Recherche fondamentale

7 624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés reçoivent une injection sous-cutanée dans leur première semaine de vie, les adultes et les femelles gestantes un gavage de tamoxifène, et une chirurgie terminale sous anesthésie peut être pratiquée dès le septième jour après la naissance pour vider le cerveau de son sang. Le porteur reconnaît que le gavage des femelles gestantes peut provoquer des mises bas prématurées ou difficiles et affecter les embryons, et que les souris du modèle Alzheimer développent à partir de neuf mois pertes de mémoire, apathie et comportements sociaux anormaux. Il affirme que ces phénomènes "ne peuvent pas du tout être modélisés in vitro ou in silico" du fait de la complexité des interactions avec l'"organisme entier", sans indiquer comment un calcul de puissance aboutit à 7 624 animaux.

Objectifs

​​La maturation du cerveau comprenant les processus de myélinisation, différenciation des neurones et mise en place des circuits cérébraux implique des processus complexes et des populations spécifiques de cellules liées au développement. Au cours des 10 dernières années, une grande diversité de cellules a été décrite par différentes techniques de bilogie moléculaire à haut débit et a mis en lumière une sous population de microglie spécifique qui joue un rôle clé pendant le développement pré- et post-natal. Cette microglie partage des caractéristiques communes avec la microglie spécifique de maladie présente dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer (AD). Cependant, le degré de similitude/divergence de ces états, le fait qu'ils agissent via des voies communes pour exercer des fonctions protectrices dans des contextes différents et le fait qu'ils soient transitoires ou liés à l'ontogénèse restent largement à élucider. Pour mieux comprendre le rôle des macrophages cérébraux, dans les pathologies telles qu'Alzheimer, nous utiliserons des approches génétiques et pharmacologiques afin de perturber les microglies et leurs fonctions au cours du développement embryonnaire et post-natal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale a pour objectif de déchiffrer les dynamiques cellulaires de macrophages cérébraux, leur induction et leurs rôle dans les cerveaux en developpement et dans les cerveaux en vieillissement et neurodégénératifs. En étudiant avec des techniques et modèles murins innovants ces cellules à plusieurs stades : pré-natal, post-natal et adulte, nous pourrons apporter une vision cinétique et comparer les états des cellules de microglie jeunes et pathologiques. L’étude des deux sexes en parallèle permettra de donner des indications sur le caractère sexe spécifique. Les états et les fonctions des macrophages cérébraux sont généralement étudiés en parallèle, soit au cours du développement, soit dans les maladies neurodégénératives. Ce projet vise ainsi à mettre en place un pont entre ces périodes et comparer les rôles fonctionnels des cellules de microglie jeunes et pathologiques et notamment des deux principaux facteurs qu'ils produisent, afin d'identifier les facteurs et les voies qui induisent ces états et le lien ontogénétique potentiel entre eux. In fine, cela permettra d’ouvrir la voie à à des stratégies thérapeutiques très innovantes des maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer en exploitant les propriétés neuroprotectrices de la microglie.

Procédures

Les animaux vigiles recevront une injection sous-cutanée lorsqu'ils sont en première semaine de vie ou un gavage à l'âge adulte (pour les mères gestantes afin d'observer l'effet sur les embryons et pour les souris de 2 et 12 mois). En fonction de leur stade et de l'analyse prévue, les animaux seront soumis à une analgésie suivie d'une anesthésie et enfin euthanasiés afin de prélever le cerveau. Uniquement en cas de besoin, une chirurgie terminale sera réalisée sur les animaux à partir de 7 jours post-natals, toujours sous l'effet de l'anesthésie générale avec analgésie, pour éliminer les cellules sanguines du cerveau.

Impact sur les animaux

La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et les nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire un stress pendant la contention, et une gêne légère et transitoire. Le modèle murin d’Alzheimer utilisé dans cette étude développant des comportements ressemblant à la maladie d’Alzheimer humaine, les symptômes peuvent nuire au bien-être global de l’animal. Ces souris développent des comportements de perte de mémoire, apathie et comportements sociaux aberrants à partir de 9 mois liés à la perte neuronale dans certaines zones du cerveaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer les analyses requises par le projet.

Remplacement

​L’étude des population microgliales au cours du développement et de la neurodégénérescence, de leur spécificité et de leur trajectoires nécessite l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance de l’activité cellulaire, comme la synthèse ou la dégradation de protéines. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle. Ces phénomènes ne peuvent pas du tout être modélisés in vitro ou in silico, du fait de la complexité des interactions des cellules étudiées avec l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle, Alzheimer, sexe, temps d'intêret), nous avons ainsi calculé et optimisé le nombres d'animaux nécessaires. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques telles que l'analyse de variance.

Raffinement

L'enrichissement sera augmenté pour les animaux vieillissants. Pour faciliter l'alimentation en cas de besoin, du Dietgel sera utilisé. Les manipulations (contention, gavage au tamoxifène, prélèvements, perfusion) seront effectuées par des personnes formées et compétentes. Les méthodes d'analgésie et d'anesthésie des animaux permettront de diminuer toute souffrance ou détresse liées aux manipulations. Des mesures de surveillance quotidienne sont mise en place par des personnes compétentes et formées. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions invasives seront faites sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des fonctions biologiques et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et organique. Elles sont également utilisées pour créer des modèles d’étude des pathologies humaines. La proximité génétique avec l’homme, combinée à la disponibilité d’un grand nombre de lignées génétiquement modifiées, fait du modèle murin un choix idéal pour répondre à nos questions scientifiques. Le court cycle de reproduction et la petite taille des souris facilitent leur maintien, tout en conservant une espèce relativement proche de l’homme en termes de développement. De plus, la période de gestation courte et le nombre important d’embryons permettent de générer un nombre suffisant d’animaux pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques​.

Greffées dans le cerveau de cellules de tumeurs cérébrales pédiatriques humaines au cours d'une chirurgie d'une dizaine de minutes, 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques ou génomiques. Certaines reçoivent en plus trois injections par semaine pendant quatre semaines, une prise de sang hebdomadaire pendant deux mois et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale. Le porteur indique que la tumeur, en grossissant, peut provoquer des troubles neurologiques, des difficultés à se déplacer, une perte d'équilibre et une perte de poids. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies contre des cancers du cerveau de l'enfant aujourd'hui sans traitement efficace, sont renvoyées au long terme et suspendues à la démonstration qu'un gène est bien requis à la survie des cellules tumorales.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales pédiatriques sont des maladies rares, graves et peu accessibles aux traitements actuels. Elles touchent des régions profondes du cerveau, rendant les interventions chirurgicales difficiles, et leur évolution est souvent rapide. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la croissance de ces tumeurs, en étudiant l’effet de certaines modifications génétiques dans des modèles expérimentaux. Pour cela, des cellules tumorales humaines seront greffées chez la souris afin de suivre leur développement et de tester de nouvelles stratégies de régulation de gènes.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à comprendre si certaines cellules cancéreuses du cerveau ont besoin d’un mécanisme particulier pour survivre. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui reproduit les tumeurs cérébrales observées chez l’enfant. Si ce mécanisme s’avère essentiel à la survie des cellules cancéreuses, cela pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements. À long terme, ces recherches pourraient aider à développer des thérapies innovantes pour des formes très graves de cancer du cerveau chez l’enfant, aujourd’hui encore sans solution efficace.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorale dans le cerveau. Il s'agit d'une chirurgie qui dure une dizaine de minutes au maximum pendant le quelle la souris est anesthésiée et analgésiée. Certaines souris recevront en plus trois injections par semaine pendant quatre semaines, durée 1 minute, anesthésie locale. Une prise de sang sera réalisée chaque semaine pendant deux mois (n=8) pour l’analyse du plasma. avec anesthésie locale. Finalement, lors du suivi de la en imagerie, les animaux sont anesthésiés (anesthésie générale), durée maximum de 10 min, nombre maximal de séances : 12.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux sont liés à la croissance de la tumeur et à la chirurgie. La chirurgie entraînera une douleur légère et transitoire cutanée au lieu de cicatrisation.. Lorsque la tumeur devient volumineuse, elle peut provoquer des problèmes neurologiques, comme des difficultés à se déplacer et une perte d’équilibre. Les animaux peuvent également moins s’alimenter, entraînant une perte de poids. Concernant l’administration d'un médicament d'induction, aucun effet secondaire toxique n’est attendu via la consommation volontaire de croquettes enrichies, comme le rapporte la littérature pour une exposition prolongée par ce mode d’administration Les injections sous anesthésie locale entraîneront une douleur légère et transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour des analyses histologiques ou génomiques.

Remplacement

Les tumeurs cérébrales se développent dans des régions profondes et centrales du cerveau. Elles ont la particularité de s’étendre progressivement, d’abord dans les structures proches, puis dans tout le cerveau au fur et à mesure que la maladie avance. Cette propagation est influencée par l’environnement des cellules tumorales, un phénomène complexe qui ne peut être étudié que dans des modèles vivants capables de reproduire ces interactions. L’un des principaux obstacles au traitement de ces tumeurs est la barrière hématoencéphalique, une protection naturelle qui limite l’accès des médicaments au cerveau. Pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, il est donc essentiel de disposer de modèles expérimentaux permettant d’évaluer ces traitements avant leur passage aux essais cliniques. Avant leur utilisation dans ce protocole, les modifications biologiques et les molécules ont été validées in vitro sur des cellules en culture. Toutefois, aucun autre modèle ne permettrait de reproduire avec autant de précision les défis posés par la barrière hématoencéphalique et les difficultés thérapeutiques qu’elle entraîne.

Réduction

Dans ce projet, nous avons appliqué le principe de réduction en utilisant le moins d’animaux possible, tout en assurant la fiabilité des résultats scientifiques. Pour cela, nous avons utilisé un logiciel de calcul statistique afin de déterminer précisément le nombre minimal d’animaux nécessaires pour répondre à nos questions de recherche. Ce calcul permet d’éviter les excès tout en garantissant que les résultats seront suffisamment solides pour être interprétés. Nous utilisons aussi une méthode d’imagerie qui permet de visualiser l’évolution des tumeurs de manière non invasive chez les animaux. Grâce à cette technique, nous pouvons suivre la progression du cancer sans multiplier les interventions, ce qui permet d’obtenir plus d’informations avec moins d’animaux. Enfin, des étapes de validation intermédiaires ont été intégrées dans le protocole : si une méthode ne fonctionne pas, nous l’ajustons avant de poursuivre, pour éviter d’utiliser des animaux inutilement.

Raffinement

Pour éviter toute douleur liée à la chirurgie, les animaux recevront un médicament antidouleur avant l’intervention. Une seconde dose pourra être administrée le lendemain si des signes de douleur apparaissent. L’opération sera réalisée sous anesthésie générale, pour que les animaux soient complètement endormis et ne ressentent rien. Pendant la chirurgie, leur température sera maintenue grâce à une plaque chauffante, et une injection de sérum physiologique leur sera donnée pour éviter la déshydratation. Un gel protecteur sera appliqué sur leurs yeux pour éviter qu’ils ne s’assèchent, et la zone opérée sera désinfectée pour prévenir toute infection. Après l’opération, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet, ce qui prend seulement quelques minutes. Ils seront ensuite replacés en groupe avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Leur état de santé sera suivi de près, avec une pesée deux fois par semaine, puis trois fois par semaine dès l’apparition des premiers symptômes. Ils vivront par groupe de cinq, dans un environnement confortable avec des abris en carton, des tunnels, des bâtons à ronger et du papier pour faire leur nid, afin qu’ils puissent exprimer leurs comportements naturels et réduire leur stress. Des points limites ont été définis pour garantir une prise en charge éthique et rapide en cas de signes de souffrance ou de détérioration de l’état de santé.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car ce sont les animaux les plus couramment employés pour étudier les cancers chez l’humain. Elles permettent de mieux comprendre comment les tumeurs se développent dans le cerveau et de tester des traitements dans un organisme vivant, ce qui n’est pas possible uniquement avec des cellules en laboratoire. Les greffes seront faites sur des souris jeunes adultes, âgées de 6 à 8 semaines. À cet âge, leur corps est suffisamment développé pour bien supporter les interventions, tout en permettant d’étudier correctement l’évolution des tumeurs.

Pour comprendre comment un transporteur intestinal du fructose influe sur la glycémie, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. Chaque animal reçoit trois gavages de glucose, une injection, jusqu'à six prélèvements sanguins et cinq coupures à l'extrémité de la queue, et subit deux jeûnes de quatre et six heures. Le porteur décrit ces gestes comme un stress de moins de vingt secondes et affirme que les jeûnes n'entraînent aucune hypoglycémie. Il justifie l'espèce par des lignées génétiquement modifiées disponibles uniquement chez la souris et par l'absence, selon lui, de tout modèle capable de simuler in vitro les interactions entre organes.

Objectifs

La régulation de la glycémie est placée sous le contrôle de l’insuline dont la sécrétion est fortement stimulée par le glucose lui-même et pas du tout par le fructose, lequel représente pourtant 50% des sucres consommés dans notre alimentation. Le fructose est structurellement proche du glucose mais est transporté, notamment au niveau de l’intestin, par un transporteur spécifique qui ne transporte que le fructose et est ensuite métabolisé par une enzyme également spécifique au fructose. Les souris dont ce transporteur ou cette enzyme ne sont pas présents, absorbent mal le fructose et présentent une modification de leur flore intestinale. De façon intéressante, elles présentent également une forte augmentation de leur glycémie et une diminution de l’insuline dans le sang. De plus, ces variations de glycémie ne sont pas les mêmes en fonction de leur alimentation. Ainsi, La découverte d’une nouvelle voie de régulation de la glycémie via ce transporteur et cette enzyme spécifique du fructose liée à l’alimentation, semble très importante à caractériser et c'est le but du projet proposé. Ce travail vise à déterminer chez des souris mâles et femelles qui absorbent mal le fructose, quel est l’effet de l’alimentation sur la régulation de la glycémie et quels sont les mécanismes impliqués via l’utilisation de différents régimes connus pour interagir avec la flore intestinale.

Bénéfices attendus

Les caractéristiques observées chez les souris dépourvues du transporteur du fructose et de l’enzyme responsable de sa métabolisation, à savoir une importante augmentation de la glycémie et une baisse du taux circulant d’insuline, reflètent ce qui est observé dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 représente environ 10% des cas de diabètes en France et dans le monde. Depuis une vingtaine d’années, le nombre de personnes atteintes de diabète de type 1 ne cesse d’augmenter (+ 3 à 4% /an). Les raisons de ces évolutions sont inexpliquées à ce jour, mais certaines modifications de l’environnement et leurs interactions avec le génome sont suspectées telles que les facteurs nutritionnels ou la modification de la flore intestinale. Bien que le fructose soit suspecté de conduire à la mise en place d’un diabète de type 2 (mise en place progressive de l’insulino-résistance) le rôle de son transporteur et de la principale enzyme de son métabolisme, dans la sécrétion de l’insuline et dans la régulation de la glycémie n’a jamais été étudié. Notre projet permettra possiblement d’identifier une nouvelle voie impliquée dans cette régulation et peut-être de mettre en évidence des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Les animaux vigiles recevront 3 gavages de glucose (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 1 injection (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 5 petites coupures à l’extrémité de la queue (intervention d’une durée inférieure à 1 seconde) et ils auront au maximum 6 prélèvements sanguins (intervention d’une durée inférieure à 20 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages, prélèvements et de l’injection (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à stress lors du passage de leur salle d’élevage à la salle d’expérimentation. Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements et lors de l’ injection. Les souris seront soumises à 2 périodes de jeûne (4 et 6h) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever et analyser certains tissus (pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro ou ex vivo permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans le contrôle de la glycémie d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des paramètres spécifiques à chaque souris (génétique, microbiote, alimentation) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie, insulinémie), des tissus producteurs d’hormones (pancréas), intestinaux (tissus permettant de stimuler la sécrétion d’insuline via la production de molécules de type hormonales) et impliqués dans le métabolisme des sucres (foie).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 10souris par groupe expérimental, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris ente 6 et 19 semaines et de n’effectuer les prélèvements finaux de tissus qu’à 19 semaines afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la contention avant le démarrage des gavages pour limier le stress lors de la procédure expérimentale. Les expérimentations étant effectuées dans une salle différente de la salle d’élevage les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation et maintenus dans leur cage d’élevage avec les mêmes congénères afin de réduire le stress. Les animaux seront surveillés visuellement 1 fois par semaine et leur poids mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques. De plus, les données préliminaires existantes ont été obtenues à partir de ces modèles animaux qui sont des modèles génétiques originaux disponibles uniquement chez les souris et surtout nécessaires pour décrypter le mécanisme posé ici (rôle du transporteur et du métabolisme du fructose dans la régulation de la glycémie). Il est désormais bien établi que la nutrition lors de la gestation et de l’allaitement, joue un rôle clé dans la programmation métabolique à long terme. Dans cette optique, l’alimentation durant les premières semaines de vie semble particulièrement déterminante dans l’établissement de la capacité à réguler la glycémie. Afin de clarifier l’impact de la nutrition au cours de cette période dite périnatale, nous comparerons les effets d’un apport en fibres et de la malabsorption du fructose sur la régulation de la glycémie, selon que ces interventions soient mises en place dès la naissance ou seulement à partir du sevrage. Nous avons choisi de travailler principalement sur des souris âgées de 6 semaines, car nos données préliminaires mettent en évidence des différences marquées au niveau de la glycémie et du taux d’insuline dans le sang à cet âge. Par ailleurs, afin d’évaluer la persistance ou non de ces différences au cours du temps, la mesure de la glycémie de ces mêmes animaux sera suivie et analysée également à 12 et 18 semaines d’âge.

Dix poulets de chair sont opérés à quinze jours sous anesthésie générale pour recevoir deux capteurs de température, l'un sous la peau, l'autre dans l'abdomen, et quatre-vingt-dix autres sont saignés trois fois en quinze jours. Au total 1 440 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposés à partir du vingt-quatrième jour à un coup de chaleur artificiel de cinq jours, entre 32 °C le jour et 25 °C la nuit. Le projet évalue une "programmation thermique embryonnaire" appliquée pendant l'incubation des œufs, sur une souche à croissance rapide retenue pour sa "représentativité des productions françaises actuelles" et pour répondre à "l'immédiateté de la demande terrain". Tous sont mis à mort à trente-six jours dans un abattoir commercial et leurs carcasses valorisées dans le circuit agroalimentaire, ce que le porteur présente comme l'âge classique d'abattage.

Objectifs

Le projet vise à évaluer dans une approche multicritère, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée dans différentes situations (durée de stockage des œufs, sexe), sur des poulets de chair exposés à de fortes chaleurs. Considérant les souches à croissance rapide, la souche ROSS 308 a été sélectionnée en raison de sa représentativité des productions françaises actuelles et ainsi répondre à l'immédiateté de la demande terrain. Il permettra i) d’éclairer la compréhension des mécanismes physiologiques ouvrant de nouvelles perspectives de recherche, ii) d’émettre des recommandations concrètes de mise en œuvre pour les couvoirs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de : Déterminer l'intérêt d'une programmation thermique embryonnaire sur les poulets de chair et son interaction avec le sexe des animaux et la durée de stockage des œufs. Développer un modèle thermodynamiquequi se concentrera sur la simulation des températures corporelle, sous-cutanée et de surface des plumes en fonction de la température ambiante, de l'humidité relative ambiante, du contenu énergétique théorique de l'aliment et de la dynamique de l'ingestion.  Une fois validé, ce modèle pourrait servir de substitut non invasif pour la température corporelle (et par conséquent les niveaux de stress thermique) sous diverses conditions environnementales.

Procédures

La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale (un sous cutané et un intrapéritonéal par poulet) à l’âge de 15 jours. Les animaux seront sous anesthésie générale dont le délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. Trois prises de sang seront réalisées sur un échantillon de poulets, tous les 5 jours durant 15 jours, avant, pendant et après le coup de chaleur. Concernant les prises de sang, elles durent quelques secondes par animal. L’application d’un coup de chaleur artificiel qui débutera 10 jours avant abattage pour une durée de 5 jours. Les températures oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). Les prises de sang au sinus occipital réalisées sur les poulets sont considérées comme une source de stress, notamment due à la contention nécessaire, et peuvent engendrer des hématomes. L’exposition aux fortes chaleurs peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles ainsi que des conséquences comportementales. L’élevage des animaux au sol en groupe sexé peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur.

Devenir

Tous les animaux élevés durant le projet seront mis à mort à 36 jours dans un abattoir commercial et leurs carcasses valorisées dans le circuit agroalimentaire classique. Les animaux auront atteint l’âge classique d’abattage en conditions commerciales ce qui permet la valorisation des carcasses.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Pour les effectifs, le nombre d’animaux par parquet a été défini pour respecter une densité de production comparable aux élevages commerciaux. Considérant les travaux antérieurs et la variabilité interindividuelle attendue pour nos critères d’intérêt, nous devons disposer de 240 animaux/lot pour les indicateurs de performances de croissance (poids vifs, Gain Moyen Quotidien). Du fait des installations, certaines mesures, comme la consommation alimentaire, peuvent être mesurés uniquement au parquet, c’est pourquoi nous disposons de 6 parquets/traitement. Pour garantir la robustesse des résultats pour l'évaluation des marqueurs sanguins de stress oxydatif, on estime les effectifs nécessaires à 15 poulets/lot (soit 90 poulets au total). Pour le suivi de la température corporelle des poulets, nous nous sommes appuyés sur des travaux antérieurs et sur la résolution des implants choisis. De plus, compte tenu de la faible variabilité interindividuelle de la température corporelle, le nombre de 5 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des effets significatifs sur la température des animaux. Seuls 2 lots seront suivis pour leur température corporelle soit un total de 10 poulets équipés d’implants (5 poulets x 2 lots). Les effets de la programmation thermique embryonnaire sur les critères mesurés seront analysés statistiquement.

Raffinement

Les poulets seront élevés dans des conditions standards dès l’éclosion à raison de 40 animaux par loge dans un bâtiment d‘élevage avec un contrôle automatique de la température, ventilation et lumière. Les animaux seront élevés au sol, sur copeaux et auront accès à l’aliment et à l’eau ad libitum. Cet élevage en groupe permet la proximité entre congénères et renforce les échanges auditifs, olfactifs et visuels entre les animaux, ainsi que les interactions positives. Ils seront visités deux fois par jour minimum, y compris pendant les week-ends et jours fériés et les manifestations de détresse ou de maladie seront prises en considération pour envisager le retrait des animaux (case infirmerie) ou leur euthanasie en cas d’atteinte des points limites. Le milieu de vie des poulets sera enrichi avec des chaînettes de couleur à picorer, et un perchoir sera mis à disposition des animaux dans chacune des cases dès leur arrivée dans le bâtiment à 1 jour.

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car il s'agit de l'espèce agronomique cible du projet. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux. L’opération se fera sur des animaux de 15 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant abattage (à l’âge où les animaux sont les plus sensibles au pic de température) de J24 à J28. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion l’âge classique d’abattage pour un élevage type standard à savoir 6 semaines (36 jours).

1 440 souris, chacune pesée chaque semaine, gavée ou injectée, saignée neuf fois à l'état vigile puis mise à jeun dix-huit heures avant un dernier prélèvement, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt semaines un régime riche en graisses ou en sucres destiné à leur faire développer une maladie du foie, puis des médicaments anti-inflammatoires dont l'équipe veut mesurer l'effet sur la fibrose. Toutes sont tuées à l'issue pour analyser leur foie. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier ces effets de manière intégrée et que les explorations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose du foie à la stéatose du foie inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose et le cancer. L'inflammation est un facteur clef de l'évolution de ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons tester des médicaments ayant un effet anti-inflammatoire. Lors de cette étude, des souris ayant développées ces maladies du foie par une alimentation riche en graisse et/ou en sucres seront traitées avec des médicaments et nous caractériserons l'évolution de ces maladies afin de voir les effets positifs de ces molécules et les voies impliquées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet est la potentielle mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire et anti-fibrosant d'une nouvelle molécule pharmacologique. Nous pourrons en plus de cette mise en évidence étudier les voies impliquées dans la protection d'un régime

Procédures

La contention, le gavage et les injections causent un stress et une douleur modérée et de courte durée pour les animaux. Les animaux auront des injections (durée 15 secondes) ou des gavages (durée 1 mn/souris) et seront pesés une fois par semaine (30 secondes/souris). Un prélèvement de sang sera effectué 9 fois et prendra 1 mn/souris. Ils seront soumis un changement de régime ainsi qu’à une mise à jeun de 18h avec un prélèvement de sang (1mn/souris). Tous les prélèvements sont effectuées sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

La contention, le gavage et les injections sont des sources de stress modéré pour les animaux. Les animaux seront soumis à des régulations nutritionnelles avec des changements de régime pendant 20 semaines pouvant induire un stress léger par une prise de poids avec possiblement une activité réduite . La mise à jeun peut entraîner un stress modéré aux souris.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'analyser l'effet des molécules sur le développement de la fibrose hépatique.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier de manière intégrée les effets de ces molécules sur l’inflammation et la fibrose. Par ailleurs, l'identification et la validation de ces cibles thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine ). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

La durée des régimes utilisés et les traitements relatifs aux tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et lors de la mise à jeun l'accès à l'eau est conservé. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés entraînant la mise à mort anticipée si nécessaire. En effet, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectuée.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons de souris adultes âgées de 10 à 30 semaines, car le métabolisme énergétique est régulé de manière différente chez les jeunes adultes et/ou pendant le vieillissement.

Une souris qui perd plus de 15 % de son poids ou dont la température corporelle chute de plus de quatre degrés est mise à mort, et aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne peut être administré, ces molécules faussant les réponses immunitaires étudiées. 490 souris vont être utilisées sur cette base, toutes tuées à l'issue pour analyse de leur système immunitaire et des atteintes d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un gavage, une injection, une infection bactérienne et deux prélèvements de sang sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur écrit en une phrase que "des tests statistiques stringents" ajustent le nombre d'animaux, sans donner le moindre détail pour ces 490 souris.

Objectifs

Les mitochondries, des organelles bioénergétiques fondamentales, émergent comme des régulateurs importants pour la mise en place des réponses immunitaires. En particulier, un enzyme liée au métabolisme cellulaire et localisée dans les mitochondries semble représenter un point critique de régulation par les mitochondries. Notre projet consiste à explorer et déterminer le rôle de cette enzyme dans a mise en place de réponses immunitaires antibactériennes. Afin de valider nos découvertes obtenues in vitro dans un environnement immunitiaire complexe, nous devons effectuer différentes analyses dans des modèles d’infections bactériennes chez le petit animal (souris).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, la description de nouveaux mécanismes immunitaires nouveaux liant métabolisme mitochondrial et régulation des réponses immunitaires. D’autre part, la description de ces mécanismes permettra le développement de nouveaux outils thérapeutiques dans les pathologies liées aux infections microbiennes.

Procédures

Sur l'ensemble de l'étude et pour chaque animal, il est prévu: un gavage (intervention de 1 minutes), une injection (intervention de 1 minute), deux prélèvements sur animaux anesthésiés (prise de sang, intervention de 3 minutes) suivis d'une injection (intervention de 1 minute) .

Impact sur les animaux

Les injections sur animal vigil peuvent entraîner une legère gène de courte durée. Les infections bactériennes peuvent également occasionner une gène pour l'animal. Une légère gène peut-être occasionée par l'anesthésie et le prélèvement sanguin.

Devenir

Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés afin de permettre d'une part une analyse détaillée du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que les atteintes d'organes.

Remplacement

La réponse immunitaire fait appel à une très grande variété de cellules immunitaires qui interagissent entre elles et avec les pathogènes. Il n'existe donc pas de modèle in vitro permettant d'évaluer globalement ces processus. Néanmoins, une large phase d'expérimentation in vitro nous permettra de diminuer au maximum le nombre d'animaux, notamment en ciblant nos expériences sur les souches bactériennes les plus pertinentes.

Réduction

Des tests statistiques stringents sont utilisés afin d'ajuster le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Le principe de raffinement décrit au second alinéa de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera pris en compte tout au long de la procédure expérimentale. Le bien-être animal sera évalué en utilisant des points limites décrits et gradés dans les procédures. Les souris seront hébergées dans des cages de 2 L, à raison de 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. Les injections intrapéritonéales seront effectuées selon les directives officielles du IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee). L'état des animaux sera évalué tout au long de leur vie selon une grille d'évaluation de l'état des animaux spécifique de l'animalerie, assez large pour détecter toute détresse ou stress. De plus, tout au long des procédures, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Il est admis que si l’animal perd plus de 15% du poids du corps ou si la température corporelle diminue de plus de 4 degrés, il doit être euthanasié. L'utilisation d'analgésiques ou de molécules anti-inflammatoires est impossible ici car ces molécules influencent les réponse immunitaires.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative pour l'objectif de ce projet (évaluation de la réponse anti-microbienne suite à une altération du métabolisme cellulaire via la déficience d'une enzyme ou de la dynamique mitochondriale). Un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculiare de notre objet d'étude n'existe pas. Il est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude, sans l'utilisation de lignée de souris (sources bibliographiques consultées). Le modèle souris est un modèle privilègié car il présente de grandes similarités avec l'homme, en particulier en ce qui concerne le système immunitaire. La littérature abondante concernant les fonctions du système immunitaire et du métabolisme basée sur des études chez la souris permettra d'ajuster nos approches et de limiter l'utilisation d'animaux au strict minimum. Les animaux utilisés seront à minima de jeunes souris adultes totalement matures du l'âge varie entre 10 et 25 semaines.

À un ou deux jours de vie, des souriceaux sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes pour recevoir une injection, un geste qui peut les faire saigner. Une partie d'entre eux est tuée à neuf jours pour enregistrer l'activité de leurs neurones, les autres subissent à vingt-trois jours un prélèvement de queue pour génotypage et la pose d'une puce sous la peau, puis huit tests comportementaux entre trente et quarante-quatre jours mesurant l'anxiété, les comportements répétitifs et la mémoire. 558 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie portant les mutations observées chez des enfants atteints de troubles neurodéveloppementaux graves, les autres utilisées comme témoins. Le cerveau est prélevé sur chacune après sa mise à mort.

Objectifs

Les canaux sodiques (protéines qui transportent des ions sodium) sont essentiels pour les activités électriques des neurones, base du fonctionnement du cerveau. De nombreuses mutations de canaux sodium causent des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance", apparaissant entre 3 mois et quelques années. Des études fonctionnelles des mutations humaines ont proposé que les mutations induisent une réduction de la fonction d'un canal sodique particulier (50% de diminution d'activité). Un nouveau mécanisme pathologique pour les mutations causant des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance" a été montré : elles diminuent la fonction des canaux mutés, mais il y a aussi un effet d'inhibition des canaux mutés sur les canaux non mutés (dominance négative). Cela entraîne une réduction de l'activité des canaux anormalement supérieure à 50 %. Il n’existe pas de traitement efficace pour ces troubles. Aucun médicament activateur de l'activité de canaux sodiques n’est disponible. Dans ce projet, nous testerons une nouvelle molécule qui bloque l'inhibition des canaux mutés sur les non mutés. L'effet attendu est que cette molécule puisse restaurer la fonction des canaux sodiques, améliorer le fonctionnement des neurones et donc atténuer les troubles observés sur les animaux. Nous utilisons des souris porteuses des mêmes mutations génétiques que celles observées chez les enfants atteints. Des enregistrements sur neurones permettent d'étudier en détail l'activité des canaux sodiques présents dans les neurones. Plusieurs tests comportementaux permettent de mesurer les troubles induits par la mutation (anxiété, comportement répétitif, mémoire, interaction sociale, …). Nous allons par conséquent injecter les animaux avec la molécule décrite ci-dessus et étudierons ensuite les conséquences sur l'activité électrique des neurones et sur le comportement. En cas de succès, ce serait la première molécule améliorant l'activité de ce type de canal et utilisable comme médicament. Cette stratégie serait aussi applicable à d'autres maladies dont le mécanisme est dû à un effet de dominance négative.

Bénéfices attendus

Nos résultats peuvent fournir des informations importantes sur les mécanismes des troubles neurodéveloppementaux en général, et notre stratégie thérapeutique pourrait également être utilisés pour des études sur d’autres pathologies impliquant des dominances négatives. Les maladies liées aux canaux sodiques qui nous intéressent sont considérées comme des maladies orphelines pour lesquelles aucune solution thérapeutique satisfaisante n’est disponible. Ici, nous avons défini une stratégie qui peut aider à réduire l’impact sévère de ces mutations sur les caractéristiques du système nerveux central. Il est important de souligner que l’utilisation d’une molécule bloquant la dominance négative d’un canal muté sur un canal non muté peut avoir la capacité de traiter des dysfonctionnements de canaux indépendamment de la nature de la mutation génétique et peut représenter une solution uniforme pour un ensemble de symptômes et de patients divers.

Procédures

Tous les animaux âgés de 1 ou 2 jours subiront une injection (15 sec environ). Dans une procédure, les animaux subiront à l'âge de 23 jours un prélèvement sur la queue pour génotypage (2 sec) et la pose d'une puce nécessaire à un test (5 sec) puis 8 tests comportementaux (durées allant de 6 à 40 min, âge 30-44 jours) afin de mesurer leur niveau d'anxiété, d'éventuels comportements répétitifs, leur mémoire.

Impact sur les animaux

Dans toutes les procédures, l'injection peut induire un saignement et nécessite une séparation maternelle pendant un maximum de 10 minutes, cela peut induire un stress léger pour la mère et le petit. Dans toutes les procédures les prélèvements pour génotypage peuvent provoquer un saignement. Dans une procédure l'implantation sous-cutanée d’une puce, peuvent induire une légère douleur passagère et une gêne. Un test comportemental peut induire un stress léger.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélever le cerveau.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences sur des cellules exprimant les canaux sodium mutés d'intérêt et démontré les effets du peptide d’intérêt. Les modèles animaux sont maintenant essentiels pour ce projet car ils permettront d’étudier les effets du peptide appliqué sur un organisme entier et faire preuve de concept pour une utilisation thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Nous utiliserons les souris mâles et femelles et les souris mutantes et non-mutantes de chaque portée, soit la quasi-totalité des animaux sauf pour une procédure ou la fenêtre d'âge utilisable est très restreinte d'ou l'utilisation de 1 à 3 souriceaux par portée (cela concerne 28+7=29 portées au maximum et 10 au minimum).

Raffinement

Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une grille d'observation sera utilisée pour évaluer les points limites et apporter les réponses adéquates, dont l'injection d'un antalgique en cas de douleur. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils.

Choix des espèces

La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Nous avons fait la caractérisation phénotypique des 2 lignées, par conséquent nous connaissons bien ce modèle et les résultats attendus lors des tests comportementaux. Pour toutes les procédures, les souriceaux seront injectés à 1 ou 2 jours afin d’agir dès la synthèse des protéines canal. Une procédure nécessite de mettre à mort les animaux à 9 jours pour pouvoir enregistrer l'activité des neurones. L'autre procédure commence après le sevrage (23 jours) et les tests comportementaux entre 30 et 44 jours car après les problèmes comportementaux observés sont moins marqués.