Recherche fondamentale

1 450 souris vont être utilisées, chacune opérée d'un œil sous anesthésie générale pendant trente minutes, puis soumise jusqu'à neuf séances d'imagerie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées à l'issue pour prélèvements. L'opération vise à reproduire une blessure de la cornée, avec pour effet attendu l'opacification de cet œil et une baisse de l'acuité visuelle, le second œil servant de témoin. Le porteur annonce des thérapies pour des pathologies oculaires mal prises en charge, alors que l'étape en jeu ici consiste à vérifier si des vésicules issues de cellules souches modifiées atteignent la cornée et en limitent les cicatrices.

Objectifs

L’objectif central de ce projet est le développement de thérapies pour l’œil. Physiologiquement, les cellules de la cornée assurent le maintien de sa transparence et participent à la préservation de la surface oculaire. Dans certaines maladies de la cornée (qu’elles soient génétiques ou inflammatoires) ou dans les cas de blessures cornéennes, ces cellules ne remplissent pas leur rôle ou peuvent être complètement détruites, ce qui entraine une opacification de la cornée et une perte – partielle ou totale – de la vision. Pour remplacer ces cellules détruites ou pathologiques, nous souhaitons évaluer le potentiel régénératif de cellules souches génétiquement modifiées et de dérivés de ces cellules (qu'on appelle vésicules), que ce soit pour le traitement de cicatrices cornéennes ou la préservation de la surface oculaire pathologique. Plus précisément, nous souhaitons valider la capacité des vésicules issues cellules souches modifiées génétiquement à (i) intégrer la structure de la cornée, (ii) limiter ou traiter les cicatrices cornéennes et (iii) évaluer leur capacité à restaurer un profil génétique normal dans un modèle d’atteinte de la surface oculaire. L’un des avantages d’une thérapie basée sur les vésicules par rapport à la thérapie cellulaire est que les vésicules peuvent être utilisées comme un médicament standard et ne présentent pas de risque de rejet. Afin de mettre à bien ce projet, nous aurons recours au modèle murin. La souris est en effet un modèle particulièrement adapté aux études des pathologies oculaires liées à la cornée. Malgré sa petite taille, la souris est proche de l'homme sur le plan de la physiopathologie des affections cornéennes, de la formation de cicatrices cornéennes ainsi que du renouvellement des cellules de la surface oculaire.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet de recherche est d’établir la possibilité de stabiliser, voire restaurer la transparence cornéenne dans un contexte pathologique. Le bénéfice de mettre en évidence la potentialité thérapeutique de nos particules génétiquement modifiées est multiple ; il permettra d’améliorer d’une part la description et compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la régénération cornéenne et d’envisager de nouvelles voies thérapeutiques pour des pathologies oculaires non ou mal prises en charge. Il s’agit d’une problématique de grande importance : en effet, on estime que les plaies de cornée représentent environ 7 à 14 pourcents des blessures traumatiques oculaires vues en unité d’urgence ophtalmologique.

Procédures

La chirurgie de l’œil sera réalisée une unique fois sur chacun des animaux sous anesthésie générale. La durée moyenne de l’intervention est d’environ 30 minutes (valable pour l’ensemble des animaux qui seront inclus dans le projet). Outre l’anesthésie générale, une anesthésie locale sous forme de goutte sera appliquée sur l’œil étudié et, en fin de chirurgie, des analgésiques seront administrés à l’animal. Les imageries seront réalisées sur tous les animaux. Le temps moyen d’une imagerie se situe entre 5 et 20 minutes. Les imageries d’une partie des animaux seront réalisées immédiatement après la chirurgie, puis à 24h et 48h, et enfin à 1, 2 et 4 semaines, soit au maximum 6 fois/animal et pour le restant des animaux avec d’autres techniques d’imageries 2 fois par jour les trois premiers jours suivant la chirurgie, puis à 1, 2 et 4 semaines ; soit au maximum 9 fois/animal (valable pour l’ensemble des animaux qui seront inclus dans le projet). Le traitement (à base de cellules ou de vésicules) est applicable localement, typiquement sous forme de gel ou de collyre. En gel, le traitement sera appliqué une unique fois suite à la chirurgie. En collyre, le traitement sera appliqué 2 fois par jours les 3 premiers jours puis une unique fois à 1 semaine puis 2 semaines. Le temps d’une application de collyre est inférieur à 1 minute, celui du gel autour de 5 min (durée typique de polymérisation du gel). (Valable pour l’ensemble des animaux qui seront inclus dans le projet). En fin de procédure, les animaux seront systématiquement euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des prélèvements pour analyse.

Impact sur les animaux

Le modèle étant celui d’une blessure cornéenne, il est attendu des nuisances similaires à celles de la pathologie humaine, à savoir une opacification de la cornée, entraînant sur cet œil une baisse de l’acuité visuelle. Les anesthésies générales gazeuses, ou fixes pour les expérimentations le nécessitant, peuvent générer un court stress à l’endormissement. Pour les anesthésies fixes, les animaux recevront une unique injection au niveau de l’abdomen ; cette injection peut générer une légère douleur au moment de l’introduction de l’aiguille. Il existe un risque très léger de péritonite en cas d’injections répétées. De plus, l’anesthésie peut entraîner un risque d’hypothermie ou, dans de très rares cas, un risque de décès. A la suite de la chirurgie, il peut arriver que les animaux ressentent transitoirement de légères démangeaisons au niveau de l’œil.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront euthanasiés immédiatement après la dernière session d’imagerie et des prélèvements seront systématiquement effectués pour des analyses post-mortem complémentaires.

Remplacement

En parallèle, des études in vitro sur des modèles cellulaires cornéens sont actuellement en cours : nous avons déjà mis en évidence que les cellules cornéennes étaient capables de capter correctement les vésicules et leur contenu. Toujours in vitro, nous avons également montré le bénéfice thérapeutique des vésicules (en particulier, leur activité cicatrisante et anti-fibrotique). Cependant, la complexité de la cornée et, a fortiori, sa régénération ne peut être complètement récapitulée in vitro. Il n’existe en effet pas à ce jour de modèles capables de reproduire l’ensemble des structures complexes cornéennes. Ainsi, afin de pouvoir prendre en compte la globalité des mécanismes de régénération (entre autres, les interactions cellules-cellules, la réponse immunitaire, etc.) et d’établir les mécanismes biologiques de cicatrisation impliqués, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. De plus, la finalité de cette étude étant le développement de stratégies thérapeutiques, la mise en place des voies d’administration adéquates des composés et leur biodisponibilité ne peuvent être seulement étudiées sur un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et de pouvoir répondre à la question scientifique posée, tout en tenant compte de la volonté de limiter au maximum le nombre requis. Ce projet impliquera au maximum un total de 1450 souris. Le nombre d’animaux a été estimé à l’aide d’un logiciel statistique adapté. Toutes nos expériences seront analysées grâce à des logiciels statistiques dédiés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages avec un enrichissement tel qu’un tunnel en carton, des bâtons en bois, du coton,), avec nourriture et eau à volonté. Le nombre d'animaux par cage est limité à 5. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Un seul œil sera traité durant l’expérimentation. Le second œil sera systématiquement utilisé comme contrôle de référence. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être. Toute modification physique/comportementale anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux. L’application de l’échelle décisionnelle définie par notre Structure Chargée du Bien-Etre des Animaux permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement anti-douleur, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. De plus, afin de limiter tout stress et toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement adapté aux pathologies liées à la cornée. Malgré sa petite taille, la souris est proche de l'homme sur le plan de la physiopathologie et des affections de la cornée mais également sur la formation des cicatrices cornéennes. De plus, il existe déjà un modèle murin de la pathologie ayant montré d’importantes similitudes physiopathologiques avec l’homme lors d’études histologiques préalables de leurs cornées. Au sein de notre équipe, nous possédons une bonne connaissance du comportement des souris et sommes donc aptes à juger de leur bien-être. La structure dans laquelle nous travaillerons est une structure possédant tout l’équipement spécifique pour réaliser l’imagerie de l’œil des souris. Les expérimentations se dérouleront sur des souris adultes (6-8 semaines) car il s’agit d’une période optimale pour la fonction cornéenne et sa régénération. De plus, à partir de 6 semaines, le tissu cornéen est mature et la taille de la cornée maximale.

Anesthésiées, saignées jusqu'à cinq fois, opérées pendant une heure pour interrompre puis rétablir la circulation sanguine dans un rein, 360 des 480 souris de ce projet subissent une ischémie-reperfusion rénale. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les douleurs postopératoires peuvent se manifester pendant environ 72 heures et annonce des antalgiques. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes, ensuite placés dans une banque mutualisée avec d'autres projets.

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque un manque d'oxygénation et des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la transplantation. Il est donc primordial de développer des stratégies thérapeutiques afin de limiter ces lésions. Des travaux précédents ont montré que la régulation de certaines molécules énergétiques appelées métabolites permettrait de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. Ce projet cherche à mieux comprendre comment certains métabolites et les transporteurs qui les font circuler, protègent les reins de souris contre les dommages causés par un manque temporaire de circulation sanguine et donc d’oxygènation.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par les transporteurs de métabolites afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion rénales. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le coeur, le pancréas. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Tous les actes décrits se feront sous anesthésie. Tous les animaux (480) subiront au maximum 5 prélèvements de sang (durée de moins de 1 minute) et 1 injection (durée de moins de 1 minute) ou 1 chirurgie (durée de moins de 15 minutes) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'au moins 2 jours. Une partie des animaux (360) aura en plus une chirurgie d'une durée de 1 heure pour provoquer une ischémie-reperfusion et auront un maximum de 2 injections (durée de moins de 1 minute) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un stress transitoire peu intense et un léger inconfort au réveil d'une quinzaine de minutes. Suite au prélèvement sanguin sous anesthésie, un stress de moins de 5 minutes peut être observé chez l'animal. Suite à la chirurgie sous anesthésie générale, les douleurs, qui peuvent se manifester pendant environ 72 heures, seront minorées par l'utilisation d'antalgiques. De plus, après chirurgie, peuvent être observées une légère perte de poids, une fatigue et une légère perte d'activité qui disparaissent sous 72 heures. Les prises de sang répétées sous anesthésie (acte de moins de 2 minutes) peuvent induire des douleurs qui peuvent se manifester pendant moins de 4 heures, ces douleurs seront minorées par l'utilisation d'antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédures. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie rénale. Il est donc nécessaire d’évaluer sur un organisme entier, en utilisant un modèle animal, l'impact d'une réponse systémique suite à une séquence d’ischémie-reperfusion.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude nécessitant des reins matures notamment au niveau du réseau de vaisseaux sanguins.

Six heures quarante de tests comportementaux étalés sur un mois, puis dix jours de restriction alimentaire en cage individuelle : 1 911 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant 45 minutes pour modifier, chez leurs embryons, l'expression d'un gène associé à la schizophrénie dans le cortex frontal. Le porteur reconnaît que l'isolement social peut provoquer un stress modéré, une baisse de l'activité exploratoire et une apathie légère, et propose de le compenser par une roue d'activité et des bâtons à ronger. Il justifie le choix de la souris par la conservation des grandes étapes du développement cérébral entre souris et humain, pour une pathologie qu'il définit lui-même par des idées délirantes, un retrait social et des difficultés de planification.

Objectifs

Des études récentes montrent que les mutations de certains gènes augmentent considérablement le risque de schizophrénie, une pathologie invalidante qui touche environ un pour cent de la population adulte et se caractérise notamment par des idées délirantes, un retrait social, des difficultés de concentration et de planification. L’ensemble de ces symptômes de la schizophrénie sont mal traités par les médicaments actuellement disponibles, et les effets secondaires de ces traitements sont importants. L’impératif de trouver des traitements efficaces implique de mieux comprendre les fondements neurobiologiques de la schizophrénie. Bien que rares, les mutations génétiques qui confèrent un risque fortement accru de développer la schizophrénie permettent d’identifier des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la pathologie.

Bénéfices attendus

La schizophrénie est une pathologie courante (500 000 à 600 000 patients en France) et très invalidante. Les traitements pharmacologiques de la schizophrénie traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Les grandes classes d’antipsychotiques et leurs modes d’action ont très peu évolué au cours des 50 dernières années. Le manque de progrès dans le développement thérapeutique est en grande partie une conséquence de notre compréhension limitée des troubles moléculaires sous-jacents. Très récemment, des mutations rares mais pénétrantes (qui augmentent très fortement le disque de la pathologie) dans certains gènes spécifiques ont été identifiées. Ces mutations sont très informatives car 1) elles ciblent un gène donné et 2) elles peuvent être modélisées chez l’animal. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en modifiant l’expression d’un gène impliqué dans la schizophrénie dans les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont pertinents pour comprendre les mécanismes de la schizophrénie, et possiblement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

1) Femelles gestantes : chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur). Injection d’un composé par voie intrapéritonéale (5 minutes) 2) Souris transgéniques ou issues d’embryons modifiés génétiquement : Tests de comportement (6h40 en tout, répartis sur un mois). Pour le dernier test de comportement (1h48 minutes répartis sur 9 jours), les souris seront soumises à une restriction alimentaire modérée de 10 jours au total, commençant la veille du test, pour les inciter à aller chercher une récompense sous forme de nourriture. Une euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

La perte d’expression du gène étudié par modification de gène au stade embryonnaire sera localisée uniquement dans le cerveau au niveau du cortex frontal. De ce fait, les changement du comportement liés à la perte d’expression devraient affecter sélectivement des comportements dépendants du cortex frontal (mémoire de travail, mémoire sociale). Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. La chirurgie peut induire un risque infectieux et de douleur associée à l’infection. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire. L’injection intrapéritonéale implique une contention et donc un stress momentané. Un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test des différents tests de comportements est attendu. Les souris sont placées en hébergement individuel durant la période de restriction alimentaire modérée destinée à inciter les souris à chercher une récompense lors d’un test de comportement. Cet isolement social pourrait entraîner un stress modéré, associé à des comportements comme une diminution de l’activité exploratoire ou une légère apathie. La restriction alimentaire peut entraîner une sensation de faim.

Devenir

Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie psychiatrique, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, notre étude de l'impact de la diminution d’expression d’un gène associé à la schizophrénie sur le fonctionnement du cortex nécessite d'utiliser des animaux pour pouvoir tirer des conclusions comportementales. Pour ces raisons, seule l’utilisation d’animaux permet d’aborder les mécanismes de régulation des fonctions corticales dans le cadre de cette étude. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la schizophrénie) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. En tout 1911 souris seront inclues dans le projet.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. La restriction contrôlée de nourriture chez certains animaux, destinée à accroître leur motivation pour effectuer un test comportemental, sera compensée par un environnement enrichi (fourniture de roue d’activité et de bâtons à ronger).

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale générée à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal prénatal sont des embryons à un stade de développement embryonnaire qui permet d’étudier à la fois les conséquences de la modification d’expression du gène étudié sur la prolifération et sur la migration des neurones immatures. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal posnatal sont des souris juvéniles (15 à 25 jours) ou jeunes adultes (60 à 100 jours).

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de leur procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections à l'état vigile de molécules toxiques pour les reins, subissent des recueils d'urine avec pression manuelle sur la vessie, deux anesthésies gazeuses à deux heures d'intervalle pour poser puis retirer un capteur de fluorescence sur le dos, une chirurgie avec pose de clamps pour certaines, et un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que l'insuffisance rénale induite entraîne une altération de l'état général, une prostration liée à une fatigue importante et une perte de poids, et qu'une lignée génétiquement modifiée plus sensible aux infections est employée. Il justifie le projet par le coût des maladies rénales, "approchant les 4 milliards par an", et par l'absence de thérapie ciblée, quand la molécule testée est déjà disponible dans le commerce et déjà utilisée en essais cliniques.

Objectifs

Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Des récents travaux ont montré qu’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) ainsi que sa voie de signalisation, favorisaient l'intégrité et la survie des cellules rénales, limitant ainsi l'issue de l'agression initiale. Par conséquent, nous pensons qu’un agent qui va activer cette voie de signalisation (nouvelle molécule testée dans ce projet) pourrait être bénéfique pour limiter l’impact des maladies rénales. L’interleukine ciblée et la nouvelle molécule sont disponibles dans le commerce et déjà utilisés dans des essais cliniques. Ces molécules ont déjà été testées dans deux types murins de maladies rénales qui ciblent les mêmes cellules (glomérules) mais elles n’ont pas eu le même effet bénéfique dans les deux modèles, pour des raisons encore inconnues. Les trois objectifs de ce projet sont : (1) Comprendre pourquoi la molécule à tester est protectrice dans un type de maladie glomérulaire chez la souris, mais pas dans un autre ? (2) Caractériser les effets de la molécule dans des modèles murins ciblant d’autres cellules rénales que les glomérules. (3) Optimiser l'administration de la molécule dans des modèles expérimentaux murins qui ciblent différents types de cellules rénales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie glomérulaire conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie glomérulaire vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées dans les maladies glomérulaires rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.

Procédures

(1) Injections : Une grande partie des animaux recevra de 1 à 3 injections de la molécule à tester. Cette injection est réalisée à l’état vigile et dure 10 secondes. L’induction des modèles expérimentaux nécessite, soit des injections sous anesthésie gazeuse (de 1 à 3 injections, durée 30 secondes), soit des injections à l’état vigile (maximum 9 injections, durée 10 secondes). (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux , sous anesthésie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Contentions particulières : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (Durée 2 secondes par pesée) (4) Mesure de la fonction rénale : une grande partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : Une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) L’utilisation d’un modèle de souris génétiquement modifiée plus sensible aux infections. (2) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et plus rarement une infection. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : Prise de poids en raison de présence d’ascite ou au contraire dénutrition. L'induction d'une insuffisance rénale liée à ces molécules entraine une altération de l'état général, une prostration liée à une importante fatigue et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure transcutanée de la fonction rénale et le prélèvement de sang terminal (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Tous les animaux (520) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

(1) Raffinement de l'hébergement et surveillance : les animaux sont acclimatés dans l'animalerie 1 à 2 semaines avant la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée quotidienne pendant toute la durée des protocoles. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour la lignée de souris plus sensibles aux infections : les équipements de protection individuelle sont changés plus fréquemment et tout le matériel d’élevage est stérilisé. (3) Raffinement pour les injections : toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Le volume d'injection est règlementaire. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection et un gel ophtalmique est appliqué après pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie (Clampage du rein) : pour assurer le bien-être pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une analgésie et d’une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments sont stérilisés.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre huit et dix semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, condition posée par le laboratoire pour qu'elles acceptent des tumeurs humaines. 816 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'étude des tissus tumoraux. Chacune reçoit une injection sous anesthésie locale, puis une contention manuelle de trente secondes à une minute pour mesurer la tumeur au pied à coulisse, ou une anesthésie générale d'imagerie d'au plus vingt minutes, une à deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur reconnaît que la tumeur implantée dans le flanc provoque une douleur et une gêne mécanique modérées et que des métastases peuvent apparaître, et annonce des "points limites précoces" strictement appliqués sans dire lesquels.

Objectifs

Le mélanome cutané est une tumeur maligne de la peau résultant de la transformation de mélanocytes spécialisées dans la production de la mélanine. Les cas pédiatriques de ce cancer sont très rares dans les pays européens, avec un taux d’incidence impliquant moins de 1 sur 100000 personnes par an, mais dont l’incidence augmente depuis plus de 20 ans, en relation avec une exposition au soleil non protégée. En général, les cancers à apparition précoce sont le signe d’une prédisposition génétique. Cependant, les patients qui ont développé un mélanome avant l’âge de 18 ans n’ont pas montré de mutations dans les gènes prédisposant au mélanome de l’adulte. Ainsi, pour déterminer l’origine génétique de ces mélanomes pédiatriques nous avons utilisé des technologies de séquençage à très haut débit de 55 trios, composés des deux parents sains et de l’enfant atteint d’un cancer de la peau, et de 6 tumeurs congelées. L’analyse de ces trios nous a permis d’identifier plus de 27 gènes porteurs de mutations de novo, c’est-à-dire présentent que chez l’enfant malade et absentes chez les parents sains. Ensuite, nous avons réalisé des expériences sur cellules, qui nous ont permis de réduire le nombre de gènes à étudier à 5, dont 3 gènes connus pour être impliqués dans des voies de régulations dperintents, ainsi que les deux gènes connus dans des voies de régulation de la prolifération et du métabolisme. Ces expériences in vitro ont été réalisées dans différentes lignées cellulaires, soit des lignées de mélanocytes pré-transformées pour étudier la capacité de ces mutations à transformer des cellules saines en malignes, soit des lignées de mélanome possédant des caractéristiques d’invasion et de prolifération contraire, afin d’étudier la capacité de ces mutations à favoriser des stades tardifs de la transformation tumorale. Maintenant,il est indispensable de confirmer les effets obtenus in vitro dans un modèle animal vivant de souris immunodéficientes car ce modèle permet l’implantation de tumeurs humaines avec une bonne efficacité. Ce projet a donc pour but de confirmer et d’étudier l’implication de ces mutations et de ces gènes dans le développement tumoral et la formation des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer l'implication de ces variants identifiés en clinique chez de jeunes patients dans le processus de cancérogenèse. La découverte de gènes impliqués dans la survenue des mélanomes pédiatriques permettra également d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la croissance et la diffusion de ces cellules tumorales. La prise en charge des patients pourra également être améliorée en identifiant de nouveaux marqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Certains animaux auront une injection sous anesthésie locale pendant 1 min, une contention à la main pendant 30 secondes à 1 minute pour mesurer à l’aide d’un pied à coulisse la taille de la tumeur. D'autres auront une injection sous anesthésie locale pendant 1 min ainsi qu'une anesthésie générale pour imagerie, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant 12 semaines.

Impact sur les animaux

La tumeur située dans le flan de la souris peut occasionner une une douleur et une gêne mécanique modérées. L'apparition de métastases peut entraîner potentiellement des symptômes cliniques modérés liés à la localisation de ces métastases, qui seront de petite taille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour études au laboratoire sur les tissus tumoraux.

Remplacement

Les modèles cellulaires subsitutifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, hormones…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement tumoral ou des métastases du mélanome dans les organes distants.

Réduction

Nous avons pu identifier 27 gènes pouvant jouer un rôle dans l’émergence de tumeur ou de métastases. Grâce à des analyses bio-informatiques des données de patients et des expériences in vitro, nous avons réduit ce nombre à 5. Enfin, le nombre d'animaux a été réduit au minimum et déterminé grâce à une étude statistique permettant une interprétation précise et significative des résultats.

Raffinement

Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours par les membres responsables du projet, tout comportement anormal sera évalué selon la grille de score de douleur établie et les points limites seront strictement appliqués. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Si une perte de poids d'environ 10% par rapport au poids initial est observé,un aliment appétent et énergétique sera ajouté dans la cage. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur sera administré et un enrichissement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Les souris seront anesthésiées lors des différentes procédures. Des points limites précoces ont été définis et seront strctement appliqués.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux de notre laboratoire sont exclusivement développés sur la souris immunodéficiente qui est un modèle de référence en oncologie préclinique et qui peut recevoir des tumeurs humaines. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines. En effet le développement de la souris entraine des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression de certains gènes et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris.

Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Un agent qui détruit les cellules souches de la moelle osseuse est injecté à des souris vigiles, ce que le porteur décrit comme "une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures", avant la greffe de cellules souches sanguines humaines. 45 000 souris immunodéprimées vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les nouveau-nés étant anesthésiés par hypothermie sur glace jusqu'à dix minutes, avec en plus des injections de plasmides pouvant provoquer des troubles cardio-respiratoires, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant plusieurs semaines, des prélèvements sanguins répétés et des chirurgies. 36 000 d'entre elles seront tuées et 9 000 transférées vers d'autres projets ou vers une formation interne aux gestes techniques, celles dont le taux d'humanisation reste sous 25 %. Le porteur écrit que le nombre d'animaux "sera réduit au maximum" et, dans la même rubrique, qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée", l'effectif ayant été estimé d'après les années antérieures "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs dérivées chez des souris immunodéprimées, et ainsi permettre la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel (ou représentatif d’une pathologie particulière) et pouvant être modifié par traitement, en vue d’essais préclinique chez la souris.

Bénéfices attendus

En greffant des cellules souches humaines, ou leurs dérivées, à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un modèle d’étude spécifique qui peut jouer un rôle essentiel dans la compréhension et le traitement de pathologies d’importance, comme certaines infections virales (virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou hépatites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. L’anesthésie des nouveau-nés sera réalisée par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. L’humanisation inclura l’administration d’un agent, détruisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d’une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-nés sous anesthésie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes à quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour l’implantation de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera moins de cinq minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection de l’agent myéloablatif : induit une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. La manipulation chez le nouveau-né pourrait engendrer le rejet de la mère. Afin d’éviter cela, des éléments sont décrits dans la procédure expérimentale. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Le processus d’humanisation pourra être accompagné d’une phase de modulation ou de renforcement in vivo du système immunitaire humain en fonction des objectifs expérimentaux. Cette étape vise à préparer les animaux aux études précliniques envisagées en optimisant la réponse immunitaire du modèle humanisé. Les animaux n’étant pas jugés comme aptes à entrer en étude préclinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasiés. C’est-à-dire les animaux avec un état de santé jugé moyen et/ou avis vétérinaire défavorable. Dans le cadre d’une utilisation continue, pour réaliser les études précliniques, les animaux pourront être intégrés aux autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Les animaux concernés seront ceux ayant un taux d’humanisation < 25%. Un nouveau-né mal humanisé pourra être nouvellement humanisé en étant plus âgé. La décision est prise par le vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Dans le cadre d’une utilisation continue, les souris humanisées seront impliquées dans des études de recherches précliniques impliquants le système immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 45 000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 720 études précliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succès de l’humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

Les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus à partir du sevrage. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (dietgel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement etc) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération est observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire notamment buprénorphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisagé toutes les 4–6h selon l’évaluation. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8 mL/kg. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée, ou tout score clinique dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des humains : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Depuis de nombreuses années, l'entreprise développe une expertise dans l’humanisation du système immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette expérience, il est pertinent de poursuivre le processus d’humanisation sur cette même espèce. La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés La procédure expérimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-nés jusqu'à [MODIFICATION] jusqu'à l'âge de 3,5 - 4,5 semaines, car leur immunité immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du système immunitaire humain. À cet âge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice à la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un modèle plus fonctionnel et reproductible.