’animal en 24 à 48 heures.
Impact sur les animaux
Nos expériences consistant à évaluer soit la protection conférée par la flore contre le pathogène soit la capacité des pathogènes sélectionnés à infecter et tuer les larves, la mort des poissons sera alors majoritairement considérée comme point limite. Des signes de souffrance en amont ne sont en fait que très peu listés et /ou adaptés au stade larvaire et à notre procédure d’élevage. Leur niveau d’appétit ou leur taille exacte ne peuvent pas être mesurés dans notre système et à ce stade de développement, et l’absence de réponse au stimulus souvent synonyme de souffrance n’est pas observée de manière systématique avant la mort de l’animal. Le développement de l’infection doit engendrer une douleur et/ou un stress à l’animal que l’on ne peut quantifier mais qui reste de courte durée puisque la mort intervient alors très rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car : (i) une majorité aura été en contact avec le pathogène et ils ne peuvent ainsi pas être réutilisés, ni replacés, ni adoptés. (ii) cela permettra les différentes analyses prévues (à différents temps ou en fin d’expérience)
Remplacement
Le rôle de la flore dans la protection contre l’infection et les interactions de celle-ci avec l’hôte ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et nous utiliserons ici des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est basé essentiellement sur des données de la littérature. L’analyse statistique pour la comparaison de la survie des larves dans de multiples conditions expérimentales au cours du temps s’appuiera sur l’utilisation d’un modèle de survie. Des ajustemenst seront réalisés afin de prendre en compte la multiplicité des tests.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence et comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection conférée par la flore contre un pathogène. L’ensemble des procédures consiste ainsi en l’infection des poissons-zèbres en ajoutant l’agent pathogène dans l’eau des larves de poissons et le suivi de la survie en fonction notamment de la composition de la flore reconstituée au préalable. Des mutants du pathogène utilisé seront également testés afin de mettre en lumière les facteurs de virulence impliqués dans le développement de l’infection. Les symptômes chez la larve étant peu connus et non systématiques, la mort de l’animal par l’infection ne peut majoritairement pas être évitée sans interférer avec nos résultats. Certains signes cliniques propres à la pathologie du pathogène donné seront néanmoins recherchés quotidiennement et aboutiront à la mise à mort du poisson par surdose d’anesthésique. Une observation quotidienne des poissons sera ainsi réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de quinze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Choix des espèces
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-pathogène ainsi que l’identification du rôle du microbiote sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes invasives que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, qui nécessite des poissons-zèbres adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.
Elevage, Maintien et Phénotypage d’une nouvelle lignée de rats mutants à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Porteurs d'une mutation reproduisant le syndrome de DAVID, les rats homozygotes de cette lignée meurent prématurément, après une perte de poids et une prostration qui apparaissent vers six ou sept mois. 130 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, tous tués pour prélever des tissus. La seule intervention décrite est une biopsie d'oreille d'un millimètre pratiquée sur des ratons de huit jours pour les génotyper, geste dont le porteur signale qu'il stresse aussi la mère. L'essentiel du projet consiste à élever et maintenir cette lignée, la souffrance venant du phénotype que le porteur qualifie lui-même de "dommageable".
Objectifs
Des mutations sur le gène étudié ont été identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID, maladie autosomique rare associant des syndromes d'immunodéficience sévère et d'auto-immunité, ainsi que des déficits de certaines hormones. Nous disposons au laboratoire d'un modèle rat porteur d'une des mutations identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID. L'objectif est d'utiliser ce modèle pour analyser l'impact de cette mutation dans la fonction et la différenciation des lymphocytes, dans les phénomènes auto-immuns sévères et dans les mécanismes de la "tolérance centrale thymique", mécanismes qui permettent à ces lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même .
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'établir l'importance de cette mutation spécifique sur la régulation de la réponse immune, sur l'autoimmunité et ces mécanismes de tolérance.
Procédures
Des biopsies d'oreille de 1mm seront réalisées sur ratons âgés de 8 jours (1 seule/animal) pour les identifier et analyser s'ils sont porteurs de la mutation d'intérêt.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. à la biopsie d'oreille sur ratons de 8 jours (douleur légère et de courte durée) et stress de la mère 2. au phénotype dommageable, observé à partir de 6-7 mois d'âge
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements de tissus post-mortem.
Remplacement
Des études "in vitro" ont largement validé l'impact de la mutation du gène étudié dans la fonction et la différenciation des lymphocytes. Néanmoins, ces études in vitro ne sont pas suffisantes pour répondre au défaut de "tolérance centrale thymique" (mécanismes qui permettent aux lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même) à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez les patients atteints du syndrome de DAVID. Des études chez l'animal en utilisant ce modèle de rats génétiquement altéré sont donc indispensables.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour le maintien et l'analyse de la lignée, à savoir 130 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement et différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) seront placés dans les cages . Si un animal présente des signes de faiblesse mais sans atteintes de points limites, il pourra faire l'objet d'un isolement temporaire pour éviter tout comportement agressif de ses congénères. Les animaux à phénotype dommageable seront suivis comme ceux à phénotype non dommageable : suivi de poids (2 fois/semaine), surveillance de prostration éventuelle (quotidiennement). Le phénotype dommageable des rats homozygotes pour la mutation est une létalité précoce après perte de poids significative et prostration observé à partir de l'âge de 6-7 mois. Si un signe clinique sévère est observé et/ou un point limite atteint, l’animal sera mis à mort pour des raisons éthiques.
Choix des espèces
Les rats sont de bons modèles d'étude de par leur facilité d'entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similtudes physiologiques avec l'éspèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement,...). Nous utilisons cette lignée de rats génétiquement altérés parce que ces animaux sont porteurs d’une mutation dans le gène étudié, comme celle présente chez les patients atteints du syndrome de DAVID, et qui est à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez ces patients. Pour le maintien de la lignée, nous utiliserons des rats âgés de 2 mois (maturité sexuelle) à 12 mois (déclin du taux de reproduction au dela). Pour l'analyse de la lignée, nous utiliserons des rats âgés de 2 mois (maturité du système immunitaire) à 12 mois (analyse de l'impact de l'age sur les déficits immunitaires et endocriniens).
Plateforme préclinique de modélisation des réactions allergiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des souris conventionnelles, humanisées pour leur système immunitaire ou leur foie, ou doublement humanisées, reçoivent des allergènes par la bouche ou sur la peau, 8 à 10 fois au plus, pour reproduire des allergies sur lesquelles tester environ 50 à 60 molécules. 10 000 souris vont être utilisées en cinq ans, réparties en 330 études, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sévère. L'exposition à l'allergène peut déclencher un choc anaphylactique, avec hypothermie, démangeaisons, gonflements et troubles respiratoires, et s'y ajoutent selon les études la pose d'une puce sous la peau, des injections de plasmides qui peuvent altérer de façon marquée l'état général dans les minutes suivantes, des prises de sang répétées et la mesure sous anesthésie de l'épaississement des oreilles. Les souris sont tuées parce qu'elles ont reçu des candidats médicaments dont un effet néfaste sur leur santé "ne peut être exclu", et 1 500 sont déclarées réutilisables dans un projet de formation interne, ce qui évite, selon le porteur, de commander des souris pour la formation.
Objectifs
Les allergies médiées par les immunoglobulines E (IgE), ou hypersensibilités, sont des réactions immunitaires exagérées à des antigènes environnementaux inoffensifs tels que des allergènes alimentaires, des pollens, des acariens ou encore des venins. Ces réactions peuvent aller de simples manifestations locales (urticaire, rhinite) à des manifestations systémiques graves telles que l’anaphylaxie. L’hypersensibilité de type I, aussi appelée réaction allergique immédiate, est une réponse immunitaire excessive qui se produit rapidement (quelques minutes) après l’exposition à un allergène chez une personne sensibilisée. Conséquences : inflammation, rougeur, démangeaisons, œdème, bronchoconstriction, etc. L’hypersensibilité de type IV, aussi appelée hypersensibilité retardée, est une réaction immunitaire cellulaire qui se manifeste 24 à 72 heures après l’exposition à un antigène. Conséquences : infiltration cellulaire, œdème, rougeur, induration. La compréhension des mécanismes de l’hypersensibilité de type I et IV et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques nécessite le développement de modèles précliniques fiables, reproductibles et transposables à l’homme. L'objectif principal de ce projet est de développer et caractériser différents modèles murins d’allergie médiée par les IgE et les lymphocytes T, en utilisant des souris conventionnelles non-humanisées ou humanisées (système immunitaire ou foie) ou doublement humanisées (système immunitaire + foie ). Les modèles développés serviront à mimer les différentes formes de réactions allergiques, systémiques ou localisées, afin de mieux comprendre les réponses immunitaires et d’évaluer à terme des outils préventifs, prophylactiques ou thérapeutiques. Des souris « non allergiques » (non sensibilisées) pourront être utilisés afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamique des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une plateforme complète de modélisation préclinique des allergies médiées par les IgE, adaptée à l'étude des mécanismes immunologiques et à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. On entend par « une plateforme complète » toute la chaîne de valeur préclinique, dans une logique de personnalisation, qualité et efficacité scientifique, ne se limitant pas à la simple exécution technique d’un modèle. Cela repose sur une approche progressive, car les expériences peuvent débuter si nécessaire par l’utilisation de modèles murins classiques pour les phases exploratoires, puis intégrant des modèles humanisés uniquement lorsque cela est nécessaire pour affiner la pertinence des résultats dans un contexte proche de l’humain.
Procédures
Identification par puce électronique :2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Administration : la fréquence dépend du protocole d’étude sauf pour les injections d’anticorps qui sera de 2 fois maximum. Chaque injection durera entre 10 et 15 secondes. Administration orale de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration orale durera 20 secondes. Administration locale, par contact cutané, de l’allergène : 8-10 fois maximum. Chaque administration locale durera 20 secondes. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal. Le nombre d’administration dépendra du traitement et de la voie d’administration choisie. Le suivi de la réponse anaphylactique se fera par un scoring allergique dans le cas d’allergie systémique active ou passive. Dans le cas d’allergie passive cutanée le suivi de la réponse allergique se fera par mesure de l’épaississement des oreilles, sous anesthésie, ainsi que par l’évaluation de la perméabilité vasculaire. Durée de 10 à 15 secondes. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’anémie, d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Le challenge est également susceptible d’induire une réaction allergique ou un choc anaphylactique pouvant se manifester notamment par une hypothermie, la présence de démangeaisons, de gonflements, de problèmes respiratoires et un impact sur l’activité de la souris. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer, in vitro, un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer les réactions physiologiques humaines responsables de la mise en place d’une allergie, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour les patients.
Réduction
Un total de 10 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans, permettant de réaliser 330 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe (pour faire face à la variabilité du modèle), avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Ce nombre total d’animaux inclut les groupes contrôles, les tests pilotes de validation de modèle, les répétitions inter-expérimentateurs et les pertes éventuelles. Il est prévu de tester approximativement entre 50 et 60 molécules de nature différente sur la durée de validité de ce projet. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum. Cette estimation permet de garantir la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction, grâce à une mutualisation des groupes contrôles et des revalidations de modèles précédents. Chaque molécule nécessite entre 100 à 400 animaux selon le protocole expérimental (modèle local ou systémique, voie d’administration, durée, nombre de groupes, etc.)
Raffinement
En début d’étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées en cage ventilée, préférentiellement par groupe social stable composé de 5 individus. Des compléments alimentaires (ex : Diet Gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Entre autres, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. A leur entrée dans l’animalerie, les souris recevront une période d’acclimatation de 4 jours minimum. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, du score d’allergie et de la perte de poids. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique et allergique ainsi que perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. L’utilisation de modèles murins d’allergie au pollen a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Poursuivre sur cette espèce est donc indiqué. De plus, lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur system immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Tests de molécules à visées thérapeutiques sur un modèle murin de syndrome métabolique (obésité, diabète, fibrose hépatique (NASH)).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souris sont rendues obèses, diabétiques et atteintes de stéatose du foie par des régimes riches en graisses et en sucre, pour que des chercheurs testent sur elles des candidats médicaments, dans une offre dont l'effectif suit un plan commercial. 990 souris, dont certaines dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisés, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées en fin d'étude, aux points limites ou à la demande du vétérinaire, 30 d'entre elles étant déclarées réutilisables dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Selon les études, elles subissent des tests de résistance à l'insuline et au glucose de 6 h 30 à 8 h 30 avec mise à jeun, des prises de sang répétées et des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires dans les minutes suivantes. Sous des signes "pouvant entraîner un inconfort", le porteur liste des accidents vasculaires cérébraux, des crises cardiaques, une encéphalopathie hépatique et des vomissements de sang. L'effectif couvre 33 études de quatre groupes de 5 à 10 souris, et selon lui "Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d'études ou pour le nombre total d'animaux dans le projet".
Objectifs
L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.
Bénéfices attendus
En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun. Durée totale du test entre [MODIFICATION] 6h30 et 8h30. L’administration de traitements ou de cellules pourra être réalisée selon différentes voies. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal, sans réveil de l’animal, sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux. [MODIFICATION] Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.
Impact sur les animaux
Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie (besoin excessif de manger), polyurie (trouble urinaire) , polydipsie (sensation de soif exagérée), troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : hématome, troubles cardio-respiratoires, altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). -Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. [MODIFICATION] Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.
Remplacement
Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.
Réduction
Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 a 10 animaux par groupe. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sans réveil sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis, perte de poids dépassant les seuils définis.
Choix des espèces
L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire et du foie chez des lignées de souris spécifiques. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. [MODIFICATION] Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines correspondant au délai nécessaire pour obtenir une prise de greffe hépatique suffisante dans la majorité des souris.
Etude du rôle de l’autophagie dans l’hématopoïèse normale et pathologique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Hautement immunodéprimées et maintenues en hébergement stérile, elles reçoivent des injections quotidiennes plusieurs jours de suite, des cellules leucémiques humaines ou murines, une chimiothérapie cinq jours d'affilée, puis des prélèvements de sang et de moelle dans le fémur. Le porteur décrit ce que produit l'inhibition de l'autophagie, une perte de poids puis, vers six semaines, des tremblements et une paralysie des pattes arrière, et signale que les cellules leucémiques injectées dégradent rapidement l'état général. Les bénéfices annoncés pour les malades atteints de leucémie aiguë myéloïde passent par des thérapies encore à développer, et le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'avoir des preuves d'efficacité in vivo avant tout passage en clinique.
Objectifs
L’hématopoïèse est responsable de la génération de l'ensemble des cellules sanguines. En condition physiologique, l’hématopoïèse est soutenue par les cellules présentent dans la moelle osseuse (MO). Des dérégulations de ces cellules peuvent conduire à la survenue d'hémopathies malignes (maladies du sang) telles que les leucémies. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont les cancers du sang et de la moelle osseuse les plus courants chez l’adulte. Malgré un taux élevé de rémission après traitement par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes. L’autophagie est un processus impliqué dans l’homéostasie cellulaire, la régulation du métabolisme mais également l’hématopoïèse. Ainsi, des dérégulations de l’autophagie sont impliquées dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’autophagie des cellules du microenvironnement a également été mise en évidence comme favorisant la croissance de différents cancers en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie des cellules du microenvironnement de la MO dans la régulation de l’hématopoïèse et de la chimiorésistance des LAM. Mieux comprendre ces mécanismes nous aidera à mieux prévenir et soigner les hémopathies malignes.
Bénéfices attendus
La résistance aux chimiothérapies représente un enjeu clinique majeur dans les LAM. Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans l’hématopoïèse mais également la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM et ainsi diminuer les récidives.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Pré-conditionnement des animaux : une injection par jour pendant 1 ou 2 jours, 48h avant injection des cellules. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. – Inhibition de l'autophagie : une injection par jour pendant 4 jours. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. – Traitements par chimiothérapie : 1 injection par jour pendant 5 jours, durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. - Test cibles thérapeutiques : leur fréquence d’administration sera déterminée selon la littérature, en respectant scrupuleusement les recommandations des volumes limites. Ces procédures dureront de quelques secondes à 1 minute. - Injection des cellules hématopoïétiques. Durée : quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles - Injection des cellules leucémiques. Durée : quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles. - Prélèvements sanguins : Toutes les 4 semaines si besoin. Durée : environ 1 minute. Sur animaux anesthésiés ou vigiles. - Prélèvements de moelle : Si absence de cellules aux prélèvements sanguin. Durée : environ 1 minute. Sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
L’inhibition de l’autophagie conduit à une perte de poids puis plus tardivement (6 semaines) à une neurodégénérescence caractérisée par des tremblements et paralysie des pattes arrière. Le pré-conditionnement des animaux permettant la greffe des cellules conduit à des nuisances temporaires : déshydration et perte de poids. L’injection de lignées cellulaires de LAM qui prolifèrent rapidement engendre une détérioration rapide de l’état général des souris : déshydratation, perte de poids, paralysie des pattes arrière. Nuisances concernant les points des expériences : contention : stress, injection IP : stress, douleur modérée, Prélèvements veineux : douleur légère (sous anesthésie), prélèvements intra-fémoraux : douleur modérée, notamment au niveau du genou (sous anesthésie + analgésiques/antalgiques).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les échantillons à analyser (sang, cellules de la moelle osseuse et de la rate).
Remplacement
Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans l’hématopoïèse et la résistance leucémique, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.
Réduction
Les cohortes décrites ont été calculées de manière à utiliser le nombre juste d’animaux. C’est-à dire un nombre suffisant pour observer l’effet attendu, mais suffisamment réduit pour ne pas utiliser de façon injustifiée des animaux. Pour cela, nous utilisons un logiciel paramétré pour pouvoir détecter des différences entre les groupes égales ou supérieures à 30%, en utilisant des tests statistiques appropriés en fonction des expériences et des groupes expérimentaux.
Raffinement
L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des animaux, adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement (par le personnel de la zootechnie et les expérimentat.eurs.rices) et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les souris utilisées dans le projet étant des animaux hautement immunodéprimés, ils sont maintenus dans un hébergement stérile. Les cages sont disposées sur des portoirs ventilés et toute personne pénétrant dans les hébergements doit porter les équipements de protection individuelle (EPI) suivants: masque chirurgical, charlotte, surchaussures, combinaison, gants. Les protocoles ont été étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection (des cellules, des composés) et la durée de traitement. Des anesthésiques et analgésiques seront également utilisés lors des prélèvements veineux et intrafémoraux. Lors des expériences (chimiothérapie ou autres composés, ainsi qu’après injection de lignées cellulaires), qui pourraient engendrer une dégradation de l’état de santé des animaux, celui-ci sera évalué grâce à une grille de score adaptée (état général, poids, pelage, réflexes…). En cas d'approche d'un point limite, le responsable de l'étude prendra une décision dans les 24h après le signalement, afin de choisir une éventuelle suspension du traitement, réhydratation ou un soin. L’expérience sera stoppée (et les animaux mis à mort) lorsque le score atteindra un score trop élevé. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies et dans l’hématopoïèse. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ce modèle intègre les caractéristiques de la pathologie humaine et aide à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Il présente des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. L’injection de cellules hématopoïétiques (cellules du sang) murines ou humaines permet de reproduire l'hématopoïèse, processus permettant la génération de l'ensemble des cellules du sang et permet ainsi d'étudier toutes les cellules de ce processus. L’injection des cellules leucémiques dans la circulation sanguine des souris est actuellement le modèle préclinique le plus utilisé pour étudier la leucémie aiguë myéloïde in vivo puisqu'il permet de reproduire de manière relativement fidèle la maladie telle que retrouvée chez l’homme. Au début des expériences, les animaux seront âgés d’environ 7 à 12 semaines car les transplantations de cellules hématopoïétiques ou cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là.