Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des effets antitumoraux d’un nouveau peptide pour les tumeurs et métastases cérébrales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Quatre-vingt-quatre souris reçoivent un cathéter jugulaire reposé entre chaque séance, puis jusqu'à vingt perfusions d'une heure, éveillées, en quatre semaines. Sur 221 souris au total, toutes tuées à l'issue, 48 subissent en plus une implantation de cellules tumorales dans le cerveau, cinq injections de chimiothérapie par semaine pendant quatre semaines et trois séances d'irradiation, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux développant un glioblastome. La rubrique consacrée aux objectifs ne décrit aucune question scientifique et se limite à indiquer que l'étude s'inscrit dans les thématiques de l'unité, qu'elle a été validée par son conseil scientifique et qu'elle fait l'objet d'une collaboration industrielle.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans les thématiques de recherche de l’unité. Il a été validé par le Conseil Scientifique de l’unité et fait l’objet d’une collaboration industrielle ayant elle-même validé l’importance scientifique de l’étude.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration de l’efficacité des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (Glioblastome et Métastases cérébrales) (Radiothérapie+Chimiothérapie). En effet, dans les premiers temps (à court terme) nous évaluerons un débit d’administration optimal et nous nous assurerons que l’administration répétée de la molécule n’engendre pas de conséquences néfastes à l’animal. Puis à long terme nous évaluerons les effets de cette molécule en présence de radiochimiothérapie sur la croissance tumorale dans des modèles de glioblastome murins et métastases cérébrales.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Pose de cathéter jugulaire : 20 minutes par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 84 animaux sont concernés. -Injection lente (animal vigile): 60 minutes par animal, réalisées au maximum 20 fois sur un animal pendant une période de 4 semaines, 84 animaux sont concernés. -Prélèvements sanguins : 2 minutes par animal, réalisées au maximum 3 fois sur un animal , 12 animaux sont concernés. -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 48 animaux sont concernés. -Injection de la chimiothérapie (animal vigile) : 5 fois sur 5 jours consécutifs pendant maximum 4 semaines ; 5 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. -Injection pour les 60 animaux de la procédure métastase cérébrale. -Injection d'analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de glioblastomes ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h. La nuisance est considérée comme sévère. Les séances fractionnées de radiothérapie et les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal, un autre point limite est ainsi défini par une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations / min lors de l’irradiation. S’il est atteint, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si la fréquence n’augmente pas à nouveau, la procédure sera arrêtée. Cette fréquence est mesurée en continu par un ballonnet abdominal, ce qui nous permet d’être très réactif. Ces nuisances sont très courtes de moins d’une minute. La nuisance est considérée comme légère. Comme l’infusion de la molécule est prévue quotidiennement (5/7 j), le cathéter jugulaire sera replacé entre chaque session d’infusion. Cela occasionnera probablement une gêne pour l’animal sans toutefois lui induire une souffrance.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir la meilleure conformation de la molécule mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Concernant les troisième et quatrième procédures et afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe de traitement pour le Glioblastome et 15 animaux par groupe pour les métastases au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques , et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 et 15 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs et en espérant une valeur statistique. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculé est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation (au minimum 7jours) avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Pour remédier à la perte de poids, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire. Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et après les procédures d’implantation tumorale et d’injection du traitement. Si une perte de poids supérieure à 15% est observée, la procédure sera arrêtée. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale et/ou l’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Pour limiter ces douleurs, les souris reçoivent une injection d'analgésique 20min avant la chirurgie et les anesthésies locales sont réalisées par application d'un gel Les souris sont ensuite anesthésiées pendant la chirurgie. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement et grâce à l’échelle d’évaluation « Grimace scale », nous pouvons évaluer efficacement les éventuelles douleurs de l’animal. Dès qu’une observation de l’expression faciale de l’animal atteint un seuil critique sans que pour autant les points limites entrainant la mise à mort ne soient atteints, une couverture analgésique sera mise en place par une injection quotidienne d'analgésique. Les infusions de la molécule ayant lieu quotidiennement (5/7j), cela minimise fortement le risque de bouchage du cathéter jugulaire. Si cela arrive, un flux d’héparine sera réalisé pour le déboucher.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur les cellules tumorales tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral qui peuvent modifier l’effet thérapeutique du traitement. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes C57Bl/6 car ces souris présentent la composante inflammatoire et notamment macrophagique. Le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris C57Bl/6 qui permet alors d’éviter toute inflammation aberrante due au rejet de « greffe » par la souris souche utilisée. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire. Concernant le modèle de métastases cérébrales, ce dernier est réalisé sur souris Nude (immunodéficiente) car ce sont des cellules humaines qui sont injectées. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Etude de l’efficacité radiosensibilisante de nanoparticules dans le glioblastome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules tumorales sont implantées dans le cerveau de 120 souris, qui subissent deux chirurgies crâniennes de trente minutes et, pour 48 d'entre elles, trois séances d'irradiation de 4 Gy sur trois jours consécutifs. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance sévère. Le projet reprend un protocole déjà autorisé, la seule modification demandée étant d'avancer le début du traitement du dixième au septième jour, "pour des raisons d'injectabilité du traitement dans la tumeur". Le porteur situe la perte de poids, de motricité et de sensibilité liée au glioblastome en fin de protocole et la borne à vingt-quatre heures, durée qui suppose que les points limites soient repérés à temps.
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nouvelles nanoparticules pour les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles. Un projet équivalent a déjà fait l’objet d’une demande d'autorisation de projet qui a été acceptée avec un début de traitement à J10. Or, pour des raisons d’injectabilité du traitement dans la tumeur, nous désirons débuter le traitement plus tôt (J7) d’où cette nouvelle demande d'autorisation de projet.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court terme est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des nanoparticules qui ont montré, par des études précédentes, leur capacité à rester suffisamment longtemps dans la tumeur pour les fractions de radiothérapie. A long terme, le bénéfice attendu est l’administration de ces nanoparticules lors des stratégies thérapeutiques conventionnelles chez l’Homme.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale et injection du traitement) : 30 minutes maximum par animal, réalisée deux seules fois sur chaque animal, les 120animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. - Injection d'analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale
Impact sur les animaux
Les séances fractionnées de Radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Ces interventions sont donc légères. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Un autre point limite est ainsi défini par une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations / min lors de l’irradiation. S’il est atteint, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si la fréquence n’augmente pas à nouveau, la procédure sera arrêtée. Cette fréquence est mesurée en continu par un ballonnet abdominal, ce qui nous permet d’être très réactif. Ces nuisances sont très courtes de moins d’une minute. Ces interventions sont donc légères. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale et l’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Ces nuisances sont atténuées par l’injection d’analgésique et leur durée est de quelques minutes. Ces interventions sont donc modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de glioblastome ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h . A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée sévère.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer des organes pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures nanoparticules (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe sur le modèle mais aussi sur les données issues d’autres tumeurs par le partenaire fabriquant les nanoparticules. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait max 12 animaux par sous-groupe de traitement nécessaire afin d’obtenir une différence significative. Ce nombre d’animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude après analyse statistiques séquentielles.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, cartons). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids dû aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur les cellules tumorales tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral qui peuvent modifier l’effet thérapeutique du traitement. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes C57Bl/6 car ces souris présentent la composante inflammatoire et notamment macrophagique, cible de notre traitement. Le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris femelles C57Bl/6 qui permet alors d’éviter toute inflammation aberrante due au rejet de « greffe » par la souris souche utilisée. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.
Impact de la glycation sanguine dans l’AVC hémorragique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le sang injecté dans le cerveau vient d'autres rats, rendus diabétiques par une injection unique puis saignés au bout de quatorze jours. 130 rats au total vont être utilisés, tous tués à l'issue, 120 d'entre eux dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La chirurgie cérébrale dure trente minutes et dépose ce sang dans le striatum pour reproduire une hémorragie, avec des troubles locomoteurs et une perte de poids attendus au réveil. Le bénéfice avancé reste à deux conditionnels de distance, comprendre pourquoi les séquelles sont plus lourdes chez les personnes diabétiques, ce qui "pourrait donc à termes permettre de proposer des cibles thérapeutiques".
Objectifs
Les objectifs du projet sont de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques qui pourraient expliquer pourquoi les personnes diabétiques ont des AVC hémorragiques plus sévères (atteintes neurologiques plus importantes et mortalité plus importante). Notre hypothèse est que le sang glyqué ("sucré/diabétique") et notamment les globules rouges "diabétiques" pourraient être responsables d'un œdème, d'une réaction inflammatoire et d'un stress oxydant exacerbés entrainant par conséquent des séquelles cérébrales plus importantes. Dans ce contexte, nous voulons injecter du sang "sain" et du sang "diabétique" dans le cerveau de rat afin d'étudier différents aspects physiopathologiques: œdème, inflammation, stress oxydant, réactivité et mort de différents types cellulaires
Bénéfices attendus
La meilleure compréhension de l'impact de l'épanchement de sang "diabétique" dans le cerveau (hémorragie) et de ses conséquences pourrait permettre d'identifier la raison de l'aggravation des séquelles neurologiques et de la mortalité chez les personnes diabétiques. Cela pourrait donc à termes permettre de proposer des cibles thérapeutiques pour améliorer le pronostic des personnes diabétiques à la suite d'un AVC hémorragique et ainsi limiter leurs séquelles et la surmortalité
Procédures
Pour la Procédure 1 (induction Diabète de type 1) : une injection unique d'une drogue ou de tampon salin en intra-péritonéal et mesure de la glycémie à J+2 puis J+7 pour vérification de la glycémie. Le sang sera récupéré à 14 jours post-induction du diabète. Pour la Procédure 2 (Mimer un AVC hémorragique) : Chirurgie cérébrale sous anesthésie chimique (30 min) pour mimer un AVC hémorragique.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues pour les animaux de la procédure 1 impliquant la mise en place d'un diabète sont une polyurie et polydypsie caractéristiques du diabète. On peut envisager une perte de poids mais qui devraient rester limitée vue la durée de maintien de la pathologie (14 jours). Pour les animaux subissant l'injection de sang au niveau du striatum cérébral (Procédure 2), des troubles locomoteurs initiaux ainsi qu'une perte de poids initial sont prévus (difficulté à s'alimenter). Les animaux récupèrent assez vite et donc cette perte de poids est temporaire. L'infection est un risque faible. Egalement, une faiblesse et/ou douleur liée aux différents prélèvements et actes chirurgicaux peuvents survenir. Des douleurs post-opératoires représentent également une nuisance.
Devenir
A l'issue de chaque procédure l'ensemble des animaux sera euthanasié pour analyse.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors d’une hémorragie cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Ils impliquent un oedème, la migration et la prolifération des cellules cérébrales, ainsi que l'interaction entre plusieurs types cellulaire. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors d’un dommage cérébral comme un AVC hémorragique (hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux). A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation. C'est pourquoi le modèle in vivo est pertinent et ne peut être remplacé.
Réduction
Une partie des expérimentations sera réalisée de façon séquentielle sur 2 groupes (2 x 5 animaux par groupe). Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. D'après notre expérience et connaissance des analyses effectuées via des expérimentations similaires, le nombre de 10 animaux par groupe permet de pallier à l'hétérogénéité de réponses des animaux, et les tests statistiques réalisés seront suffisamment puissants.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des conditions optimales selon les réglementations en vigueur. L’atmosphère sera contrôlée en température et humidité. Ils auront à disposition nourriture et boisson. Une anesthésie générale est prévue avant toute manipulation invasive. Dans un souci de réduction de la douleur, toutes les mesures seront prises pendant les expérimentations (anesthésie, analgésie). Un enrichissement adapté à ce type d'expérimentations sera mis en place. Des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus.
Choix des espèces
Les rats sont des mammifères dont la neuroanatomie est proche de celle de l'humain. Ce sont des animaux permettant de mimer la pathologie de l'AVC hémorragique et de mieux la comprendre. Des rats de 12 semaines seront utilisés car ils correspondent à des stades de développement bien caractérisés quant aux processus neurologiques mis en place lors de l'AVC hémorragique.
Modèles nutritionnels pour l’induction de désordres métaboliques chez des souris génétiquement modifiées ou immunodéficientes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Les expérimentateurs excluent de l'étude et mettent à mort tout animal dont l'état ne s'améliore pas, selon une grille de score prévue pour chaque procédure. 2 000 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines et pendant une quarantaine de semaines, elles reçoivent un régime hypercalorique et des boissons au fructose qui les rendent obèses, diabétiques et porteuses d'une stéatose hépatique, avec une à deux administrations de composés par jour, des jeûnes de six heures, une épilation sous anesthésie pour l'échocardiographie et jusqu'à trente semaines d'hébergement seule en cage. La finalité déclarée est de disposer de modèles reproductibles, utilisables ensuite pour tester des candidats thérapeutiques contre l'obésité et la stéatose.
Objectifs
L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.
Procédures
Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possible. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (1 fois, durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement (max 3 fois). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes (1 fois). Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique (3 fois).
Impact sur les animaux
Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère (quelques minutes) . Pour pouvoir relever la consommation alimentaire et hydrique, nous pourrons être amené à héberger les souris de façon individuelle pendant une partie ou toute la durée du projet (jusqu'à 30 semaines). Les souris seront stressées par cet hébergement, même si elles voient et entendent leur congénères. Pour palier le stress engendré, du sur-enrichissement (petits tunnels suspendus, boule de bois notamment) sera ajouté dans les cages et le personnel est formé à l'approche délicate des animaux, aux gratouilles lors des préhensions. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h. Lors des mesures de composition corporelle, l'animal peut ressentir un stress léger modéré , cela dure environ 2 minutes.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Pour les animaux immunodéficients, nous mettrons en place une zone dédiée et un process clair pour garantir leur statut sanitaire. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique pour chaque procédure est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et le mettront à mort. Les prélèvements de sang seront fait sous couverture analgésique.
Choix des espèces
Les souris sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques et des comorbidités associées. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.
Régénération rénale chez la petite roussette juvénile
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Un antibiotique choisi pour sa toxicité rénale est injecté à 48 petites roussettes juvéniles, de jeunes requins, afin de détruire une partie de leurs néphrons et d'observer comment le rein se reconstruit. Elles subissent une à quatre anesthésies et restent trois semaines en aquarium, dans des procédures classées à un niveau de souffrance léger. Le RNT chiffre la nuisance de l'injection à quelques secondes et celle qui suit à trois semaines, sans autre qualification que "faible", alors que la lésion rénale est le but même du protocole. Toutes seront tuées à l'issue pour que leurs reins soient coupés en lames d'histologie, environ trois cents par individu.
Objectifs
Le rein est un organe essentiel pour, entre autre, maintenir l’homéostasie des fluides dans le corps, pour la régulation de la pression artérielle et pour l’élimination des déchets. L’unité fondamentale du rein est le néphron, composé d’une structure où se fait la filtration du sang et d’un ensemble de tubules acheminant le produit de filtration. Les néphrons sont issus d’une population de cellules souches présentes dans le rein uniquement pendant l’embryogenèse chez les mammifères. Suite à une lésion, les mammifères peuvent réparer les néphrons existants mais ne peuvent pas former de nouveaux néphrons. A l’inverse, les requins et les raies sont capables de former de nouveaux néphrons tout au long de la vie. Cela a également été montré de manière expérimentale chez la raie hérisson suite à une néphrectomie partielle chez l’adulte. La possibilité de former de nouveaux néphrons chez les poissons cartilagineux tout au long de la vie est liée à la persistance des cellules souches dans le rein au-delà de l’embryogenèse. Ces animaux sont donc des modèles très intéressants pour étudier les mécanismes moléculaires sous-tendant la régénération des néphrons. La mise à jour de ces mécanismes dans ces espèces pourrait permettre la réactivation du processus de formation de nouveaux néphrons chez les mammifères et ainsi aider à la récupération de la fonction rénale dans le cas de maladie chronique. Notre objectif est donc ici d’étudier la cinétique de régénération rénale chez la petite roussette, un petit requin abondant dans l’Atlantique Nord. Les lésions rénales seront induites par une méthode moins drastique que la néphrectomie partielle qui demande en outre une maîtrise chirurgicale de pointe. Comme alternative, nous utiliserons un antibiotique connu pour son effet nephrotoxique et non létal à des doses modérées. Ce modèle de régénération rénale induite par des lésions à la gentamicine a déjà été décrit sur des poissons téléostéens (poisson zèbre) adultes.
Bénéfices attendus
Bien que les propriétés de régénération rénale chez les requins soient connues depuis plus de 30 ans, aucune étude n’a encore envisagé d’analyser de manière histologique et moléculaire la cinétique de régénération rénale chez ces animaux suite à une lésion néphrotoxique d’ordre chimique. La mise en évidence de nouveaux néphrons chez la raie hérisson après une ablation partielle du rein a pu montrer que le processus de régénération n’était pas simplement physiologique mais pouvait aussi être induit lors d’une ablation partielle du rein, c’est-à-dire dans un contexte traumatique. Quels changements moléculaires subissent les cellules souches du néphron pour s’engager dans la formation de nouveaux néphrons suite à une lésion néphrotoxique? C’est la question que nous proposons d’explorer dans ce projet au travers du protocole d’injection d’un antibiotique dans des roussettes juvéniles. Ce projet nous permettra donc de déchiffrer les mécanismes moléculaires mis en œuvre dans la formation de nouveaux néphrons dans un contexte pathologique. La possibilité d’induire ces mécanismes moléculaires dans le but de réactiver la formation de nouveaux néphrons pourra alors un jour être testée chez les mammifères, ce qui pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques dans le cadre de maladies rénales chroniques.
Procédures
Les juvéniles seront soumis à une injection sous anesthésie puis placés dans un bac de réveil. Pendant la durée de l’expérience (3 semaines), les juvéniles sont maintenus dans des aquariums de 100 L. Les roussettes juvéniles seront soumises, selon les groupes, à une, deux, trois ou quatre anesthésies de quelques minutes chacune.
Impact sur les animaux
Nuisances lors de la pêche des juvéniles L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est d’une dizaine de secondes (transfert du bac où les juvéniles ont éclos vers la pièce voisine). Nuisances lors de la procédure d’injection L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est de quelques secondes (injection de 100 microlitres de solution) Nuisances après l’injection L’intensité de cette nuisance est faible et sa durée est de 3 semaines.
Devenir
Tous les juvéniles utilisés dans notre expérience seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et procéder à des analyses.
Remplacement
Les animaux choisis dans cette étude (les requins) possèdent une propriété biologique bien particulière: la possibilité de former de nouveaux néphrons tout au long de la vie et ceci dans un contexte à la fois physiologique (génération perpétuelle de néphrons) et traumatique (régénération de néphrons après une lésion mécanique). Cette propriété n’est pas présente chez les mammifères indiquant qu’elle s’est perdue au cours de l’évolution. Il est donc nécessaire de se tourner vers les requins pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette régénération. Ces mécanismes, qui impliquent d’analyser le comportement des cellules souches du néphron, doivent être étudiés dans l’animal entier. En effet, on sait aujourd’hui que le microenvironnement des cellules souches est un élément crucial pour indiquer si ces cellules doivent se différentier ou s’auto-renouveler. Nous avons également consulté l’annuaire des compétences en méthodes substitutives (AREA) afin de vérifier qu’il n’existe pas de modèles organoïdes chez les requins en France. Il n’en existe pour aucun organe chez ce groupe d’animaux. La règle de remplacement de l’animal entier ne peut donc pas être appliquée dans ce projet.
Réduction
Seulement 3 juvéniles seront analysés à chaque point de collecte (4 points de collecte en tout: Jour 2, semaine 1, semaine 2 et semaine 3). Les analyses suivant l’injection vont se faire sur des coupes d’échantillon enrobé dans de la paraffine. Chaque juvénile peut fournir environ 300 coupes de paraffine (épaisseur de chacune: 10 micromètres) offrant ainsi un nombre important de support pour collecter des mesures. Par exemple, au point de collecte «semaine 1», 3 juvéniles vont être prélevés. Chaque juvénile va fournir 300 coupes. Cent coupes pourront entrer dans l’analyse 1 offrant la possibilité de faire 100 mesures. Trois juvéniles étant analysés, 300 mesures peuvent être collectés. L’expérience étant répétée deux fois, nous pouvons obtenir 2 x 300 mesures pour l’analyse 1. L’utilisation de seulement 3 juvéniles est donc largement suffisante pour fournir un nombre important de mesures et pour permettre de réaliser des tests statistiques. La règle de réduction peut être appliquée.
Raffinement
Nous allons utiliser un anesthésique à deux reprises lors de la manipulation des juvéniles: lors de l’injection des solutions puis avant la mise à mort. Avant la mise à mort des animaux, ceux-ci seront maintenus dans des aquariums jusqu’à 3 semaines après l’injection des solutions. Dans chaque aquarium, un enrichissement environnemental sera proposé aux animaux sous la forme de pièce en pvc de taille adaptée pour que les animaux puissent se cacher à l’intérieur si besoin. Une nourriture variée et adaptée sera proposée à satiété aux juvéniles: colin, calamar et crevettes rose. Pendant cette période de 3 semaines où les animaux seront dans les aquariums, ils seront observés quotidiennement. Nous avons établi une grille de suivi des juvéniles après l’injection. Grâce à cette grille nous nous assurerons que les animaux injectés avec de la solution expérimentale se comportent comme les animaux injectés avec la solution contrôle. Le suivi des animaux inclut des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
L'espèce choisie est la petite roussette. Cette espèce appartient au rang taxinomique des poissons cartilagineux qui regroupent les requins, les raies et les chimères. Une étude a montré en 2003 que les poissons cartilagineux possédaient la capacité de régénérer le rein après une néphrectomie partielle. L'union internationale pour la conservation de la nature (UICN) a défini le statut de conservation de la petite roussette comme "préoccupation mineure". Comme nous étudions un processus de régénération, nous ne pouvons pas travailler sur l’embryon. L’embryogenèse d’un organisme correspond à une étape de croissance et développement intense qui ne peut être assimilé à de la régénération. La régénération ne peut être analysée qu’au stade post-embryonnaire. Comme il s’agit d’expériences qui n’ont encore jamais été réalisées, il nous semblait difficile de les réaliser d’emblée sur des adultes. Notre choix s’est donc porté sur les juvéniles. Ils sont de petites tailles et facile à manipuler. Les roussettes seront utilisées au stade juvénile. Comme nous étudions un processus de régénération, nous ne pouvons pas travailler sur l’embryon. L’embryogenèse d’un organisme correspond à une étape de croissance et développement intense qui ne peut être assimiler à de la régénération. La régénération ne peut être analysée qu’au stade post-embryonnaire. Comme il s’agit d’expériences qui n’ont encore jamais été réalisées, il nous semblait difficile de les réaliser d’emblée sur des adultes. Notre choix s’est donc porté sur les juvéniles. Ils sont de petites tailles et facile à manipuler.
Interactions entre le microbiote intestinal et la microglie, les astrocytes et les neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale et modulation des effets de récompense de la nicotine (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Jusqu'à huit gavages en une seule journée pour certaines, une administration intragastrique quotidienne pendant dix jours pour la plupart, 2 402 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent des antibiotiques ou un régime gras pendant plusieurs semaines, une nuit de privation de nourriture, une chirurgie intracérébrale ou une section du nerf vague pour une partie d'entre elles, et une batterie de tests censés mesurer l'anxiété et l'état dépressif. L'objet réel est de savoir si les bactéries intestinales modifient la réponse du cerveau à la nicotine. Le porteur écrit que "les dommages escomptés pour les animaux sont minimes", puis énumère les points limites qui déclencheront leur mise à mort, perte de poids supérieure à 20 %, diarrhée persistante plus de deux jours, poids dépassant 45 grammes, locomotion fortement compromise.
Objectifs
L’objectif général du projet est de comprendre dans quelle mesure et comment les bactéries intestinales influencent les processus associés à l’addiction aux drogues et plus particulièrement à la nicotine, composé actif principal du tabac. En effet l’addiction reste un enjeu de santé publique majeur, le tabac étant la principale cause de mortalité précoce, et il reste beaucoup à découvrir sur les mécanismes qui sous-tendent cette pathologie. Tous les individus n’ont pas le même risque de développer une addiction après avoir expérimenté une drogue telle que la nicotine. Plusieurs facteurs génétiques et environnementaux contribuent à augmenter ce risque chez certains individus. De plus en plus d’études montrent un rôle très important de la flore intestinale dans le fonctionnement du cerveau et dans le développement de maladies psychiatriques y compris dans l’addiction. Cependant les mécanismes d’action mis en jeu sont encore très peu connus. On sait que les drogues activent le circuit dit de récompense au sein du cerveau. En plus des neurones, le cerveau comprend également un ensemble de cellules dites gliales qui servent de support à l’activité neuronale et mettent en jeu des mécanismes de défense. Il est connu que ces cellules influencent la réponse des neurones du circuit de la récompense aux drogues. De plus en plus d’études suggèrent que les bactéries intestinales influencent fortement leur activité. Ainsi, les objectifs précis du projet sont de caractériser l’impact de la flore intestinale d’une part sur l’activité des neurones et des cellules gliales du circuit de la récompense, et d’autre part de comprendre le lien mécanistique qui existe entre flore intestinale, cellules gliales et neurones en réponse à la nicotine. L’ajout d’une chirurgie au cours d’une des procédures sans ajout d’animaux nécessite une modification du projet initial.
Bénéfices attendus
L’addiction aux drogues représente l’un des enjeux majeurs des systèmes de santé, et leur prévalence s’accroit, sans aucun traitement suffisamment efficace à ce jour. Le projet permettra d’identifier de nouveaux facteurs de prédisposition à l’addiction et en particulier à l’addiction à la nicotine, principal composé actif du tabac. A court terme, il permettra d’identifier dans quelle mesure et comment les bactéries intestinales modifient la réponse du cerveau à la nicotine. Identifier les souches de bactéries, leurs métabolites et mécanismes d’action impliqués dans les effets des drogues, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique, pourra ouvrir à plus long terme sur de nouvelles stratégies d’intervention pour aider à la prévention et /ou à la cessation du tabagisme basées notamment sur l’utilisation de prébiotiques et /ou de probiotiques précis et sur des modifications des habitudes de vie ayant une action directe sur la composition de la flore intestinale. .
Procédures
Les animaux seront soumis à différents tests comportementaux, à raison d’un test maximum par jour, dans le but de tester leurs fonctions locomotrices, mnésiques et sociales, leurs états émotionnels de type anxieux ou dépressif, ainsi que leur sensibilité aux effets hédoniques des drogues. Ils seront soumis à une administration intragastrique; dans la majorité des cas elle sera réalisée une fois par jour pendant 10 jours et une minorité d’animaux recevront jusqu’à 8 administrations en une journée mais seulement une journée. Une minorité d’animaux devront être privés de nourriture mais uniquement pendant une nuit et l’eau sera laissée à volonté. L’exposition à des antibiotiques ou à une nourriture riche en graisse sera réalisée pendant 10jours à quelques semaines chez certains animaux. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours une infusion ou implantation intracérébrales sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour perturber la flore intestinale ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisi sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort de type anxieux passagers chez certains animaux soumis à une nourriture riche en gras, exposés à l’administration intra-gastrique, ou à certains tests comportementaux de dépression, ou à une privation alimentaire pendant une nuit, ou à une chirurgie intracérébrale ou de vagotomie. Ces nuisances seront gérées par des points limites spécifiques et précoces et par un protocole d’anesthésie et d’analgésie en cas de chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les cerveaux devront être prélevés pour des expériences ex vivo.
Remplacement
Pour évaluer le rôle des bactéries intestinales, et identifier les mécanismes mis en jeu, sur les processus associés à la dépendance à la nicotine, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un circuit intestin-cerveau fonctionnel, et d’étudier les comportements de prise volontaire et les états psychologiques associés aux effets hédoniques des drogues au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique entre intestin et cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisants pour en faire des modèles d’étude pertinents.
Réduction
La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec des biostatisticiens. Dans les études prévues, notamment l’étude des comportements, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 10 et 12 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions (parfois en deux réplicas) pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Pour l’étude de l’expression des gènes, les experts en bioinformatique préconisent un minimum de 4 animaux par condition. Un groupe contrôle sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de souris sont couramment utilisées. Notre expérience dans les différents aspects du projet nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions avec des statistiques appropriés, pour mesurer l’effet des différents facteurs et de leur interaction possible sur les différents paramètres d’intérêt. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y a aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec du coton, et/ou des igloos en carton, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués. Si apparition des signes d’infection et en accord avec le vétérinaire des antibiotique seront donnés. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression facial très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, ou diarrhée systématique pendant plus de deux jours suite aux antibiotiques, ou prise de poids supérieure à 150% ou poids dépassant 45g ou locomotion fortement compromise suite au régime riche en graisse ). Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les mécanismes et comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions physique et émotionnelle reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler l’activité du cerveau, la flore intestinale et le génome sans dommages durables pour les individus. La souris est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier la flore intestinale et son lien avec le cerveau. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le cerveau soit suffisamment développé notamment pour l’étude de leur comportement Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement
Etude de la représentation neuronale et l’effet comportemental de la manipulation respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à la fin du protocole pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées dans leur cerveau, 455 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, la seconde durant de deux à quatre heures et demie, puis des séances d'enregistrement en contention pouvant atteindre trois heures par jour pendant une semaine. Une partie d'entre elles reçoit jusqu'à sept administrations de molécules anxiogènes ou panicogènes utilisées en psychiatrie, pendant que leur rythme respiratoire est manipulé, ce que le porteur décrit comme une physiologie inhabituelle source de stress. L'effectif tient en partie à un choix de méthode assumé dans le RNT, où la puissance statistique repose sur le nombre de neurones enregistrés plutôt que sur le nombre d'animaux.
Objectifs
La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.
Bénéfices attendus
La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.
Réduction
Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.
Raffinement
Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Hébérgement : Les animaux sont hébergés à plusieurs dans des cages enrichis (dôme, coton). Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires
Choix des espèces
Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Évaluer les effets de traitements innovants dans un modèle de sepsis pulmonaire chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 98
980 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, 70 d'entre eux étant gardés vivants pour être réutilisés dans d'autres expériences et tous les autres tués pour prélever leurs organes. Les expérimentateurs leur inoculent un pneumocoque, parfois associé à un virus grippal, pour déclencher un sepsis pulmonaire. S'ensuivent jusqu'à deux injections par jour pendant 72 heures et des prises de sang allant jusqu'à 7,5 % du volume sanguin, 64 animaux subissant en plus une chirurgie sous anesthésie générale. Les atteintes attendues tiennent en trois lignes, isolement, démarche affaiblie, écoulements, perte de poids et chute de température corporelle, quand le bénéfice espéré tient dans une phrase au conditionnel sur un traitement qui "pourrait avoir un impact significatif".
Objectifs
Le sepsis est une maladie grave, causée par une réponse incontrôlée du système immunitaire à une infection. Elle fait 11 millions de victimes par an dans le monde, en particulier chez les jeunes enfants et les personnes âgées, dont le système immunitaire est plus fragile. Aujourd’hui, les traitements actuels visent à réduire l’inflammation et combattre l’infection. En collaboration avec une autre équipe de recherche, nous avons testé une nouvelle molécule prometteuse. Cette molécule réduit l’activation des macrophages, un type de cellule immunitaire, et améliore la survie de souris atteintes de sepsis. Cependant, les modèles précliniques utilisés ont leurs limites, en manquant de représentativité avec le sepsis humain, ou en étant invasif et difficiles à reproduire. Bien que cette molécule semble efficace, nous avons encore beaucoup à apprendre sur son fonctionnement global. Nous pensons qu’elle influence plusieurs aspects du système immunitaire et qu’il est essentiel de confirmer son efficacité dans un modèle plus proche du sepsis humain. Objectifs de l’étude: 1. Développer un modèle de sepsis pulmonaire: Comme la majorité des cas de sepsis pulmonaires sont causés par une bactérie (Streptococcus pneumoniae), souvent associée à des infections virales comme la grippe, nous infecterons des rongeurs avec ces agents. Cela nous permettra de vérifier si ces modèles reproduisent les symptômes des patients humains atteints de sepsis. 2. Tester la molécule dans ces conditions : Nous administrerons différentes doses pour identifier la dose optimale et étudier comment elle se distribue dans le corps par des techniques d’imagerie. Nous analyserons aussi la réponse immunitaire, notamment l’activité des cellules et des molécules responsables de l’inflammation. 3. Explorer en combinaison avec des corticoïdes : Les corticoïdes, souvent utilisés pour réduire l’inflammation, peuvent avoir des effets secondaires importants. En combinant ces deux traitements, nous espérons réduire ces inconvénients tout en améliorant l’efficacité du traitement. Nous mesurerons les mêmes paramètres pour évaluer les bénéfices de cette combinaison. En conclusion, cette recherche nous permettra de mieux comprendre les effets de la nouvelle molécule dans un modèle plus proche du sepsis humain. Ces avancées ouvriront potentiellement la voie à des essais cliniques et, à terme, à une utilisation thérapeutique, seule ou associée à d’autres traitements comme les corticoïdes.
Bénéfices attendus
Le sepsis provoque la majorité des admissions dans les unités de soins intensifs. Il se manifeste par une réponse inflammatoire généralisée due à une infection incontrôlée. Malgré les avancées médicales et l’application des directives internationales, les traitements actuels restent principalement symptomatiques, sans solution curative véritable. Dans le cadre de notre projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d’un traitement curatif prometteur nouvellement synthétisé. Si nos résultats sont concluants, ce traitement pourrait avoir un impact significatif non seulement sur la santé humaine et vétérinaire.
Procédures
La plupart des animaux (plus de 90 %) seront soumis à des injections et des prélèvements de sang pratiqués sous anesthésie générale. Un animal subira un maximum de 2 injections par jours sur une durée de 72h, et les prélèvements ne dépasseront pas 7,5 % du volume sanguin de l’animal. Nous estimons à 64 le nombre d’animaux qui subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Celle-ci sera précédée d’une injection d’anti- douleur, et suivie par une ou plusieurs injections de traitement. Les animaux pourront subir également des prélèvements de sang dans les 72h qui suivent la chirurgie, dans la limite de 7,5 % du volume sanguin de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour reproduire le sepsis présentent des changements de comportement. Ils ont tendance à s’isoler, montrent une faiblesse physique qui affecte leur démarche, et peuvent avoir des écoulements, comme un nez qui coule. On observe également une perte de poids et une baisse de leur température corporelle.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de collecter les échantillons et mesurer les changements aux niveaux tissulaires, cellulaires ou moléculaires. Certains animaux pourront être gardés en vie, s’ils ont subi une procédure modérée ou légère et ne démontrent pas de signes pathologiques. Ils seront alors réutilisés.
Remplacement
Dans cette étude, l’utilisation d’animaux est nécessaire en raison de la complexité du sepsis, qui affecte plusieurs organes en même temps. Pour bien comprendre cette maladie, il est indispensable d’étudier ses effets sur un organisme entier. Par ailleurs, les résultats obtenus chez les rongeurs, lorsqu’ils sont cohérents entre différents modèles, reflètent généralement bien ce qui se passe chez l’Homme. Dans le cas où notre projet révèle certains mécanismes qui peuvent être étudiés sur cellules, nous remplacerons l’utilisation de modèles animaux par les cultures cellulaires.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes basés sur les travaux précédents menés dans notre laboratoire, ainsi que sur une analyse approfondie de la littérature scientifique sur cette maladie. Nous avons aussi optimisé les prélèvements sanguins et les échantillons de tissus (cœur, foie, reins, poumons, glandes surrénales, muscles, moelle épinière, et omentum) prélevés après l’euthanasie de chaque animal. De plus, nous avons effectué un test statistique appelé "test de supériorité" (avec une puissance de 90 % et un seuil d’erreur de 5 %) pour déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Enfin, les variations des données collectées seront analysées à l’aide d’une méthode statistique spécifique (analyse de variance à deux facteurs) pour évaluer les effets du modèle et du traitement.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Nous surveillerons régulièrement les rongeurs pour détecter toute douleur excessive, car cela pourrait fausser nos résultats. Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons cinq critères standardisés, chacun noté sur 4 points, permettant d’obtenir un score global sur 20 : • L’état physique, le comportement, et les sécrétions seront vérifiés visuellement. • Le poids sera suivi à l’aide d’une balance. • La température corporelle sera mesurée avec un thermomètre rectal adapté aux rongeurs. Les rongeurs seront placés dans des armoires ventilées, où la température et la pression seront contrôlées. Ils auront un accès permanent à l’eau, à la nourriture, ainsi qu’à du papier et du coton pour construire leur nid. Nous ajouterons également des éléments d’enrichissement pour encourager le jeu et l’activité. Étant des animaux sociaux, aucun rongeur ne sera isolé dans sa cage, sauf en cas d’agressivité ou si des soins particuliers sont nécessaires.
Choix des espèces
Depuis 40 ans, plus de 10 000 études ont été publiées sur le sepsis en utilisant des rongeurs comme modèle animal. Leur utilisation nous permet de mieux situer nos résultats dans un contexte scientifique global. Ces modèles de rongeurs ont été largement étudiés, et l’on connaît bien leur cycle de vie ainsi que leurs éventuels impacts sur les expérimentations. Les rongeurs sont compatibles avec un large éventail de techniques pour analyser différents paramètres et mécanismes, y compris ceux que nous utiliserons dans cette étude. Une étude future pourrait se concentrer sur les mécanismes physiopathologiques liés à l’administration de la supformine. L’utilisation de souris est donc recommandée, notamment pour faciliter de futures comparaisons avec des souris transgéniques. Enfin, le rat présente l’avantage de fournir un volume de sang suffisant pour réaliser plusieurs analyses, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les différences entre individus Les souris seront âgées de quelques jours à 24 mois. Cette grande amplitude permettra de moduler le système immunitaire dès le plus jeune âge et d’évaluer les effets de nos traitements sur des souris âgées plus représentatives des patients touchés par le sepsis. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 400 g et agés de 5 à 10 semaines lors de leur utilisation soit l’âge de leur maturité sexuelle pour cette espèce. La grande majorité des animaux (80-90%) seront des souris. Les rats (10-20%) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang, et ce afin de réduire le nombre d'animaux employés.
Evaluation d’une première génération de doubles analogues GLP-1/26RFa pour le traitement du diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
802 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune enchaînant des jeûnes de six heures, des incisions au bout de la queue et des séjours seule en cage de calorimétrie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un régime gras les rend obèses et hyperglycémiques avant de recevoir des analogues d'hormones digestives, une sonde télémétrique étant implantée sous anesthésie chez une partie d'entre elles au cours d'une chirurgie d'une heure. La mise à mort sert à prélever les organes pour l'histologie. Le porteur indique avoir écarté deux molécules sur cellules bêta-pancréatiques avant de passer à la souris, puis affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives non-animales appropriées" pour la suite.
Objectifs
Face au défi majeur que constitue la prise en charge de l’obésité et de ses nombreuses comorbidités, dont le diabète de type 2 (DT2), il devient crucial de développer des stratégies thérapeutiques innovantes et efficaces. Le diabète de type 2, largement associé à l’obésité, représente une véritable urgence de santé publique en raison de sa prévalence croissante. À ce jour, les traitements classiques ne permettent pas toujours un contrôle optimal de la maladie, soulignant ainsi la nécessité de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, l’émergence récente de molécules multi-agonistes, tels que les doubles agonistes et, plus récemment, les triples agonistes combinant les actions sur les récepteurs des incrétines ouvre de larges perspectives thérapeutiques. Ces nouvelles molécules permettent de cibler simultanément plusieurs voies métaboliques impliquées dans la régulation de la glycémie, de la sécrétion d'insuline et du métabolisme lipidique, en s’appuyant sur l’axe entéro-insulaire. Cette approche pluri-hormonale est ainsi particulièrement prometteuse pour améliorer la gestion du DT2, en optimisant la régulation métabolique. Plusieurs peptides aux propriétés métaboliques intéressantes ont été identifiés et étudiés. Parmi eux, un neuropeptide découvert pour ses effets incrétiniques, s’intègre parfaitement dans ce nouveau paradigme thérapeutique. En effet, il présente des effets bénéfiques sur la sécrétion d'insuline et la régulation de la glycémie, faisant de lui un candidat de choix pour être combiné à d’autres hormones dans le cadre de traitements pluri-hormonaux. Le projet s’inscrit pleinement dans cette dynamique et vise à concevoir, caractériser et évaluer, à la fois in vitro et in vivo, une première génération de molécules chimériques combinant les effets d'une incrétine traditionnelle et de cette nouvelle. L’objectif est de développer des molécules capables de potentialiser les effets thérapeutiques des agonistes actuels tout en explorant de nouvelles voies de régulation du métabolisme glucidique et lipidique, afin d'offrir une alternative prometteuse et plus efficace pour le traitement du diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre des avancées majeures dans les domaines de la recherche fondamentale et biomédicale, avec des répercussions importantes pour la compréhension et le traitement des maladies métaboliques. Tout d'abord, il s'agit de concevoir de nouveaux doubles analogues, qui combinent les actions de différentes hormones impliquées dans la régulation du métabolisme glucidique. Ces molécules innovantes feront l'objet d'une caractérisation approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels elles interviennent dans le maintien de l'homéostasie du glucose, tant dans des conditions normales que dans des contextes physiopathologiques. Une attention particulière sera portée à l'analyse de leur impact sur les cellules β-pancréatiques, les tissus cibles de l'insuline, ainsi que sur les mécanismes de signalisation associés à la sécrétion et à l'action de l'insuline. Ce volet permettra d'élucider comment ces analogues peuvent corriger les perturbations métaboliques observées dans des états pathologiques comme l’obésité et le diabète de type 2. Ensuite, en nous basant sur les résultats obtenus lors de ces investigations, nous envisageons de proposer ces nouveaux analogues comme molécules prometteuses pour le développement de traitements pharmacologiques innovants. En effet, l'identification de telles cibles ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques complexes comme l’obésité et le diabète de type 2. Ces traitements viseront non seulement à restaurer une régulation efficace de la glycémie, mais aussi à corriger d’autres déséquilibres métaboliques associés à ces pathologies, en améliorant possiblement la sensibilité à l'insuline, la gestion des lipides et la réduction de l'inflammation systémique. Ce projet permettra d’évaluer le rôle potentiel thérapeutique d'une nouvelle classe de molécules incrétinomimétiques, en contribuant à la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées pour les patients souffrant d’obésité et de diabète de type 2.
Procédures
Les animaux subiront diverses expérimentations et prélèvements, sous anesthésie ou en état de veille. Pour le suivi glycémique, des prélèvements sanguins seront effectués à l’extrémité de la queue. Une semaine de repos sera respectée entre chaque expérimentation pour la récupération sanguine. Une chirurgie d’une heure sous anesthésie permettra d’implanter une sonde télémétrique pour un suivi continu de la glycémie. Pour l’analyse tissulaire, les animaux seront placés sous anesthésie profonde en vue d’une chirurgie sans réveil. Enfin, pour le suivi métabolique, ils seront hébergés en cage de calorimétrie indirecte avant d’être regroupés avec leurs congénères.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par le peptide seul n'a pas montré d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures. Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Afin de suivre la glycémie, un implant télémétrique sera introduit au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par l’utilisation d‘analgésiques adaptés. Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6h avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : Perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux. Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique. Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés en cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : isolement des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à morts afin de prélever les organes pour permettre une étude histologique.
Remplacement
Pour mieux comprendre la fonction des doubles analogues, nous caractérisons leurs effets en sélectionnant les deux molécules les plus prometteuses sur des lignées de cellules bêta-pancréatiques, ainsi que sur des lignées cellulaires préalablement transfectées avec les récepteurs d'intérêt. Cette méthode permet de réduire considérablement l'utilisation d'animaux dans les premières phases de l'étude. Toutefois, pour appréhender pleinement le rôle physiologique et physiopathologique de ces doubles analogues dans l'ensemble des systèmes de l'organisme, des études in vivo sont indispensables, car il n'existe pas d'alternatives non-animales appropriées à ce stade. Dans ce contexte, la grenouille a déjà été utilisée dans des recherches antérieures, ayant conduit à l'identification du peptide d'intérêt. Les études ultérieures menées chez les mammifères ont confirmé son rôle crucial dans la régulation du métabolisme énergétique et glucidique, ce qui en fait un candidat de choix pour un développement thérapeutique visant les maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2. Une approche physiologique complète ne peut être réalisée que grâce à des études sur des modèles mammifères, qui offrent la meilleure approximation des processus physiologiques humains. Ces modèles sont essentiels pour évaluer les effets des doubles analogues dans un contexte proche de la physiologie humaine et pour envisager leur potentiel en tant que traitement innovant contre le diabète et l’obésité.
Réduction
Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons entrepris une planification expérimentale en amont et avons réalisé des estimations de puissance statistiques. Ceci permet de réduire au plus juste le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant d’avoir la puissance statistique nécessaire à nos tests. En outre, cela permet d’éviter le double emploi et la réplication d’expériences. Ces calculs ont été réalisé avec EDA (Experimental Design Assistant), ils prennent en compte l’« effect size » prévu (estimé par nos précédentes études et adapté selon la significativité scientifique de la différence, c’est-à-dire la différence minimale ayant une conséquence scientifique significative), la déviation standard prenant en compte la variabilité inter-individuelle, le type de test statistique prévu, la puissance statistique et le risque alpha. Le design de nos expérimentations prévoit quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple) qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à minimum trois individus par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. Pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle des doubles analogues dans la régulation de l’homéostasie glucidique et de comprendre les mécanismes d’actions de ces peptides. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Etude de l’activité cérébrale chez la souris vigile modèle expérimental de la maladie de Parkinson (1/2).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées du cerveau dans un premier établissement puis descendues par monte-charge du quatrième au premier étage vers un second pour les enregistrements, 360 souris vont être utilisées dans ce volet initial, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. La chirurgie dure une heure quinze à une heure trente, suivie de quatre tests moteurs de huit minutes et de trois jours d'apprentissage à quarante-cinq minutes par jour, la moitié des animaux recevant en plus une injection abdominale d'une molécule pharmacologique. Saignement intracérébral, douleurs aiguës après la pose des implants, infection, contention crânienne : le porteur liste les atteintes prévisibles sans les chiffrer. Le bénéfice annoncé tient à une meilleure compréhension de la connexion entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, face à un déficit moteur induit avec perte de poids et comportements de rotation, avant la mise à mort des 360 souris pour analyse histologique.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie qui touche le cerveau et provoque des troubles du mouvement, comme des tremblements ou une raideur musculaire mais provoque aussi des troubles non-moteurs. Cette pathologie est caractérisée par la perte progressive de certains neurones dans une zone spécifique du cerveau appelée « substance noire », qui produisent une substance essentielle au bon fonctionnement du cerveau : la dopamine. Dans ce projet, nous nous intéressons à une autre région du cerveau très importante dans cette maladie : le noyau sous-thalamique. Ce noyau joue un rôle central dans la coordination des mouvements et pourrait être impliqué dans l’apparition des symptômes de la maladie de Parkinson. Cependantt, certaines connexions de ce noyau, notamment avec le cortex moteur (la zone qui contrôle les mouvements volontaires), sont encore mal connues. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment cette voie de communication fonctionne dans le contexte de la maladie de Parkinson. Pour cela, nous avons entrepris d’étudier l’activité des neurones du cortex moteur de souris atteintes de Parkinson, grâce à des techniques sophistiquées comme l’imagerie cérébrale en temps réel. Nous pourrons ainsi tester l’impact de la stimulation ou de l’inhibition de cette voie sur le fonctionnement du cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de ces circuits cérébraux dans la maladie, et à long terme, il pourrait aider à concevoir de nouveaux traitements plus précis et plus efficaces pour les patients atteints de Parkinson. Ce projet se déroule dans 2 établissements Utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la connectivité entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, ce qui va contribuer significativement aux connaissances sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson.
Procédures
Chirurgie : (se déroulera dans l'établissement Utilisateur: EU1). sous - anésthésie générale, les 360 animaux du projet recevront une chirurgie au niveau du cerveau, durée moyenne : 1h15 à 1h30. Le reste des interventions se dérouleront dans l'établissement Utilisateur: EU2 (même bâtiment). Comportement: -Tous les animaux (n=360) recevront le test de comportement moteur , durée : 8 minutes (4 fois soit 2x avant la chirurgie et 2 x après la chirurgie). -Tous les animaux (n=360) recevront l’apprentissage de la tâche motrice pendant 3 jours soit 45 min par jour. Puis 180 souris réaliseront cette tâche pendant la séance d'imagerie (d’enregistrement de l’activité) (1 fois) et 180 la réaliseront 2 fois. - 180 animaux vont recevoir une injection abdominale d’une molécule pharmacologique et une injection du serum physiologique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle de la maladie de Parkinson, qui entraîne un déficit moteur caractérisé par une réduction de l’activité locomotrice, une perte de poids et des comportements de rotation. D'autres effets indésirables prévisibles peuvent inclure : • un risque de saignement intracérébral, • des douleurs aiguës post-chirurgicales, notamment liées à la pose d’implants, • un risque d’infection associé à l’intervention chirurgicale et à la présence de matériel implanté, • un stress à court terme induit par l’utilisation de la contention crânienne, le stress physiologique associé à l’anesthésie générale •la douleur liée aux injections abdominales.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation, soit 360 souris pour une analyse précise histologique afin de valider l'ensemble des résultats.
Remplacement
Le but du projet est de caractériser l’activité électrique des neurones pyramidaux du cortex moteur en lien avec le noyau sous-thalamique. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections dans le cerveau, afin de faire exprimer des protéines capables de moduler l’activité du de ce noyau, combinées aux enregistrements de l’activité électrique in vivo chez l’animal réalisant une tâche comportementale. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions nécessaires pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles. Au-delà de l’intérêt de comparer les effets obtenus chez les 2 sexes, ceci permet d’inclure tous les animaux transgéniques des portées produites pour ce projet afin d’éviter que des animaux de l’autre sexe soient euthanasiés inutilement. La qualité de nos procédures qui est basée sur des années d'expériences, ce qui nous permettra de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle. Le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe.
Raffinement
Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie (2 fois par jour y compris le WE) jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place de mesures conservatoires si besoin. Des points limites suffisamment précoces sont définis. Les animaux seront ainsi suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques. En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie et ce pendant 3 jours après la chirurgie et 15 jours pour les souris lésées, modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs dure 3 min environ (du 4° au 1er étage), il se fait par le monte-charge. Les souris sont transportées dans des cages opaques dédiées au transport interne avec litière et papier. Les groupes sociaux sont respectés pendant le transport.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central (cerveau et moelle épinièredes vertébrés). En effet, c'est un mammifère présentant un lien de parenté proche avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologiques neurologiques telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris à l'aide de neurotoxines, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette étude n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le cerveau et la moelle épinière sont matures. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.
Implantation d’embryons dans des femelles porteuses pseudogestantes
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Assurer le statut sanitaire des lignées commandées par des utilisateurs extérieurs passe par 1 500 souris femelles, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Accouplées à des mâles vasectomisés pour être rendues pseudogestantes, elles subissent une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour qu'on leur implante des embryons, avec un risque d'infection au point d'incision et une douleur modérée. Le porteur ne décrit la procédure qu'en une phrase. Celles qui ne portent pas sont tuées, les autres le sont après le sevrage des souriceaux, et le porteur compte cette méthode comme une réduction du nombre d'animaux parce qu'elle évite de maintenir des lignées en accouplement permanent.
Objectifs
Ce projet vise à assurer la continuité et la qualité sanitaire des lignées de souris utilisées en recherche, par la mise en œuvre de deux prestations complémentaires :(1) la redérivation de lignées afin de les adapter au statut sanitaire exigé par notre zone d’hébergement, et (2) la reviviscence de lignées à partir d’embryons cryoconservés. Ces procédures impliquent toutes la réimplantation d’embryons dans des femelles pseudogestantes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à produire des souriceaux présentant des caractéristiques génétiques définies et un statut sanitaire contrôlé, indispensables à la réalisation de recherches biomédicales ou fondamentales de nos utilisateurs. Il repose sur deux prestations : la redérivation de lignées pour assainissement sanitaire, et la reviviscence de lignées à partir d’embryons cryoconservés. L’obtention d’animaux génétiquement modifiés permet de modéliser des pathologies humaines ou d’étudier des fonctions biologiques spécifiques, tandis que le maintien d’un haut niveau sanitaire garantit la fiabilité des résultats expérimentaux, la sécurité des installations et la conformité aux exigences réglementaires. 1. La redérivation de lignées, qui permet d’éliminer des agents pathogènes ou opportunistes pouvant compromettre les résultats expérimentaux, la santé des animaux ou la sécurité des installations. Cette opération est essentielle pour introduire ou maintenir des lignées dans des zones d’animalerie à statut sanitaire élevé. 2. La reviviscence de lignées à partir d’embryons cryoconservés, qui offre la possibilité de restaurer des lignées précieuses sans recourir à une reproduction continue. Elle répond également à des besoins ponctuels de recherche, tout en contribuant à la réduction du nombre d’animaux élevés sans usage immédiat.
Procédures
Les femelles subissent une chirurgie sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie de ré-implantation peut entrainer une infection au point de chirurgie et une douleur modérée qui seront traités selon les recommandations du vétérinaire. Pour l infection la plaie sera néttoyée à la vetedine ou au chlorexyderm.
Devenir
les femelles ayant subi la chirurgie sont toutes mises à mort (soit si non gestation soit apres le sevrage des souriceaux)
Remplacement
Ce projet permet une prestation fournit à des utilisateurs ayant deja obtenu une DAP pour leur projet de recherche. Ils ont besoin soit de rederiver des animaux pour être conforme au statut sanitaire de la zone qui hebergera leurs animaux soit de revivifier leur lignée à partir d'embryons congelé. Cette prestation n'est atteignable qu'en reimplantant des embryons dans des femelles pseudogestantes. La transplantation d’embryons permet de garantir le statut sanitaire d’une zone de production tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Elle évite de maintenir des lignées en accouplement permanent et permet de produire un lot de souris à un moment donné, ce qui limite le nombre de portées nécessaires. Cette méthode contribue donc à une utilisation plus raisonnée des animaux, en accord avec les principes des 3R.
Réduction
La lecture des bouchons vaginaux permet de ne sélectionner que les femelles ayant effectivement été accouplées. Si aucune bouchon vaginal n'est observé, les femelles sont remises en accouplement.
Raffinement
Pour le moment les femelles sont accouplées avec des males vasectomisés et ensuite subissent une chirurgie. Les femelles pourront etre ré-implantées par voie basse. Cette technique est en cours de tests et de validation. L’efficacité de cette technqiues étant à confirmer, elle sera applicable uniquement aux modèles homozygotes et simple transgéniques. Pour faciliter la convalecence post-opératoire et reduire la douleur, la chirurgie est unilatérale. La réimplantation dans une seule corne utérine est aussi efficace qu’une réimplantation bilatérale. Chaque cage est enrichie avec des accessoires spécifiques tels qu'un igloo en plastique rouge, des bâtonnets de bois et du papier essuie-tout pour la construction de nids. Leur statut sanitaire (SOPF; sans opportuniste ni pathogène spécifique; pour cette zone) est vérifié trimestriellement. Les zootechniciens, sensibilisés aux diverses pathologies potentielles en élevage, prennent des mesures préventives pour éviter toute souffrance des animaux. Ils possèdent une expertise dans les gestes techniques et sont formés aux méthodes alternatives à la préhension par la queue. Des produits de soins sont disponibles et utilisés selon les recommandations du vétérinaire désigné. L’habituation des animaux à leur zootechnicien permet de diminuer le stress des animaux lié à la contention. Les personnels sont parfaitement formés à la technique chirurgicale qui, procédurée avec du matériel de chirurgie aiguisé et désinfecté, permet de limiter le stress et la douleur des animaux au maximum. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et l’analgésie contrôlées, sur tapis chauffant dans des conditions optimales d aseptie.
Choix des espèces
Les lignées hébergées au sein du service sont tous des modèles murins. Les procédures sont celles de prestations de services, les utilisateurs du service n’utilisent que le modèle murin. Les femelles utilisées sont au stade de maturation sexuelle (après 6 semaines en general dans notre cas).
Etude du rôle des cellules T résidentes mémoires du système immunitaire dans la tuberculose et développement de stratégies vaccinales et thérapeutiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 014 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 588 d'entre elles et sévère pour 1 426. Elles sont infectées par la bactérie de la tuberculose alors qu'elles sont éveillées, maintenues dans des tubes de contention pendant une nébulisation qui dure quarante à quarante-cinq minutes par groupe de vingt. Certaines reçoivent chaque jour pendant deux à trois semaines des molécules par gavage ou par voie intrapéritonéale, d'autres subissent une ouverture de la cage thoracique et restent jusqu'à cinq heures sous respiration artificielle, en hypothermie et déshydratation, sans être réveillées. Parmi les atteintes sévères, le porteur cite la perte de poids, la perte de pelage, l'isolement social et la difficulté à respirer, et conclut que le projet "nécessite" un "organisme entier" faute de culture cellulaire reproduisant ces interactions.
Objectifs
La tuberculose est l'une des maladies les plus meurtrières au monde, causant près de 1,5 millions de décès chaque année. Elle reste difficile à diagnostiquer et à suivre chez les patients, et il est encore compliqué de la prévenir par la vaccination ou de la traiter efficacement avec des médicaments. Même si l'on sait que le système immunitaire joue un rôle clé dans cette maladie, notre compréhension actuelle est encore limitée, ce qui complique les efforts pour améliorer le dépistage, le suivi et le traitement. Ce projet de recherche s'appuie sur des découvertes récentes qui montrent des différences dans les cellules immunitaires présentes dans les poumons de souris infectées par la tuberculose, selon qu'elles y sont plutôt sensibles ou plutôt résistantes. L'objectif est de tester de nouvelles approches, soit par des traitements qui renforcent le système immunitaire, soit par des vaccins, pour stimuler une réponse protectrice des cellules T (un type de cellules immunitaires) chez la souris. Plus précisément, le projet cherche à renforcer certaines cellules immunitaires, les cellules T « mémoires », qui pourraient jouer un rôle crucial dans la protection contre la tuberculose.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet un gain de connaissances fondamentales concernant le rôle de cellules T mémoires du système immunitaire dans le contrôle de l'infection. A partir de ces travaux, nous espérons des retombées indirectes comme par exemple le fait de pouvoir exploiter ces connaissances en proposant de possibles nouvelles approches préventives ou thérapeutiques, et ce, à partir de l'identification de stratégies vaccinales et/ou de l'utilisation de molécules pharmacologiques favorisant la résolution de l’infection en favorisant l’action des cellules T mémoires du système immunitaire. Ces démarches s'inscrivent dans la perspective de l'Organisation Mondiale de la Santé de mettre fin à la tuberculose.
Procédures
Dans ce projet, les souris seront infectées par la bactérie responsable de la tuberculose ; ceci se produit sur des animaux vigiles par l’utilisation d’aérosol et se déroule en une fois en quelques minutes. Certaines souris recevront l’administration d’un vaccin prophylactique (une seule injection dans une étape qui dure quelques minutes et qui est réalisée chez l’animal endormi) et d’autres recevront l’administration répétée de molécules thérapeutiques, réalisée sur des animaux vigiles de façon répétée (au maximum une fois par jour) pendant 2 à 3 semaines. Certaines souris seulement infectées subiront une chirurgie au niveau de la cage thoracique (une seule fois sous anesthésie générale et pour une durée de 5 heures au maximum).
Impact sur les animaux
Pour les souris recevant la vaccination (procédure 2), un stress faible lié à l’injection et à l’anesthésie est attendu, depuis l’endormissement jusqu’à la vaccination, qui ne durera pas plus de trois minutes au total. Pour les souris recevant les anticorps ou molécules thérapeutiques (procédure 3 et 4), un stress léger est attendu pour les administrations qui se feront par voie intrapéritonéale ou par gavage. Pour les souris infectées par M. tuberculosis (procédures 1, 2, 3 et 4), les nuisances attendues sur les animaux seront engendrées suite à la nébulisation et à l'induction de la pathologie pulmonaire. Les nuisances liées à la nébulisation sont : un stress modéré depuis leur installation et leur désinstallation dans les tubes de contention. L’ensemble de la nébulisation durera entre 40 et 45 minutes pour une infection de 20 souris (la mise en place de toutes les souris dans les tubes de contention, le cycle de l’infection et le démontage des tubes de contention). Les nuisances sévères observées durant la période d’infection sont : la perte de poids ou de pelage, l’isolement social ainsi que la tachypnée ou la dyspnée. Pour l’imagerie intravitale (procédure 1), les souris subiront un stress faible lors de injections IV par voie retro-orbitale qui ne dureront pas plus que 10 secondes. L’anesthésie provoquera une hypothermie et une déshydratation chez la souris durant la procédure chirurgicale qui ne durera pas plus de 20 minutes. Une fois sous respiration artificielle, la souris subira les mêmes nuisances (hypothermie et déshydratation) lesquelles dureront pendant la phase d’acquisition au microscope ne dépassera pas une durée de cinq heures.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences car celles-ci sont réalisées dans un environnement infectieux et que le poumon doit être analysé comme point final.
Remplacement
Nous nous intéressons à l’impact des cellules T mémoires dans la tuberculose. Etant donné que les populations de lymphocytes d’intérêt sont assez rares, qu’elles sont pour certaines accessibles seulement dans les poumons et qu’il n'existe aucun modèle cellulaire ni de possibilité de culture ex vivo, nous devons utiliser un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclut les modèles multicellulaires du type "organoïde"). Une partie de l’étude porte sur le comportement des lymphocytes notamment leur dynamique de déplacement, leur localisation pulmonaire et leurs interactions avec les cellules infectées dans l’environnement pulmonaire. L’autre partie vise à mobiliser ces cellules sur le site infectieux dans un cadre de thérapies ciblant l’hôte ou de vaccinations. L’ensemble de ces événements sont étroitement liés à certains paramètres physiologiques tels que la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et le microenvironnement des poumons. Il n’existe aucun modèle cellulaire de culture ex vivo à ce jour qui recapitule cette complexité d’interactions. De ce fait, afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire et un tissu pulmonaire suffisamment proche de l’homme. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier telles les souris vivantes.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 2014 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré trois étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, certaines étapes de nos projets pourront en effet être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des promesses offertes par les résultats. Nous possédons une forte expertise dans le domaine de la microscopie intravitale des poumons ce qui nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Pour les thérapies ciblant l’hôte et la vaccination, nous disposons là aussi d’une forte expertise qui nous a permis de développer des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés. Finalement, l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille minimale des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Des tests statistiques seront utilisés sur des lots de 6 animaux par test.
Raffinement
Dans ce projet, plusieurs étapes peuvent causer de la douleur, du stress ou de l’inconfort aux animaux, et nous les prenons en compte pour minimiser ces effets : • Vaccination : Elle se fait sous anesthésie pour éviter la douleur. • Administration de substances : Nous privilégions des méthodes non douloureuses, comme les aérosols ou la prise d’eau, ou faiblement douloureuses comme certaines injections. • Injections spéciales : Elles sont réalisées sous anesthésie et avec un analgésique pour éviter toute douleur. • Suivi des souris infectées : Les souris sont surveillées quotidiennement pour repérer tout signe de souffrance. Si leur état se dégrade, elles sont mises à mort pour éviter toute souffrance inutile. • Chirurgie pour l'observation au microscope : Les souris reçoivent des anesthésiques et des analgésiques pour éviter la douleur, et leur confort est surveillé pendant toute la procédure. Elles ne sont pas réveillées après l'intervention. Ainsi, chaque étape est encadrée pour assurer le bien-être des animaux autant que possible.
Choix des espèces
Il existe plusieurs modèles animaux pour étudier la tuberculose, comme les singes, les poissons ou les rongeurs. Nous avons choisi d’utiliser des souris, car elles réagissent de manière similaire aux humains en termes de réponse immunitaire et de développement de la maladie. En particulier, certaines souris développent des lésions pulmonaires ressemblant à celles observées chez l’homme, ce qui permet une étude plus représentative. Les souris offrent aussi l’avantage de pouvoir utiliser des outils précis pour suivre les cellules du système immunitaire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris d’un groupe génétique commun, ce qui permet d’éviter des différences qui pourraient fausser les résultats. Pour ce projet, seules des souris adultes de 6 à 12 semaines seront utilisées, car leur système immunitaire est suffisamment développé à cet âge pour fournir des résultats pertinents.