Recherche fondamentale

4 500 souris vont être utilisées, chacune soumise jusqu'à trente-deux semaines de régime gras associé à un composé qui élève la pression artérielle, quarante heures en cage individuelle sans enrichissement et vingt-quatre heures en cage métabolique sur grille. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une à deux administrations par jour, des pompes implantées sous la peau au cours d'une chirurgie de dix à quinze minutes, trois prises de sang, des mises à jeun de six heures et des courses sur tapis roulant. Le porteur attend de ce modèle qu'il permette d'évaluer de futurs médicaments contre l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, et précise que les animaux seront traités avec les molécules de ses clients, aux doses que ceux-ci auront fixées.

Objectifs

Les désordres métaboliques (diabètes, obésité, ...) et le vieillissement augmentent le risque de maladies cardiovasculaires dont l’insuffisance cardiaque, qui touche 1 à 1,5 millions de Français. On distingue deux types d’insuffisance cardiaque. D’un point de vue étiologique et physiopathologique, les 2 formes d'insuffisance cardiaque sont très différentes. La forme à fraction d’éjection préservée (50 % des cas) est une maladie qui se manifeste de plusieurs façons et présente une physiopathologie complexe. À l’heure actuelle, le traitement de cette forme d’insuffisance cardiaque ne repose sur aucune recommandation solide. Jusqu’à il y a peu, il était d’usage d’appliquer aux patients les mêmes stratégies thérapeutiques que celles utilisées pour les patients souffrants d’une de l’autre forme d’insuffisance cardiaque. Parmi les facteurs de risque identifiés figurent : l’âge, le sexe féminin, les maladies métaboliques (diabète et obésité), l’hypertension, … Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie, il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie de cette maladie, en incluant une ou plusieurs comorbidités. Le développement de modèles prédictifs et robustes ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels.

Bénéfices attendus

Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, donc présentant plusieurs comorbidités afin d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouvelles cibles ou futurs médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.

Procédures

Pour induire une insuffisance cardiaque chez la souris, des régimes gras associés à un composé chimique augmentant la pression artérielle seront mis à disposition dans les cages d'hébergement (jusqu’à 32 semaines de procédure). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par voie : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié ou vigile. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 à 15 minutes sous couverture analgésique). Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés (à 3 reprises pendant les 32 semaines). Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Pour les mesures de paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose pourront être effectués (des mesures répétées du taux de sucre dans le sang après administration de sucre). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (20 minutes maximum). L’exploration de la fonction métabolique se fera sur animaux vigiles. Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement. Pour la fonction rénale, la mise en place d’un patch, nécessitera une courte anesthésie (moins de 10 minutes) puis sera effectuée sur animaux vigiles. La mesure des paramètres urinaires se fera en cage métabolique (24 heures). Au maximum, ces examens seront effectués à la fin de l’induction, au milieu et à la fin des traitements. Bien que non invasifs, ils requièrent pour la plupart une anesthésie gazeuse qui pourrait impacter les mesures. Ainsi, il aura 3 examens par semaine maximum. Au-delà, ils devront être distribués sur plusieurs semaines. Pour faire les échographies et fixer les patchs, nous devrons au préalable dépiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. En fin de procédure, les animaux seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.

Impact sur les animaux

Le modèle induit progressivement une dysfonction cardiaque associée à d’autres comorbidités. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), prises hydriques et alimentaires (poids et hydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Les animaux seront nourris, au plus tôt à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet avec un régime enrichi en graisse pour une durée de 32 semaines. Cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer un inconfort. Les administrations (jusqu’à 12 semaines, 1 à 2 fois par jour) et les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer un stress léger à modéré et une douleur légère (piqûre). Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires en cages métaboliques, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h générant un stress et un inconfort. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder à la collecte des organes et du sang pour l'évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans les organes cibles, paramètres métaboliques et de fonction rénale et cardiaque dans le sang...)

Remplacement

Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions cardiaques associées aux complications métaboliques, vasculaires et rénales ne peuvent être pleinement reproduites que dans un système in vivo pour le moment. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.

Réduction

Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte la mortalité (environ 10%) et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (10% des animaux exclus après randomisation à la fin de l’induction). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par régime, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal sur les paramètres cardiovasculaires, métaboliques et rénaux pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), une grille de score spécifique est mise en place. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Des mesures de la fonction cardiaque, vasculaire, rénale et métabolique peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques non invasives. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles (tapis de course/cage métabolique), une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré et per-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.

Choix des espèces

Les souris sont largement utilisées et caractérisées par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires et cardio-métaboliques. Il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe,, …). L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 4 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie.

Une injection dans le vitré ou sous la rétine, parfois répétée trente jours plus tard, puis une imagerie de l'œil sous anesthésie et jusqu'à deux électrorétinogrammes de moins d'une heure : 2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une opacification possible de la cornée et des saignements dans l'œil quand un vaisseau est touché. Il s'agit de tester une thérapie génique neuroprotectrice contre les dégénérescences de la rétine, avec un taux de réussite d'injection annoncé entre 50 et 75 %, les souris mal injectées étant tuées sur place encore sous anesthésie. L'effectif de 2 000 souris sur cinq ans est présenté comme "ajustable" sans autre justification, et les tests comportementaux censés mesurer la vision ne sont pas nommés.

Objectifs

Certaines maladies des yeux provoquent la mort progressive des cellules sensibles à la lumière (appelées photorécepteurs) dans la rétine, ce qui entraîne une perte de la vision. Ces maladies, comme les rétinites pigmentaires, le glaucome ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), touchent des millions de personnes dans le monde. Leur fréquence augmente avec l’âge, et il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour la plupart d’entre elles. Notre projet vise à développer une nouvelle approche pour protéger les cellules de la rétine avant qu’elles ne meurent. Cette stratégie est dite "neuroprotectrice" : elle ne vise pas à remplacer les cellules perdues, mais à préserver celles qui sont encore vivantes. L’avantage est qu’elle pourrait s’appliquer à un grand nombre de patients, quel que soit le type exact de mutation génétique ou la cause précise de la maladie. Pour cela, nous utilisons une technique appelée thérapie génique. Elle consiste à introduire dans l’œil, grâce à un virus inoffensif (appelé AAV, pour adeno-associated virus), un gène protecteur qui aide les cellules à survivre. Ce gène a été identifié comme capable d’activer des mécanismes naturels de survie dans les cellules de la rétine. Le but de ce projet est de tester cette thérapie dans plusieurs modèles expérimentaux de maladies de la rétine, et de comprendre comment elle agit au niveau cellulaire.

Bénéfices attendus

Il existe peu de traitements pour les maladies de la rétine, et la plupart ne sont efficaces que pour certains patients selon leur mutation génétique. Notre projet vise à développer une thérapie génique applicable à un large nombre de cas, quel que soit le type de mutation. En testant cette approche dans plusieurs modèles, nous espérons poser les bases d’un futur traitement plus universel, avec à terme un développement clinique possible pour les patients.

Procédures

Une partie des animaux du projet recevrons une injection intravitréenne durant max 5 minutes et un certain nombre de ces animaux recevront une deuxième injection intravitréenne 30 jours plus tard. Une autre partie des animaux du projet recevrons une injection sous rétinienne durant 5 minutes max et un certain nombre de ces animaux recevront une injection intrapéritonéale 1 mois plus tard. Tous les animaux injectés subissent une imagerie de leurs yeux tant qu’ils sont toujours sous anesthésie pour vérifier la qualité des injections (10 minutes). Certains animaux subiront un Electroretinogramme (ERG) 2 fois à des âges différents sous anesthésie générale et locale pour une durée inférieure à 1h. Des tests comportementaux pour tester la vision seront également réalisé sur une partie des animaux vigiles. Ces tests durent entre 10 et 30 minutes et seront réalisés deux fois à quelques mois d’intervalle.

Impact sur les animaux

Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Les animaux peuvent présenter des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection si un vaisseau est accidentellement touché ce qui est rare.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin des procédures auxquelles ils sont associés ; leurs rétines permettront des analyses aux échelles tissulaires, cellulaires et moléculaires. Grâce à cette méthode, nous pourrons caractériser l’ensemble des effets du traitement sans augmenter le nombre d’animaux utilisés

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Enfin, les modèles animaux permettent d’étudier les réactions comportementales et électrophysiologiques au traitement, qui seront des informations cruciales pour poursuivre ultérieurement vers un essai clinique. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter un niveau d’information suffisant. L’existence de lignées de souris atteintes de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. De nombreux mutants comme la souris rd10 présentent des mécanismes moléculaires de dégénérescence similaires à ceux observés chez les patients humains. Travailler in vivo permettra de valider nos vecteurs, les modèles in vitro ne permettant pas d’observer la réponse des cellules dans leur environnement réel. Les techniques qui seront effectuées sont peu invasives et couramment utilisées en recherche ophtalmologique.

Réduction

Notre étude se déroule sur 5 ans, et comprend l’analyse de plusieurs modèles et vecteurs thérapeutiques. Ceci est important pour vérifier que notre stratégie thérapeutique va cibler le plus grand nombre de patients ainsi que pour comprendre le mécanisme d’action. Nous indiquons ici environ 2000 souris sur 5 ans pour réaliser toutes les expérimentations que nous pensons nécessaire, mais cela sera ajustable. Si un nombre d’individus correctement injectés pour obtenir les résultats statistiques souhaités est atteint nous arrêterons les injections. Le criblage in vitro des différentes isoformes ex vivo par milieu conditionné devrait permettre d’identifier rapidement au moins une isoforme d’intérêt. Le but est d’obtenir 15 à 20 yeux traités, en fonction des expérimentations. et pour chaque vecteur. Le taux de réussite d’injection (large détachement rétinien sans fuite de liquide dans le vitrée) pouvant varier entre 50% et 75%, nous prévoyons donc plus d’animaux que nécessaire. Nous ne garderons que les animaux correctement injectés dans au moins un œil. Les autres seront sacrifiés à la fin de l’injection, encore sous anesthésie. Chaque œil pouvant être analysé séparément, le nombre d’animaux est réduit. Nous commencerons par établir la dose de vecteurs à injecter sur les temps courts. Nous comparerons ensuite l’efficacité de nos différents produits de thérapie génique, pour ne réaliser les procédures chez ce modèle qu’avec celui sélectionné à la dose efficace. Les animaux subiront divers tests détaillés dans les procédures ci-après, très peu invasifs et quasiment indolores. Grâce à nos équipements, nous pourrons réaliser nos expériences à différents temps sur les mêmes animaux. Des tests statistiques seront réalisés. Finalement, si nous nous apercevons que le traitement n’est plus efficace à partir d’un certain temps, les temps restants supérieurs ne seront pas réalisés.

Raffinement

Durant l’injection dans l’oeil, une anesthésie locale sera effectuée. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur due à l’injection dans l’oeil, les animaux recevront de manière préventive un analgésique, par injection sous-cutanée à la suite de l’opération. Que ce soit durant l’élevage ou pendant les procédures, les animaux seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire.

Choix des espèces

L’existence de lignées de souris atteintes de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. De nombreux modeles murins de dégénérescence rétinienne sont des mutants spontanés apparus dans les colonies d’élevage au cours du temps. Le modèle murin de retinite pigmentaire utilisé correspond aux pathologies humaines d’intérêts pour notre étude, avec une mutation sur un gène conduisant à une dégénérescence des photorécepteurs. Travailler in vivo permettra de valider l’efficacité de nos vecteurs. Les modèles in vitro comme les organoïdes rétiniens ne permettent pas d’observer la réponse des cellules dans leur environnement réel (interaction avec l’épithélium pigmentaire rétinien, absence de vascularisation et de cellules immunitaires). De plus, les modèles murins sont nécessaires afin de tester l’efficacité du traitement en mesurant des réponses comportementales et électrophysiologiques. Les résultats précliniques in vivo sont également nécessaire d’un point de vue règlementaire si nous voulons conduire ce produit jusqu’à un essai clinique. Les techniques qui seront effectuées sont peu invasives et couramment utilisées en ophtalmologie chez l’homme. En ce qui concerne l’âge des animaux utilisés il est déterminé par l’âge d’apparition de la maladie et sur le fait que chez la souris les paupières s’ouvrent 14 jours après la naissance quand la rétine a fini de se développer. A ce stade l’œil a une taille correcte permettant l’injection des doses nécessaires.

Modifiées pour n'exprimer qu'un récepteur humain à la place du récepteur murin, 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales de côlon ou de pancréas sous anesthésie générale, puis des chimiothérapies une fois par semaine pendant trois semaines et jusqu'à cinq injections de la molécule testée. Les tumeurs peuvent gêner leurs mouvements et se nécroser, et les souris sont tuées quand la tumeur atteint une taille limite ou en cas de perte de poids. La molécule a déjà été administrée à des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques, où elle a été bien tolérée, mais le porteur indique qu'elle active le récepteur chez la souris alors qu'elle l'inhibe chez l'humain, ce qui le conduit à construire un modèle murin porteur du récepteur humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester l’efficacité de la combinaison thérapeutique de chimiothérapies et d’une molécule bloquant un récepteur humain et rechercher le mécanisme mis en jeu. Ce projet a comme origine un essai clinique de phase I réalisé avec cette molécule sur des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques. Cette molécule s’est révélée être bien tolérée par les patients, ne pas présenter de toxicité et il y a eu stabilisation de la maladie pour certains des patients inclus. L’étude de l’effet anti-tumoral de cette molécule avait été réalisée dans des modèles de rongeurs, or il s’est avéré que cette molécule qui active le récepteur chez la souris, au contraire inhibe ce même récepteur chez l’Homme. Ce projet a donc comme but d’élucider le mécanisme anti-tumoral de cette molécule dans un modèle de souris exprimant le récepteur humain et non murin. Nous chercherons également à montrer l’intérêt d’associer cette molécule à des chimiothérapies pour augmenter l’efficacité anti-tumorale de cette thérapie. En effet, un nouvel essai clinique est en projet et inclura des patients porteurs de tumeurs coliques ou pancréatiques traitées par des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Afin de pouvoir finaliser la mise en place d’un nouvel essai clinique chez les patients porteurs de cancers pancréatiques et coliques, il est nécessaire de déterminer l’efficacité thérapeutique de ces combinaisons dans ce modèle de souris exprimant uniquement un récepteur humain, ainsi que de comprendre le mécanisme mis en place. A l’issu de ce projet, l’essai pourra débuter et à terme nous comptons bien pouvoir proposer un nouveau type de traitement pour les patients atteints de ce type de tumeurs.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection des chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines - injection de la molécule, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales, ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées des traitements pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - La molécule est également utilisée à des doses déjà bien établies dans les modèles murins et induit un léger épisode fébrile qui ne devrait pas être présent dans ces souris humanisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur pourra être prélevée.

Remplacement

L’effet de la molécule combinée ou non à des chimiothérapies a déjà fait l’objet de nombreuses expériences in vitro en utilisant des cellules cancéreuses et immunitaires humaines, porteuses du récepteur humain. Cependant pour démontrer l’efficacité anti-tumorale de ces combinaisons, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant l’ensemble des cellules présentes dans les tumeurs : cellules immunitaires, fibroblastes, vaisseaux sanguins… De plus, cette démonstration nécessite aussi que ces organismes présentent un récepteur humain d’où ce modèle de souris humanisées pour ce récepteur.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage. En cas de nécroses sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, un produit cicatrisant sera utilisé. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection de la molécule, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Le fait que la molécule, ciblant le système immunitaire, a un mode d’action différent sur le récepteur humain de ce qui est retrouvé sur le récepteur murin nous oblige à utiliser un modèle de souris modifiées pour n’exprimer que le récepteur humain. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Des prélèvements dans l'os du tibia toutes les trois semaines, des prises de sang tous les vingt et un jours et des injections d'anticorps deux fois par semaine attendent 9 724 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le myélome leur est inoculé par injection de cellules tumorales murines ou humaines, et le RNT décrit ensuite des douleurs chroniques, des ulcérations, une anémie, une immunosuppression persistante et une mobilité qui se dégrade. L'objectif déclaré est d'évaluer des anticorps monoclonaux et bispécifiques avant des essais chez l'humain. Le porteur écrit néanmoins que ce protocole "vise à réduire l'utilisation d'animaux" et que les interventions "visent à minimiser la souffrance animale", alors que les 9 724 souris seront toutes tuées pour prélèvements post mortem.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le myélome multiple, en particulier à travers l'immunothérapie, afin d'augmenter l'efficacité des traitements actuels et, à terme, induire la guérison des patients à long terme. Cela inclut l'évaluation de l'activation des lymphocytes tueurs par l'administration d'anticorps monoclonaux, en testant ces approches sur des modèles murins de myélome. L'objectif est également de suivre le comportement des cellules immunitaires in vivo pour mieux comprendre leur rôle dans la lutte contre la tumeur et d'identifier des solutions thérapeutiques innovantes qui pourraient être validées avant des essais cliniques sur l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet offre des bénéfices multiples pour la recherche fondamentale et les traitements cliniques du myélome multiple, en répondant aux questions clés des immunothérapies et en optimisant leur efficacité. L’étude de l’action des anticorps monoclonaux ou bispécifiques et leur association avec des chimiothérapies classiques vise à surmonter les résistances observées chez certains patients et à augmenter les taux de réponse à long terme. Ces travaux permettront aussi d’identifier de nouvelles cibles immunologiques et d’approfondir notre compréhension des rôles de molécules spécifiques et des mécanismes d’action des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules NK dans le contexte tumoral, avec des implications directes pour les thérapies humaines. Les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) sont des cellules du système immunitaire capables de reconnaître et de détruire les cellules tumorales ou infectées, en libérant des substances cytotoxiques. De leur côté, les cellules NK (Natural Killer)sont des acteurs clés de l'immunité innée qui éliminent les cellules anormales sans nécessiter d’activation préalable par un antigène, jouant ainsi un rôle crucial dans la surveillance immunitaire contre le cancer. Grâce aux études croisées entre modèles humanisés et murins, ce projet permettra de relier directement les résultats aux thérapies appliquées en clinique, avec l’ambition d’élaborer des traitements plus ciblés, limitant les effets secondaires et adaptés au profil de chaque patient. En parallèle, ce protocole vise à réduire l'utilisation d’animaux en maximisant la collecte de données longitudinales, conformément aux exigences éthiques modernes. Enfin, en testant l'efficacité des combinaisons d’immunothérapie et de chimiothérapie, ce projet constituera une base solide de données précliniques pour accélérer la transition vers des essais cliniques, soutenant ainsi l'intégration de nouvelles approches dans le traitement du myélome multiple.

Procédures

Dans le cadre de ce protocole, les animaux subiront plusieurs interventions afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le myélome multiple. Voici les principales interventions : 1. Prélèvements sanguins : Réalisés tous les 21 jours. 2. Injections de traitements : Administration d’anticorps monoclonaux et anticorps bispécifiques Fréquence : deux fois par semaine, pendant 2 semaines max. 3. Injections de cellules tumorales: Pour induire le myélome, des lignées murines ou humaines sont injectées. 4. Prélèvements intra-osseux : Prélèvements intratibiaux toutes les 3 semaines pour évaluer la croissance tumorale. 5. Suivi de la croissance tumorale : Mesures fréquentes de la taille des tumeurs. 6. Analgésie et soins : Administration d'analgésique (20 min avant le prélèvement) pour soulager la douleur. Les animaux présentant des signes de souffrance seront euthanasiés. Ces interventions visent à minimiser la souffrance animale tout en assurant le suivi des traitements expérimentaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce protocole expérimental visant à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le myélome multiple, les animaux sont susceptibles de présenter diverses nuisances, dont certaines peuvent s’inscrire dans la durée. Les prélèvements sanguins répétés, peuvent induire une anémie modérée et un stress physiologique cumulatif sur une période de plusieurs jours à plusieurs semaines. Les injections de cellules tumorales et les administrations de traitements sont susceptibles d'entraîner des effets secondaires systémiques prolongés, tels qu’une perte de poids progressive ou une immunosuppression persistante, pouvant affecter le bien-être sur le moyen terme. Les prélèvements intra-osseux, réalisés ponctuellement sous anesthésie, comportent un risque limité mais réel de douleur post-procédure ou de boitement temporaire, généralement de courte durée (24 à 72 heures), nécessitant une surveillance clinique ciblée. Le développement tumoral peut, quant à lui, s’accompagner de douleurs chroniques, d’ulcérations et d’une altération progressive de la mobilité, avec une intensification des signes cliniques au fil des jours, imposant des critères d’arrêt clairs et anticipés (CF grille de scoring) Enfin, la manipulation fréquente des animaux, associée aux contraintes environnementales liées aux procédures expérimentales, représente un facteur de stress chronique non négligeable, dont les effets peuvent s’accumuler tout au long de l’étude. Une surveillance rapprochée, associée à des mesures de raffinement (anesthésie, analgésie, période de récupération, limitation des interventions non essentielles), est mise en place afin de limiter au maximum la durée et l’intensité de ces nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélèvement post mortem.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans ce protocole n’intervient qu’après une phase approfondie d’études in vitro sur des modèles cellulaires. Ces recherches préliminaires ont permis de démontrer l’importance des facteurs étudiés dans la régulation des mécanismes biologiques liés au myélome multiple. Ces approches in vitro, incluant notamment des co-cultures cellulaires et des tests fonctionnels sur les récepteurs et les cytokines, permettent de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires en validant en amont les hypothèses expérimentales. Ainsi, les modèles murins ne sont utilisés que pour des validations finales indispensables, lorsque les systèmes cellulaires ne permettent plus de répondre aux questions scientifiques posées. Cette démarche s’inscrit pleinement dans le principe de remplacement des 3R.

Réduction

Le principe de Réduction, dans le cadre des 3R, vise à minimiser le nombre de souris utilisées tout en assurant la solidité scientifique des résultats. Dans ce protocole, une planification rigoureuse des expériences, appuyée par des analyses statistiques, permet de déterminer avec précision le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives, évitant ainsi toute expérimentation superflue. L’emploi de suivis longitudinaux, tels que des prélèvements sanguins ou intratibiaux répétés, permet d’optimiser la collecte d’informations sans accroître le nombre de sujets utilisés. Par ailleurs, le partage des données entre équipes de recherche et le recours à des modèles complémentaires, comme les systèmes in vitro ou les simulations informatiques, renforcent l’efficacité des études tout en limitant le recours aux animaux.

Raffinement

Le principe de raffinement est appliqué dans ce protocole pour assurer les meilleures conditions de bien-être animal tout au long de l’étude. Une procédure rigoureuse de suivi quotidien des souris est mise en place, permettant d’observer tout signe de stress ou de souffrance. En cas de douleur, des mesures adaptées, comme l’administration d’analgésiques, sont immédiatement appliquées pour limiter les effets indésirables des interventions. De plus, des techniques minimisant l’inconfort, comme l’utilisation de méthodes non invasives et des conditions de logement enrichies, contribuent à réduire le stress. Cette approche vise à respecter les exigences éthiques tout en maintenant la qualité scientifique des données obtenues.

Choix des espèces

Les modèles souris sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. Ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisées en clinique

Capturés à la palangre, à la canne ou au chalut, gardés jusqu'à deux heures en vivier, puis anesthésiés pour recevoir une marque acoustique implantée dans l'abdomen en moins de cinq minutes, 500 poissons sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent bars et quatre cents poissons d'autres espèces sont concernés, parmi lesquels des requins-taupes, des roussettes, des raies et des soles. Le porteur décrit un stress de capture de quinze minutes à une heure, des douleurs postopératoires de quelques heures et un réveil surveillé de trois à dix minutes, et reconnaît que ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. Tous les individus marqués sont ensuite relâchés là où ils ont été pris, pour que leurs déplacements autour de six parcs éoliens en mer soient suivis pendant cinq ans.

Objectifs

Les espèces marines mobiles jouent un rôle essentiel pour relier entre eux les habitats marins. Le développement actuel des parcs éoliens en mer en Europe modifie ces habitats, impactant potentiellement les communautés biologiques et les liens naturels entre les zones marines. Les poissons peuvent voir leur distribution, abondance et comportement affectés en raison d'effets directs et indirects, tels que les effets ‘récif’, ‘d’agrégation’ et ‘barrière’, ainsi que la perte d'habitat et les perturbations acoustiques, influençant ainsi la dynamique des populations. Ce projet suivra les déplacements de plusieurs poissons pour comprendre comment ils relient les habitats entre Atlantique et Manche. Il identifiera leur usage des milieux naturels (fonds marins) et artificiels (structures humaines), repérera les zones partagées avec les installations en mer, et aidera à définir des stratégies de gestion adaptées. Les espèces ciblées incluent le requin-taupe commun, l’émissole tachetée, la petite et grande roussette, les raies bouclée, brunette, lisse et douce, le bar, les daurades grise et royale, la pagre, les poissons plats (sole, plie, barbue), le grondin rouge et le lieu jaune. L’objectif repose sur la télémétrie acoustique, qui permettra de suivre les déplacements de ces espèces durant 5 ans, le long des façades Manche - Atlantique. Cette méthode utilise des émetteurs envoyant des signaux ultrasonores à 69 kHz, captés par des récepteurs (hydrophones) disposés dans la zone d’étude. La brièveté et l’espacement des signaux réduisent le risque de perturbation chronique ou de masquage acoustique. La fréquence d’émission, hors de la plage de communication principale de la plupart des mammifères marins, limite les risques d’interférence. Les données suggèrent un faible impact, à confirmer par d’autres études. Les récepteurs sont ensuite récupérés pour accéder aux données de détection des individus marqués. Ce suivi à long terme permettra de mieux comprendre les dynamiques de déplacement et d’utilisation de l’espace dans le temps par les espèces ciblées à différentes échelles spatiales. La télémétrie par marquage électronique utilise des balises DST (Data Storage Tag) enregistrant des données environnementales (température, profondeur, lumière) utilisées pour modéliser les mouvements des animaux. La récupération de ces balises (via recapture ou largage) est nécessaire pour accéder aux données.

Bénéfices attendus

L’identification des zones vitales pour le cycle de vie des poissons est indispensable à la gestion durable des ressources halieutiques. Cependant, leurs localisations et leurs utilisations par différentes espèces restent largement méconnues . Au vu de la forte croissance de l’éolien en mer et de son potentiel impact sur les zones fonctionnelles des ressources halieutiques, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces installations sur les écosystèmes marins. Ce projet apportera des informations concertes sur la réponse des espèces à l’installation et la présence de ces nouvelles structures artificielles. Six parcs éoliens en mer, en construction ou en exploitation, serviront de sites d’études permettant une analyse comparative des impacts selon différents contextes de développement. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et ainsi répondre aux questions suivantes: les espèces interagissent-elles avec les parcs éoliens en mer ? comment réagissent-elles à l’implantation d’une structure physique en mer ? Quelle est la fidélité dans le temps de ces espèces aux parcs éoliens en mer ? Quel est-ce que les espèces se déplacent entre ces parcs éoliens en mer et les autres habitats marins naturels de la région au cours du temps ? Font-ils preuve d’une fidélité pluriannuelle à certains sites ? Si oui, à quelle(s) saison(s) ? Comment les conditions environnementales influencent-elles ces tendances ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur les espèces de poissons fréquentant la zone hauturière Manche/Atlantique. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces espèces d’intérêt, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour la mise en place de suivis pérennes des populations au sein des parcs éoliens en mer à venir afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines.

Procédures

Les espèces de poissons de ce projet seront capturées par des pratiques de pêche les moins impactantes possibles sur la condition physique des animaux et permettant un taux de survie optimal (ex. pêche à la ligne, palangre, court trait de chalut). 500 poissons, sauf les poissons plats, seront marquées chirurgicalement par la pose d’une marque interne sous anesthésie générale. L'acte de chirurgie dure moins de 5 minutes par individu. Sur ces mêmes individus, un marquage d’identification externe sera effectué sur la nageoire caudale, permettant l’identification des individus marqués. Les poissons plats (soles, plies) seront marqués sous anesthésie générale avec la pose d’un émetteur externe sur la nageoire pectorale de l’individu. L’acte de pose de l’émetteur en lui-même dure moins de 5 minutes par individu. Les individus seront relâchés dans la zone de capture le plus rapidement possible en bonne condition.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de cette procédure incluent : - Le stress à la capture par pêche à la palangre (nuisance modérée, 15min à 1h selon les conditions de manipulation), pêche à la canne (nuisance modérée, de courte durée < 10min), et pêche au chalut (nuisance modérée, de courte durée < 30min )- la période de captivité avant intervention (nuisance faible à modérée, durée variable de quelques minutes à 2h), - L’implantation de la marque interne (nuisance modérée, durée < 15min), - L’implantation de la marque externe (nuisance faible à modérée, durée

Devenir

Tous les animaux marqués seront remplacés dans leur milieu naturel, à l'endroit de leur capture

Remplacement

Afin de répondre aux besoins de connaissances sur les zones de vie des poissons et les impacts des parcs éoliens en mer sur les ressources halieutiques, il est essentiel de caractériser les mouvements et les patrons d’occupation individuels des espèces exposées. Cette connaissance ne peut pas être acquise sans l’étude de poissons vivants en milieu naturel, exposé à l’installation de parcs éoliens en mer. Il n’est pas donc possible de faire appel à des méthodes de remplacement.

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de pertinence scientifique et statistique. En télémétrie acoustique, la probabilité de détection des individus permettant d’analyser le comportement dépend grandement du réseau de récepteurs déployés sur le milieu ainsi que du nombre d’individus marqués. Cette probabilité de détection peut diminuer avec plusieurs facteurs environnementaux (ex : turbidité de l’eau, bruit ambiant). Différentes études sur des milieux similaires et avec un réseau de récepteurs semblable ont montré qu’entre 95% et 100% des individus ont été détectés après le marquage. En prenant en compte les contraintes de la télémétrie acoustique (ex: probabilité de détection) et la littérature existante, le marquage de >30 individus / espèce est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques.

Raffinement

Les mesures pour limiter la souffrance et le stress lors du marquage incluent (1) le type de pêche permettant de limiter la capture à

Choix des espèces

Les différentes zones d’étude en Manche et Atlantique présentent une grande variété d’espèces capturables. Cette étude propose de cibler une liste d’espèces (i) d’intérêt pour évaluer et mouvements et l’effet d’attraction de parcs éoliens en mer sur les poissons ayant différentes stratégies de mobilité, (ii) à enjeux de conservation et/ou halieutiques et (iii) présentes sur les zones. Les campagnes initiales de marquage identifieront les espèces abondantes à cibler en priorité. Le nombre d’individus par espèce rentrant dans une procédure sera limité à N=40 par site avec un maximum de N=500 marques acoustiques déployées dans le projet. Un total de 300 marques électroniques seront déployés sur des bars, raies et lieus jaunes, si le double marquage est possible (i.e. individus suffisamment grands avec une cavité intra-péritonéale adaptée). Pour la majorité de ces espèces, l’acquisition de connaissances sur leur dynamique spatiale est une première étape primordiale pour améliorer nos connaissances sur l’impact potentiel de l’implantation des parcs éoliens en mer sur ces populations. Les individus, matures ou immatures, seront sélectionnés s’ils présentent un poids suffisant pour supporter une marque (poids total de la/les marque.s

Trois souris par groupe vont être utilisées en surnombre pour compenser un taux d'échec de 20 % à l'injection dans la veine de la queue, celles dont l'injection rate étant écartées et tuées aussitôt. Elles sont 70 en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome puis sont gardées quatorze jours pendant que les métastases se développent, avec une perte de poids, une cachexie et des difficultés respiratoires parmi les effets attendus. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des métastases et l'intégrité des vaisseaux sanguins, et conclut que le projet "nécessite" d'observer l'"organisme entier".

Objectifs

Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Le projet est la suite d’un projet qui nous a permis de démontrer que le miR-155 est un nouveau facteur stimulant la croissance des vaisseaux sanguins mais qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. En particulier, nous avons établi qu’une exposition au miR-155 entraine une altération de la forme et de la structure des vaisseaux sanguins, notamment en fragilisant la paroi des vaisseaux et ayant pour conséquence de faciliter la formation de nouvelles ramifications vasculaires. Ces ramifications se font par bourgeonnement des cellules endothéliales qui tapissent la face interne des vaisseaux. Le miR-155 est classé comme un biomarqueur du cancer en raison de sa surproduction dans le microenvironnement tumoral de cancers solides (sein, poumon, foie). Dans notre projet nous émettons l’hypothèse qu’un excès de miR-155 d’origine tumorale conduirait à une perte d’intégrité et d’étanchéité des vaisseaux sanguins qui pourrait favoriser la dissémination des cellules tumorales et donc la formation de foyers métastatiques. Dans ce contexte nous souhaiterions déterminer la contribution du miR-155, synthétisé naturellement par des cellules de mélanome, au processus métastatique in vivo. Nous prévoyons d’utiliser un modèle de métastases chez la souris en réalisant une analyse macroscopique des foyers tumoraux pulmonaires complétée par des approches d’immunofluorescence afin d’évaluer l’intégrité des vaisseaux sanguins. En fonction des résultats obtenus, nous tenterons, dans un second temps, de préciser la spécificité et d’élucider le mécanisme de transfert du miR-155 produit par les cellules tumorales pour une action sur les cellules vasculaires.

Bénéfices attendus

Nous avons montré dans une étude précédente que le miR-155 favorise la formation de vaisseux sanguins mais il génère des vaisseaux anormaux et perméables ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Nous souhaiterions confirmer ces observations dans des souris adultes quand le réseau vasculaire est établi et mature. En particulier, nous souhaiterions déterminer si le miR-155 produit par les cellules tumorales circulantes induit des dommages vasculaires. Cette fragilisation de la paroi des vaisseaux par le miR-155, aurait pour conséquences de faciliter l’échappement des cellules tumorales circulantes et de favoriser le développement de foyers métastatiques. Ainsi, nous pourrions envisager des stratégies pour le cibler (cible thérapeutique) afin de préserver l’intégrité vasculaire et limiter l’apparition de métastases.

Procédures

Une injection de cellules tumorales par souris sera effectuée. Les analyses seront réalisées après 14 jours. Tous les animaux sont concernés par les procédures.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir des conséquences de l’injection de cellules tumorales et tout particulièrement au cours du développement des métastases durant 14 jours. Les effets indésirables et nuisances attendus dans ce modèle et qui seront particulièrement observés afin de déceler un mal-être chez ces animaux sont les suivants : - Perte de poids - Cachexie - Gêne/douleur - Difficulté respiratoires (métastases pulmonaires)

Devenir

14 jours après l’injection (procédure1) ou si un point limite est atteint, les animaux seront directement sacrifiés par du personnel formé et qualifié. Différents tissus seront prélevés pour analyses (ex. : poumons, foie, reins, aorte, yeux,... ) puis fixés pour des analyses macroscopiques et en histologie. En fonction des résultats obtenus sur les premiers animaux, la méthode de mise à mort prévue pourrait évoluer vers une méthode alternative (procédure 2) permettant de fixer profondément les tissus et ainsi faciliter nos analyses. Cette procédure sera elle aussi réalisée par un personnel qualifié.

Remplacement

Certains aspects du projet vont être réalisés in vitro sur des cellules vasculaires d’origine commerciale. En particulier, des co-cultures avec les lignées de cellules tumorales seront réalisées. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier le développement des métastases et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). Dans ce contexte, la réalisation du projet nécessite d’avoir recours à l’animal afin d’étudier des effets sur l'organisme entier qui ne sont pas approchables in vitro (ex. : formation de métastases, relations avec le système immunitaire à grande échelle, ...).

Réduction

Basé sur notre expérience et sur la littérature existante, nous devons prendre en compte que le taux d’échec pour les injections par la veine caudale chez la souris est de 20% en moyenne (causes d’échec : résistance à l’injection, bulles et qu’il existe une certaine variabilité intrinsèque au développement des métastases. Afin d'obtenir des études statistiques fiables, nous avons réalisé des analyses de puissance statistique. Suite à ces analyses, nous avons calculé que nous aurions besoin au minimum de 11 animaux utilisables par groupe d'étude lorsque nous utilisons le test statistique adéquat. De plus, pour pallier ce taux d’échec d’injection de 20%, nous tablons donc sur 14 animaux par groupe d'étude, soit 3 souris pouvant être écartées de l’étude en cas de problème d'injection. Par conséquent, 11 animaux par condition seront analysables statistiquement et ceci pour chacun des 5 groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, les expériences en place sont étudiées afin de recueillir le maximum de données et d'échantillons biologiques. C'est la raison pour laquelle nous recueillerons les poumons (site privilégié pour la formation de métastases dans le cas du mélanome) et d’autres d'organes d’intérêt (ex. : foie, reins, aorte, yeux... ), lors du sacrifice des animaux. Ceux-ci seront utilisés aussi bien pour des études à l'échelle macroscopique (dénombrement des foyers métastatiques) que microscopique (histologie). Des morceaux de tissus seront aussi congelés pour des analyses transcriptomiques et protéiques, a posteriori.

Raffinement

L’élevage est supervisé par le personnel compétent de l’animalerie. L’hébergement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate ou polysulfone. Afin de réduire le stress des animaux, une phase d'habituation sera mise en place en cinq séances sur deux semaines avant le début de la procédure. Cette période permettra de les familiariser progressivement au déplacement vers la salle d'expérimentation ainsi qu'à la manipulation. Concernant les problèmes inhérents aux injections, tous les animaux dont l’injection n’aura pas été maitrisée seront écartés de l’étude et immédiatement sacrifiés par du personnel qualifié pour ne prendre aucun risque. Les injections seront réalisées sous anesthésie, induisant une analgésie modérée.

Choix des espèces

Dans la recherche en oncologie, la souris constitue un modèle pertinent qui présente l’avantage d’être très documenté d’un point de vue des protocoles développés par la communauté scientifique étudiant la croissance tumorale et le processus métastatique. L'étude de la formation de métastases pulmonaires dans les modèles de cancer peut s'effectuer par la formation de métastases provenant de la tumeur primaire et nécessite donc une implantation de cellules dans un organe. Cependant, en se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait qu’une injection de cellules tumorales chez la souris constitue un procédé plus rapide, plus efficace en termes de formation de métastases, et moins sévère du point de vue chirurgical, en vue d'étudier ce processus. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 7-8 semaines minimum. En dessous de cet âge, les animaux ne sont pas assez matures. En particulier, les poumons et le système vasculaire ne sont pas complétement développés, ce qui pourrait interférer avec nos résultats car nous souhaitons étudier l’effet du miR-155 sur les vaisseaux matures.