Recherche fondamentale
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Immunogénicité de stocks de MOPEVACLAS à différents ratios « ARN/particule infectieuse » chez la souris S129 IFNAR
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vérifier que des lots d'un vaccin contre la fièvre de Lassa gardent leur pouvoir immunisant malgré des écarts de fabrication, telle est la finalité de ce projet. 48 souris immunodéficientes de lignée S129 IFNAR vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Marquées par des encoches pratiquées dans les oreilles, réparties en quatre groupes de douze, elles reçoivent une ou deux injections à un mois d'intervalle et un prélèvement de sang. La moitié est tuée au quinzième jour, l'autre au quarante-cinquième, pour prélever les organes servant à mesurer la réponse vaccinale.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de confirmer qu’un vaccin contre la fièvre de Lassa conserve ses propriétés immunogéniques indépendamment de certaines caractéristiques variables du vaccin qui peuvent être mesurées lors de sa production. Ces résultats sont essentiels pour le développement clinique de ce candidat vaccin.
Bénéfices attendus
L’efficacité d’un vaccin contre la fièvre de Lassa a déjà été démontrée chez le primate non humain. Des lots cliniques de ce vaccin sont actuellement en production. Ce projet nous permettra de vérifier que certaines caractéristiques mesurées sur les lots produits n’impactent pas l’immunogénicité du vaccin, permettant ainsi le développement du vaccin vers des essais cliniques.
Procédures
Après répartition en 4 groupes de 12 animaux (6 mâles + 6 femelles par groupe, 3 vaccins testés selon différens protocoles vaccinaux), les 48 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - Une ou deux injections de vaccins à un mois d’intervalle sur animaux vigiles - Un prélèvement de sang sur animaux vigiles. - Une mise à mort. Chacun des gestes effectués sur les animaux ne durera pas plus de 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
Ce type de vaccin a déjà été utilisé chez le rongeur et n’a pas causé d’effets secondaires chez les animaux. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever les organes qui seront utilisés pour déterminer les réponses à la vaccination.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro l’induction de réponses immunitaires humorales et cellulaires spécifiques que peut conférer une solution vaccinale. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité des candidats vaccins.
Réduction
Dans ce projet, 4 groupes de 12 animaux seront constitués. Chaque groupe de 12 souris est constitué de 6 animaux mâles et 6 animaux femelles. Dans chaque groupe, les animaux recevront une injection de milieu ou une injection de vaccin. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort à J15 pour des prélèvements qui permettront de déterminer les réponses à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection à J30 et sera mise à mort à J45 pour prélèvements qui permettront de déterminer les réponses après une seconde vaccination. La mise à mort de douze animaux par groupe constitue un minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser des tests statistiques robustes de comparaison de groupes. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des données, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.
Raffinement
Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de désinfectant. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique, l’ajout de gel hydrique peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. Des points limites sont établis et les mesures adaptées mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée est un modèle largement utilisé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Étude de l’impact d’un activateur de la kinase HRI dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une ischémie cérébrale est provoquée par occlusion d'une artère, suivie d'une thrombolyse vingt minutes plus tard, puis d'un traitement à une heure et à vingt-quatre heures. 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par exsanguination au quinzième jour pour prélever leurs tissus. Le projet teste un composé synthétique, le BTdCPU, sur un deuxième modèle d'accident vasculaire cérébral après des résultats obtenus sur un premier. Le porteur classe en sévères les douleurs postopératoires et les déficits fonctionnels ou cognitifs, et écrit par ailleurs que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et ne présentent aucun "syndrome du comportement malade".
Objectifs
L'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique, résultant de l'occlusion d'un vaisseau cérébral, prive les neurones d'oxygène et de nutriments, induisant un stress majeur du réticulum endoplasmique (RE). Face à ce stress, les cellules neuronales activent des mécanismes de survie, notamment en ajustant la façon dont elles fabriquent les protéines. Une molécule essentielle à la fabrication des protéines est modifiée, ce qui ralentit la production générale de protéines. Ce ralentissement permet à la cellule d'économiser son énergie. Cette modification est un mécanisme clé de régulation de la production de protéines en cas de stress. Elle ralentit la fabrication globale de protéines, permettant à la cellule d'économiser de l'énergie pour survivre dans des conditions difficiles. Plusieurs enzymes peuvent provoquer cette modification en réponse à différents types de stress. L'une de ces enzymes, qui est habituellement liée à un manque de fer, montre une implication croissante dans la physiopathologie neuronale et potentiellement dans la réponse au stress ischémique cérébral. Elle représenterait donc un moyen supplémentaire de réguler la fabrication des protéines. Dans ce contexte, le BTdCPU est un composé synthétique, principalement utilisé en recherche pour son action activatrice sur cette enzyme particulière, notamment dans des études précliniques métaboliques et cancérologiques. Des expériences préliminaires sur neurones montrent que de petites quantités de BTdCPU améliorent la survie des cellules après un manque d'oxygène. Chez des souris ayant eu un AVC, l'administration de BTdCPU a réduit la taille des lésions et amélioré leurs fonctions motrices. Ces résultats prometteurs ouvrent la voie à une étude plus approfondie du rôle de cette enzyme dans d'autres modèles d'AVC chez les souris. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact du BTdCPU, seul ou combiné à l'Altéplase, sur les lésions, l'inflammation et la récupération fonctionnelle dans un modèle murin d'AVC ischémique thromboembolique. Tester ce traitement sur un autre modèle animal d'AVC permettrait de confirmer son potentiel thérapeutique après un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en Plaques (SEP) et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de l’efficacité et du mécanisme d’action de notre candidat nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement à 1 heure et 24 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50 minutes). J0+6 heures : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique moléculaire (durée : 30 minutes). J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle (durée : 10 minutes/session). J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5 minutes/session). J+15 : Exsanguination par perfusion intracardiaque (n=80).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de la procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « syndrome du comportement malade ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de Sclérose en Plaques (SEP) et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.
Élevage d’un modèle de souris reproduisant un cancer colorectal conduisant à des altérations du système musculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris de cette lignée sont modifiées pour développer des polypes intestinaux, un cancer du côlon qui leur fait perdre force et masse musculaires et provoque une anémie. 420 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toute la portée, y compris les souriceaux dont le génotype ne sert à rien pour l'étude, subit à sept à dix jours un prélèvement de tissu pour analyse génétique. Les mâles reproducteurs sont tués à quatorze semaines, âge auquel le porteur affirme que l'atteinte musculaire reste sans incidence notable, et 210 animaux repartent vers l'élevage ou vers un prélèvement de tissus après leur mise à mort.
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain à des répercussions sur l’organise entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur réduit la force et la masse musculaire mais les mécanismes biologiques sont encore mal connus. Le projet vise à décrire la procédure d’élevage d’un modèle de souris qui développe des polypes intestinaux, correspondant à un cancer du côlon.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus seront l’identification génétique de la lignée à partir d’une biopsie de tissu pour optimiser la gestion de l’élevage. Ce projet permet aussi d’organiser au mieux la production de cohortes d’animaux pour nos projets scientifiques (utilisation continue vers des projets liés à l’étude des dysfonctions musculaires liées au cancer).
Procédures
Pour sélectionner les souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un morceau de tissu sera prélevé à l’âge de 7-10 j sur toutes les souris de la portée (souris d’intérêt pour ce projet, mais aussi les souris de génotype non pertinent ou ne présentant pas phénotype dommageable) pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Les souris atteintes d’un cancer du côlon seront utilisées jusqu’à l’âge de 14 semaines, stade au cours duquel les atteintes musculaires restent légères et sans incidence notable sur la capacité des animaux à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, on prélève un morceau de tissu pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci peut entrainer une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Le risque de saignement est très faible. La nuisance liée au phénotype dommageable est principalement induite par une anémie et une légère diminution de la masse et de la force musculaire à l’âge d’utilisation des animaux qui n’impacte par leur capacité à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter.
Devenir
Les mâles reproducteurs du modèle de cancer du côlon âgés de 14 semaines seront mis à mort. Les animaux WT (mâles et femelles) âgés de moins de 8 mois pourront être réutilisés par des expérimentateurs de l’équipe dans le système d’élevage en vue du maintien de lignées ou pour un prélèvement de tissus post-mortem. Dans le cas contraire ils seront mis à mort.
Remplacement
Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires ont déjà été réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l’analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en connaissant le schéma d’accouplement et le nombre de lots de souris nécessaires pour chaque projet d’expérimentation.
Raffinement
Pour vérifier la modification génique, la biopsie sera réalisée sur une zone peu innervée à l’âge de 7-10 jours pour limiter la douleur liée à la petite incision. Lors de la contention des nouveau-nés, le zootechnicien se frottera les mains dans la litière pour limiter le stress des animaux. La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. L’âge de la mise à mort des animaux a été fixé à 14 semaines pour les mâles reproducteurs, stade au cours duquel les atteintes musculaires restent légères et sans incidence notable sur la capacité des animaux à se mouvoir, s’hydrater et s’alimenter.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l’homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle strié squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes permettant ainsi de réaliser des études plus spécifiques.
Immunisation des souris par des vaccins à ARNm pour l’évaluation de la protection face à un challenge infectieux et le développement d’anticorps monoclonaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à six injections sur animal vigile et à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, dont des ponctions rétro-orbitaires, 111 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées, en fin de procédure, au moment d'atteindre les points limites, ou pour prélever les organes servant à l'étude des anticorps. Le projet vise à vérifier que certaines protéines protègent contre une bactérie résistante aux antibiotiques et à produire des anticorps utilisables en diagnostic ou en traitement. La nourriture leur est retirée pendant seize heures avant l'infection, qui peut provoquer diarrhée, perte de poids et septicémie sévère jusqu'à la mort, les souris atteignant les points limites étant mises à mort avant ce terme.
Objectifs
Ce projet a deux objectifs : 1) Vérifier si certaines protéines peuvent protéger des souris contre une infection. 2) Créer des anticorps pour voir s’ils peuvent servir à diagnostiquer ou à prévenir l’infection, surtout en cas de bactérie résistante aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Les anticorps et vaccins identifiés peuvent être utilisés comme outils de diagnostic ou comme traitements thérapeutiques potentiels contre l'infection causée par la bactérie d’intérêt.
Procédures
Les animaux subiront un maximum de 6 injections d'une durée inférieure à 1 minute (contention + piqûre), réalisées sur animaux vigiles. Un maximum de 4 prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les prélèvements sanguins (subjugal ou rétro-orbitaires), l'anesthésie sera de courte durée (anesthésie + prélèvement sanguin, temps inférieur à 5 minutes).
Impact sur les animaux
L’injection des antigènes pourrait entraîner des effets indésirables tels qu’une inflammation locale au site d’injection lors de l’immunisation. Les animaux seront injectés et cela peut provoquer une douleur légère, et stress (moins d'une minute) pour les animaux. L'anesthésie sera de courte durée, elle peut provoquer un certain stress (moins de 5 minutes) et de l’hypothermie. Le jour -1 avant l'infection, le retrait complet de la nourriture des cages est effectué 16 heures avant l'infection (mais l'eau est conservée). Cela peut causer un certain stress aux animaux. En raison des injections, il est possible que les animaux ressentent une douleur due à l'inflammation causée par les immunisations. En raison de l'infection par la bactérie, les animaux peuvent développer une maladie caractérisée par une perte de poids corporel, des dysfonctionnements intestinaux (diarrhée) et une translocation bactérienne vers la circulation sanguine, pouvant conduire à une septicémie sévère pouvant possiblement entraîner la mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort que ce soit à la fin de la procédure, ou ceux qui auront atteint les points limites lors des expériences de survie, ou ceux utilisés pour le prélèvement d'organes destinés à l’étude des anticorps.
Remplacement
Les protéines ciblées sont sélectionnées en amont par le biais d'outils bioinformatiques adaptés avant toute expérimentation chez l'animal. Cependant le recours à un modèle murin reste indispensable. L’utilisation de souris dans ce projet est essentielle car elles permettent de mieux comprendre comment le corps réagit à un vaccin avant de passer à des études chez l’humain. Les souris possèdent un système immunitaire suffisamment proche de celui de l’homme pour donner des indications fiables sur l’efficacité et la sécurité d’un vaccin. Elles sont également utilisées pour produire des anticorps, des molécules naturelles qui aident le corps à se défendre contre les infections, et qui peuvent ensuite être utilisées pour développer des traitements.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés grâce à des tests statistiques adaptés afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats. Pour cela, des méthodes statistiques rigoureuses ont été utilisées pour calculer le nombre minimal de souris nécessaire à l’obtention de données fiables. Cette approche permet de limiter l’utilisation d’animaux tout en maintenant la qualité scientifique et éthique de l’étude.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera vérifié tout au long de la procédure expérimentale, avec une fréquence définie pour chaque étape de la procédure. Tous les prélèvements sanguins sont réalisés avec l'application d’un anesthésique local. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale et avec un analgésique. Une grille de points limites stricts et spécifiques au projet a été déterminée afin de pallier toute souffrance.
Choix des espèces
Afin de développer des thérapeutiques contre les maladies infectieuses chez l'Homme, les souris permettent d' évaluer la réponse immunitaire et le développement des anticorps. Les souris sont utilisées pour les valider et éventuellement ces anticorps peuvent être transposés à l'homme à des fins thérapeutiques et diagnostiques. Les souris auront au moins 7 semaines (âge adulte) afin que leur système immunitaire soit complètement fonctionnel. Cela assure l'homogénéité des sujets nécessaire a la reproductibilité intra et inter expérimentale des résultats attendus.
Rôle des incrétines dans la phase céphalique de libération de l’insuline au cours de l’obésité associée au diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une chirurgie de trente minutes leur implante une canule à demeure dans le bulbe olfactif, puis viennent les tests de tolérance au glucose et à l'insuline de deux heures, avec sept mesures de glycémie par ponction de la queue, un gavage et des injections intrapéritonéales. Une partie des souris est rendue obèse et diabétique par un régime hypercalorique, avec hyperglycémie chronique et résistance à l'insuline. Après la chirurgie, elles vivent seules pendant environ trois mois pour protéger les canules, un isolement dont le porteur reconnaît lui-même qu'il constitue "un stress en soi".
Objectifs
La phase céphalique précéde et prépare l'organisme à la régulation métabolique nécessaire pendant le repas: elle est donc très importante à étudier dans le cadre des pathologies métaboliques. Ce projet a pour objectif d'étudier les effets d'une molécule exprimée dans le bulbe olfactif, le Glucagon Like-Protein 1 (GLP-1), sur la phase céphalique de libération d'insuline chez des souris obèses comparées à des souris normopondérées.
Bénéfices attendus
Les statistiques mondiales et françaises sur la progression de l'obésité et du diabète de type 2 sont très alarmantes. La pandémie touche 1 milliard d'humains obèses en 2025. Dans ce contexte, des nouvelles voies de thérapie sont à explorer. L'Ozempic(R) et le Wegovy(R) sont des médicaments analogues du GLP-1 communément utilisés dans ces pathologies métaboliques mais leurs actions cérébrales sont méconnues. Notre étude permettra de mieux comprendre les effets centraux de ces molécules pharmacologiques et de mieux décrire l'axe de régulation métabolique entre le système olfactif et le pancréas pendant la phase céphalique de libération d'insuline précédant la prise alimentaire chez la souris, une phase qui existe également chez l'humain.
Procédures
>Chirurgie. Les souris auront une chirurgie d'environ 30 minutes pour installer une canule dans leur bulbe olfactif, permettant d’y injecter les protéines nécessaires à l'étude. >Suivi métabolique. Pour suivre l'utilisation de glucose, un test de tolérance au glucose sera effectué : la glycémie sera mesurée à plusieurs temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) en déposant une goutte de sang sur un glucomètre, un appareil similaire à ceux pour humains. De faibles volumes de sang seront également prélevés aux temps 0, 15 et 90 minutes pour mesurer l’insuline, l’hormone de régulation du glucose. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline durent chacun deux heures. >Hébergement individuel. Pour procéder aux injections intracérébrales, une canule sera installée à demeure dans le bulbe olfactif des souris. Après chirurgie, pour éviter toute lésion qui adiendrait dans les interactions en hébergement collectif, il sera procédé à un hébérgement individuel des souris. Cet hébérgement durera environ 3 mois, un temps nécessaire pour effectuer l'ensemble des tests métaboliques.
Impact sur les animaux
>Les souris qui seront sous régime hypercalorique connaitront une augmentation significative de leur poids avec l'installation d'une obésité mais également une hyperglycémie chronique et une résistance à l'insuline qui reproduisent le diabète de type 2. >Les animaux qui subiront une injection intranasale peuvent avoir une gêne respiratoire par l'irritation passagère due au liquide placé dans les fosses nasales. >Les animaux qui subiront une chirugie stérotaxique sous anesthésie pourraient ressentir une douleur modérée à leur réveil. >Après la chirurgie, les animaux seront hébérgés individuellement afin d'éviter que les canules de perfusion ne soient endommagées dans leurs interactions sociales et ne les blessent. Cet hébérgement individuel est un stress en soi. >Concernant les tests de tolérance au glucose (OGTT) et à l'insuline (ITT), des nuisances légères pourraient survenir pendant le gavage (OGTT), l'injection intrapéritonéale (ITT) et les prélèvements de sang par ponction à la queue de l'animal (légère douleur, OGTT). Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible dans l'ITT.
Devenir
Toutes les souris de ce projet (512 au total) seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin d'effectuer un prélévement de leur cerveau.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de pouvoir injecter et faire pénétrer une molécule pharmacologique dans le cerveau par voie intranasale afin d'obtenir une voie d'accès non-invasive pour moduler positivement le métabolisme énergétique des souris obèses. Le projet nécessite donc un animal vivant et de procéder à des injections in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences et en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible. Nous prendrons soin d'utiliser les mêmes souris pour effectuer des injections croisées entre saline et molécule pharmacologique dans les procédures avec injection intracérébrale d'agents pharmacologiques. Ainsi les souris seront leur propre témoin, ce qui permettra de réduire le nombre de souris.
Raffinement
>Toutes les souris seront acclimatées à l'animalerie en cage collectif pendant au moins une semaine avant de procéder aux expériences. Elles seront hébergées dans des cages avec enrichissement sensoriel (nid, bois à ronger, tunnel). Les animaux seront regulièrement examinés (poids, apparence, comportement). Les souris seront habituées à la contention avant les procédures expérimentales. >Pour éviter tout problème respiratoire pendant l'injection intra-nasale chez la souris, il sera procédé à une injection par narine à la fois avec un temps de pause de 3 minutes entre chaque injection pour laisser le temps à la souris de récupérer de la première contention et également d'observer son comportement. >Pour les tests métaboliques, nous avons prévu les prélèvements de sang en calculant au plus près des volumes nécessaires aux mesures du glucose et de l'insuline, ce qui réduira l'impact sur le bien-être animal. > Les animaux seront hébérgés individuellemment après chirurgie dans des cages standards avec des milieux enrichis (nids végétaux, bois à grignoter) ce qui permettra d'éviter toute blessure qui pourrait intervenir en hébergement collectif. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance et éventuellement d'euthanasier les animaux dont les points-limites auraient été atteints. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants la chirurgie, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. >A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. >Enfin, pour procéder à la perfusion intracardiaque avec une respiration et des battements cardiaques à l'arrêt, une mise à mort sera réalisée par injection intrapéritonéale d'une dose d'anesthésiant à dose élevée, précédée 15 minutes avant d'une injection intrapéritonéale d'un sédatif.
Choix des espèces
Les souris sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre, et représente un modèle d'étude adéquat. De plus, nous avons l'expertise depuis plusieurs années du suivi du bien-être et du phénotypage métabolique des souris. Les expériences seront effectuées sur des souris agées de 8 semaines et au-delà, ce qui permet de travailler sur des animaux adultes, lorsque que toutes les structures cérébrales sont stabilisées dans leur développement.
Modulation des acteurs cellulaires dans le développement de la cardiomyopathie atriale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, donc porteuse d'un phénotype dommageable dès le départ. 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre comment les cellules immunitaires participent à la maladie de l'oreillette qui accompagne l'obésité. Certaines subissent l'ablation de la rate, puis quatre mois de régime gras, une prise de sang hebdomadaire sur animal vigile, deux tests métaboliques de deux heures avec huit prélèvements chacun, des échocardiographies et des électrocardiogrammes sous anesthésie, d'autres l'implantation sous-cutanée d'une pompe. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever les tissus, une mise à mort que le porteur présente comme "la seule solution éthique permettant d'obtenir des résultats fiables".
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie cardiaque la plus fréquente en pratique clinique. Elle est la principale cause d’accidents vasculaires cérébrales et de l’insuffisance cardiaque. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population. Les thérapies actuelles sont limitées, ce qui en fait un enjeu majeur de santé publique. De nombreux facteurs de risques y sont associés tels que le vieillissement, l’hypertension et les syndromes métaboliques comme l’obésité. Chez les patients obèses, son incidence augmente avec l’indice de masse corporel. A l’échelle du tissu, l’oreillette est dilatée et accumule du tissu gras. Ce remodelage tissulaire est une cardiomyopathie atriale qui évolue par une disparition du tissu gras et un remplacement par une matrice, la fibrose. Comme les autres tissus affectés par l’obésité, une réponse systémique active l’inflammation et le système immunitaire contribuant ainsi à l’activation de précurseurs qui sont à l'origine du tissu gras et de la fibrose. L’hypothèse est que les cellules immunes sont impliquées dans le développement de la maladie. Les objectifs sont 1-d’identifier la nature et la source des cellules immunes, et 2-de moduler leur rôle dans la maladie. Pour développer ces objectifs, des modèles murins soumis à une alimentation enrichie en régime gras sera utilisée pour induire l’obésité et le développement de la cardiomyopathie. L’étude du rôle des cellules immunes sera aussi effectuée dans des modèles de souris génétiquement modifiés.
Bénéfices attendus
Le projet porte sur la compréhension du remodelage atrial dans le contexte de l'obésité et sur la modulation de molécule cible. Cette étude permettra de développer une thérapie ciblée en vue d'une meilleure prise en charge des patients. En effet, le but de se projet est de pouvoir cibler des biomarqueurs précoce afin de ralentir le dévelopement de la maladie et de prévenir la fibrillation atriale.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie d’ablation de la rate (1 fois, 10-15 minutes par animal) effectuée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Les animaux seront ensuite placés sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Après 1 semaine de régime, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin chaque semaine sur animal vigile (1 fois par semaine, quelques secondes par animal). Après 2 mois (8 semaines) et 4 mois (16 semaines) de régime, 2 tests métaboliques seront réalisés afin d’évaluer les syndromes métaboliques (2 tests, 2 fois à 2 mois et 4 mois, espacés de 5 jours, durée 2h par test). Ces tests consistent à administrer une molécule (1 fois, quelques secondes sur animal vigile) et à prélever une goutte de sang 8 fois sur une période de 2 heures pour tester l'évolution de la glycémie (8 fois, quelques secondes sur animal vigile). Des échocardiographies cardiaques seront effectuées sous anesthésie générale (2 fois à 2 mois d’intervalle, 15 minutes par animal) suivi 5 jours après d’un électrocardiogramme effectuées sous anesthésie générale et analgésie (2 fois à 2 mois d’intervalle, moins de 5 minutes par animal). Une seconde partie des animaux seront préalablement placés sous régime riche enrichie en graisse pendant 2 mois. Après 4 semaines de régime, ils subiront une chirurgie d'insertion sous-cutanée d'une pompe osmotique à délivrance contrôlée de molécules (1 fois, 5 minutes par animal). La réalisation est effectuée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique pré et post-opératoire. Après 1 mois (4 semaines) de régime, 2 tests seront réalisés afin d’évaluer syndromes métaboliques (2 tests, 1 fois à 1 mois, espacés de 5 jours, durée 2h par test). Ces tests consistent à administrer une molécule (1 fois, quelques secondes sur animal vigile) et à prélever une goutte de sang 8 fois sur une période de 2 heures pour tester l'évolution de la glycémie (8 fois, quelques secondes sur animal vigile). Des échocardiographies cardiaques seront effectuées sous anesthésie générale (1 fois après 2 mois de régime, 15 minutes par animal) suivi 5 jours après d’un électrocardiogramme effectuées sous anesthésie générale et analgésie (1 fois après 2 mois de régime, 3 mintues par animal). A la fin de chaque période de maintien, les animaux subiront un dernier prélèvement sanguin sous anesthésie avant l’euthanasie par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins pourront induire une douleur aux animaux. Les régimes alimentaires spéciaux pourront entrainer une prise de poids ou une perte de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Les tests métaboliques sont une nuisance associée à la sensation de faim liée à la mise à jeun, le stress et la douleur de courte durée lors des administrations de molécule puis celles associés aux prélèvements sanguins de faible volume et un risque de saignement. Le régime gras peut engendrer des démangeaisons cutanées. Le gavage par canule apporte un stress à l'animal notamment par la contention au niveau de la nuque et peut également irrité la cavité buccale/œsophage de l’animal. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). Elle engendre aussi des difficultés de déplacements et une fragiltié à s'alimenter et peut engendrer une douleur post opératoire. Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Des animaux à phénotype dommageable (immunodéficience) seront utilisés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée, afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.
Remplacement
Des lignées de cellules de macrophages sont étudiées in vitro. Néanmoins le statut métabolique et le phénotype des macrophages sont un biais dans la véracité des résultats. D'autre part, l'étude porte essentiellement sur un dialogue inter-organe influencant le phénotype des cellules et l'environnement du tissu. Ainsi, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cardiomyopathie atriale (CMA) et est indispensable dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité du système immunitaire et son impact dans l'organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement cardiaque.
Réduction
1000 animaux seront utilisés. Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé statistiquement afin d'obtenir des résultats fiables. Le nombre d'animaux est aussi calculé suite à des études antérieures. Les paramètres échocardiographie et d'obésité seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les anesthésies utilisés sont adaptés selon la procédure. Lors de la procédure de chirurgie, les animaux sont placés sus un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle. Les analgésiques sont utilisés par injection. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 animaux maximum par cage) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les animaux sont mis en présense de jouet de raffinement (tunel, maisonnette). Leur cage est enrichi avec des objects réglementaires d'enrichissements, des batonnets. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement sur les critères de prise de poids et de l'état de la cicatrice post-chirurgie. Les points limites seront définis pour ce projet.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études car elles sont vulnérables à la fibrillation atriale (FA) et susceptibles de développer la cardiomyopathie atriale (CMA). C’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des gènes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Souris adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
MODIFICATION Effets des polluants environnementaux pendant les fenêtres d’exposition critiques sur le neurodéveloppement et la pathologie autistique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées avant leur naissance puis par le lait à trois fongicides de vignoble, le cyprodinil, le mépanipyrim et le pyriméthanil, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les petits sont suivis à l'ouverture des yeux, sur le réflexe de sursaut, l'acquisition de la marche et l'orientation olfactive, puis évalués à l'âge adulte sur la sociabilité, les stéréotypies et l'anxiété, avec des frottis vaginaux quotidiens et des prises de sang. Le projet cherche à établir que ces substances, aux doses autorisées dans l'eau potable, provoquent des comportements comparables à ceux observés chez les personnes autistes, ce que le porteur dit avoir déjà découvert, tout en écrivant que ces mêmes doses ne présentent pas d'effets indésirables notables. Sur la réduction, il se borne à mentionner des outils statistiques appropriés, sans rien dire de ce qui fixe l'effectif à 240 souris.
Objectifs
Les objectifs de cette recherche sont d’examiner comment certains polluants que l’on trouve couramment dans notre environnement affectent le développement du cerveau et le vieillissement. Nous étudions principalement trois fongicides, qui sont des produits chimiques utilisés pour protéger les cultures de la moisissure : le cyprodinil, le mépanipyrim et le pyrimethanil. Ces substances sont largement employées dans les vignobles et sur d’autres fruits après la récolte. Nous avons découvert que l'exposition à ces fongicides, même à des niveaux considérés comme sûrs dans l'eau potable, peut perturber le développement du cerveau des animaux et mener à des comportements similaires à ceux observés chez les personnes autistes. Nous nous interesserons également a la fonction de reproduction de nos animaux. Notre but est maintenant d’identifier les moments critiques pendant le développement où ces fongicides peuvent avoir le plus grand impact, afin de mieux comprendre comment ils provoquent ces effets néfastes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment l'exposition à des produits chimiques présents dans l'environnement peut affecter le développement des troubles neurologiques et contribuer à l’apparition de l’autisme. Les produits que nous étudions sont des fongicides, qui sont des substances utilisées pour lutter contre les moisissures sur les cultures. Les niveaux d'exposition que nous utilisons correspondent à ceux autorisés dans l'eau potable, ce qui est important pour la santé publique. À long terme, les résultats de notre recherche pourraient aider à modifier les règles sur l'utilisation de ces produits afin de mieux protéger la santé humaine.
Procédures
Les mères seront exposées à des fongicides à des doses réglementaires autorisées dans l'eau potable. La trajectoire de développement des souriceaux comprendra l'ouverture des yeux (durée du test : 1 minute), l'examen du conduit auditif (durée du test : 1 minute), le réflexe de sursaut (durée du test : 1 minute), l'acquisition de la marche (durée du test : 1 minute), l'orientation olfactive (durée du test : 5 minutes) et l'activité motrice (durée du test : 10 minutes). À l'âge adulte, les animaux seront évalués pour leur habileté sociale, leur capacité à générer des stéréotypies motrices et cognitives, ainsi que leur niveau d'anxiété. Chacun de ces tests durera entre 7 et 15 minutes et ne sera réalisé qu'une seule fois par animal. Les frottis vaginaux quotidiens (moins d’une minute) peuvent être inconfortables. De même, la prise de sang (environ 5 minutes) peut entraîner un stress temporaire.
Impact sur les animaux
L’exposition aux fongicides à des doses réglementaires autorisées ne présente pas d’effets indésirables notables. Dans les expériences précédentes, nous n'avons observé ni douleur, ni souffrance, ni perte de poids, ni stress liés au traitement. De plus, les animaux seront soumis à des tests comportementaux éthologiques non invasifs, ne générant pas de stress particulier, à l’exception du stress causé par la contention, la manipulation et la séparation des congénères pendant la durée des tests. La prise de sang, tout comme les frottis vaginaux, peut entraîner un certain inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus à des fins d'analyses ex-vivo.
Remplacement
Pour mieux comprendre les causes de l’autisme et développer de nouveaux traitements, il est essentiel de disposer de modèles animaux que les scientifiques peuvent étudier. En examinant de près le comportement de ces animaux, nous pouvons vérifier s'ils représentent bien les caractéristiques de l'autisme. Cela nous aide également à tester l’efficacité de nouveaux traitements. L’évaluation des effets d’un traitement doit se faire principalement à travers le comportement des animaux, car il n’existe pas de test biologique permettant de diagnostiquer l’autisme. En effet, le diagnostic repose uniquement sur l’observation des comportements. C’est pourquoi nous devons étudier les animaux dans leur ensemble pour capturer toute la variété de leurs comportements.
Réduction
Nous utilisons des outils statistiques appropriés pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des expériences.
Raffinement
Nous améliorerons nos expériences pour réduire au maximum l'inconfort ou le stress que les animaux pourraient ressentir pendant les tests. Les souris seront placées en petits groupes de 2 à 4, avec tout le nécessaire pour construire un nid (comme de la ouate et des cabanes en carton). Un même expérimentateur s'occupera d'elles tous les jours, afin qu'elles s'habituent à la manipulation. L'autisme touche aussi bien les hommes que les femmes, c'est pourquoi nous étudierons des animaux des deux sexes. Chaque souris sera testée à différents moments de sa vie, depuis sa période de développement jusqu'à l'âge adulte. Cela nous permettra de suivre leur évolution et de mieux comprendre les étapes clés du développement de la pathologie. Pendant les expériences, nous mettrons en place des points limites stricte (suivi de l’expression faciale et de la posture, poils hérissés, dos voûté, absence de toilettage, ptose palpébrale, perte de poids ou prise de poids de plus de 10 %) afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux qui nous permettent d'étudier facilement les problèmes de compétences sociales, un symptôme clé de l'autisme. De plus, leur comportement est très riche, ce qui nous aide à évaluer d'autres réponses qui peuvent également être touchées par l'autisme. Les problèmes de comportement observés chez les souris qui modélisent l’autisme sont suffisamment clairs et fiables pour tester si notre modèle est correct et, si c'est le cas, pour voir si certains traitements peuvent avoir des effets bénéfiques. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 à 12 semaines), moment où leur comportement est bien développé et où les problèmes de comportement se sont stabilisés.
Influence de la stimulation vagale sur la Restauration Cognitivo-motrice et la Modulation Inflammatoire Post-Traumatisme Crânien.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
95 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un poids est lâché sur leur crâne pour reproduire un traumatisme crânien, avec des fractures et des apnées attendues dont certaines peuvent se compliquer d'un arrêt cardiaque, puis une électrode est posée autour du nerf vague dans le cou et retirée après une séance de stimulation vraie ou simulée. Vingt souris servent uniquement à ce que les expérimentateurs s'entraînent aux deux gestes, et l'effectif intègre une mortalité anticipée de 20 %. Le porteur espère que la stimulation réduira l'étendue de la lésion et conclut que ces informations sont "impossibles à générer autrement qu'avec l'utilisation d'animaux".
Objectifs
Chaque année, les traumatismes crâniens touchent environ 55 millions de personnes dans le monde. Ils sont principalement causés par les accidents de la route et les chutes. Un grand nombre de ces patients conservent des séquelles durables, affectant leurs fonctions motrices, cognitives, comportementales ou psychologiques. Ces troubles entraînent une altération significative de leur qualité de vie. À ce jour, les solutions thérapeutiques disponibles – qu’elles soient médicales, chirurgicales ou issues de la rééducation – ne permettent pas de prévenir efficacement la mort neuronale, à l’origine de ces déficits. Il est donc essentiel d’explorer de nouvelles approches. L’une des pistes actuellement étudiées par notre laboratoire repose sur la stimulation du nerf vague. Ce nerf, situé au niveau du cou, est capable de transmettre des signaux au cerveau. Lorsqu’il est stimulé par des impulsions électriques délivrées par une électrode, ces signaux peuvent modifier l’activité de certaines régions cérébrales, notamment celles impliquées dans le contrôle du mouvement. Cette technique est déjà utilisée en pratique clinique pour traiter des pathologies telles que l’épilepsie, la dépression ou les migraines, tant chez l’animal que chez l’humain. Elle pourrait également représenter une solution prometteuse pour les traumatismes crâniens puisqu’elle permettrait d’amplifier la récupération motrice des rongeurs et de l’Homme après un accident vasculaire cérébral. Certaines études de traumatismes crâniens chez les rongeurs vont également dans ce sens à la fois pour les capacités motrices et cognitives lorsque la stimulation est réalisée plus tardivement. De surcroît, plusieurs études rapportent que cette stimulation diminuerait l’inflammation du cerveau, qui est l’une des causes de l’aggravation des lésions tant sur les modèles d’accident vasculaire cérébral que de traumatisme crânien. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de la stimulation du nerf vague dans les suites précoces d’un traumatisme crânien chez la souris. L’étude portera à la fois sur la réponse inflammatoire du cerveau après le traumatisme, et la récupération des fonctions motrices, cognitives et psychiques. En favorisant une récupération plus complète via la stimulation du nerf vague, cette approche innovante contribuerait à améliorer leur qualité de vie et à réduire les séquelles à long terme.
Bénéfices attendus
D’après nos hypothèses, nous prévoyons qu’une séance de stimulation dans les heures qui suivent le traumatisme crânien, devrait réduire l’étendue et la sévérité de la lésion en modulant la réponse des acteurs de l’inflammation ce qui contribuerait à restaurer un environnement favorable au bon fonctionnement des neurones. Nous espérons que cette intervention se traduira, à terme, par une amélioration des capacités motrices, cognitives et comportementales. Le parallèle entre les mécanismes impliqués dans le traumatisme crânien et ceux observés lors d’un accident vasculaire cérébral renforce la crédibilité de cette approche. En effet, les bénéfices observés dans les modèles expérimentaux d’accident vasculaire cérébral sont encourageants et confortent notre démarche. Ce projet ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients touchés par un traumatisme crânien, offrant un espoir d'une récupération optimale.
Procédures
Dans cette étude, les souris subiront deux interventions chirurgicales : la première consiste à reproduire un traumatisme crânien, et la seconde à placer une électrode autour d’un nerf situé dans le cou, appelé nerf vague. Cette électrode permet d’envoyer, ou non, de légères stimulations électriques selon les groupes. Elle sera retirée à la fin de la chirurgie, après la séance de vraie ou de fausse stimulation. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, et les animaux recevront des médicaments contre la douleur avant et après l’intervention. Un suivi attentif sera mis en place pour surveiller leur état de santé et repérer tout signe de souffrance. Certaines souris ne subiront pas de traumatisme crânien mais auront par les mêmes étapes de chirurgie à l’exception de la chute du poids. De même, certaines souris ne recevront pas de stimulation électrique malgré la pose de l’électrode mais suivront les mêmes étapes chirurgicales que celles stimulées. Au total, 95 souris seront impliquées dans le projet : – 10 seront utilisées pour s’entraîner à la procédure du traumatisme crânien – 10 pour s’entraîner à la pose de l’électrode – 25 auront uniquement une incision sans traumatisme crânien – 50 auront un traumatisme crânien – 25 recevront la stimulation du nerf vague après implantation – 50 auront l’implantation de l’électrode sans stimulation Pour mesurer les effets des interventions, des tests du comportement seront réalisés. Ces tests évaluent les mouvements, les réflexes et les capacités de mémoire des souris. Deux outils seront principalement utilisés : – un test neurologique permettant d’évaluer les séquelles motrices, cognitives et les réflexes sur 85 souris, réalisé entre 4 à 8 fois selon les groupes ; – un test de reconnaissance d’objets, permettant d’évaluer la mémoire spatiale sur 51 souris, réalisé deux fois avant le traumatisme, puis quatre fois après. À la fin du protocole, les animaux seront profondément anesthésiés en ayant préalablement reçus une dose d’anti-douleur, puis mis à mort pour permettre des prélèvements du cerveau destinés à l’analyse des tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Lors de la chirurgie du traumatisme crânien et dans les minutes suivant celui-ci, des fractures du crâne, des apnées inférieures à 5 secondes, dont certaines peuvent se compliquer d’un arrêt cardiaque, peuvent être attendus.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin d’étudier leur cerveau et de comparer entre elles les différences de taille de lésion, de réponse des acteurs de l’inflammation, et de la survie des neurones.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée chez l'être humain car cela nécessiterait une analyse post-mortem immédiate du cerveau. Les mécanismes pathologiques consécutifs au traumatisme crânien et les séquelles motrices et cognitives post-traumatiques sont trop complexes pour être étudiés in vitro (système cellulaire ou tranche de cerveau) ou in silico (modélisation par un programme informatique). Les informations qui seront recueillies dans cette étude sont donc impossibles à générer autrement qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Ce projet est conçu de manière à n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux, tout en garantissant la fiabilité des résultats. En effet, il est bien établi dans la littérature scientifique que les comportements et les réactions inflammatoires du cerveau peuvent varier fortement d’un individu à l’autre après une lésion cérébrale, en particulier dans le cas du traumatisme crânien. Cette variabilité naturelle impose d’inclure un nombre minimal d’animaux pour pouvoir détecter des différences significatives entre les groupes étudiés. Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé par des test statistiques adaptés en tenant compte de la fiabilité des tests comportementaux utilisés, de notre expérience acquise dans des études précédentes, et des recommandations présentes dans la littérature scientifique actuelle. Ainsi, l’effectif théorique de 8 souris dans chacun des 3 groupes pour la partie 1 et l’effectif de 17 souris par groupe (3 groupes) dans la seconde partie permettra de mettre en évidence des différences en prenant en compte une mortalité maximale de 20%. Ce modèle de traumatisme crânien a été choisi en raison d’un taux de mortalité réduit en comparaison aux autres modèles avec des lésions cérébrales identiques permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés et la souffrance en permettant une récupération fonctionnelle rapide. De plus, nous anticipons les éventuelles complications post-opératoires afin de garantir les meilleures conditions de récupération pour les animaux, permettant ainsi de réduire les pertes animales, de favoriser une récupération rapide, et donc de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, tout en veillant à leur bien-être.
Raffinement
Avant l’entrée dans l’étude, afin de diminuer le stress de l'animal, nous réaliserons du "Handling", c’est-à-dire une habituation au contact de la main de l’expérimentateur, ainsi qu’une habituation préalable aux tests comportementaux. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière. Les cages sont enrichies d’un tunnel afin de limiter l’ennui de l’animal et de favoriser son enrichissement cognitif. Pour éviter tout stress inutile, les cages seront placées dans une pièce calme et isolée du bruit extérieur. Le suivi des animaux sera effectué trois fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, tout au long du projet. Cette surveillance commencera avant l’opération et se poursuivra jusqu’à la fin de leur participation à l’étude. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et des médicaments contre la douleur seront également administrés avant et après l’opération afin que les animaux ne ressentent aucune douleur pendant et après l’intervention. L’état de chaque animal sera contrôlé régulièrement, toutes les six heures après la chirurgie, grâce à une échelle spécifique appelée Mouse Grimace Scale, qui permet de détecter la douleur chez la souris de façon fiable. Seules des personnes spécialement formées et expérimentées seront autorisées à pratiquer les opérations et à surveiller le bien-être des animaux. Le bien-être des animaux est au cœur de nos préoccupations, et toute douleur ou signe de souffrance fera l’objet d’une prise en charge immédiate. Depuis leur arrivée jusqu’à la fin de leur prise en charge, tout sera mis en œuvre pour respecter les principes éthiques et garantir aux animaux des conditions de vie adaptées et aussi confortables que possible.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est un mammifère non primate proche génétiquement de l’Homme : son degré́ d’homologie avec l’Homme est donc très élevé́. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser des lésions cérébrales acquises et le niveau de compréhension du fonctionnement de leur organisme et de leur cerveau est très avancé. L’anatomie du système nerveux et son fonctionnement proche de celui de l’Homme en font un très bon modèle pour le traumatisme crânien. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des résultats aussi pertinents. Les animaux seront âgés de 16 à 24 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité́ cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des souris adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité́ des données déjà̀ disponibles dans la littérature scientifique sur les modèles de traumatisme crânien. Cet âge nous semble cohérent souhaitant être au plus proche des traumatismes crâniens par accident de la route chez l’Homme survenant majoritairement chez l’adulte de plus de 15 ans.
Effet de l’âge et du poids sur les potentialités des cellules souches musculaires de truites arc en ciel
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Améliorer les pratiques d'élevage piscicole et mieux maîtriser la croissance musculaire de la truite : c'est d'abord à cela que sert ce projet, où 125 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La procédure tient en une privation alimentaire d'un an, les poissons n'étant nourris que le lundi et le jeudi, ce qui les laisse jusqu'à cinq jours par semaine dans une sensation de faim que le porteur qualifie de modérée. Sur les 125 truites affamées, dix seulement serviront à produire les résultats, les autres étant là pour maintenir une densité correcte dans les bacs. La piste médicale évoquée, un traitement de l'atrophie musculaire, arrive après les objectifs zootechniques.
Objectifs
La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, la croissance musculaire est continue tout au long de la vie de l’animal mais la formation de nouvelles fibres (hyperplasie) diminue avec l’âge et(ou) le poids, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons précédemment montré que la fonctionnalité de la niche (environnement des cellules souches musculaires) diminuait rapidement pour atteindre un minimum dès 500g. Lors d'une expérience préliminaire nous avons montré que cette diminution était liée au poids et pas à l'âge. Notre objectif est maintenant de déterminer quelles sont les gènes différentiellement exprimés avec le poids qui peuvent expliquer cette diminution.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'identifier les gènes différentiellement exprimés en fonction du poids et pas de l'âge des animaux. Cette question qui existe également chez les mammifères, ne peut être résolue que grâce à l’utilisation de poissons avec une croissance continue et une très forte plasticité de croissance comme la truite. Cette connaissance devrait permettre d’améliorer les pratiques zootechniques afin de maîtriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite. Au-delà de ces aspects agronomiques, une meilleure compréhension des impacts de l’âge et du poids sur les capacités des cellules souches à se différencier, pourrait fournir de nouvelles pistes dans le traitement de certaines pathologies d’atrophie musculaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire afin de ralentir leur croissance pendant 1 an, puis ils seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être nourris uniquement 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui engendre une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine. Néanmoins ces animaux, de par leur métabolisme, peuvent aisément gérer des périodes sans nourriture.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables du projet et des prélèvements de tissus musculaires seront réalisés pour analyser l'expression de l'ensemble des gènes.
Remplacement
Les objectifs du projet étant de déterminer l’impact de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques du muscle, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour soumettre le minimum d’animaux à la restriction alimentaire modérée, nous allons utiliser des bacs de petite taille afin de maintenir une densité optimale avec 125 poissons/bac au maximum. Parmi ces animaux, 10 seront utilisés pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité) et leur manipulation sera réduite au maximum avec un suivi du bien-être à l'aide d'une grille. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Un enrichissement particulier sera mis en place avec des plantes et tubes en plastique pour limiter l'agressivité potentielle.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une des rares espèces qui permet de tester séparément l’effet de l’âge et du poids compte tenu de sa croissance continue et de sa très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques de la niche étaient bien différentes à 10g (~6 et 12 mois) et 1kg (12 mois).
Vaccin pour Induire une Immunité Mucosale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une injection unique de vaccin, puis une prise de sang par semaine pendant cinq semaines, puis, entre cinq et douze semaines plus tard, une infection par un virus ou une bactérie : 2 160 souris suivent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une perte de poids et une variation de la température corporelle, et l'animal dont la grille de score atteint sa valeur maximale est tué. Le projet vise des vaccins qui déclenchent une immunité au niveau des muqueuses, que les vaccins actuels induisent peu, et le porteur affirme que ce modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées le jour de l'expérience, pour prélever les poumons et les autres organes où sont analysées les cellules immunitaires.
Objectifs
La vaccination est parfois la seule option clinique pour lutter contre les maladies infectieuses face à une évolution rapide et croissante de la résistance aux médicaments (antibiotiques, antiparasitaires par exemple) ou le faible nombre de médicaments anti-viraux sur le marché. Ainsi, les vaccins ont permis d'éliminer des infections telles que la variole ou la poliomyélite, et atténuer les effets d'autres infections comme la grippe ou le COVID-19. Il est clair que l’objectif de la vaccination est de permettre à un individu de développer une protection active spécifique vis-à-vis d’un microbe, en utilisant les ressources naturelles de l’immunité afin de générer une immunité dite « mémoire ». Toutefois, les vaccins induisent très peu l’immunité dite « mucosale », qui protège les muqueuses des organes tel que les poumons. Ceci peut donc expliquer la recrudescence de certaines pathologies respiratoires comme la coqueluche contre laquelle 86% de la population mondiale est vaccinée (40 millions de cas et 300000 décès d’enfants par an dans le monde). Ainsi, l'amélioration des vaccins et l'optimisation des stratégies de vaccination sont donc aujourd’hui plus que nécessaires, afin de mettre en place une immunité « mucosale » vis-à-vis de n’importe quel microbe pour prévenir une infection quelles qu’en soient la porte d’entrée ou les manifestations cliniques. Ce projet de recherche ambitionne d’aider au développement de stratégies vaccinales innovantes en améliorant les vaccins existant afin de mettre en place une immunité mucosale protectrice à long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’une protection à long terme de cellules immunitaires générées par la vaccination. En effet, la majorité des vaccins disponibles sur le marché ne permettent pas de mettre en place une immunité mucosale favorisant la recrudescence de plusieurs infections.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie -d'une durée de 20 minutes comptant la phase d'endormissement, du geste technique et de reveil-, pesées - d'une durée de 30 secondes-, administration de vaccin - d'une durée de 30 secondes- , injections de virus ou bactérie - d'une durée de 30 secondes- et prise de sang - d'une durée de 30 secondes-). Les animaux recevront une seule injection de vaccin pour mettre en place une immunité protectrice. Nous verifierons si le vaccin a un effet protecteur en analysant les cellules du système immunitaire présentes dans le sang des souris, 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Puis, 5 à 12 semaines plus tard, les animaux seront infectés une seule fois par un virus ou une bactérie afin de vérifier l’effet protecteur des cellules immunitaires mises en place par le vaccin sur le court et long terme. A l’issue de l’exprimentation, les animaux seront mis à mort pour une analyse précise des cellules immunitaires au sein des tissus tel que les poumons.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tels que : l’anesthésie, pesées, administration de vaccin, injections de pathogène, transfert adoptif et prise de sang. De plus, l’infection peut provoquer une perte de poids et une variation de la température corporelle.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle de souris est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expériences. Dans la mesure du possible, les expériences sont regroupées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.
Raffinement
Les souris seront hébergées, en zone d’expérimentation A2L2 (dans un laboratoire de biosécurité car nous utilisons des organismes pathogènes pour lesquels il y a un traitement curatif et/ou préventif), par groupe de 5 au maximum par cage et de même sexe afin d’éviter le stress de l’isolement. L’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de plusieurs éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid, durant leur hébergement. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des procédures . Les souris seront observées quotidiennement et une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale . Si un des points limite est atteint (valeur maximale de la grille de score) cela entrainera la mise à mort de l’animal . Pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation des animaux affaiblis par l’infection, de la nourriture hydratée et du lait en poudre appétant seront aussi fournis directement dans la cage. Suivant les cas, des mesures complémentaires seront prises en concertation avec le SBEA (structure du bien-être animal) et le vétérinaire référent. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’anti-inflammatoire entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésiques qui pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Toutefois, l'utilisation d'anesthesie pourra être utilisée pour certaines procédures comme les injections intra-nasales.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont similaires à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 6 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant en début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.
Développement de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement du diabète de type 2. Effets physiologiques de deux biomimétiques, HB2 et K1K1, sur des modèles diabétiques de rongeurs (souris).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour la plupart afin de prélever pancréas, foie, muscles et tissu adipeux, 885 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une centaine devant être réutilisées ailleurs ou cédées à d'autres équipes. Elles sont obèses et diabétiques, par lignée, par régime gras ou par destruction chimique de leurs cellules pancréatiques, et reçoivent jusqu'à une injection intrapéritonéale par jour pendant trois semaines. La mesure de la glycémie exige une petite incision de la veine caudale tous les deux jours, plusieurs fois par heure les jours de test de tolérance, et le porteur décrit une polydipsie qui peut multiplier par dix la prise de boisson. Il conclut qu'il n'existe "aucun modèle non animal utilisable" pour ces études, les inconnues étant selon lui trop nombreuses pour bâtir un modèle informatique fiable.
Objectifs
Le diabète et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandus, touchant des millions de personnes dans le monde, et souffrent encore d’un manque de traitements pharmacologiques efficaces. Un diabète non maîtrisé, peut, au fil du temps, provoquer de graves lésions cardiaques, vasculaires, oculaires, rénales et nerveuses. Les cellules béta-pancréatiques sont au cœur du problème, car elles ne fournissent pas suffisamment d’insuline aux organes pour éviter la maladie, en raison de leur défaillance, mais aussi de leur destruction. Malgré les efforts de recherches, peu d’options thérapeutiques sur le traitement des cellules Bêta sont disponibles. Récemment, 2 composés peptidiques biomimétiques (1 et 2) développés par notre laboratoire, et visant à protéger les cellules bêta et à maintenir leur fonctionnement, ont démontré leur efficacité et leur non-toxicité à travers plusieurs approches in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 2 composés peptidiques chez 4 modèles d’animaux diabétiques différents. Procédure 1 : test du composé 1 chez un modèle de souris obèse et diabétique de type 2. Procédure 2 : test du composé 2 chez deux modèles de souris diabétiques (type 1 pour l’un et type 2 pour l’autre), procédure 3 : test des 2 composés chez un modèle de souris rendues obèses et diabétiques suite à une alimentation riche en graisse, procédure 4 : test du composé 2 dans un modèle de souris rendue diabétique de type 1 suite à la destruction des cellules bêta pancréatiques. Aussi, pour améliorer l’adhésion au traitement, nous prévoyons de formuler ces nouvelles molécules pour pouvoir les administrer par voie orale. Pour ce faire, nous utiliserons les propriétés d’un polysaccharide issu d’une algue brune, l’alginate, que nous réduirons sous la forme de nanoparticule, une taille permettant de mieux encapsuler les molécules. Notre maitrise dans ce domaine, confirme que les nanoparticules d’alginate sont un adjuvant efficace pour encapsuler les substances et les délivrer à leur organes cibles. L’objectif de cette demande est de déterminer l’effet de ces deux composés associés ou pas avec l’alginate sur l’amélioration de l’état diabétique de modèles murins diabétiques et obèses. Cette étude sera réalisée sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique, ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires actuelles du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, peu d’options thérapeutiques restent disponibles pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. L’exploitation de molécules protégeant les cellules bêta pancréatiques et potentialisant leur fonctionnement est prometteuse dans le développement d’un traitement anti-diabétique. Grâce aux nanotechnologies, et dans une vision de gestion durable et biologique, dont les avancées permettent d’améliorer et d’optimiser la délivrance des médicaments (peptide/nanoparticule), nous utiliserons l’alginate, un polysaccharide naturel provenant d’une algue brune comme nanoparticule. L’alginate est déjà utilisé dans le milieu industriel comme adjuvant et comme excipient de médicaments.
Procédures
Le type d'intervention se limite à des injections intra-péritonéales, et des prélèvements sanguins au niveau de la queue pour mesurer la glycémie. La mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre nécessite une petite incision au niveau de la veine caudale pour prélever une quantité de sang d’environ de 2 à 2,5 μL. Ce type de prélèvement dure 3-4 secondes. Les injections s'effectueront sur une durée de 3 semaines, selon une fréquence pouvant aller au maximum jusqu'à 1 fois/jour. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. La mesure de la glycémie se fera à une fréquence une fois tous les 2 jours sauf lors des tests de tolérance au glucose ou les tests de tolérance à l'insuline, où dans ce cas s'effectueront à plusieurs reprises dans un temps limité de 2h ou 1h30 respectivement. Il est également prévu de mesurer l'insuline et les triglycérides en prélevant 20 μl et 50μl de sang, respectivement de la queue, une fois par semaine et lors des tests de tolérance.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles engendrent peuvent être une source de dérèglements internes, tels que une hyperphagie, polydipsie, un problème de thermorégulation, une hyperlipémie et une augmentation des productions hormonales de la glande hypophyse et des glandes surrénales. Ces désordres métaboliques entrainent une polyurie et une activité physique amoindrie. Ainsi les risques de déshydratation sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Enfin, pour les souris dont le diabète de type 1 est induit (procédure 4), un état d’inconfort et de douleur peut être identifié suite au développement de la maladie et de l’hyperglycémie. Il peut s’ensuivre un arrêt de la croissance pondérale, voire une perte de poids, une hypoinsulinémie, une polydipsie (la prise de boisson pouvant être multipliée par 10), une polyurie et une hyperphagie.
Devenir
Tous les animaux diabétiques et certains de leur contrôles seront utilisés dans les procédures et seront pour la majorité mis à mort pour le prélevement d'organes (pancréas, foie, muscles; tissu adipeux). Les animaux non euthanasiés pourront éventuellement être réutilisés dans d'autres procédures. Par exemple, pour les groupes contrôles, ils pourront être communs à plusieurs études non refaites, voire si possibilité, être donnés à d'autres groupes.
Remplacement
Ce projet propose des substances novatrices pour lesquelles les informations ne sont pas encore disponibles dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales, telles que les lignées cellulaires ou organoïdes, soient un atout précieux pour la recherche, ces dernières ne peuvent reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez la souris, qui est étroitement liée à celle de l'homme. En raison de la grande complexité des troubles physiopathologiques du diabète et de l’obésité et de leur intégration complexe dans l’organisme, les inconnues sont trop nombreuses pour créer des modèles informatiques fiables. Par conséquent, il n'existe aucun modèle non animal utilisable pour ces études.
Réduction
Des expériences in vitro préalables ont été effectuées dans le but de déterminer les conditions optimales de délivrance des molécules, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 5 animaux par groupe expérimental sont nécessaires. Une réduction de ce nombre pourrait être problématique car quelques animaux peuvent être perdus au cours des expériences (pour cause de mort naturelle). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux (soit un triplicat d’expériences avec 5 souris/groupe) par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie. Le nombre de souris sera également limité puisque l’établissement d’un profil métabolique et l’isolement post-mortem des organes cibles s’effectuera sur un même individu. Enfin, dès que possible, le groupe contrôle sera commun à plusieurs études non refaites.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en œuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social. Les animaux seront hébergés par groupe de 5, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels et de matériaux de nidification. Un suivi quotidien sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les animaux étant diabétiques, leurs cages seront changées tous les jours afin d'éviter les désagréments causés par le syndrome polyuro-poydipsique. Les nids préalablement construits par les animaux seront éventuellement remis dans leur nouvelle cage pour plus de confort et de sentiment de sécurité. Les points limites sont les suivants : troubles du comportement ; signes d’absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale) ; perte de poids de 15 % à 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques, endocriniens et inflammatoires de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de la conception d’un dispositif de délivrance de molécules à visée thérapeutique. Les animaux atteints du diabète de type 2 ou diabète de type 1 utilisés dans le projet (souris db/db, souris sauvages soumises à un régime HFD, souris NOD souris sauvages traitées par la Streptozotocine) sont les modèles standards couramment employés pour étudier l’efficacité thérapeutique de la méthode (baisse de la glycémie recherchée). Il est important de travailler avec des animaux dont le stade de développement est terminé, sans pour autant travailler avec des animaux trop âgés pour ne pas biaiser les résultats. Ainsi, les protocoles démarreront avec des souris âgées d’au moins 5-6 semaines pour les souris db/db et les souris C57Bl6N. Pour le modèle des NOD, il sera préférable de travailler avec des souris agées de 12 semaines minimum.
Réaction de sevrage, métabolites microbiens et régulation du système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.
Procédures
- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées
Impact sur les animaux
L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.