Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Effets des régimes nutritionnels paternels sur le métabolisme des spermatozoïdes, la reproduction masculine et la gestation chez la souris, 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Comprendre pourquoi les hommes obèses sont moins fertiles, et ce que leurs spermatozoïdes transmettent à leur descendance, sert de cadre à ce projet. 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour collecte d'organes. Rendues obèses, hyperglycémiques et résistantes à l'insuline par un régime riche en lipides suivi jusqu'à vingt-quatre semaines, elles subissent des jeûnes de vingt-quatre heures, des gavages de glucose, des injections d'insuline et d'hormones, jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, et pour les femelles gestantes une mesure quotidienne de pression artérielle sous contention de dix minutes. Sur les effectifs, le porteur écrit s'assurer d'utiliser "le nombre d'animaux minimal", sans donner ni calcul ni détail des groupes derrière ces 2 914 souris.
Objectifs
De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.
Procédures
Interventions réalisées dans l'établissement 1 : - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'etablissement 2: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.
Remplacement
Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.
Réduction
Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.
Les neurones à 26RFa/orexines de l’hypothalamus : cible thérapeutique potentielle pour le diabète de type 2 ? Une étude chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
2 323 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale pour prélever leurs organes. Rendues obèses et diabétiques par leur alimentation, elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie cérébrale de quarante minutes pour activer ou inhiber un groupe de neurones, jusqu'à six sessions de deux heures de prélèvements sanguins à la queue toutes les quinze minutes après mise à jeun, et quinze jours d'isolement en cage d'enregistrement. Le bénéfice avancé, de nouvelles pistes contre la "diabésité", reste une perspective, quand le protocole décrit des atteintes datées et répétées. Le porteur conclut qu'un modèle in vivo intégré est "obligatoire" et qu'il n'existe "pas d'alternative non-animale".
Objectifs
Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations du fonctionnement, de l’activité et de la signalisation de ce réseau de neurones, dans son rôle régulateur de la glycémie. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.
Bénéfices attendus
De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles, et potentiels défauts de l’activité électrique et de signalisation de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.
Procédures
- Afin d'activer ou d'inhiber les neurones à 26RFa ou bien d’administrer des composés pharmacologiques dans le système nerveux central, les animaux subiront une chirurgie réalisée sous anesthésie / analgésie durant 40 minutes. - Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement durant 15 jours dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus. - Afin de prélever des tissus à l’issus des tests physiologiques, les animaux subiront une chirurgie terminale sous profonde anesthésie / analgésie.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin d'être génotypés, les animaux subiront une biopsie de l'extrémité de la queue. Nuisances prévues : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Afin de moduler l’activité de la population neuronale d’intérêt, les souris subiront une chirurgie. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par des analgésiques. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun avant chaque test physiologique et une incision à l’extrémité de la queue permettant la ponction de gouttes de sang. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux ; douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement. Nuisance prévue : hébergement individuel des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.
Remplacement
Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, et de caractériser dans ce contexte le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.
Réduction
Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec le site BiostaTGV® qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités. Le design de nos expérimentations prévoit quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple) qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie/analgésie (locale ou générale). Il sera prévu, pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, une période de rétablissement minimum d’une semaine entre chaque test, leur permettant une stabilisation de leur poids corporel et la reconstitution initiale de leur volume sanguin après prélèvement.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète, et de caractériser dans ce contexte le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Mise au point d’un nouvel agent de contraste biocompatible pour l’imagerie photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Pose d'un cathéter, épilation à la crème dépilatoire, injection d'un produit inflammatoire ou chirurgie du cerveau de trente minutes, séance d'imagerie, puis perfusion mortelle. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet met au point un agent de contraste à base de microparticules de polydopamine, destiné à repérer l'inflammation en imagerie photoacoustique. Le porteur qualifie cette imagerie de non invasive et annonce dans le même texte que l'injection du produit inflammatoire peut provoquer une insuffisance cardiaque, des lésions de plusieurs organes et la mort des animaux.
Objectifs
L'inflammation joue un rôle central dans de nombreuses maladies, qu'elles soient neurologiques (AVC, traumatismes crâniens), digestives (maladie de Crohn), rénales (néphropathie diabétique) et cardiaques (ischémie du myocarde, myocardite). Ce projet vise à développer l’imagerie photoacoustique, une méthode innovante et non invasive pour visualiser l’inflammation de manière précoce et précise. Il repose sur l’utilisation de microparticules de polydopamine, un matériau biocompatible qui absorbe la lumière infrarouge et devient détectable en imagerie. En associant les microparticules de polydopamine à un anticorps ciblant une molécule inflammatoire, ces particules permettent de localiser les zones touchées dès les premiers stades de la maladie. Déjà prometteuse en IRM avec de l’oxyde de fer, cette approche pourrait offrir une alternative plus accessible pour détecter l’inflammation. L’objectif est d’évaluer sa précision et sa compatibilité biologique en vue d’une future application médicale.
Bénéfices attendus
Il est attendu de la technique d'imagerie photoacoustique utilisant ce nouvel agent de contraste qu'elle puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation dans les différents modèles de maladies inflammatoires proposés. Cette étude pourra apporter les premiers éléments permettant d’envisager une application clinique future. A terme, cette nouvelle méthode d’imagerie pourrait améliorer le diagnostic et la prise en charge de nombreuses pathologies inflammatoires.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie (durée : environ 15min) o 1 épilation d'une zone de la peau avec une crème dépilatoire sous anesthésie (durée : inférieure à 5 min) o 1 séance d'imagerie photoacoustique (non invasive) avec injection de produit de contraste sous anesthésie (durée : environ 20min) o Induction d'un modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) OU Induction d'un modèle de neuroinflammation par une unique chirurgie stéréotaxique sous anesthésie (durée : environ 30min) o Pesées lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 perfusion après anesthésie et analgésie profonde (durée : environ 5min).
Impact sur les animaux
Les deux modèles d'inflammation utilisés peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra induire des changements dans le fonctionnement cérébral (symptômes dépressifs, de l'anxiété, altérations des fonctions mentales) et la chirurgie cérébrale réalisée pour induire le modèle peut provoquer des micro-saignements et des douleurs au niveau des points de suture de la peau. Dans le deuxième modèle, l'injection du produit inflammatoire peut induire une inflammation généralisée, une insuffisance cardiaque et des lésions touchant plusieurs organes ce qui peut mener à la mort des animaux. L’injection des microparticules pourrait provoquer une légère irritation ou une réaction inflammatoire. Enfin, l’anesthésie, bien que couramment utilisée, peut parfois causer des effets secondaires comme des troubles respiratoires, une baisse de température ou une récupération plus lente après le réveil (fatigue, comportement modifié).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés en imagerie photoacoustique sur les microparticules de polydopamine (en utilisant des "fantômes") et ont montré que la polydopamine présente une absorption et une fluorescence significatives dans la région du proche infrarouge, adaptée à l'imagerie photoacoustique. Cependant, les expériences in vitro ne peuvent pas totalement remplacer les études in vivo, car il est crucial d’évaluer la sensibilité et la spécificité de détection des microparticules de polydopamine après injection dans un organisme vivant, en tenant compte des facteurs spécifiques à l'environnement biologique, tels que le flux sanguin, le passage du signal à travers la peau, les interactions avec les tissus environnants, la distribution des particules dans les différents organes. De plus, des études in vivo sont nécessaires pour évaluer la biodistribution et la biodégradabilité des particules à long terme, ainsi que pour détecter d’éventuels effets indésirables qui ne peuvent se manifester qu'après une période prolongée dans un organisme vivant. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet sont essentielles et ne peuvent être remplacées par des méthodes ne nécessitant pas l’utilisation d’animaux vivants, car seule l’expérimentation in vivo peut fournir les données complètes nécessaires pour valider cette approche et garantir sa transposition en clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été soigneusement évalué à partir des données issues de nos précédentes études ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types de microparticules. Conformément aux recommandations scientifiques, pour le développement d’un nouvel agent de contraste dans une modalité d’imagerie donnée, il est essentiel de s’appuyer sur un nombre d’animaux compris entre 5 et 10 par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est nécessaire pour évaluer la spécificité (par exemple, à travers des études comparatives avec des particules ciblant les molécules d’adhésion endothéliales ou des particules contrôles) et la sensibilité (notamment via des études de dose-réponse). Le nombre d’animaux requis est important mais d'après nos précédentes expériences dans le développement d’agents de contraste, nous avons établi que ces contrôles sont indispensables pour garantir la validité des résultats. Nous avons conçu le protocole de manière à minimiser ce nombre, en nous assurant que chaque expérience soit la plus informative possible tout en respectant les principes de réduction et de raffinement dans l’utilisation des animaux.
Raffinement
Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à oeuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Un gel "diet énergie" sera placé dans la cage pour faciliter la prise alimentaire et l'hydratation. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite dans les 3 heures après les injections, puis tous les jours jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines, car c’est à partir de cet âge qu’ils sont considérés comme adultes.
Étude des conséquences tissulaires, biologiques et fonctionnelles des déafférentations vestibulaires périphériques sur modèles rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 550
Un animal qui suffoque, tremble ou présente des troubles respiratoires après l'injection du produit ototoxique est aussitôt anesthésié puis tué. 550 rats et 300 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus. Un composé chimique est injecté à travers le tympan sous anesthésie générale pour détruire les capteurs de l'équilibre, ce qui provoque vertiges, pertes d'équilibre, perte de poids et parfois ulcère de la cornée par lésion du nerf facial. Le porteur prévoit des tests comportementaux aux jours 1, 2, 3, 4, 7, 10, 15, 21 et 30 après la lésion, quinze minutes par séance, sans jamais préciser lesquels.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les conséquences d’une atteinte des capteurs vestibulaires de l’équilibre situés dans l’oreille interne. L’objectif est d’identifier les mécanismes responsables des troubles de l’équilibre et ceux qui permettent une récupération naturelle, appelée « compensation vestibulaire ». Les recherches s’organisent autour de plusieurs thématiques : • Comprendre comment les noyaux vestibulaires situés dans le tronc cérébral s’adaptent après une lésion vestibulaire. Tester si la restauration de l’équilibre après lésion vestibulaire peut être améliorée grâce à des médicaments ou des exercices de rééducation. • Étudier la capacité naturelle des capteurs vestibulaires de l’oreille interne à réparer leurs connexions après une atteinte. • Explorer l’impact du vieillissement sur ces capteurs et son lien avec les troubles de l’équilibre liés à l’âge. • Analyser les variations hormonales associées aux lésions vestibulaires afin de déterminer leur rôle dans l’apparition et l’évolution des symptômes vestibulaires. Ces travaux permettront de mieux cerner les mécanismes biologiques à l’origine des troubles de l’équilibre et d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer leur traitement et leur prise en charge.
Bénéfices attendus
Utilisation du modèle animal de vestibulopathie pour mieux comprendre la physiopathologie vestibulaire. L’objectif étant d’améliorer les processus de rééducation et traitements pharmacologiques anti vertigineux de manière à les rendre plus efficace pour une meilleure prise en charge du patient vestibulaire.
Procédures
Injection d’une solution chimique à travers le tympan sous anesthésie générale pour induire le syndrome vestibulaire (vertige, déficits de la posture et de la marche) : de 5 à 10 min. Test comportementaux aux Jours 1, 2, 3, 4, 7, 10, 15, 21 et 30 après la lésion vestibulaire: 15 min par session. Chirurgie sans réveil (Perfusion intracardiaque) pour les prélèvement d’organes d'intérêts.
Impact sur les animaux
Souffrances inévitables : L’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne (composé ototoxique utilisé pour la lésion vestibulaire) peut être source d’inconfort. Les déficits vestibulaires conduisent à des effets indésirables tels que des problèmes de maintien de la posture, une perte d’équilibre et de la fatigue. Nuisances potentielles : Les animaux soumis à une lésion vestibulaire peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire. Une perte de poids est attendue chez les animaux après la lésion vestibulaire en conséquence de la chirurgie et des problèmes d’équilibre majeurs présents les premiers jours. Les tests comportementaux peuvent être source de stress pour les animaux car ils sont séparés temporairement de leurs congénères (5 à 10min). Autres nuisances possibles : perte d’appétit, instabilité posturale, absorption possible des composés ototoxiques par voie orale (via la trompe d’Eustache), ulcère de la cornée en raison d’une possible lésion du nerf facial, saignement depuis la cavité tympanique ou apnée aiguë pendant l’administration des composés ototoxiques entraînant le décès de l’animal. Nuisances potentiellement générées par les prélèvements sanguins : œdème
Devenir
La totalité des animaux du projet (rat n=550 ; souris n=300) seront mis à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour des analyses biologiques.
Remplacement
Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture, au barycentre et concernant l’état d’anxiété de l’animal), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été fixé avec l’aide d’un statisticien du laboratoire. Nous avons utilisé un logiciel approprié nous permettant de calculer la puissance statistique pour atteindre les résultats escomptés, tout en maintenant un nombre d’animaux le plus faible possible. Dans une approche de réduction, les mêmes animaux serviront à la fois pour les tests comportementaux, les prélèvements sanguins et l’analyse des tissus vestibulaires.
Raffinement
Avant l’administration d’une solution chimique à travers le tympan pour induire les déficits vestibulaires, les animaux sont sous anesthésie générale. La température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée, et une solution d'hydrogel est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire. Avant le réveil de l’animal, une solution sera injectée pour sa réhydratation et ainsi compenser les pertes liquidiennes liées à la chirurgie. Les biberons des cages des animaux seront équipés d’une pipette allongée et une solution nutritionnelle complète sera fournie dans la cage des animaux pour faciliter l’hydratation et l’alimentation durant la première semaine post-lésion. La douleur et l’état de santé des animaux seront évalués grâce à une grille d’observation qui prend en compte leur apparence, leur comportement, leur hydratation et d’éventuels signes cliniques. • Si l’animal présente un comportement normal, il poursuit l’expérience. • En cas de signes légers, une surveillance renforcée est mise en place et un traitement contre la douleur peut être donné. • Si des signes de souffrance apparaissent, un traitement contre la douleur adapté est administré et un avis extérieur est demandé pour décider de la suite de l’expérimentation. • En cas de souffrance sévère, l’expérience est immédiatement arrêtée et l’animal est endormi puis mis à mort. Certains signes graves entraînent aussi un arrêt immédiat, comme une perte de poids importante, de fortes difficultés motrices ou respiratoires, ou encore des complications liées à la lésion. Par exemple, si des substances utilisées lors de la lésion vestibulaire provoquent une réaction aiguë (suffocation, tremblements, troubles respiratoires), l’animal est aussitôt anesthésié et mis à mort pour éviter toute souffrance. Les animaux sont habitués à l’expérimentateur et à la salle d’expérimentation pendant 1 à 2 semaines pour limiter le stress. Une récompense (riz soufflé chocolaté) est donnée aux animaux après les tests comportementaux avant leur retour dans l’animalerie. L’hébergement des animaux se fait en groupe pour limiter le stress. Nous vérifierons après chaque prélèvement sanguin si un œdème se présente. Une pression sur la queue de l'animal sera réalisée après chaque prélèvement pour faciliter la coagulation et éviter un saignement. L'animal sera surveillé pendant 5min avant de le remettre dans sa cage et du riz soufflé chocolaté lui sera donné en récompense.
Choix des espèces
Le modèle rat présente de nombreux avantages en termes de manipulation et de coût et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez l’homme. Le choix de ce modèle pour les expérimentations sur l’axe Compensation et Hormones relève du souhait de bénéficier des expérimentations réalisées et validées précédemment dans l’équipe. Le modèle souris de déafférentation du vestibule a été précédement développé par notre équipe. Le choix du modèle souris a été priorisé avec l’objectif d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées. Le modèle TTK souris a permis d’identifier les acteurs impliqués dans le processus de réparation des synases vestibulaires endommagées et dans les processus de restauration fonctionnelle qui en résultent. Nous souhaitons poursuivre les études sur ce même modèle afin de bénéficier des avancées initialement publiées. Le choix du modèle souris pour les expérimentations sur le vieillissement relève du même souhait de bénéficier des expérimentations réalisées sur la souris adulte. Pour étudier la plasticité post-lésionnelle du système nerveux, les rats et les souris utilisés seront âgés d'au moins 3 mois (jeunes adultes), âge auquel le système nerveux est considéré comme mature. Selon les courbes de poids, le poids des rats mâles sera compris entre 300 et 350g, tandis que celui des femelles sera compris entre 200 et 250 g au début des expérimentations. Pour les souris le poids sera compris entre 15 et 35g. Pour l’Axe « AGING », des souris de différents âges seront utilisées (3-6-18-24 mois) afin de suivre l’expression âge-dépendante du BDNF dans le cerveau.
Evaluation de la pharmacocinétique de composés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 500
Lapins : 125
500 souris, 500 rats et 125 lapins vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, tous tués pour récupérer organes et fluides et y doser un composé. Les prélèvements sanguins se font au sinus rétro-orbitaire chez la souris, à la veine caudale chez le rat, à la veine marginale de l'oreille chez le lapin, avec des isolements d'une heure par jour en cage individuelle pour récolter urines et fèces. Le projet suit le devenir de molécules dans le corps pour le compte de clients, l'espèce étant choisie selon la demande de ces derniers. Le porteur retient le lapin parce que sa taille permet des prélèvements de plus grand volume, argument de réduction qui repose sur la quantité de matière tirée de chaque individu.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la pharmacocinétique de composés (médicament ou ingrédient). Lors de l’élaboration d’un nouveau médicament, il est indispensable de s’assurer qu’il atteindra correctement sa cible (cellule, tissu), qu’il pourra être correctement utilisé puis éliminé. C’est précisément l’objectif des études de pharmacocinétique : suivre le devenir d’un composé dans l’organisme. Les résultats de ces études permettent d’identifier les éventuelles étapes au cours desquelles le composé rencontre un obstacle l’empêchant de remplir sa mission (absorption, distribution, métabolisme, élimination). C’est sur la base de ces résultats que la formulation, la dose ou le mode d’administration peuvent être ajustés pour optimiser l’efficacité d’un composé donné. En première intention, des évaluations in silico et/ou in vitro permettent de faire une première étape de caractérisation d’un composé (formulation, structure, concentration, etc.). En deuxième intention, l’évaluation chez l’animal vivant apporte des informations supplémentaires cruciales pour améliorer l’efficacité du composé : biodisponibilité sanguine et tissulaire, concentration des métabolites, clairance, demi-vie, etc. C’est l’objet du présent projet.
Bénéfices attendus
De nombreuses pathologies sont aujourd’hui incurables à cause d’un manque d’efficacité des traitements existants. Nos études de pharmacocinétique contribueront à rendre les traitements du futur plus ciblés et plus efficaces en ayant une meilleure connaissance de leur utilisation par l’organisme.
Procédures
1) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie ou non (selon l’espèce, et le site du prélèvement). Ces prélèvements seront très rapides (1 minute). Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude, mais respectera les limites décrites dans la procédure. 2) Les animaux pourront être soumis à des prélèvements de fèces ou de mictions. Ces prélèvements s’effectueront sur une durée maximale d’une heure par 24h, en cage isolée. Le nombre de prélèvements sera dépendant de chaque étude. 3) Les animaux recevront une ou plusieurs injections de composés. Les administrations sont très rapides (2-3 minutes). Le nombre d’administrations sera dépendant de chaque étude mais respectera les limites décrites dans la procédure.
Impact sur les animaux
Les nuisances pouvant être causées dans ce protocole proviennent : - De l’introduction d’une aiguille lors de l’injection d’un composé. - D’un prélèvement sanguin (pouvant être réalisé à la veine mandibulaire ou au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat), veine marginale de l’oreille (lapin) du vivant de l’animal. Dans le cas d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire (souris), à la veine caudale (rat) ou à la veine marginale de l’oreille (lapins), les animaux seront anesthésiés. - D’un isolement de courte durée (1h maximum par 24h) pour la récolte de mictions et de fèces ou bien lors de l’administration d’un composé par voie aérienne en cage à nébuliser. Toutes les manipulations seront effectuées par un personnel qualifié. Une attention particulière sera portée au stress de l’animal en favorisant une acclimatation des animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans cette procédure seront mis à mort afin de récupérer leurs organes et fluides dans le but de pouvoir doser le composé injecté, ses métabolites et ses précurseurs, ou toute molécule nous permettant de retracer le devenir du composé dans l’organisme.
Remplacement
Chaque fois que cela sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement des tests animaux. L’utilisation unique d’études in vitro n'est pas suffisante pour évaluer la pharmacocinétique d’un composé. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, tissulaires d'un animal entier. De plus, c’est une exigence réglementaire de démontrer des effets bénéfiques chez l’animal (puis chez l’Homme), pour qu’un médicament potentiel puisse prétendre à une autorisation de mise sur le marché.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, chaque fois que cela sera possible, les candidats médicaments seront initialement évalués en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre minimum d’animaux est défini en tenant compte de la variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes d’animaux. Le nombre de rats, de souris et de lapins nécessaires a été défini afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Cela nous conduit à former des groupes de 10 animaux chez la souris et le rat, et des groupes de 5 animaux pour les lapins.
Raffinement
Les expérimentateurs sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences des expérimentateurs est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Par ailleurs, les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton) de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Les lapins seront eux hébergés par 2, selon les conditions de la réglementation 2010/63. L'enrichissement sera composé de buchettes et d'un jouet. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante. Pour les gestes qui le nécessite, conformément à la règle des 3R, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Les animaux seront vus quotidiennement par un expérimentateur et/ou un zootechnicien. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Cependant, le lapin est phylogénétiquement plus proche de l'Homme que les rongeurs et compte tenu de sa taille, il permet des prélèvements de fluides ou de tissus importants réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Par conséquent, selon la demande du client l’espèce la plus adaptée sera choisie pour l’étude. Par défaut, les animaux seront utilisés à l'âge adulte car l’essentiel de notre activité se concentre sur des composés visant une population adulte. Nous n’excluons pas la possibilité qu’une étude nécessite de se dérouler chez des animaux plus jeunes (système immunitaire immature). Le cas échéant, l’âge minimum des animaux correspondra à l’âge du sevrage (3 semaines pour les souris et les rats et 7 semaines pour les lapins).
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 2/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 70 d'entre elles recevant en plus un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Elles subissent des injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline et de dexaméthasone, des mesures de pression artérielle en tube de contention, des échographies cardiaques sous anesthésie et des transferts entre trois établissements. Toutes sont tuées après les seize semaines pour prélever des organes, une partie de ces prélèvements étant redistribuée à d'autres chercheurs du laboratoire pour des mises au point techniques.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Vingt prélèvements sanguins, un par semaine pendant vingt semaines, et jusqu'à quatre séries d'injections dans les deux muscles des pattes pour chaque souris. 1 840 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs organes et y doser les vecteurs. Ces vecteurs synthétiques doivent transporter des ARN messagers codant des anticorps, avec l'idée de faire produire le traitement par l'organisme lui-même. Le porteur annonce un "tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies", alors que le projet en est à comparer l'efficacité de formulations chez la souris.
Objectifs
La prévention et le traitement des maladies infectieuses ainsi que le développement d’alternatives au antiviraux chimiques limités pourraient voir le jour sur la base de la production d’anticorps neutralisant directement par l’organisme ouvrant ainsi un nouveau paradigme en biothérapie. Le développement d'une plateforme universelle d’ARNm codant pour ces anticorps permettrai de concevoir rapidement des traitements antiviraux, et ainsi d'offrir des solutions thérapeutiques plus confortables et plus efficaces pour les patients et à moindre coût. Cette approche pourrait être un tournant majeur dans la lutte contre les épidémies et les pandémies. Dans ce cadre, l’utilisation de vecteurs synthétiques est un élément indispensable à son succès car les molécules d’ARN sont incapables de franchir la membrane cellulaire, étape pourtant indispensable pour la production de la protéine correspondante. Les avancées récentes dans la chimie des vecteurs synthétiques ont permis le développement de vecteurs composés de polymères ou lipides, et qui possèdent des caractéristiques permettant d’envisager le transfert d’acides nucléiques (ARNm) avec des efficacités similaires à celles obtenues avec des vecteurs d’origine virale. Cela permet d’envisager simplement l’utilisation de ce type de vecteur à des fins de vaccinations, ou afin d’induire la production de protéines thérapeutiques in vivo. Les objectifs de ce projet sont de poursuivre l’optimisation de vecteurs synthétiques existants et la découverte de nouveaux, d’optimiser leur développement en évaluant l’efficacité (par dosage dans le sang et les tissus) des vecteurs pour le développement de traitements antiviraux à base d’anticorps produits directement dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole, permettra de poursuivre la caractérisation et l’identification des vecteurs synthétiques de nouvelles générations efficaces, simples et non-toxiques. Également, cela permettra d’évaluer l’efficacité de ces vecteurs synthétiques dans le cadre du développement d’alternatives aux anti-viraux chimiques pour lutter contre les maladies infectieuses. - Long terme : en cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des maladies infectieuses ou toute maladie nécessitant la production d’un anticorps thérapeutique, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables et ii) le développement de méthodes de prévention d’infection non chimiques qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels tout en préservant l’environnement de l’accumulation de métabolites chimiques dans l’environnement et (iii) limiter l’utilisation d’antibiotiques qui induisent des résistances. L’impact du succès de ce projet serait de proposer une approche ARNm universelle, immédiatement disponible pour toutes les indications thérapeutiques, offrant une réponse biologique robuste et facilement industrialisable grâce à un outil standardisé et unique quel que soit le produit
Procédures
Les animaux subiront des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie gazeuse de l'animal, placé sur tapis chauffant. La procédure durera moins de 5 min. Au maximum 4 séries d'injections intramusculaires dans les 2 muscles par souris espacées d’au moins 3 jours. Des prélèvements de sang seront également effectués sur animal anesthésié. Des prélèvements sanguins sont prévus avant l'injection puis 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude pour un durée totale de 20 semaines, soit 20 prélèvements sanguins en tout. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus à l’injection ou aux prélèvements de sang. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une inflammation au site de prélèvement sanguin, une léthargie…. Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Inflammation transitoire au niveau du site d’injection; 2) Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang; 3)- Risque infectieux lié à la réalisation du geste invasif (injection et prélèvement).
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs évalués in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, la meilleure efficacité de transfection étudiée ici correspond aux conditions où le plus de protéine codée par l’ARN messager issu du vecteur est exprimée dans le tissu dans lequel a été injecté le vecteur, donc seule l’approche in vivo sera considérée pour évaluer leur efficacité. En outre, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des ARN dans des cellules en culture, ni même des organoïdes. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteurs a été récemment validée et qui a fait l’objet d’un développement préclinique réglementaire dont le plan d’étude a été validé par l’ANSM et les résultats présentés également à l’ANSM démontrant aucune toxicité ni mortalité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité autant que possible tout en garantissant l’obtention de résultats interprétables, afin d’éviter la nécessité d’une étude supplémentaire. Un premier criblage in vitro a permis de ne retenir que les vecteurs les plus efficaces. En tenant compte de la variabilité attendue des réponses, un maximum de 10 animaux par groupe a été prévu. Ce seuil permet d'assurer la pertinence des analyses et la fiabilité des comparaisons, tout en respectant le bien-être animal. Le nombre a été déterminé à partir de données historiques et d’une approche statistique, et l'utilisation de chaque animal a été optimisée grâce à des mesures longitudinales et à des études pilotes. L’effectif sera revu à la baisse si les résultats préliminaires d’efficacité le permettent, en visant des données cohérentes et reproductibles entre les individus.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement - tube, frisotis, dôme, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins. Dans le cas de l'observation d'un inconfort liée aux injections intramusculaires, une injection de buprénorphine sera effectuée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sera effectué une fois par semaine. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors des prises de sang), et les injections seront réalisées sous anesthésie et les animaux positionnés sur tapis chauffant.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car les vecteurs que nous utiliserons à titre de comparaison ont été validés in vivo sur la souris. De plus, cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets des vecteurs chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté à aux vecteurs étudiés mais concernera quasi exclusivement des souris adultes d’environ 8 à 10 semaines pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux.
Le rôle des gènes SoxC dans le dévelopment du rein
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Des femelles gestantes reçoivent une dose unique de tamoxifène par pipette, sous contention de vingt à trente secondes, pour désactiver trois gènes chez leurs embryons. 214 souris vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet cherche à comprendre comment ces gènes commandent la formation du rein fœtal, sans perspective thérapeutique annoncée au-delà de la connaissance elle-même. Le porteur écrit que le tamoxifène "ne cause aucun effet secondaire" et fonde ses calculs sur 20 embryons, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 214 souris déclarées.
Objectifs
Certaines malformations du rein et de l’appareil urinaire font partie des anomalies les plus graves que l’on peut détecter à la naissance. Dans les cas les plus sévères, elles peuvent entraîner la mort du nouveau-né. Dans d’autres cas, ces malformations peuvent causer des maladies rénales chroniques qui apparaissent plus tard, à l’adolescence ou à l’âge adulte. Ces maladies sont souvent liées à d’autres problèmes de santé, comme le diabète ou l’hypertension (pression artérielle trop élevée), qui sont les principales causes de mortalité chez les personnes atteintes. Depuis 1990, le nombre de cas de maladies rénales chroniques a augmenté de 29 %. Malgré l’ampleur du problème, il n’existe aujourd’hui aucun traitement permettant de guérir ces maladies. Dans notre laboratoire, nous cherchons à mieux comprendre comment se forment les reins. Pour cela, nous étudions un groupe de gènes qui pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Nous étudions les embryons parce que les reins se forment pendant la grossesse. Pour comprendre l’origine des malformations, il faut observer le développement dès le début, pas une fois que l’organe est déjà formé. Le tamoxifène est un médicament que l’on utilise comme un “interrupteur” pour activer un changement dans les gènes, de manière très ciblée, chez les souris de laboratoire. Dans notre modèle, certaines souris ont été génétiquement modifiées pour posséder un gène qui peut être désactivé (ou "supprimé") à un moment précis de leur vie. Mais ce gène ne se désactive pas tout seul : il faut un signal pour déclencher cette suppression. Ce signal, c’est le tamoxifène. Quand on administre le tamoxifène à ces souris, il agit comme une clé qui active une enzyme spéciale déjà présente dans leur organisme (appelée Cre recombinase, une sorte de petit outil moléculaire). Cette enzyme est inactive tant que le tamoxifène n’est pas là. Une fois activée, cette enzyme va repérer des "balises" spéciales placées autour du gène ciblé et va alors le couper ou le désactiver, comme si on retirait une pièce d’un circuit électrique. Ce mécanisme permet aux chercheurs d’étudier l’effet de la disparition de ce gène, à un moment précis et dans un tissu particulier, sans affecter tout l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement d'un groupe de 3 gènes altère la formation du rein fœtal. Ces malformations peuvent aboutir à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours. Les éléments de réponse à cette question permettront d’approfondir notre connaissance dans ce domaine.
Procédures
Chaque animal sera nourri par une dose unique de tamoxifène. Temps de contention de l’animal : 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet d’expérimentation, nous envisageons une seule procédure qui consiste à administrer à des femelles gestantes du tamoxifène par voie orale, il ne s’agit pas de gavage mais par la méthode pipet feeding (alimentation par pipette) qui est moins invasive. Le tamoxifène ne cause aucun effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés selon la réglementation, car il n’est pas possible de les maintenir en vie après l’expérimentation en raisons de contraintes éthiques et sanitaires.
Remplacement
Une des étapes de ce projet nécessite une quantité très importante des cellules progénitrices du rein. Afin de remplacer l’animal nous avons mis au point, dans notre laboratoire, un protocole qui nous nous permet d’obtenir des cellules progénitrices du rein en quantité suffisante sans avoir recours à l’animal. Afin d’étudier d'autres aspects du fonctionnement de ces gènes, nous aurons besoin d'invalider les trois gènes à la fois, ce qui n'est possible que sur le rein des embryons mutants.
Réduction
Selon nos calculs basés sur des tests statistiques, nous nous basons sur 20 embryons mais si nous constatons des variations moins grandes que prévues, nous reverrons le nombre d’embryons à la baisse.
Raffinement
Des points limites seront appliqués : perte de poids >15 %, signes de suffocation, altération persistante de l’état général (prostration, perte de mobilité, difficulté d’alimentation/hydratation), ou douleur manifeste non contrôlée. Tout animal présentant un de ces critères sera immédiatement retiré de l’étude et mis à mort (décrit selon 3.3.3) Une surveillance régulière, adaptée aux périodes critiques, sera appliquée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris comme modèle de recherche, car elle partage de nombreuses ressemblances génétiques et biologiques avec l’être humain. De plus, son patrimoine génétique peut être facilement modifié et étudié en laboratoire. Cela nous permet de créer des souris porteuses de maladies rénales semblables à celles que l’on observe chez l’humain. Nous utiliserons des femelles adultes âgées d’environ 8 semaines, car c’est à cet âge qu’elles sont le plus fertiles.
Colonisation et impact des archées méthanogènes sur la physiologie de l’hôte MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
142 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Des souriceaux au microbiote défini reçoivent jusqu'à six administrations orales, jusqu'à cinq administrations rectales sous anesthésie et jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois précédées d'un traitement antibiotique. Cinq stratégies de colonisation par des archées méthanogènes sont mises en concurrence, la plus efficace étant ensuite reproduite deux fois pour en mesurer la variance, ce qui revient à mettre au point un modèle avant toute question biologique. Le porteur reconnaît utiliser des lignées cellulaires et des organoïdes pour explorer le même sujet, et conclut malgré tout qu'il n'existe "pas de méthodologie alternative".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle de colonisation des archées dans le tractus intestinal de souris au microbiote défini Oligo-MM12 (OMM12). Ce modèle va permettre l’étude de l’impact de la colonisation sur la physiologie intestinal et immunitaire de l’hôte. De plus, grâce à la grande stabilité intrinsèque du microbiote OMM-12, nous pourrons examiner quels sont les conséquences des archées sur la communauté microbienne tant en termes de stabilité, d’abondance ainsi que des modifications du métabolisme lié à l’hydrogène. Afin d’atteindre cet objectif, nous allons tester 5 stratégies de colonisation des souris avec les archées intestinales : 1.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 2.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux axéniques 3.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique 4.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique avec l’aide d’un traitement antibiotique 5.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 avec 5 gavages Enfin, après avoir sélectionné l’approche la plus efficace pour la colonisation des archées, nous la reproduirons deux fois indépendamment afin d’en évaluer la reproductibilité et la variance (Etude 6).
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront d’établir un modèle murin de colonisation avec des archées méthanogènes dans un microbiote définit. Ces études permettront de mieux comprendre les déterminant de la colonisation des archées intestinales chez la souris et par extension chez l’humain (dynamique temporelle, impact des bactéries, régime alimentaire). A ce jour, différentes publications montrent des corrélations entre la présence des archées et différentes pathologies chez l’humain mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les interactions archées-microbiote-hôte. Grâce à ce modèle nous pourrons étudier par la suite le rôle de ces micro-organismes, uniques en termes de structures et de métabolisme, dans le contexte de maladies inflammatoires de l’intestin et d’allergie.
Procédures
- Administrations orales : 1 à 6 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Administrations rectales : 1 à 5 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Injection par voie intrapéritonéale : 1 à 5 lors des administrations rectales, quelques secondes
Impact sur les animaux
Un premier essai de colonisation dans les souris OMM-12 adultes a montré que le gavage par des archées méthanogènes n’induit pas d’effet indésirable comme la perte de poids ou une augmentation du stress des animaux. L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer un inconfort léger de courte durée. Les administrations rectales seront réalisées sous anesthésie ce qui limitera le stress des animaux et ne devrait pas induire d’effet indésirable au-delà de l’anesthésie elle-même.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements terminaux, effectués en fin de procédures et sous anesthésie, ne permettant pas leur réveil. Ces prélèvements sont nécessaires pour évaluer la colonisation des bactéries étudiées et analyser l’impact sur la physiologie de l’hôte.
Remplacement
Nous utilisons des stratégies de remplacements in vitro en utilisant des lignées cellulaires et des organoïdes afin d’explorer le rôle des archées intestinales sur l’inflammation et la barrière intestinale. Cependant ces modèles de remplacement son limité et ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre le microbiote et l’hôte. Toutefois, l’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour tester notre hypothèse car il n’existe pas de méthodologie alternative permettant d’analyser les interactions hôtes-microbiotes dans le contexte intestinal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, nous n’entreprendrons certaines études du projet uniquement si elles sont pertinentes scientifiquement. Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’outil de modélisation statistique (Shade) et les conseils d’une statisticienne. Le nombre d’animaux est limité au stricte nécessaire et suffisant pour déterminer si la colonisation des archées est réussie. Des tests statistiques seront menés afin de valider l’impact sur le poids des souris, la stabilité de la colonisation, de quantifier les potentielles modifications du microbiote et de déterminer la variance du modèle. Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à pris en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, microbiote, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Les procédures expérimentales de ce projet sont légères ou modérées du fait de la répétition des injections. Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une évaluation régulière des animaux et à la mise en place de points limites pertinents. Le gavage et l’administration rectale seront pratiqués avec du matériel adapté : sondes de gavage souples adaptées à l’âge de souris et à usage unique. Cela permettra de réduire significativement les nuisances liées aux gestes techniques eux-mêmes. De plus, si la colonisation fonctionne avec une seule administration, les autres administrations ne seront pas pratiquées. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée D’après les données provenant d’expériences précédentes, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson ne provoque pas de nuisances chez les animaux.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin nous permet d'analyser l'interaction des trois composants : le microbiote, les archées et la réponse de l’hôte. Il n’est pas possible de mener cette étude en utilisant les poissons zèbres ou des invertébrés car ceux-ci ne possèdent pas de microbiote anaérobie similaire aux humains et ni les conditions physico-chimiques nécessaires à la vie des archées méthanogènes. Les souris auxquelles nous allons recourir seront des souriceaux à la naissance que nous suivrons entre la période postnatale et la période adulte (6-10 semaines) ainsi que des adultes.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique EU2/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un lymphœdème est provoqué chirurgicalement chez des souris femelles de cinq semaines, sous anesthésie générale, avec trois injections intradermiques d'un vecteur au cours de la même intervention. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, transportées entre deux établissements pour que les prélèvements terminaux se fassent ailleurs. Le porteur décrit le lymphœdème comme une pathologie douloureuse et handicapante survenant après une chirurgie du cancer, puis résume les effets sur les souris à des douleurs modérées et un léger stress. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour collecter les échantillons.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est également implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.La réalisation des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphoedème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphoedème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphoedème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endotheliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permette de repondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement
Raffinement
Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera réalisée chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 a 12 semaines.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Wistar.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Une injection sous-cutanée par jour, du jour précédant l'accouplement jusqu'à la mise bas ou la mise à mort. 924 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger, la seule nuisance retenue par le porteur étant une inflammation locale au point d'injection. Les mères sont anesthésiées puis disloquées, les embryons refroidis sur glace puis décapités entre les stades E14,5 et E20,5, pour prélever cœur, placenta, aorte, reins, poumons, foie et sang. L'hypothèse testée, un lien entre une modification des protéines et l'hypertrophie cardiaque des nouveau-nés de mères diabétiques, reste au conditionnel dans le texte, quand la mise à mort de 924 rats et de leurs portées est, elle, programmée.
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle protéique qui est augmentée lors de stress métabolique chronique, type diabète (hyperglycémie). Elle a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiaque. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication d’une modification des protéines dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse, en lien avec l’altération de la vascularisation placentaire. (2) Identifier les mécanismes impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par une augmentation de la modification des protéines.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
1 jour avant l’accouplement et jusqu’au euthanasie ou la mise bas les animaux recevront une fois par jour, une injection sous cutanée afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation. A la fin de cette période, les embryons sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, placenta, aorte, rein, poumons, foie, sang).
Impact sur les animaux
L’injection sous cutanée peut être à l’origine d’une inflammation localisée, qualifiée de nuisance légère.
Devenir
A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie des embryons, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les développements cardiaque et placentaire sont des processus complexes et intégrés faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque et placentaire par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 924 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques type ANOVA 1 voie seront réalisés après avoir fait une analyse d’égalité des variances.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements (y compris après l’accouplement) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Une semaine d’acclimatation sera alors réalisée. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement, pour les males et par deux pour les femelles dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Pour les mâles servant à la reproduction, ils seront hébergés par 2 à la réception jusqu’à la reproduction. Post accouplement, les rats seront hébergés individuellement. Lors du sacrifice des animaux (sacrifice des mères), une couverture anesthésique sera mise en place, puis l’animal sera disloqué. Les embryons de E14.5 à E20,5 seront anesthésiés sur glace puis euthanasiés par décapitation et prélevés. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recours et qui les maîtrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque et placentaire, différents stades de développement embryonnaires sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire de E5,5 à E20,5, permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et placentaire.
Maintien et génotypage invasif d’une lignée de souris génétiquement modifiée développant une atteinte musculaire progressive
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
La grande majorité de ces souris quitte le projet pour d'autres protocoles déjà autorisés, les autres, celles dont le génotype ne convient pas et les anciens reproducteurs, sont tuées. 4 428 souris porteuses d'une mutation provoquant une myopathie progressive vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit, jeune et éveillée, une biopsie de la queue pour identifier son génotype, geste répété au pavillon de l'oreille aux ciseaux fins quand l'analyse échoue. Le projet n'a d'autre objet que d'entretenir la lignée et de produire les lots d'animaux des projets de recherche, et le porteur ne justifie le chiffre de 4 428 que par le contrôle du nombre d'accouplements.
Objectifs
Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes d’une maladie génétique du muscle conduisant à une atteinte musculaire (myopathie) et nous développons également des approches thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de la mutation la plus fréquente chez l’homme qui récapitule en grande partie la pathologie humaine. Ces souris développent une faiblesse musculaire lentement progressive mesurable sur certains muscles par un perte de force. Il n y’a pas d’atteinte cardiaque ou respiratoire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du génotype d'intérêt pour nos études, indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie et pour pouvoir évaluer nos stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques d'une myopathie rare et invalidante (moins de 1 cas pour 100 000 naissances) et permettront le développement et la validation de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour d’autres maladies neuromusculaires.
Procédures
Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigile. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes. Exceptionnellement, s’il y a un problème de génotypage une nouvelle biopsie pour vérification sera réalisée, dans ce cas une petite biopsie tissulaire au niveau du pavillon de l’oreille sera réalisée en quelques secondes avec des ciseaux fins aiguisés
Impact sur les animaux
Les prélèvements pour le génotypage permettant l’identification génétique pourront induire une douleur légère et un léger stress de courte durée chez l'animal. Il peut également y avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Le phénotype des animaux induit une myopathie progressive qui peut entrainer une fatigue musculaire ainsi que des douleurs musculaires pouvant réduire la mobilité des animaux dans de rares cas.
Devenir
La grande majorité des animaux sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres projets préalablement autorisés utilisant des animaux à des fins scientifiques (utilisation continue). Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasié.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaire participant au développement de la pathologie musculaire. De la même manière, pour le développement de stratégies thérapeutiques seul une administration dans organisme entier permet de vérifier l’efficacité e la potentielle toxicité d’un traitement ainsi que sa bonne dispersion aux organes cibles (ici les muscles) en fonction de son mode d’administration. Un modèle animal est donc nécessaire pour une bonne compréhension de la physiopathologie et comme modèle préclinique pour tester des approches thérapeutiques.
Réduction
4428 animaux seront entretenus dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre d'accouplement afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés. Nous avons aussi optimisé notre stratégie de croisement afin d'obtenir des portées avec le bon génotype. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et d’arrêter les croisements si un nombre suffisant d’animaux est obtenu. Si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopreservation sera envisagée.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Des animaux sont indispensables pour étudier le muscle in vivo dans un système pathologique. Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire est la souris pour laquelle de nombreux outils analytiques sont disponibles. Le modèle utilisé est reconnu et validé par la communauté scientifique, permettant des comparaisons directes avec les données. Enfin, une nos stratégies thérapeutiques pour laquelle nous avons fait la preuve de concept est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Les souris utilisées pour les accouplements auront entre 2 et 8 mois d'âge afin conserver une bonne productivité des accouplements. Les accouplements seront échelonnés dans le temps afin d’obtenir des portées tout au long de l’année et si les lots produits sont suffisants pour assurer les expériences dans le cadre des projets actuels et futurs, les accouplements seront arrêtés et une cryopréservation sera envisagée. Les animaux pour l’élevage sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 8 mois de vie pour les reproducteurs. Les animaux seront utilisés dans le cadre de projets autorisés, entre 3 semaines et 8 mois. Cela permet d’étudier le développement de la maladie en physiopathologie et aussi de pouvoir intervenir avant l’apparition des symptômes (avant 3 semaines) ou bien sur un phénotype plus installé (après 3 mois) lors d’évaluation de l’efficacité des traitements à prévenir ou reverter la maladie.