Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Obtention d’une lignée simple transgénique à deux génotypes non dissociables
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un prélèvement de poils sous anesthésie sur chaque souris des deux premières générations : c'est la seule procédure décrite pour un élevage de 1 200 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet du projet est de fabriquer une lignée transgénique portant deux modifications indissociables, destinée à d'autres travaux sur les enzymes qui font communiquer cellules cérébrales et vaisseaux sanguins. Le porteur écrit qu'aucune souris ne sera élevée en excès ou sans raison, tout en prévoyant la mise à mort de celles dont le génotype ne présente pas d'intérêt. Celles qui portent le génotype recherché restent en vie, pour la reproduction ou pour être versées à des expériences ultérieures.
Objectifs
L’objectif est d’obtenir une lignée de souris modifiées, avec deux caractéristiques non différenciables, destinée à être utilisée dans des projets de recherche scientifique. Ces souris sont des outils précieux en recherche médicale, particulièrement utiles pour comprendre comment certains gènes agissent dans différentes parties du corps et à différents moments. Elles nous aideront à mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de certaines enzymes impliquées dans la communication entre les cellules du cerveau et les vaisseaux sanguins, que ce soit en situation normale ou en cas de maladie. L’objectif final est de proposer des traitements mieux adaptés. Le bien-être des animaux sera suivi attentivement pour vérifier si ces modifications entraînent ou non des effets indésirables. Toutefois, d’après la manière dont ces souris ont été conçues, aucun effet négatif n’est attendu.
Bénéfices attendus
Etablir une lignée de souris modifiées possédant deux caractéristiques particulières qui ne peuvent pas être différenciées. Élever cette lignée a pour but de disposer d’un modèle fiable et spécifique pour étudier le rôle d’un gène ou d’un type de cellule dans un tissu ou un organe précis. Cela aidera à mieux comprendre certains mécanismes biologiques ou liés à des maladies, en lien avec les projets de recherche. Dans un premier temps, les chercheurs vérifieront que la modification apportée fonctionne comme prévu. Ensuite, les souris seront utilisées dans des expériences ciblées pour répondre aux questions posées par ces projets. Ce type de modèle permet d’obtenir des résultats plus précis, de limiter les erreurs et, à long terme, de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. Il pourra aussi être utilisé dans d’autres projets ou collaborations, ce qui renforce son intérêt scientifique.
Procédures
Prélèvement de poils sous anesthésie. Tous les animaux de première et deuxième génération seront concernés jusqu'à ce que la lignée soit établie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations (ex: génotypage), et restent légères. Aucun effet indésirable majeur n’est prévu du fait de la modification génétique, mais un suivi clinique sera mis en place pour détecter tout phénotype inattendu. Des mesures seront prises si des signes de souffrance ou de gêne apparaissent, en accord avec les critères d’arrêt définis.
Devenir
Les souris de génotypes qui ne sont pas d'intérêt seront mise à mort ou utilisé pour de la mise au point dans le cadre des projets de recherches. Les autres souris serviront à la reproduction ou à l'expériementation.
Remplacement
À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris modifiées pour atteindre les objectifs des projets de recherche. Les expériences réalisées en laboratoire sur des cellules ou par ordinateur ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. L’utilisation de ces souris reste donc nécessaire pour comprendre certains mécanismes biologiques, notamment les effets de certaines modifications dans un corps vivant. Dans ce cadre, ce modèle reste indispensable.
Réduction
Le nombre de souris élevées est strictement limité aux besoins réels des projets de recherche et au maintien de la lignée. Aucun animal ne sera produit en excès ou sans raison. La reproduction est planifiée de façon centralisée et régulièrement ajustée en fonction des demandes des chercheurs et du responsable de l’élevage. Des outils de suivi permettent d’éviter les excédents. Quand c’est possible, les animaux sont partagés entre différents projets ayant des besoins similaires, pour éviter de faire plusieurs élevages séparés. Si certains animaux produits ne sont pas utilisés, la nécessité de poursuivre les prochaines portées est systématiquement réévaluée.
Raffinement
L’environnement des souris sera adapté aux besoins spécifiques de cette nouvelle lignée. Pour l’identification génétique, un simple prélèvement de poil sera préféré à une méthode plus invasive. Le bien-être des animaux sera contrôlé deux fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, par du personnel qualifié. Si un effet indésirable devait apparaître chez certains descendants, une surveillance renforcée sera mise en place pour les premières générations. L’état de santé des souris sera évalué chaque jour selon une méthode standard, incluant l’observation de leur comportement, de leur poids, de leur aspect général et d’autres signes spécifiques liés au modèle utilisé. En cas de problème ou de souffrance, une intervention rapide sera déclenchée, selon des critères établis avec le vétérinaire. Lors des prélèvements et de l’identification, les animaux seront endormis avec un gaz anesthésiant pour éviter toute douleur. Le personnel est formé pour manipuler les souris avec douceur et effectuer les gestes rapidement. Après chaque prélèvement, une surveillance sera assurée pour vérifier qu’il n’y a pas de complications.
Choix des espèces
La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Son utilisation est essentielle pour étudier finement le rôle de certaines enzymes dans les interactions entre les cellules du cerveau et les vaisseaux sanguins. Elle permet de contrôler précisément leur activité, d’observer leurs effets dans un organisme vivant, et de tester des traitements potentiels. Cette approche, qui combine plusieurs domaines de recherche, est indispensable pour avancer vers des thérapies mieux adaptées aux maladies du cerveau. Les animaux seront génotypés à 4 semaines de vie.
Développement de l’immuno-IRM pour la détection précoce chez la souris des lésions cardiaques induites par les anthracyclines
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une insuffisance cardiaque grave, parfois mortelle dès le cinquième jour : voilà ce que provoque le traitement anticancéreux injecté à 420 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère et toutes tuées pour prélever leur cœur. Les injections sont répétées trois fois par semaine pendant trois semaines, suivies d'une pesée quotidienne, de la pose d'un cathéter sous anesthésie profonde et d'une séance d'IRM d'une heure avec produit de contraste. Le but est de vérifier qu'une technique d'imagerie repère les premiers signes d'inflammation du cœur chez les patients sous chimiothérapie, 9 % d'entre eux développant ce type d'atteinte. Le porteur retient la souris parce que son anatomie cardiovasculaire ressemble dans ses grands traits à celle de l'être humain et parce que les modèles de cardiotoxicité y sont déjà bien établis.
Objectifs
Environ 9 % des patients traités avec certains médicaments anticancéreux, appelés anthracyclines, développent des problèmes cardiaques, notamment une fragilisation du muscle du cœur. L’atteinte cardiaque liée aux anthracyclines est souvent irréversible d'où l’importance d’un diagnostic précoce, idéalement avant l’apparition des premiers signes. Ce projet de recherche vise à améliorer la détection précoce de ces atteintes cardiaques grâce à une technique d’imagerie appelée immuno-IRM. Cette méthode permettrait de repérer les toutes premières réactions inflammatoires dans le cœur, en utilisant des produits de contraste injectables ciblant des molécules spécifiques liées à l’inflammation. Cela pourrait aider à mieux surveiller les patients sous chimiothérapie, à adapter leur traitement en fonction du risque, et à tester de nouvelles approches pour protéger leur cœur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples, tant sur le plan scientifique que médical. En premier lieu, le développement d’un modèle expérimental fiable de toxicité cardiaque induite par les anthracyclines permettra une meilleure compréhension des mécanismes précoces de l’atteinte cardiaque, en particulier des processus inflammatoires qui précèdent les altérations fonctionnelles. En intégrant l’immuno-IRM à ce modèle, le projet vise à démontrer la capacité de cette technique d’imagerie à détecter de manière non invasive et ciblée des marqueurs précoces d’inflammation cardiaque et à identifier de nouvelles cibles biologiques. Par ailleurs, il apportera les premières preuves de concept en faveur d’une translation clinique de cette approche, grâce à l’utilisation de produits de contraste injectables compatibles avec une utilisation chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Mise en place d'un modèle de cardiotoxicité induit par injection d'un traitement anti-cancéreux (nombre : 1 seule fois ou 3 fois par semaine pendant 3 semaine suivant la procédure ; durée : inférieure à 5min) o Pesée quotidienne (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Une seule imagerie IRM avec injection de produit de contraste (durée : environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Le modèle de cardiotoxicité peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le traitement anti-cancéreux utilisé est connu pour induire des dommages cardiaques pouvant mener à une insuffisance cardiaque grave et dans certains cas au décès. Des effets comme des sensations de nausées ou des lésions de la muqueuse gastro-intestinale peuvent se produire. D’autres complications peuvent également apparaître comme un stress (repéré des mouvements anormaux dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson voire une perte de poids…), de la fatigue (repérée par une réduction de l’activité spontanée voire une léthargie, une altération du toilettage…) et une douleur (repérée par de la prostration, des poils hérissés…). L’injection des produits de contraste peut générer des irritations locales, des réactions inflammatoires et des problèmes de tolérance. Enfin, des réactions indésirables aux agents anesthésiques (problèmes respiratoires, hypothermie) peuvent avoir lieu et les animaux peuvent être affectés par une anesthésie prolongée, notamment en termes de récupération post-opératoire (fatigue, comportement altéré). Dans cette étude, nous étudierons 2 types de cardiotoxicité : une forme chronique et une forme aiguë. Dans la forme aigue, une mortalité est observée dès le 5ème jour suivant l’induction.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (coeur), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.
Remplacement
Des tests en laboratoire ont été réalisés, notamment à l’aide de systèmes appelés « fantômes », pour vérifier que les produits de contraste injectables sont bien détectables par imagerie. Ces essais ont permis de confirmer que ces produits génèrent un signal visible dans des conditions simples et contrôlées. Cependant, ces tests ne permettent pas de reproduire ce qui se passe réellement dans un organisme vivant, notamment l’apparition de certaines molécules liées à l’inflammation du cœur. C’est pourquoi un modèle animal de toxicité cardiaque, induite par un médicament comme la doxorubicine, est indispensable. Il permet d’étudier l’efficacité du produit de contraste injectable dans un contexte proche de celui d’un patient malade. Les expériences proposées dans ce projet sont donc nécessaires car aucune méthode alternative ne permettrait d’obtenir les mêmes informations sans utiliser d’animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été soigneusement évalué à partir des données issues de nos précédentes études ayant développé les applications de l’immuno-IRM. Conformément aux recommandations scientifiques pour le développement d’un nouvel agent de contraste dans une modalité d’imagerie donnée, il est essentiel de s’appuyer sur un nombre d’animaux compris entre 5 et 10 par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est nécessaire pour évaluer la spécificité (par exemple, à travers des études comparatives avec des particules ciblant les molécules d’adhésion endothéliales ou des particules contrôles) et des animaux contrôles (recevant du sérum physiologique), indispensables pour garantir la validité des résultats. Nous avons conçu le protocole de manière à minimiser ce nombre, en nous assurant que chaque expérience soit la plus informative possible tout en respectant les principes de réduction et de raffinement dans l’utilisation des animaux.
Raffinement
Les animaux auront le temps d'acclimatation de deux semaines. Un enrichissement du milieu est aussi prévu pour les souris (papier kraft, morceau de bois). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. A partir du début de la mise en place du modèle, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse (d'après la grille d’évaluation comportementale standardisée de Mouse Grimace Scale) ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une attention particulière sera accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée tous les jours afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 10%. Après injection, une surveillance sera faite comme suit : 15 minutes après injection, puis 1 heure après puis de une à deux fois par jour. Des points limites adaptés ont été préalablement mis en place et des décisions spécifiques seront prises en conséquence.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans les domaines des cardiopathies ischémiques et inflammatoires et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connues. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le potentiel diagnostic de l’imagerie de l’inflammation dans le suivi de ces pathologies. Nous utiliserons des souris qui pèsent entre 35-40g, ce qui correspond à un stade de développement de 8 à 12 semaines. En effet, les protocoles de modèles de cardiotoxicité expérimentale chez la souris utilisent des modèles sur des jeunes adultes.
Impact de l’exposition précoce à un insecticide sur le développement cérébral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer si un insecticide perturbe la formation de la myéline dans le cerveau en développement, 1 636 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes reçoivent de la deltaméthrine dans leurs croquettes du septième jour de gestation au vingt-deuxième jour après la naissance, leurs petits sont séparés d'elles vingt minutes pour être comptés et sexés, puis testés à l'âge adulte sur l'activité locomotrice pendant vingt-quatre heures, l'anxiété, les interactions sociales et la mémoire spatiale. Les descendants et les mères sont tués pour prélever les cerveaux, seules seize souris servant d'inconnues dans le test social pouvant être réutilisées ailleurs. Le porteur attend des effets modérés sur le développement cérébral et le comportement des souriceaux exposés, sans impact selon lui sur leur bien-être général, et annonce une surveillance toutes les 48 heures assortie de points limites déclenchant la mise à mort.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement tels que les déficits d’apprentissage, les troubles de l’attention et les troubles du spectre autistique touchent de nombreux enfants et représentent un problème de santé publique majeur. Souvent associés à des handicaps durables, ils sont en partie attribués à l’exposition aux polluants environnementaux durant le développement cérébral qui s’étend de la vie fœtale à l’adolescence. Parmi ces polluants, les pesticides, largement utilisés en agriculture pour améliorer les rendements et assurer la sécurité alimentaire, sont aussi couramment employés dans les habitations pour lutter contre les nuisibles. Leur usage intensif n’est pas sans conséquences pour la santé humaine et l’environnement. Des initiatives visent à réduire leur usage et à remplacer les substances les plus toxiques. Cela a conduit à une utilisation accrue d’insecticides plus récents. Ils contaminent désormais une grande partie de la population, y compris les femmes enceintes et les enfants. Certaines études indiquent un lien entre exposition précoce à ces insecticides et des troubles du neurodéveloppement, mais les mécanismes restent inconnus. Parmi les étapes clés du développement cérébral, la myélinisation est un processus par lequel une gaine riche en lipides se forme autour des fibres nerveuses. Toute perturbation de la mise en place de la myéline peut contribuer aux troubles du neurodéveloppement. Ce projet étudiera l’impact d’une exposition précoce à un insecticide récemment développé sur la myélinisation cérébrale chez la souris. Le pesticide sera administré aux souris pendant la gestation et l’allaitement par l’alimentation. Ses impacts seront évalués chez les descendants à différents stades de développement par plusieurs approches expérimentales. Ces travaux visent à mieux comprendre les effets de ces composés pour éclairer les décisions concernant la régulation des pesticides.
Bénéfices attendus
L’utilisation croissante de certains insecticides dans l’agriculture a conduit à une exposition généralisée de la population, y compris les femmes enceintes et les enfants. C’est pourquoi il est nécessaire de mieux comprendre leurs effets possibles sur la santé, notamment pendant les périodes où le cerveau se développe rapidement. Ce projet vise à combler une lacune importante : on en sait encore très peu sur la manière dont ces insecticides pourraient perturber la formation de la myéline, une gaine protectrice qui entoure les fibres nerveuses et joue un rôle clé dans le bon fonctionnement du cerveau. Une myéline anormale peut contribuer à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches permettront d’apporter de nouvelles informations sur les effets des insecticides sur le cerveau en développement. Elles aideront aussi à mieux évaluer les risques liés à ces substances et à mieux protéger les personnes les plus vulnérables comme les enfants. Enfin, les résultats pourront éclairer les décisions des autorités pour une utilisation plus sûre des pesticides.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests comportementaux à l’âge adulte, répartis sur plusieurs jours. Les tests incluent l’évaluation de l’activité locomotrice (24 h), de l’exploration et de l’anxiété (environ 10 min), des interactions sociales (5 min) et de la mémoire spatiale (4 jours consécutifs de test d’environ 10 min/jour). Lors de la mise à mort, l’anesthésie et l’analgésie seront réalisées par injection sous-cutanée (moins d’une minute chacune). La perfusion intracardiaque dure environ 7-8 minutes.
Impact sur les animaux
Les croquettes contenant le pesticide pourraient perturber la prise alimentaire et entraîner une perte de poids. Un stress pourra être engendré par la séparation des souriceaux nouveaux-nés de leurs mères pendant environ 20 minutes lors de l’étape de comptage des souriceaux, de détermination de leur sexe et d’homogénéisation des portées le jour suivant la naissance. La contention des souris pour réaliser les injections sous-cutanées pourrait également être source de stress correspondant à la durée du geste c’est à dire moins d’une minute. Chez les souriceaux exposés, des effets modérés sur le développement du cerveau sont attendus, pouvant influencer leur comportement (anxiété, mémoire, relations sociales), sans impact sur leur bien-être général ni sur leurs fonctions vitales.
Devenir
A la fin de la procédure visant à vérifier l’absence de modification de l’appétit des souris nourries aux croquettes contenant l’insecticide, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés. Du sang sera également prélevé pour mettre au point le dosage de l’insecticide. A la fin de la procédure d’exposition pendant la gestation et l’allaitement, tous les descendants seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses. Les mères seront mises à mort au moment du sevrage. Les animaux utilisés comme « souris inconnues » dans le test d’interactions sociales pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
La myélinisation est un processus développemental long et complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires entre les différents types cellulaires cérébraux et dépendant également de facteurs circulants tels que les hormones. Pour cette raison, son étude ne peut être envisagée qu’« in vivo ». De plus, l’exposition par voie orale chez l’animal constitue à ce jour le modèle le plus pertinent pour reproduire la principale voie d’exposition chronique à la deltaméthrine dans la population humaine.
Réduction
Au début du projet, une première étude sera réalisée pour vérifier que la présence de l’insecticide dans la nourriture n’affecte pas l’appétit des souris. Ceci permettra d’éviter d'utiliser inutilement un grand nombre d'animaux si les conditions ne sont pas optimales. Le nombre d'animaux prévu a été calculé en fonction de notre expérience pour chaque type d’analyse prévue. Ce nombre d’animaux sera suffisant pour appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions pour analyser les résultats obtenus. Plusieurs analyses seront réalisées à partir du même animal pour limiter leur nombre.
Raffinement
Les souris adultes non gestantes, les mères et les souriceaux après sevrage seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Les souris femelles utilisées présentent d’excellentes qualités maternelles, ce qui permettra de minimiser le stress et la souffrance des petits. La méthode d’exposition des animaux à l’insecticide par incorporation dans les croquettes, non invasive, ne générera pas de stress ou de souffrance. Au cours des tests comportementaux, des précautions seront prises pour minimiser le stress des animaux et assurer la qualité et l’exploitabilité des résultats, incluant des sessions d’habituation aux enceintes. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale et après administration d’un analgésique. Des points limites sont définis pour anticiper et prendre en charge la détresse et la douleur. Une surveillance toutes les 48h (ou 72h du vendredi au lundi), sera mise en œuvre incluant l’observation de l’apparence, de signes cliniques et du comportement des animaux. Un score sera établi pour évaluer un éventuel stress et/ou douleur et le prendre en charge de manière adaptée selon la gravité à l’aide de grilles pour lesquelles des points limites ont été définis. Si les points limites sont atteints, nous procéderons au renforcement de la surveillance ou à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour ce type d’étude. De plus, le laboratoire dispose d’une expertise spécifique sur ce modèle, ainsi que des outils nécessaires à l’étude des anomalies de la myéline. Au début du projet, des souris femelles adultes âgées d’environ 3 mois seront utilisées afin de vérifier que l’incorporation de l’insecticide dans les croquettes n’a pas d’influence sur l’appétit de souris. Ce stade a été choisi car, par la suite, les souris exposées directement à l’insecticide seront des femelles adultes gestantes d’un âge comparable. L’exposition à l’insecticide sera réalisée pendant la gestation et l’allaitement, de la 7ᵉ journée de gestation jusqu’au 22ᵉ jour postnatal. Cette période a été choisie pour cibler le développement cérébral. Elle couvre également une période critique où le cerveau est particulièrement sensible aux influences extérieures. Les stades auquels seront réalisées les différentes analyses ont été choisis en fonction des périodes auxquelles se produisent les évènements étudiés. Pendant les 3 premières semaines après la naissance, les cellules responsables de la synthèse de myéline seront étudiées. La formation de myéline sera suivie jusqu’à l’âge adulte. Enfin, des tests comportementaux seront réalisés chez les souris adultes afin d’évaluer les impacts à long terme de l’exposition pendant le développement.
Sélection d’un vecteur optimisé pour une thérapie génique précoce d’un modèle murin de syndrome myasthénique congénital
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Injectées dès la naissance d'un vecteur viral, puis soumises trois ou quatre fois à des tests de force d'agrippement, de coordination, de fatigabilité musculaire et de capacité respiratoire, 2 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont toutes tuées, les unes avant sevrage parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché, les autres en fin de procédure pour prélever leurs tissus. Le modèle porte une délétion du gène ColQ qui reproduit un syndrome myasthénique congénital, avec faiblesse musculaire généralisée dès les premiers jours de vie. Une précédente tentative de thérapie génique menée par la même équipe a provoqué une toxicité inattendue, fait que le résumé rapporte tout en présentant les prélèvements sanguins comme une douleur équivalant à l'introduction d'une aiguille.
Objectifs
Le syndrome myasthénique congénital est une maladie rare d’origine génétique, ayant une incidence estimée à 1 personne sur 250 000. Elle présente des caractéristiques cliniques et génétiques hétérogènes, puisque différents gènes déficients peuvent être individuellement associés à ce type de pathologie. Ces gènes sont impliqués dans le bon fonctionnement des jonctions neuromusculaires, qui est la structure permettant la transmission de l’information nerveuse vers les muscles et donc la contraction musculaire. L’un des syndromes myasthéniques congénitaux est associé à des mutations dans le gène COLQ, pour collagène Q. Les patients souffrent de faiblesse musculaire sévère, de fatigue, de scoliose importante, d’insuffisance respiratoire et ont une espérance de vie réduite. Pour le moment, il n’existe pas de traitement curatif mais uniquement des traitements symptomatiques. Le but du projet est de concevoir une approche de thérapie génique innovante pour le syndrome myasthénique congénital lié à ColQ, consistant à l’introduction du gène sain dans les cellules à l’aide de vecteurs. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin déficient en ColQ qui reproduit les symptômes observés chez l’Homme. Dans une étude précédente, nous avons administré un vecteur viral non optimisé, porteur du gène sain COLQ, pour une première preuve de concept à un stade post-symptomatique et qui a provoqué une toxicité inattendue. Nous souhaitons, dans ce projet, traiter les animaux avec un vecteur viral que l’on optimisera pour une meilleure spécificité et efficacité pour le transfert du gène COLQ et son expression en protéine essentiellement dans le muscle squelettique, en tenant compte des résultats obtenus précédemment dans l’équipe. Nous avons sélectionné à partir d’études sur cellules en culture, 6 vecteurs différents. Le phénotype des souris traitées avec ces vecteurs à différentes doses sera analysé jusqu’à 3 mois ou 1 an, en évaluant l’état général des souris, la force musculaire et globale, la capacité respiratoire, l’état des jonctions neuromusculaires et la structure des fibres musculaires.
Bénéfices attendus
Grâce à l’étude de différents vecteurs, à différentes doses, ce projet pourrait permettre d’identifier chez la souris, un vecteur efficace pour traiter à une dose la plus faible possible le syndrome myasthénique congénital liée à l’absence de collagène Q, tout en réduisant le risque de toxicité. Ce vecteur optimisé pourra être utilisé pour le développement préclinique et clinique d’un candidat médicament pour cette pathologie mais pourra également être utilisé pour traiter d’autres syndromes myasthéniques congénitaux, en changeant uniquement le gène responsable de la pathologie.
Procédures
Injection des traitements : injection unique, environ 2min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1h30, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force d’agrippement : 2min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de coordination et de force musculaire : 10min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de fatigabilité musculaire : 5min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la capacité respiratoire : 1 fois 10 min par souris. Mesure de la force globale : 1 fois 10 min par souris. Analyse de la transmission de l’information nerveuse vers les muscles : 1 fois 20 min par souris. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : 4 fois, environ 5 min par souris.
Impact sur les animaux
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine collagène Q. Les animaux malades développeront des troubles du comportement moteur liés à une faiblesse musculaire généralisée. Suite aux traitements, dans le cas d’une injection à dose suboptimale, les nuisances seront liées à celles du modèle. Les injections intraveineuses ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère équivalente au seuil de douleur lié à l’introduction d’une aiguille sous bonne pratique vétérinaire. L’animal subira, au cours des évaluations fonctionnelles, un stress lié à la manipulation. Très rarement, certains animaux pourront souffrir de blessures des griffes/doigts, de petites plaies ou d’altérations des fonction locomotrices suite aux tests fonctionnels.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés avant sevrage s’ils ne possèdent pas le génotype nécessaire pour être inclus dans les études. Le reste des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer l’efficacité des traitements.
Remplacement
Dans ce projet, une présélection de vecteurs a été réalisée en mesurant l’efficacité de ces vecteurs à délivrer le gène thérapeutique dans les cellules musculaires, et à produire la protéine d’intérêt. Cependant, ces modèles en laboratoire ne nous permettent pas d'observer comment le vecteur se répartit dans tout le corps ni d'étudier les effets thérapeutiques, car ils ne peuvent pas simuler les problèmes de fonctionnement des muscles, comme la perte de force. Pour évaluer l’efficacité et la spécificité d’un vecteur administré dans l’ensemble du corps, l’utilisation d’animaux est indispensable. Notre modèle de souris reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui nous permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents tissus pour analyser leur spécificité. Ils permettent d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle et de la jonction neuromusculaire ou encore les niveaux de biomarqueurs dans le sang.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre un animal sain et un animal traité. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons sélectionné grâce à des études sur cellules les 6 meilleurs vecteurs viraux capables d’exprimer fortement la protéine COLQ dans les cellules musculaires. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 6 vecteurs à 3 doses différentes pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la pathologie à moyen terme, sur 3 mois. Les 2 meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale sur une période de 1 an. Dans l’étude à 3 mois, nous procèderons par étape, en injectant en premier les animaux avec la plus forte dose de vecteurs. Si des animaux injectés avec une certaine dose d’un vecteur donné montrent des signes d’absence d’efficacité, nous n’injecterons pas les doses plus faibles pour ce vecteur. Si un des vecteurs injectés dans l’étude à 3 mois a un effet thérapeutique nettement supérieur aux autres, l’étude de dose à un an se fera uniquement avec ce vecteur. La toxicité d’un médicament est évaluée avec la dose thérapeutique optimale sur des animaux sains. Dans cette étude, des animaux sains seront injectés avec les 3 doses de ce vecteur car la portée est entièrement injectée à la naissance. Par conséquent, nous utiliserons ces animaux pour l’étude de toxicité, au lieu d’injecter ultérieurement de nouvelles portées lorsque nous serons capables de déterminer la dose thérapeutique optimale. Nous réduisons ainsi le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. S’il s’avère qu’un seul animal se retrouve dans une cage, au sevrage, puisqu’il est le seul à devoir être suivi sur la période d’étude, un animal compagnon sera ajouté pour éviter l’isolement. Pour éviter des bagarres entre mâles, le compagnon sera un frère de la même portée si possible. Sinon un autre mâle du même âge sera ajouté dès le sevrage, ce qui réduira les risques. Après sevrage, les souris mutantes traitées ou non seront observées quotidiennement avec attention et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine. Avant sevrage, la fréquence est réduite à une fois par semaine pour limiter les manipulations et donc le stress pour la portée et la mère. Un aliment hydratant et nourrissant sera appliqué dès constatation que les animaux éprouvent des difficultés à se mouvoir. Des points limites adaptés ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène ColQ (pour collagène Q), responsable d’un syndrome myasthénique congénital, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques caractéristiques de cette maladie. Afin de favoriser l’expression de la protéine COLQ le plus tôt possible et de ralentir la progression de la maladie, les animaux seront traités dès la naissance, sachant que les animaux malades présentent des signes de la pathologie dès les premiers jours de vie. Les animaux seront suivis sur une période de 3 mois ou de 1 an, pour déterminer l’efficacité des traitements à moyen et long terme.
Etude du mécanisme de transformation de cellules immunitaires en cellules cancéreuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un lymphome, elles portent toutes un phénotype dommageable, et 290 d'entre elles subissent une prise de sang sur animal vigile, une biopsie d'oreille et une injection intraveineuse sous anesthésie, dont 240 avec cinq injections répétées. Le développement du cancer provoque prostration, poil hérissé, dos voûté, gonflement de l'abdomen et troubles respiratoires liés aux tumeurs du thymus. Le porteur indique que des études in vitro sur cellules humaines ont déjà été menées, puis conclut que le recours aux animaux reste "nécessaire" pour observer le développement d'un cancer.
Objectifs
Au laboratoire, nous travaillons sur les lymphomes, qui sont des cancers qui affectent certains globules blancs (lymphocyte). Nous avons mis au point un modèle de souris qui développent ce type de cancer. Ce modèle nous a permis de trouver un gène dont l'expression est diminuée dans ce type de cancer. L’objectif de ce projet est de continuer à étudier ce modèle pour mieux comprendre comment se développe les lymphomes et étudier le rôle de ce gène dans ce développement. Nous souhaitons donc poursuivre notre étude débutée en 2019.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes du développement d’un certain type de lymphome et ainsi pouvoir améliorer les traitements et la prise en charge thérapeutique des patients car il s’agit encore d’une pathologie dont le taux de survie à 5 ans n’est que de 30%.
Procédures
Les 810 souris générées auront un phénotype dommageable et seront soumises à de la contention. Parmi toutes ces souris, 290 auront une injection par intraveineuse (30 sec) après une anesthésie et un prélèvement de sang sur souris vigile (moins d’1 min) et une biopsie d'oreille (1 mm ; 30 sec). Parmi ces 290 souris, 240 auront 5 injections répétées.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements et biopsie seront sources de stress et de douleur (inflammation/infection sur le site d'injection et de prélèvement). Les effets indésirables liés au développement du cancer seront la prostration, le poil hérissé, le dos vouté, un gonflement exacerbé de l'abdomen et des problèmes respiratoires associés au développement de tumeur au niveau du thymus.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort : soit lors d’atteinte de point limite, pour éviter toute souffrance inutile, soit à la fin des procédures, car ces souris génétiquement modifiées ne pourront ni être réutilisées dans un autre projet, ni replacées
Remplacement
Des études in vitro sur des lignées de cellules humaines ont été réalisées et ont permis d'étudier l'impact du gène sur la survie et prolifération de ces cellules. Cependant, ces approches ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire, ni le développement de cancer. C'est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet pour étudier l'impact de ce gène sur le développement de cancer.
Réduction
Dans cette nouvelle DAP nous voulons compléter nos effectifs déjà en expérimentation afin d’obtenir au total 25 souris/groupes expérimentaux . Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=810) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables pour la cinétique de développement de la tumeur. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (incidence des tumeurs, analyse phénotypique des tumeurs, analyse de marqueurs sanguins)
Raffinement
La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur, stress ou souffrance des souris. Les gestes douloureux seront toujours précédés d'une anesthésie gazeuse qui limitera la douleur des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3 fois par semaine. Au fur et à mesure de l'apparition de cancer et de mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour la nidification, morceaux de bois et tube plastique pour l'enrichissement ludique). Pour les étapes de reproduction, les souris gestantes seront maintenues avec le mâle géniteur. Les croisements seront contrôlés afin de limiter le risque de développement précoce de cancer chez les animaux reproducteurs.
Choix des espèces
Le développement de modèles animaux est indispensable à l’étude de cancer. Pour l’espèce souris, nous disposons de nombreux outils génétiques nous permettant d’étudier précisément les mécanismes moléculaires qui conduisent au développement de cancers. Ce degré de précision n’est actuellement atteignable dans aucune autre espèce de mammifère. Pour les accouplements, nous utiliserons des souris arrivées à maturité sexuelle c'est à dire 6-10 semaines. Les souris en expérimentation seront âgées de 8 à 12 semaines (âge standard pour l'étude du système immunitaire) et car nous devons utiliser des souris adultes mais jeunes de manière à pouvoir les étudier sur un temps suffisamment long pour que des cancers se développent.
Etude des mécanismes neuronaux de l’apprentissage moteur itératif chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, chacune subissant une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes puis, jusqu'à deux mois durant, trente minutes par jour la tête fixée dans un dispositif. Une partie d'entre elles est opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, les autres relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. L'apprentissage étudié consiste à souffler de l'air sur l'œil de l'animal après un signal lumineux, jusqu'à ce qu'il ferme la paupière au signal seul. Le porteur situe ce travail dans la recherche fondamentale et renvoie à un repérage seulement "possible" de pathologies de l'apprentissage.
Objectifs
Le cerveau est composé de très nombreuses cellules nerveuses qui communiquent entre elles via des synapses. La recherche fondamentale en neurosciences vise à comprendre comment ces éléments relativement simples mais nombreux peuvent se concerter pour assurer les fonctions complexes du cerveau. Ce projet s'intéresse à l'apprentissage de gestes par la répétition, un processus présumé impliquer une partie du cerveau appelé le cervelet. Il existe plusieurs théories qui tentent d'expliquer la concertation des cellules nerveuses pour permettre ce type d'apprentissage. L'objectif de ce projet est de mener des mesures au cours d'un apprentissage progressif chez la souris pour tester les théories concurrentes. L'apprentissage étudié consiste en un clignement de la paupière en réponse à un petit souffle d'air dirigé vers l'oeil. Si de façon répété le souffle d'air est précédé par un signal lumineux, initialement sans effet, l'animal développe un clignement suite au signal lumineux avant même que le souffle n'ait lieu. Il est connu que le cervelet intervient dans cet apprentissage. Nous mesurerons l'activité des cellules nerveuses pendant l'apprentissage. Dans d'autres expériences, nous influencerons leur activité pour voir si et comment l'apprentissage est modifié. En parallèle, nous quantifierons le nombre de certaines protéines d'intérêt aux synapses du cervelet. Ces mesures et manipulations nous permettront de tester l'adéquation des théories différentes et si besoin était en proposer de nouvelles. L'apprentissage est un processus primordial dans le fonctionnement du cervelet et notre projet vise à approfondir nos connaissances des mécanismes sous-jacentes.
Bénéfices attendus
Le fonctionnement détaillé du cerveau reste largement inconnu et constitue aussi un chantier central pour la compréhension de cerveau ainsi que de ses dysfonctionnements. Notre projet vise à comprendre au niveau synaptique, cellulaire et du réseau l'apprentissage et optimisation de mouvements par la répétition. Au delà de l'importance de cette problématique spécifique et l'intérêt de ce type de travail pour la recherche fondamentale, il est possible qu'à terme la compréhension des mécanismes de l'apprentissage nous permettrait d'identifier des pathologies liées aux dysfonctionnements de l'apprentissage et/ou proposer des thérapies basées sur l'apprentissage.
Procédures
Une partie des animaux seront impliqués dans une chirurgie (90 minutes) au niveau du crane et du cerveau sous anesthésie et analgésie. Après récupération ils suivent un protocole d'apprentissage et des mesures d'activité neuronale (30 minutes par jour) pendant une période allant jusqu'à 2 mois. D'autres animaux sont impliqués dans une procédure (45 minutes) sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus ou envisageables sont les suivants. Stress (estimé faible) lié à l'hébergement, à la manipulation, à la contrainte d'être maintenue tête fixe, au jet d'air, au gêne dû à l'implant. Pendant la chirurgie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, détresse respiratoire, douleur, écart de température, saignement. En période post-opératoire, des évènements rares : douleur, écart de température, infection, notamment des plaies autour de l'implant, signe neurologiques dus à l'implantation de l'électrode ou l'injection de virus. Avant l'euthanasie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur, détresse respiratoire, saignement.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux dans toutes les procédures est nécessaire afin de permettre le prélèvement du cerveau pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à comprendre les l'apprentissage moteur. Une analyse théorique préalable a permis de faire des hypothèses précises, mais les tester nécessite des mesures lors du comportement, in vivo. Des techniques de modélisation seront utilisées pour analyser les résultats et pour concevoir les expériences suivantes. Cela optimisera le rendement de l'expérimentation animale. Les expériences in vitro visent à étudier l'implication du cervelet dans cet apprentissage et nécessitent de prélever le tissu chez l'animal après l'apprentissage in vivo. Des méthodes de culture ne sauraient reproduire la structure 3-dimensionnelle du cervelet ni l'influence de l'expérience de l'animal.
Réduction
En total 200 souris seront nécessaire pour ce projet. Les effectifs ont été estimés suivant un calcul de puissance basé sur des expériences précédentes. Une analyse statistique optimisée sera appliquée pour interpréter de manière fiable les résultats.
Raffinement
Les animaux commandés auprès d'un fournisseur agréé externe bénéficient d'une semaine d'acclimatation suivant leur arrivée. Tous les animaux sont hébergés dans une animalerie respectant l'ensemble de normes sur la température (régulée à 22 C), ventilation (salle d'hébergement centrale en surpression), hygrométrie (55 pourcent), nourriture et eau ad libitum, change de litière (hebdomadaire), socialisation (plusieurs souris par cage, maximum 6), vérification quotidienne. Enrichissement avec papier Kraft ou de type igloo. Avant la chirurgie, les animaux sont habitués progressivement à la présence de et à la manipulation par l'expérimentateur (4 séances minimum). La chirurgie a lieu sous anesthésie et avec administration d'un analgésique péri- et postopératoire. L'ensemble des interventions ont été regroupées afin de pratiquer une seule chirurgie. La récupération post-opératoire est aidée par un tapis chauffant. Les animaux opérés bénéficient d'un temps de récupération (minimum une semaine). Avant les expériences comportementales, les animaux sont habitués progressivement au poste expérimental. Un comportement où le renforcement n'est que légèrement aversif (un bref jet d'air vers l'oeil) a été sélectionné. Pour l'euthanasie avant le prélèvement du cerveau, une anesthésie profonde est pratiquée. Des points limites adaptés ont été définis pour l'ensemble des phases du projet et seront appliqués.
Choix des espèces
La Souris représente un modèle important des mammifères, fournit une grande partie des travaux de la littérature existante sur lesquels le projet se base, offre des outils génétiques optimisés. Les procédures expérimentales ont été optimisées chez la Souris pour réduire la souffrance des animaux. Le projet utilise des souris adultes exclusivement, âgées au 2--3 mois. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'apprentissage de l'adulte.
Etude multimodale de la comorbidité inflammation périphérique chronique et trouble de l’usage d’alcool.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisis parce qu'ils boivent de l'alcool de façon stable et prévisible dans les protocoles d'auto-administration, 608 rats mâles et femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une injection dans la patte arrière entretient une inflammation pendant deux mois, à quoi s'ajoutent des chirurgies abdominales, sous-cutanées ou intracérébrales de trente minutes à deux heures, des prises de sang sublinguales et trois séances d'IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Le porteur annonce des douleurs postopératoires de trois jours, un risque infectieux au site d'incision et une douleur à la patte enflammée. Tous les rats sont tués à la fin de leur procédure, pour prélever du tissu ou vérifier que les canules et les lentilles implantées se trouvaient au bon endroit.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment une inflammation périphérique chronique influence les comportements de consommation d’alcool chez le rat, en tenant compte des différences entre mâles et femelles. Nous combinerons des approches comportementales, physiologiques, d’imagerie cérébrale et de neurobiologie pour caractériser les mécanismes cérébraux impliqués dans cette comorbidité. Toutes les études se feront aussi bien chez les mâles que chez les femelles.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les interactions entre inflammation périphérique chronique et trouble de l’usage d’alcool (TUA), deux conditions fréquemment comorbides chez l’humain. En utilisant des approches précliniques chez le rat, ce travail permettra de caractériser les effets de l’inflammation sur les comportements de consommation d’alcool et sur les altérations fonctionnelles entre les structures responsables de la motivation à consommer et celles responsables du contrôle inhibiteur du comportement. L’étude intégrera des analyses différenciées selon le sexe, afin de mieux appréhender les éventuels mécanismes neurobiologiques spécifiques. Les mesures comportementales et d’IRM fonctionnelle réalisées sont directement transposables à l’humain, renforçant la valeur translationnelle de ce projet. L’exploration complémentaire de l’implication de la voie vagale permettra d’identifier de potentielles cibles périphériques pour moduler cette comorbidité. À terme, ce projet contribuera à l’identification de biomarqueurs et de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients souffrant de TUA associé à un état inflammatoire chronique.
Procédures
- Injection dans la patte arrière d'un produit pro-inflammatoire (1 fois, durée : 2 mois) - Chirurgies abdominale, sous-cutanée ou intra-cérébrale (1 fois chacune dans la majorité des cas, un seul groupe sera soumis à 2 chirurgies de 20 minutes chacune espacées de 1 à 2 semaines, durées de 30 minutes à 2h selon le type de chirurgie)- Anesthésie générale pour imagerie cérébrale - Prise de sang (sublingual) - IRM fonctionnelle (3 fois 1 heure espacées de 1 et 2 semaines).
Impact sur les animaux
Douleurs post-opératoire (3 jours), risque infectieux au site d'incision (5 jours), douleur à la patte inflammée (3-4 jours), perte de poids transitoire en post-opératoire (2 jours).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour soit permettre le prélèvement de tissu en post-mortem, soit pour vérifier les sites d'implantation des canules guide ou des lentilles.
Remplacement
Les modèles in vitro actuels (organoïdes, et organ-on-chips) ne permettent pas de rendre compte du lien complexe existant entre les organes périphériques et le cerveau, ainsi que de l’organisation complexe du cerveau nécessaires à l’étude des interactions entre le cerveau et les atteintes périphériques (inflammation chronique). L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.
Réduction
Nous avons mis en place une rationnalaisation de l'utilisation des animaux pour nous permettre d'obtenir des données comportementales, physiologiques et neurobiologiques sur les mêmes animaux nous permettant ainsi de réduire grandement le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Nous avons évalués le nombre d'animaux nécessaires dans chacun des groupes expérimentaux pour nous assurer d'une puissance statistique suffisante tout en utilisant le moins d'animaux, ceci basé sur les résultats déjà obtenus dans d'autres expériences réalisées soit au sein de notre laboratoire ou dans le laboratoire de nos collaborateurs.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans un environnement enrichi d'un tube en carton et d'une buchette en bois. De la musique sera diffusée en continu dans les pièces de stabulation. Les rats seront manu pilés tous les jours permettant un enrichissement inter-espèce. Les rats seront placés 5 jours par semaine dans une cage d'auto-administration permettant un enrichissement moteur (appui sur les leviers) et un enrichissement cognitif (apprentissage d'une tâche d'auto-administration nécessitant une planification de l'action). Au cours des différentes étapes, les soins appropriés seront apportés aussi bien pendant les phases de consommation que dans les périodes per-opératoires en respectant les points limites fixés et déterminés par une échelle de bien-être animal reconnue internationalement.
Choix des espèces
Le rat constitue le modèle le plus adapté pour ce projet, en raison de ses capacités d’apprentissage, de sa robustesse physiologique et de la richesse des données disponibles en neurosciences comportementales. Contrairement à la souris, le rat développe des comportements stables et fiables dans les protocoles d’auto-administration orale d’alcool, ce qui est essentiel pour modéliser le trouble de l’usage d’alcool (TUA) de manière pertinente. Par ailleurs, le rat présente une réponse plus homogène et plus facilement interprétable dans les modèles d’inflammation chronique et de douleur, avec une meilleure transposabilité aux phénomènes observés chez l’humain. Sa taille permet également l’implantation plus fiable de dispositifs de télémétrie permettant l'enregistrement d’un électrocardiogramme et d'un électro-encéphalogramme (EEG/ECG), la réalisation d’imagerie fonctionnelle cérébrale (IRM) de qualité, et l’utilisation de techniques comme l’imagerie calcique sur animal vigile. L’ensemble de ces éléments rend le rat indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Les rats arriveront au laboratoire à l'âge de 7 semaines et seront conservés pendant 5 à 6 mois. L'addiction à l'alcool ainsi que la douleur chronique apparait en général à l'âge adulte.
Les effets anti-tumoraux de l’anesthésie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées de fibrosarcomes sous anesthésie générale, 320 souris reçoivent une injection unique d'un anesthésique testé pour ses effets anti-tumoraux, puis leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever tissus et organes. Le porteur rappelle qu'un travail antérieur a permis de guérir 50 % des souris en associant cet anesthésique à une immunothérapie, et 75 % en injection intratumorale, puis affirme qu'il est "indispensable" d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Les points limites qui déclenchent la mise à mort sont annoncés comme définis et strictement appliqués, sans que le résumé indique lesquels ni à quelle taille de tumeur ils s'appliquent.
Objectifs
Notre récent travail a permis de démontrer l'effet anti-tumoral d'un anesthésique. Il permet une réduction significative de la croissance tumorale. Associée à l'immunothérapie, il permet de guérir 50% des souris et de générer une mémoire immunitaire. Injectée directement en intratumoral,il permet de guérir 75% des souris. De très nombreuses études précliniques ont pu observer la présence de récepteurs impliqués à la surface de nombreuses lignées tumorales. Afin de démontrer que l'action anti-tumorale de ce médicament repose sur des récepteurs spécifiques, nous réaliserons des expériences dans lesquelles des souris porteuses de fibrosarcomes ou de fibrosarcomes modifiés dont les cellules seront déficientes pour ces récepteurs seront traitées avec de l'anesthésique étudié.
Bénéfices attendus
Démontrer que l'action antitumorale de l'anesthésique repose sur les récepteurs spécifiques étudiés. Ce résultat pourrait amener à des essais randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement ces agents sont utilisés comme complément analgésique per-opératoire et n'ont aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique.
Procédures
Greffe de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes), traitement par injection (1 fois, durée 1 minute), anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections uniques de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress léger et transitoire chez l’animal et les croissances tumorales en sous cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées.
Devenir
Euthanasie des animaux pour études sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Les effets des traitements anticancéreux impliquent des processus multiparamétriques impliquant des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que la dexmedetomidine induit une réponse anti-tumorale médiées par les récepteurs alpha2 adrénergiques présents sur de nombreuses lignées tumorales. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour étudier l'immunité et l'efficacité des traitements sur la réponse anti-tumorale. La confirmation de cette activité anti-tumorale in vivo ouvrirait la possibilité d'utiliser systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction des cellules tumorales résiduelles.
Réduction
Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes déterminés par calcul statistique pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront analysés par des méthodes statistiques. L’étude sera arrêtée si une procédure invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Nous souhaitons prouver l'efficacité de potentiels nouveaux agents anti-tumoraux afin d'augmenter la réponse anti-tumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitement. Le modèle souris permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler, et suffisamment grand pour pouvoir avoir des injections de cellules tumorales. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, nous réaliserons donc les études sur des adultes.
Rôle du facteur endothélial Cxcl12 dans la promotion tumorale induite par le stress adrénergique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections espacées de 24 heures déclenchent une mutation ciblée, puis une micropompe est implantée sous la peau sous anesthésie pour diffuser en continu une substance qui imite le stress chronique, et quatorze jours plus tard des cellules de cancer de la peau sont injectées dans la veine de la queue. L'objectif est de suivre pendant deux semaines la formation de métastases pulmonaires, la mise à mort de toutes les souris étant imposée par les tumeurs développées. Le porteur écrit que l'implantation de la pompe ne devrait générer aucune souffrance, et affirme que l'étude des phénomènes métastatiques "nécessite" un modèle in vivo.
Objectifs
Le but de ce projet est de découvrir comment les vaisseaux sanguins influent sur la croissance des tumeurs. Nous voulons en particulier comprendre comment le corps réagit au stress constant et comment cela peut affecter la formation de tumeurs secondaires (dans d’autres organes ici les poumons) à distance du site primaire d’une tumeur (dans un organe ici la peau) lors du phénomène de métastase cancéreuse. Des recherches antérieures ont montré qu’une protéine activée lors d’un stress continu induit la production d'une substance chimique dans la paroi interne des vaisseaux sanguins. L’objectif de notre travail est de comprendre comment cette modification influence l’expression des gènes des cellules des vaisseaux sanguins et facilite la dissémination des cellules tumorales sur le site secondaire de la circulation vers l’organe métastasé. Pour mener cette étude, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées qui ne produisent pas la Cxcl12 spécifiquement dans leurs cellules de la paroi interne des vaisseaux sanguins. Nous allons également utiliser une forme de cancer de la peau très vascularisée comme modèle de tumeur primaire. Pour simuler le stress constant, nous allons implanter des mini-pompes dans ces souris, délivrant une substance qui imite le stress. Au cours de nos recherches, nous allons examiner le développement de tumeurs secondaires pulmonaires, ainsi que les changements dans leur vascularisation, sur deux semaines.
Bénéfices attendus
Étant donné la disponibilité d'antagonistes situés sur les parois des vaisseaux qui se comportent déjà bien pour le traitement chez l'homme, les résultats issus de cette étude pourraient être facilement transférés pour des thérapies complémentaires du cancer.
Procédures
Nous soumettrons nos groupes de souris à deux injections d’une substance permettant de générer la mutation specifique espacées de 24h. Ces gestes techniques réalisés par du personnel compétent et expérimenté sont réalisés en quelques secondes. Les souris qui ne produiront pas la substance chimique spécifiquement dans leurs les cellules de la paroi interne des vaisseaux sanguins et les souris contrôles la produisant seront soumises 6 jours plus tard à une implantation d’une micropompe sous la peau réalisée sous anesthésie qui durera au maximum 5 minutes. Quatorze jours après une implantation réussie, les souris recevront en intraveineuse dans la veine caudale des cellules de cancer de la peau ce geste réalisé par du personnel compétant et expérimenté n’excédera pas 1 minute. L’implantation de la micropompe sera accompagnée d’un traitement analgésique préopératoire en sous cutané.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à des manipulations de courte durée lors du nettoyage des cages et des pesées occasionnelles qui peuvent engendrer un léger stress. Les génotypésdes animaux seront determiner par extraction d'ADN à partir de follicles pileux réalisées sur souriceaux de 21 jours. Ce geste n’engendre aucune douleur à cet âge. L’implantation de la micropompe en sous cutané sera réalisés sous anesthésie et avec un traitement préopératoire d’antalgique et ne devraient générer aucune souffrance chez les souris. Il existe un risque minime de cicatrisation altérée au niveau du site chirurgical d’implantation. La formation de métastases, c’est-à-dire de tumeurs secondaires à distance de la tumeur primaire facilitées par la dissémination dans la circulation sanguine, sera examinée au bout d’un temps court au niveau des poumons. L’expérience accumulée sur ces modèles a montré que vu le temps d’utilisation pour observer des métastases pulmonaires est très inférieur au temps permettant la croissance de tumeurs sous-cutanées, et que la souffrance des animaux est minimisée.
Devenir
Les tumeurs développées chez les souris exigent que toutes les souris soient mis à mort à la fin des expériences.
Remplacement
L’étude de la contribution de la circulation sanguine et de l'extravasation des cellules tumorales depuis les vaisseaux et donc des phénomènes métastatiques à distance de la tumeur primaire, nécessite d’utiliser un modèle in vivo.
Réduction
L’utilisation de micro-pompes micro-osmotiques permet de limiter le stress des animaux et d’éviter des traitements trop invasifs. Cela réduit aussi le risque que certains animaux meurent à cause du stress. Le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude a été calculé grâce à un test statistique, afin de garantir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation.
Raffinement
Les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté. L’implantation sous-cutanée de micro-pompes réduit considérablement le stress lié à la manipulation des animaux (par exemple, aucune injection quotidienne n'est nécessaire). Le stress des animaux est réduit à un niveau minimum. Toutes les mesures seront prises pour minimiser le degré de souffrance des animaux, comme décrit dans la grille de score. L'anesthésie et l'analgésie seront assurées pendant l'implantation de la pompe osmotique en sous cutané. La douleur ou la souffrance des animaux pendant l'induction de la tumeur peut être maintenue à un niveau modéré grâce à des mesures adaptées prises en concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Etre Animal; Conseille le personnel d'institute sur des questions relatives au bien-être des animaux) et le vétérinaire référent. La mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés basés sur une observation quotidienne des animaux (apparence de l’animal, évolution du poids, modifications du comportement, respiration, aspect de la cicatrice au niveau du site d’implantation de la micropompe, mobilité, croissance d’une tumeur cutanée) au cours de la procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. L'utilisation d'analgésiques sera également proposée lors de l’atteinte de certains points limites.
Choix des espèces
Pour obtenir des données sur la fonction et la contribution spécifique du facteur produit par les cellules de la paroi des vaisseaux sanguins dans la progression tumorale (ici la métastase de la tumeur primaire dans des organes secondaires), le modèle murin est particulièrement approprié. En effet les modèles de formation des tumors et de stress chronique utilisés sont bien établis chez la souris. Toutes les lignées de souris étant consanguines sur un fond génétique stable, elles permettent de futurs croisements entre les lignées et des implantations de tumeurs dérivées de souris de même fond génétique que les souris receveuses. Le taux d'échec de l'implantation de tumeurs est dès lors minime. En raison de la comparaison avec l'évolution de la progression tumorale chez l'homme, ce projet sera réalisé sur des souris adultes âgées de 9 à 15 semaines.
Prélèvements « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
105 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un seul geste, l'amputation des deux millimètres distaux de la queue au sevrage, à vingt et un jours, en une dizaine de secondes. Ces souris portent une mutation identifiée chez deux jeunes patients atteints d'épilepsie sévère, et le porteur indique qu'elles font des crises récurrentes, sont hyperactives et se toilettent davantage. L'amputation se pratique sans anesthésie, le porteur estimant qu'une anesthésie générale serait "une nuisance additionnelle non justifiée" au regard de la gravité de la procédure. Celles qui n'ont ni le génotype ni le sexe voulus, seuls les mâles modifiés étant gardés, sont tuées "très rapidement", les autres après reproduction, à six mois au plus tard.
Objectifs
Notre projet a pour but de maintenir une lignée de souris génétiquement altérées qui permettent d'étudier l'encéphalopathie épileptique du développement (DEE). Ces souris reproduisent une mutation humaine identifiée chez deux jeunes patients atteints d’épilepsie sévère accompagnée par un retard cognitif grave et progressif. Les souris portant cette mutation ont des crises d’épilepsie récurrentes et présentent des troubles du comportement et de la cognition (elles ont hyperactive et moins anxieuse que les souris normales). L’étude des mécanismes neuronaux causant les DEEs est le principal domaine de recherche de notre équipe. L’utilisation des souris génétiquement altérées s’inscrira dans le cadre d'un programme de recherche multicentrique (= impliquant plusieurs laboratoires) qui se propose de développer des nouvelles méthodologies diagnostiques et thérapeutiques pour les DDE.
Bénéfices attendus
L’utilisation de nos souris génétiquement altérées permettra de mieux comprendre les mécanismes de base de l'encéphalopathie épileptique du développement. Cette pathologie restent actuellement intraitable. En outre, le programme multicentrique auquel nous contribuons en nous appuyant sur nos souris génétiquement altérées, se propose de développer des nouvelles méthodologies diagnostiques et thérapeutiques à appliquer à l'encéphalopathie épileptique du développement. Le présent projet permettra de maintenir la lignée de nos souris génétiquement altérées pour que l'on puisse en disposer pour les projets qui porteront sur notre thématique.
Procédures
Au moment du sevrage (à l'âge de 21 jours) on effectuera une biopsie de la queue par prélèvement de 2mm à son extrémité. La durée de la manipulation est d'environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
Des publications précédentes ont mis en évidence que nos souris génétiquement altérées présentaient des crises d’épilepsie, de l’hyperactivité, une réduction de l'anxiété et une augmentation du comportement d'auto-toilettage. La gestion de la lignée impliquera de réaliser une caractérisation génétique à partir d'un prélèvement de tissu. Ce prélèvement consistera en l'amputation des 2 mm distaux de la queue des animaux. Cela peut générer une légère douleur et un léger stress.
Devenir
Les souris incluses dans la présente demande permettront de maintenir une lignée d'intérêt et de produire des lots expérimentaux pour alimenter les projets de l"équipe portant sur l'encéphalopathie épileptique du développement. Les souris qui n'auront pas les bonnes caractéristiques génétiques ou le bon sexe (on ne gardera que les mâles génétiquement altérés) seront mises à mort très rapidement. Les autres seront gardés le temps qu'ils se reproduisent puis seront mises à mort (à l'âge de 6 mois au maximum).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’autres projets. Il n’existe aucune alternative satisfaisante (pour notre lignée) à la biopsie de tissus pour avoir accès au matériel génétique afin de le caractériser. Les projets qui seront alimentés par les souris reproductrices décrites dans cette demande d'autorisation, consistent typiquement à explorer les mécanismes neuronaux sous-jacents à l'encéphalopathie épileptique du développement, en utilisant des souris réalisant certains types de comportements (enregistrements de neurones sur souris vigiles) ou en ayant recours à des enregistrements électrophysiologiques sur tranches de cerveau. Dans les deux cas, l'utilisation de souris est, par nature, indispensable.
Réduction
Le schéma de reproduction vise la génération de la population minimale de reproducteurs nécessaires au maintien de la lignée et à la gestion des projets de recherche.
Raffinement
Les méthodes mises en oeuvre pour réaliser la biopsie nécessaire au génotypage sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiées au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
Nos souris génétiquement altérées portent une mutation génétique isolée chez des patients humains atteints d’encéphalopathies épileptique du développement. En outre, ces souris présentent des caractéristiques qui miment plusieurs aspects de la maladie comme les crises d’épilepsie et des comorbidités comme les troubles du comportement et de la cognition. Les animaux du présent projet seront utilisés en tant que reproducteurs jusqu’à l’âge de 6 mois. Un mâle est un bon reproducteur jsuqu'à cet âge; au-delà l'efficacité des accouplements peut baisser.
Le rôle des granulines dans la régénération des organes du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
936 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cœur, leur nageoire ou d'autres tissus, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 432 subissent l'amputation au scalpel d'une partie de la nageoire caudale, d'autres une cryolésion du cœur de deux minutes sous anesthésie, et 168 sont écartés après génotypage parce qu'ils ne portent pas la modification recherchée. Le porteur décrit ensuite de l'hyperventilation, une prise alimentaire réduite et des comportements qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation, prostration au fond du bac ou nage exclusive en surface, et prévoit de tuer immédiatement les poissons dont la nage devient erratique. Le bénéfice annoncé se limite à l'identification de stratégies immunomodulatrices capables de stimuler la régénération des organes chez les mammifères, perspective lointaine face aux lésions cardiaques et aux amputations infligées maintenant.
Objectifs
Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. En particulier, selon l'Organisation Mondiale de la Santé (World Health Organization), les cardiopathies ischémiques telles que l'infarctus du myocarde représentent la première cause de mortalité dans le monde (13% du nombre total de décès dans le monde) et la deuxième cause de morbidité, juste après le COVID-19, dans la dernière évaluation (2021). Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. Avec l'allongement de la durée de vie des populations modernes, l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé - elle touche une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde (Organisation Mondiale de la Santé). Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire (c'est-à-dire un modèle de régénération osseuse), et retrouver leur fonction. Le moment, l'étendue et le type de réponse immunitaire après une lésion d'organe influencent fortement les résultats de la régénération. En particulier, une vague inflammatoire autolimitée est essentielle pour parvenir à une régénération correcte des organes. Les granulines sont molécules naturellement produites par l'organisme pour aider à contrôler l'inflammation et potentiellement soutenir la réparation des tissus, et jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire. De plus, elles sont régulées à la hausse dans les tissus en régénération chez le poisson zèbre. Nous émettons l'hypothèse que les granulines jouent un rôle clé dans le processus de régénération. Ce projet vise à étudier le rôle des granulines pendant la régénération des organes du poisson zèbre (cœur et nageoire). Cette étude sera essentielle pour stimuler la régénération dans des scénarios non régénératifs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'étudier les aspects immunitaires particuliers qui stimulent la régénération des organes. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.
Procédures
Pour les études cardiaques, 336 animaux seront soumis au génotypage par prélèvement caudal sous anesthésie. Parmi eux, 50 % (168) n'auront pas le bon génotype et ne subiront donc pas d'autres procédures (ils sont donc classés comme modérés). 168 animaux seront génotypés sur la base de la seule fluorescence. Cela est réalisé en analysant rapidement la fluorescence au niveau des yeux sous un stéréomicroscope, sous anesthésie. Parmi ces derniers, 336 seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Pour les études de régénération de la nageoire caudale, certains poissons-zèbres (432) seront soumis à une amputation d'une partie de nageoire, une procédure considérée comme légère. Pour ce faire, les poissons anesthésiés sont placés sur le côté dans une boîte de Pétri et, à l'aide d'un scalpel, une coupe rapide est effectuée sur la nageoire caudale et une petite partie du tissu est enlevée, sans affecter les autres tissus environnants. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours (nous n'étudions ici que les 7 premiers jours, lorsque le processus de régénération est très actif). Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes) du tissu de la nageoire caudale en cours de régénération, et la coloration des os en direct (15 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent : - La cryoblessure (cryoinjury) pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Pour éviter que ces animaux meurent en quelques heures ils sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé. - Amputation de la nageoire caudale. Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes. Aucun fardeau phénotypique n'a été identifié pour les mutants grn1/2, mais on s'attend à ce qu'ils présentent une immunosuppression à un moment donné de leur vie, car ils pourraient être plus sensibles aux infections/maladies. Ce phénomène sera donc surveillé. Les animaux surexprimant le gène grn1 ne devraient avoir des niveaux de grn1 affectés que lors d'un choc thermique, car il s'agit d'une lignée inductible. La surexpression de grn1 peut également conduire à des altérations immunitaires et sera donc également surveillée, en particulier après un choc thermique. Toutes les autres interventions n'entraînent généralement pas de nuisances ou d'effets indésirables en elles-mêmes, à l'exception de l'anesthésie qui leur est associée et qui entraîne généralement une hyperventilation pendant quelques minutes après la récupération.
Devenir
Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils géniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus (principe de remplacement). En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau : nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). NB: L’évaluation du poids sera effectuée toutes les deux semaines. Les poissons ne seront pas anesthésiés pour évaluer leur poids. Ils seront placés vigiles dans un bac d’eau sur une balance préalablement tarée.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est génétiquement modifiable, ce qui permet des études à grande échelle rapides et peu coûteuses. De nombreuses lignées transgéniques et mutantes sont disponibles pour répondre à des questions biomédicales clés. Le poisson-zèbre adulte est capable de régénérer ses organes, offrant des perspectives pour favoriser la régénération dans des contextes non régénératifs. Cette capacité diminue avec l’âge, reflétant la réduction de la capacité réparatrice et le dysfonctionnement des organes observés chez les mammifères. Le système immunitaire du poisson-zèbre est conservé chez les mammifères. Ces caractéristiques font du poisson-zèbre un modèle précieux pour l’étude de la régénération des organes et de la réponse immunitaire. Toutes les expériences seront réalisées sur des poissons adultes, car toute la pathophysiologie que nous étudions se développe à l'âge adulte, et le protocole se concentre sur la réponse immunitaire (et la réponse immunitaire adaptative n'est mature que chez les animaux adultes). En outre, l'objectif proposé se concentre sur l'étude de la régénération chez les individus adultes.
Criblage du profil pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution de composés de thérapies ciblées anticancéreuses chez la souris porteuse de tumeur.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris utilisées est immunodéprimée par construction, pour accepter la greffe de tumeurs humaines. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, portant chacune une tumeur greffée sur animal vigile. Elles reçoivent jusqu'à trois injections du composé à tester, des mesures de tumeur au moins deux fois par semaine, plusieurs prélèvements sanguins sur animal vigile, puis un prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil que le porteur décrit comme pouvant provoquer un arrêt cardiaque. 540 d'entre elles pourront être réutilisées, et les souris jamais entrées en protocole sont utilisées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser ensemble ou indépendamment les paramètres de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse chez la souris porteuse de tumeur au niveau pharmacocinétique (PK) c’est à dire le devenir du candidat médicament dans le sang au cours du temps, pharmacodynamique (PD), son effet sur l’organisme, et de biodistribution (BioD), sa distribution dans l’organisme. Ces composés, développés dans le cadre de thérapies ciblées anticancéreuses pour l’Homme, nécessitent une évaluation complète de leur comportement in vivo afin d’optimiser les futures études d’efficacité et de tolérance. L’étude PK sera réalisée selon une méthode d’échantillonnage conventionnel ou la méthode de micro-échantillonnage, avec des volumes de sang total prélevés concordants avec une limite réglementaire de 7.5 % du volume sanguin total par semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes. Des prélèvements d’organes et de tumeurs pourront également être effectués à différents temps post-administration afin d’étudier la biodistribution du composé et leur impact sur les tissus (PD). Ces données permettront de déterminer la répartition tissulaire du composé, d’identifier les éventuels organes cibles ou de stockage, et de corréler ces observations avec les effets pharmacodynamiques observés. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), la stratégie d’échantillonnage (PK) ainsi que les groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) (PD/BioD) seront optimisés. Cela permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe cinétique et des données de biodistribution et de pharmacodynamie à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer ensemble ou indépendamment des données précliniques de pharmacocinétiques, de biodistribution tissulaire et d’activité pharmacodynamiques de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse. Les résultats attendus permettront d’identifier les profils d’exposition systémique, la répartition dans les tissus cibles, ainsi que les effets biologiques induits par ces composés dans les organes sains et les tumeurs. L’intégration potentielle de ces trois paramètres dans une même étude permettrait une compréhension globale et rigoureuse du comportement in vivo de ces candidats, permettant (1) de continuer d’en optimiser les propriétés (2) d’orienter la sélection de composés ayant la meilleure fenêtre thérapeutique et (3) d’anticiper/optimiser les schémas posologiques (dose, fréquence, voie d’administration). En intégrant des approches de réduction du nombre d’animaux (via le suivi longitudinal sur un même individu et l’utilisation ciblée de groupes satellites), ce projet s’inscrit pleinement dans une démarche éthique et scientifique rigoureuse. À terme, les données générées contribueront à accélérer le développement de thérapies ciblées innovantes contre le cancer, avec un fort potentiel de transposition vers l’Homme grâce à la pertinence translationnelle du modèle utilisé.
Procédures
# Greffe tumorale sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Prise de mesure des tumeurs sur souris vigiles minimum deux fois par semaine et quotidiennement en cas d’approche des points limites (2-3 minutes), # Injection des composés sur souris vigile (1-3 minutes_maximum 3 fois) # Un prélèvement sanguin intermédiaire sur souris vigile (2-3 minutes_plusieurs fois), # Un prélèvement de sang terminal sur souris sous anesthésie et analgésie générale sans réveil (2-5 minutes_ 1 fois).
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie fixe ou gazeuse. # Les animaux vigiles subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale, (2) de l’injection des composés et (3) de prélèvements sanguins intermédiaires. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs minutes lors d’un prélèvement de sang terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, sous anesthésie et analgésie générale sans réveil. »
Devenir
Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation#50826 avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Remplacement
S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et de distribution, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle de souris.
Réduction
Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3Rs. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux par groupe (4 à 5) a été défini sur la base d’une analyse de puissance statistique, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. Dans les cas où des prélèvements tissulaires seront nécessaires pour les analyses de biodistribution et de pharmacodynamie, des groupes satellites pourront être utilisés de manière ciblée, uniquement aux temps les plus pertinents, et en nombre restreint. Cette approche permettra de limiter les duplications inutiles tout en assurant la qualité des données biologiques collectées. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, bâtons à ronger…). Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscrits afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de celluloses et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’environ une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Cette surveillance sera renforcée à l’approche des points limites. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogènes, mieux vascularisées et de limiter les nécroses tumorales. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Ainsi les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Il est à noter que le phénotype «immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).
Choix des espèces
#Les études pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et de distribution nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). De plus, les souris immunocompétentes ou immunodéprimées sont des espèces pertinentes pour la greffe de tumeurs murines ou humaines. Enfin, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. #Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’Etablissement Utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte.