Recherche fondamentale

Une chirurgie de 90 minutes interrompt puis rétablit la circulation sanguine dans le foie de 836 souris, qui subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une ou deux injections des molécules testées, puis deux prélèvements sanguins pour 616 d'entre elles et six pour les 220 autres. L'opération peut occasionner des douleurs pendant environ 72 heures, ainsi qu'une fatigue et une baisse de mobilité. Les organes sont prélevés sur des animaux tués, ce que le porteur justifie par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'architecture et la vascularisation du foie, d'où il conclut qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal.

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une greffe. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Des recherches récentes ont montré qu’un traitement agissant sur le métabolisme des cellules permettait de réduire ces lésions, du moins dans le cas du rein. Le but de notre projet est de tester cette approche sur un autre organe : le foie. Pour cela, nous allons tester trois molécules différentes sur un modèle de souris pour voir si elles peuvent protéger le foie contre les effets de l’ischémie-reperfusion.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu dans la protection des lésions l’ischémie-reperfusion hépatiques, afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le rein, le coeur, le pancréas, les poumons. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Tous les actes décrits concernent toutes les souris. 1 ou 2 injections des molécules testées (durée de l'intervention 1 minute). En fonction du site d'injection, elles seront faites sur animal vigile ou anesthésié. S'il y a 2 injections, elles seront espacées au moins de 90 minutes. 1 acte chirurgical sous anesthésie d'une durée de 90 minutes pour provoquer l'ischémie-reperfusion du foie. 2 prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie (616 animaux), et 6 prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie (220 animaux), pour mesurer différents paramètres biologiques. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'un minimum de 20 heures.

Impact sur les animaux

Les injections sur animal vigile pourront induire un stress transitoire de moins d'1 minute ainsi qu'une légère douleur de moins de 5 minutes. La douleur liée aux injections et aux prélèvements de sang sur animal anesthésié sera minorée par l'utilisation d'antalgique local. Suite à l'anesthésie de 90 minutes, l'effet attendu au réveil est un stress léger et un inconfort léger, tous deux d'une durée de 15 minutes. En post-opératoire, la chirurgie peut occasionner des douleurs pendant environ 72 heures, qui sont minorées par l'administration d'antalgiques. Une légère perte de poids peut aussi être observée qui sera reversée en 72 heures. Après ischémie-reperfusion hépatique, une fatigue et une diminution de la mobilité sont attendues ; elles disparaissent sous 72 heures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro du foie, cependant ces modèles sont très limités pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Les groupes contrôles serviront à plusieurs conditions expérimentales. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Certaines injections et les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. La procédure chirurgicale sera réalisée en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être et diminuer leur stress.

Choix des espèces

Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2). La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude.

Rendues sourdes par une exposition sonore ou par chimiothérapie, opérées sous anesthésie générale, puis soumises chaque semaine à une heure de test auditif sous anesthésie, 14 880 souris et 1 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des tests comportementaux deux fois par semaine, que le porteur ne nomme pas, et des administrations hebdomadaires par voie orale ou par injection. Le porteur annonce que la prise en charge garantit le bien-être des animaux non-humains dans la phrase même où il indique que tous seront anesthésiés puis tués, et décrit par ailleurs des récompenses alimentaires distribuées après chaque manipulation. Sur les 16 080 rongeurs, dix rats jugés en bonne santé et non utilisés dans les expériences pourront être proposés à l'adoption, les autres étant tués pour analyses.

Objectifs

466 millions de personnes souffrent de déficience auditive dans le monde (OMS, 2020). D’ici 2050, ce chiffre devrait s’élever à 900 millions. Les surdités et les pathologies de l’oreille interne représentent une problématique majeure de santé publique, en raison de leur fréquence et de leur impact sur la qualité de vie et l’inclusion sociale. Notre projet vise donc à développer des solutions innovantes pour restaurer les fonctions de l’oreille interne, en particulier l’audition. Pour cela, nous testons différentes approches thérapeutiques sur des modèles animaux (rongeurs), certains présentant des altérations génétiques ou acquises similaires à celles que l’on retrouve chez les patients en clinique. L’objectif final est d’identifier des traitements efficaces et sûrs, afin de les faire évoluer vers des essais cliniques et, à terme, améliorer la prise en charge des personnes souffrant de pertes auditives dans différents contextes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer et affiner des modèles précliniques de surdité (congénitale, induite par le bruit ou par chimiothérapie) chez le rongeur (rats et souris), dans le but d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques destinées à restaurer l’audition, dans un contexte où les solutions actuellement proposées aux patients (appareils auditifs, implants cochléaires) restent imparfaites et ne permettent pas toujours une récupération satisfaisante des capacités auditives. Plusieurs bénéfices sont attendus à différentes échelles : A court terme : amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes de la surdité dans différents contextes (génétiques, environnementaux, toxiques). A moyen terme : développement de modèles animaux robustes et transposables aux pathologies humaines, permettant une meilleure évaluation des traitements candidats. Long terme : Passage en phase clinique de certaines approches thérapeutiques testées avec succès en phase préclinique, pouvant aboutir à la restauration partielle ou totale de l’audition chez des patients atteints de surdité, améliorant ainsi leur qualité de vie, leur communication et leur inclusion sociale. Indirectement, ce projet contribue à la mise en place de méthodes expérimentales optimisées et éthiques, visant à réduire le nombre d'animaux nécessaires grâce à des modèles plus prédictifs et à l’intégration de marqueurs précoces d’efficacité et de toxicité. Ce projet se distingue par la diversité des modèles de surdité étudiés, couvrant plusieurs causalités majeures de cette pathologie. Il offre une plateforme préclinique complète et pertinente pour le développement de traitements innovants, en lien direct avec des applications cliniques concrètes. Il s’inscrit pleinement dans une logique de recherche relationnelle entre le laboratoire et le patient, avec un fort potentiel d’impact sociétal.

Procédures

LE PROJET COMPREND LES INTERVENTIONS SUIVANTES SUR DES RATS ET DES SOURIS : •CHIRURGIE SOUS ANESTHESIE GENERALE - DUREE MOYENNE DE 30 MINUTES - UNE FOIS PAR ANIMAL •TESTS AUDIOMETRIQUES SOUS ANESTHESIE GENERAL - DUREE DE 1 HEURE - UNE FOIS PAR SEMAINE •EXPOSITION SONORE SUR ANIMAUX VIGILES - DUREE DE 15 MINUTES - UNE FOIS PAR ANIMAL •TESTS COMPORTEMENTAUX SUR ANIMAUX VIGILES (APRES PERIODE D'HABITUATION) - DUREE DE 10 A 30 MINUTES - DEUX FOIS PAR SEMAINE •ADMINISTRATION DE SUBSTANCES PAR VOIE ORALE OU PAR INJECTION - DUREE DE 1 HEURE - UNE FOIS PAR SEMAINE

Impact sur les animaux

LES CHIRURGIES PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS PASSAGERES QUI SERONT SOIGNEES PAR LA PRISE D'ANTIDOULEURS. CERTAINS TRAITEMENTS, NOTAMMENT DE CHIMIOTHERAPIE, PEUVENT ENTRAINER DES EFFETS SECONDAIRES TEMPORAIRES COMME UNE PERTE DE POIDS, DES TROUBLES DIGESTIFS OU UNE BAISSE DE TEMPERATURES. LES TESTS AUDITIFS, LES OBSERVATIONS DU COMPORTEMENT, AINSI QUE CERTAINES MANIPULATIONS PEUVENT AUSSI CAUSER UN STRESS DE COURTE DUREE.

Devenir

A LA FIN DU PROJET, LA PRISE EN CHARGE DES ANIMAUX EST STRICTEMENT ENCADREE POUR GARANTIR LEUR BIEN-ETRE. TOUS LES ANIMAUX INCLUS DANS LES PROJETS SERONT ANESTHESIES PUIS EUTHANASIES SELON DES METHODES LEGALES ET ETHIQUES AFIN DE PERMETTRE DES ANALYSES SCIENTIFIQUES. LES ANIMAUX QUI NE PARTICIPENT PAS AUX EXPERIENCES POURRONT ETRE PROPOSES A L'ADOPTION APRES AVIS FAVORABLE DU VETERINAIRE DU A LA BONNE SANTE DE L'ANIMAL.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études in vitro sur des cellules de lignées humaines ou des organoïdes, nous ne pouvons pas remplacer le modèle animal car les composés doivent être testés sur des modèles entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes avant de passer en phase clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini grâce à des études pilotes dans un précédent projet comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence sur les paramètres étudiés lors d’études. Un même animal peut être son propre contrôle lorsque cela est possible pour participer à la réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

LES ANIMAUX SONT HABITUES PROGRESSIVEMENT AUX CHERCHEURS, AUX MANIPULATIONS ET AUX TESTS, SOUVENT AVEC DES PETITES RECOMPENSES ALIMENTAIRES. POUR FAVORISER LEUR BIEN-ETRE, LES CAGES SONT ENRICHIES D'ELEMENTS PERMETTANT DES INTERACTIONS SOCIALES, ET UNE AIRE DE JEUX A ETE CREEE POUR REFORMER DES GROUPES SOCIAUX SI NECESSAIRE. DES MESURES SPECIFIQUES SONT MISES EN PLACE POUR LIMITER LA DOULEUR ET LE STRESS : SUIVI ATTENTIF APR7S LES OPERATIONS, COMPLEMENTS ALIMENTAIRES, REHYDRATATION, CHAUFFAGE, APPORT EN OXYGENE ET TRAITEMENT DE LA DOULEUR. APRES CHAQUE MANIPULATION, LES ANIMAUX RECOIVENT EGALEMENT UNE RECOMPENSE.

Choix des espèces

LES RATS ET LES SOURIS ONT ETE CHOISIS CAR LEUR SYSTEME AUDITIF RESSEMBLE BEAUCOUP A CELUI DE L'ETRE HUMAIN. LES SOURIS PEUVENT AUSSI ETRE GENETIFQUEMENT ALTEREES, CE QUI PERMET DE REPRODUIRE CERTAINES FORMES DE SURDITE OU DE MALADIES PRESENTES CHEZ L'HOMME. LES TRAITEMENTS SONT TESTES DES LE PLUS JEUNE AGE POUR MIEUX COMPRENDRE LEUR EFFICACITE, MAIS AUSSI A L'AGE ADULTE POUR SIMULER DES PERTES D'AUDITION LIEES A L'EXPOSITION AU BRUIT OU A D'AUTRES CAUSES.

216 souris privées de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec un volume de tumeur autorisé jusqu'à 1 500 mm3. Cent quarante-quatre d'entre elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas sous la peau, cent huit une injection intraveineuse de nanoparticules, trente-six une injection directe dans la tumeur. Le porteur écrit pouvoir "imaginer" une perte de poids et de motricité chez les animaux dont la tumeur grossit. Aucun traitement n'est évalué à ce stade : les 216 souris sont utilisées pour choisir la souche, la dose et la voie d'administration de l'essai thérapeutique à venir, dont l'effectif n'est pas indiqué.

Objectifs

Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est Hommes : environ 9 % et Femmes : environ 10 %. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lèvera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des cellules qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisément, les nanoparticules seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement du cancer du pancréas. Cette première partie, courte et considérée pilote nous aidera dans le choix de souche de souris d'intérêt, le type de cellules vecteurs plus pertinentes, la dose de nanoparticules et la voie d'administration d'intérêt. Cela permettra donc de réduire le nombre de groupes expérimentaux par la suite pour l’étude thérapeutique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales : 144 souris concernées = 5 min /souris - injection intraveineuse : 72 souris saines + 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris - injection intra-tumorale : 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Afin d’éviter cela, nous avons prévu un volume maximum de tumeur à atteindre de 1500mm3. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des particules véhiculées dans les différents types cellulaires est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui-même est une étude pilote pour établir le bon choix de souche de souris, de modèle tumoral et de voie d’administration de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers du pancréas. Une suite est prévue une fois ces informations traitées.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur ainsi que la voie d’administration et les doses optimales à utiliser pour l’utilisation des nanoparticules dans les cellules vectrices. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature complétées par des simulations à l’aide d’outils en ligne régulièrement utilisés en recherche.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de trois individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il s'agit d'animaux OGM, au système immunitaire affaibli. Ils sont donc hébérgés en animalerie spécifique, en environnement controlé afin d'éviter tout risque d'infection et donc éviter un phénotype dommageable.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales qui peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris au système immunitaire déficient « SCID » qui sont considérées les plus pertinentes dans l’étude de tumeurs pancréatiques. Nous utiliserons des mâles et des femelles, tenant compte que la prévalence du cancer du pancréas touche aussi bien les hommes que les femmes. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Produire des souris qui développent d'elles-mêmes des tumeurs mammaires, puis les tuer pour en prélever les tissus : le projet ne prévoit pas d'autre activité que l'élevage d'une lignée transgénique. 134 souris femelles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur écrit n'avoir jamais observé les stades les plus avancés, tout en admettant qu'ils pourraient s'accompagner d'une perte de poids, d'une apathie et d'une difficulté à se mouvoir. La conduite tient à un seuil de taille : quand un zootechnicien palpe une tumeur qui approche du maximum autorisé, il le signale et l'animal est sorti ou tué dans les plus brefs délais.

Objectifs

Le but du projet est de produire des souris présentant spontanément des tumeurs mammaires afin de prélever des tissus sur ces animaux après euthanasie.

Bénéfices attendus

En permettant l'élevage de cette lignée transgénique qui développe des tumeurs, le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers mammaires.

Procédures

C’est l’élevage d’une lignée de souris présentant spontanément des tumeurs mammaires.

Impact sur les animaux

Seules les souris femelles (et pas les mâles) transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires. Il n'y a donc pas d'intervention pour favoriser ce processus de cancérisation. Cependant, même si nous ne l'avons jamais observé, aux stades les plus avancés de la maladie, des souris pourraient présenter des signes d'affaiblissement, avec une perte de poids et une apathie, voire une difficulté à se mouvoir si les tumeurs mammaires étaient maintenues au-delà du point limite.

Devenir

Les souris présentant des tumeurs sont euthanasiées à la fin des procédures, soit pour des prélèvements post-mortem, soit parce qu'elles atteignent le point limite.

Remplacement

Nos souris transgéniques développent spontanément des tumeurs mammaires. Elles serviront à générer des prélèvements après euthanasie qui seront utilisés en recherche. Même s’il est maintenant possible d'utiliser des cellules en culture, il n'est pas possible de reproduire la diversité de cellules présents dans une tumeur, ni l'évolution de la nature de ces cellules au cours du temps. L’étude de ces prélèvements permettra de comprendre les mécanismes sous-jacents au développement du cancer du sein.

Réduction

Le nombre de souris est limité au minimum pour maintenir la colonie et produire les animaux nécessaires pour notre étude. Ce nombre doit permettre d'obtenir un nombre suffisant d'animaux à prélever. Nous prévoyons que 134 souris développant des tumeurs seront produites au cours des 5 ans du projet.

Raffinement

Les souris sont élevées avec un enrichissement du milieu au niveau de la litière avec du coton et une cabane en carton. Les souris sont suivies quotidiennement et lorsque des tumeurs mammaires apparaissent, un suivi visuel et par palpation est réalisé. Si le zootechnicien constate l’apparition d’une tumeur qui pourrait s'approcher de la taille maximale autorisée, il doit le signaler immédiatement et l’équipe de recherche demande la sortie de l’animal ou l’euthanasie dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la croissance tumorale. Pour toutes les reproductions des animaux de 6 semaines en capacité optimale de reproduction sont utilisés. Les animaux utilisés à des fins scientifiques ont 4, 8 ou 12 semaines.

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant six à douze mois à des régimes enrichis en gras et en sucre destinés à provoquer une stéatose puis un cancer du foie, avec une injection intraveineuse sous anesthésie, huit à douze échographies hépatiques, trois prélèvements de sang et un transport entre deux établissements. Le porteur attend une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité et leur comportement, ainsi qu'une altération de l'état général liée au développement des tumeurs. Les retombées annoncées, de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles pistes thérapeutiques, sont renvoyées à un "futur proche", tandis que le recours à la souris est déclaré "indispensable" au motif qu'aucune lignée cellulaire ne restituerait les interactions du foie avec les autres organes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnostic et pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée). Enfin, le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur moelle osseuse. Le nombre vient d'un calcul que le porteur détaille : environ trente mégacaryocytes observables par souris, cent nécessaires par condition, six conditions, donc quatre souris chacune. Elles reçoivent une chimiothérapie qui fait chuter leurs plaquettes, puis une injection de Romiplostim et un prélèvement de sang sous anesthésie. Le porteur décrit la thrombopénie induite comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains en l'absence de saignement, tandis que le bénéfice clinique annoncé, faire progresser la prise en charge des patients sous chimiothérapie, reste renvoyé à plus tard.

Objectifs

Chaque année, en France, environ 370 000 personnes atteintes de cancer reçoivent un traitement de chimiothérapie. Ce traitement provoque fréquemment une forte baisse de la numération plaquettaire, appelée thrombopénie, exposant les patients à des saignements. Ces thrombopénies peuvent avoir des conséquences très graves, notamment des retards dans le traitement du cancer. Les plaquettes sont produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes. Ce processus est sous l’influence d’une hormone, la thrombopoïétine (TPO). Un médicament prometteur, le Romiplostim, qui imite l'action de la TPO, pourrait aider à traiter la thrombopénie induite par la chimiothérapie. Cependant, la moelle osseuse des patients n’étant pas facilement accessible, on ne connait pas encore son impact réel sur les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. L’objectif de cette étude est une analyse quantitative et qualitative de l’état fonctionnel des mégacaryocytes (MK) de la moelle après traitement au Romiplostim, notamment en évaluant l'impact du Romiplostim sur la morphologie des MKs ex vivo à J+8. Pour se faire il sera utilisé 1) un modèle préclinique murin déjà validé par le laboratoire, 2) des souris génétiquement modifiées, sans phénotype dommageable, possédant des mégacaryocytes fluorescents et 3) une approche d'imagerie de pointe, permettant d’imager en temps réel le comportement des mégacaryocytes dans leur environnement natif.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de la PodoPZ des mégacaryocytes. La PodoPZ est une structure présente sur tout le pourtour du mégacaryocyte qui joue un rôle majeur dans la production et la libération des plaquettes dans le sang. Sur le plan clinique, l’impact du Romiplostim en tant qu’analogue de la thrombopoïétine permettra de faire avancer les traitements de restauration de la numération plaquettaire chez les patients sous chimiothérapie. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l’efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections et un prélèvement. Une injection sur animal vigile avec une durée de moins d’une minute et une sur animal anesthésié avec une durée de 2-3 minutes. Le prélèvement sanguin s’effectue sur animal anesthésié et dure moins d’une minute. La durée totale de l’anesthésie est d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont: - Le stress lié à la préhension et contention de l’animal (léger)- La douleur liée aux injections et prélèvements (léger) - La thrombopénie induite par le traitement (léger) - La baisse, éventuelle, du système immunitaire (léger). Concernant le Romiplostim, il n’est pas attendu d’effets indésirables ; au contraire ce dernier devrait améliorer les effets liés au traitement, notamment pour la thrombopénie. La durée de la procédure n’excédant pas 8 jours, il n’est pas attendu d’altération de l’aspect et du comportement des animaux (état corporel, pelage, mobilité, respiration, etc).

Devenir

Les analyses par imagerie auront lieues sur les moelles osseuses des souris, ex vivo. Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre la capacité des mégacaryocyrtes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement est fortement perturbé par une chimiothérapie. En effet, le franchissement de la barrière vasculaire met en œuvre, simultanément, des interactions entre les mégacaryocytes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Des expériences préliminaires réalisées in vitro sur des mégacaryocytes, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse. Afin de répondre à nos questions, nous devons travailler sur le fonctionnement du système hématopoïétique (création des cellules sanguines) dans sa globalité ; en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. C’est pourquoi, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant, en l’occurrence des rongeurs, par une autre méthode.

Réduction

Nous savons par expérience qu'il nous est possible d'observer en moyenne 30 mégacaryocytes par souris en imagerie. Afin d’effectuer des tests statistiques cohérents, nous devons obtenir environ 100 mégacaryocytes par condition. Il nous faut donc 4 souris par condition, qui sont au nombre de 6, ce qui fait un total de 24 souris.

Raffinement

Les animaux étant habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. Pour les injections, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, selon la procédure en vigueur et un anesthésique local ainsi qu’un onguent ophtalmique seront utilisés. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress lié à la contention. En ce qui concerne la thrombopénie induite par le traitement, en l’absence de saignement, cette dernière est non impactante pour le bien-être animal. Toutefois, nous anticipons tout risque potentiel de saignement, notamment en cas de bagarre, par un enrichissement supplémentaire (tunnel) et un suivi, rigoureux, des animaux sera effectué deux fois par jour. Cela permettra de détecter au plus tôt tout comportement agressif au sein d’une cage. Pour ce qui est du risque lié à la baisse du système immunitaire induite par le traitement, celui-ci est minime ; toutefois les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé qui permettra d’éviter le développement d’une infection. De plus, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués le cas échéant.

Choix des espèces

Pour ce qui est du choix de l'espèce, la souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir des mégacaryocytes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques, qui dans notre cas est le Romiplostim. En ce qui concerne le stade de développement des souris : les souris adultes (8–18 semaines, 25–30 g) constituent le modèle le plus adapté car leur système hématopoïétique est pleinement mature, stable et comparable à celui de l’adulte humain, ce qui permet une interprétation pertinente des résultats.

Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.

Bénéfices attendus

Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.

Procédures

Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.

Devenir

A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.

Remplacement

Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.

Réduction

Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.