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Etude des fonctions cognitives et de la formation des circuits neuronaux dans un modèle de souris muté pour un gène associé à l’autisme EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de queue pour le génotypage, jusqu'à quatre tests comportementaux et, pour certaines femelles, une chirurgie de trente minutes avec réveil : 799 souris vont être utilisées entre les deux établissements du projet, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 394 d'entre elles et modéré pour 405. L'objectif est de caractériser une lignée porteuse d'une mutation retrouvée chez des personnes autistes, en observant le développement du cortex du stade fœtal à l'âge adulte. Les tests comportementaux, annoncés comme non invasifs et non douloureux, ne sont jamais nommés, et la mise à mort de tous les animaux est justifiée par leur statut d'organismes génétiquement modifiés.
Objectifs
Contexte de l’étude : La perturbation de la formation des réseaux neuronaux pendant le développement embryonnaire est une cause de troubles graves du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique (TSA), le retard mental, l’épilepsie ou les déficits cognitifs. Les TSA concernent aujourd’hui près de 1% des naissances et sont considérés comme l’un des troubles les plus répandus de l’enfance. Cette étude a pour but d’étudier un gène muté dans les TSA et important pour le développement du cortex cérébral de la souris. Des travaux précédents ont permis de décrire les conséquences de l’inactivation complète de ce gène sur le développement cérébral et le comportement chez la souris. Mais à ce jour aucun modèle avec une mutation liée à l’autisme n’a été étudié. Objectif principal : Les modèles d’étude actuellement disponibles pour ce gène ne sont pas adaptés à l’étude des mutations retrouvées dans les troubles autistiques. Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de souris possédant une mutation identifiée à l’origine chez les patients autistes. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs nommés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peut pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Procédures
Dans l'EU1, l’essentiel des expériences seront observationnelles. Tous les animaux subiront une biopsie, une seule fois, pour le génotypage. La biopsie dure moins d'une minute. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Chaque test sera réalisé une fois par animal, au maximum 4 test par animal. Chaque test dure quelques minutes. L’ensemble des tests se déroule sur plusieurs semaines. Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Dans l'EU2, certains animaux subiront une procédure chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, et des changements des fonctions cognitives comme par exemple une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. Les animaux subiront une biopsie, une seule fois, entraînant un stress et une douleur passagers. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale avec réveil, selon une procédure bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons. Les tests d'exploration du comportement sont non invasifs mais peuvent entraîner un stress lié à la manipulation.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser un modèle murin possédant une mutation retrouvée chez des patients autistes . En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène , ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cerveau ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle. Une partie des animaux qui ont subi uniquement des observations (par exemple pesée) pourront être utilisés dans des tests de comportement, pour réduire le nombre total d'animaux Le nombre d’animaux utilisés est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été déterminé par un calcul préalable de puissance statistique.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Nous veillerons à adapter les conditions d’élevage aux phénotypes observés. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les animaux. Concernant les évaluations comportementales, les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Par ailleurs, nos précédents travaux nous ont permis de décrire que des mutations dans notre gène d'intérêt et associées à la pathologie autistique perturbent le développement cérébral et le comportement chez la souris (. Dans ce projet qui s'intéresse au neurodéveloppement, nous observerons des animaux depuis la naissance jusqu’à un stade adulte. L’étude de la formation des réseaux neuronaux se fera chez des fœtus au 3ème tiers de la gestation chez la souris. Les tests de comportement seront réalisés sur des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes.
Évaluation des effets promnésiques des dérivés de l’ibogaïne chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester si deux dérivés de l'iboga améliorent la mémoire conduit à utiliser 160 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une ou deux injections dans l'abdomen, attend trente minutes, puis passe quatre minutes dans un labyrinthe de Barnes, un test que le porteur retient pour son caractère moins anxiogène que la piscine de Morris. Aucun effet délétère des composés n'est annoncé, les molécules étant décrites comme anxiolytiques et antidépressives aux doses prévues. La mise à mort intervient juste après ces quatre minutes de test, pour prélever les cerveaux entiers et y doser les monoamines.
Objectifs
La mémoire constitue une fonction cognitive essentielle, permettant l’acquisition, la consolidation et la récupération des informations, tout en facilitant l’adaptation aux expériences antérieures. Son altération représente un enjeu majeur en neurosciences, en raison de son implication dans de nombreuses pathologies neurodégénératives et troubles cognitifs. Parmi celles-ci, la maladie d’Alzheimer constitue un problème de santé publique majeur, affectant plusieurs millions de personnes dans le monde. D'autres affections, telles que la maladie de Parkinson, les troubles cognitifs liés à l’âge, ainsi que les séquelles d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ou d’un traumatisme crânien, s’accompagnent également de déficits mnésiques significatifs. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier les effets pro-mnésiques de deux composés ibogalogues chez la souris. Afin de tester les éventuels effets bénéfiques des ibogalogues, plusieurs études ont mis en évidence le rôle central de la transmission sérotoninergique dans la modulation des processus mnésiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents, nous nous intéresserons à l’implication de différents sous-types de récepteurs sérotoninergiques susceptibles de participer aux effets de ces composés. À cette fin, des antagonistes sélectifs de ces récepteurs seront utilisés. Leur administration permettra de mieux caractériser le rôle de chaque récepteur dans les effets mnésiques induits par les ibogalogues.
Bénéfices attendus
Les traitements actuellement disponibles pour améliorer la mémoire, notamment chez les personnes âgées ou atteintes de maladies comme Alzheimer, offrent des bénéfices limités. Ils soulagent parfois certains symptômes, mais ne permettent pas d’agir en profondeur sur le fonctionnement du cerveau, ni d’améliorer durablement les capacités de mémorisation. De plus, ces traitements peuvent provoquer des effets secondaires (nausées, confusion, somnolence) et leur efficacité diminue souvent avec le temps. Ce projet explore une nouvelle voie prometteuse, en étudiant deux substances issues d’une plante africaine appelée iboga. Ces molécules, appelées ibogalogues, pourraient renforcer durablement la mémoire en favorisant des changements positifs dans les connexions entre les neurones, un phénomène appelé plasticité cérébrale. Ces recherches visent donc à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques, potentiellement utiles non seulement en cas de maladie, mais aussi dans des contextes comme le vieillissement, le stress important ou certaines difficultés d’apprentissage. Les effets de ces substances sur la mémoire sont encore peu connus, d’où l’intérêt d’une évaluation approfondie.
Procédures
Selon le protocole expérimental, chaque animal reçoit, en fonction du groupe auquel il appartient, soit une injection unique (d’une durée inférieure à une minute) de la substance étudiée, soit deux injections successives en cas de prétraitement. Dans ce dernier cas, l’animal reçoit tout d’abord un agent de prétraitement, suivi, 30 minutes plus tard, de l’administration de la substance principale à tester. Après l’injection, un délai d’environ 30 minutes est respecté afin de permettre à la substance d’agir. Chaque sujet sera ensuite soumis à un test comportemental standardisé d’une durée de 4 minutes. Le test envisagé est un test de comportement qui permet d’ évaluer les effets des agents pharmacologiques sur la mémoire et la capacité d’apprentissage chez les souris en mesurant la mémoire spatiale de la souris. À l’issue du test, les animaux seront mis à mort conformément aux directives éthiques en vigueur. Les cerveaux sont ensuite prélevés pour des analyses neurochimiques, notamment le dosage des monoamines dans les régions cérébrales d’intérêt.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables potentiels anticipés chez les animaux figurent les réactions liées aux injections. Afin de minimiser le stress et l’inconfort associés à ces manipulations, des aiguilles ultrafines seront utilisées, et les injections seront systématiquement réalisées dans le cadran inférieur droit de la cavité abdominale. Par ailleurs, le test du labyrinthe de Barnes a été choisi en raison de son caractère moins anxiogène comparé à d’autres paradigmes comportementaux, tels que le labyrinthe aquatique, permettant ainsi de réduire significativement le niveau de stress induit chez les animaux au cours de l’expérimentation. Chaque session de test ne dure que 4 minutes. À l’issue de celle-ci, les animaux seront immédiatement replacés dans leur cage habituelle, ce qui contribuera à restaurer un environnement familier et à limiter le stress résiduel. Concernant les effets indésirables liés aux agents pharmacologiques testés : aucun effet délétère majeur n’est attendu a priori. Les deux composés étudiés présentent principalement des effets anxiolytiques et antidépresseurs, déjà documentés dans la littérature. Aucune toxicité ou altération comportementale notable n’a été rapportée aux doses envisagées.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort conformément aux dispositions de l’annexe IV de la directive 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. La méthode retenue permettra un prélèvement rapide et intact des cerveaux entiers, condition indispensable à la réalisation d’analyses neurochimiques de haute précision. Cette étape a pour objectif de mettre en relation les effets comportementaux observés avec les modulations neurochimiques induites par les traitements expérimentaux, contribuant ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes d’action sous-jacents.
Remplacement
Cette étude porte sur les mécanismes de l’apprentissage et de la mémoire, lesquels nécessitent l’observation d’un cerveau intact et fonctionnel au sein d’un organisme vivant. À ce titre, le recours à un modèle animal s’avère indispensable. L’espèce choisie est la souris, largement utilisée en neurosciences pour l’étude des fonctions cognitives et l’évaluation des effets de traitements pharmacologiques. À ce jour, les modèles alternatifs disponibles (cultures cellulaires in vitro, simulations informatiques) ne permettent pas de reproduire de manière satisfaisante la complexité des interactions neuronales, notamment celles impliquées dans les processus mnésiques. C’est pourquoi l’expérimentation animale demeure essentielle pour comprendre ces mécanismes et orienter le développement de stratégies thérapeutiques innovantes. Les capacités mnésiques seront évaluées à l’aide d’un test comportemental simple, bref et non invasif, reposant sur le comportement d’exploration naturelle de la souris : l’animal est amené à rechercher spontanément un abri, évitant les zones ouvertes et lumineuses. Ce test respecte les comportements instinctifs de l’espèce, n’induit ni douleur ni stress significatif, et permet une évaluation fiable de l’efficacité des substances testées. Dans une démarche de raffinement, les injections seront réalisées selon un schéma rotatif, en alternant les côtés du corps, afin de minimiser l’inconfort potentiel. Par ailleurs, une partie complémentaire du projet sera réalisée par nos collaborateurs aux États-Unis, à l’aide de modèles alternatifs tels que les cultures cellulaires, permettant d’explorer les mécanismes à l’échelle moléculaire. Enfin, bien que les études cliniques ou post-mortem fournissent des informations précieuses, elles ne permettent pas, à elles seules, de caractériser les dynamiques fonctionnelles du cerveau en condition physiologique. Le recours à un modèle animal demeure, dans ce cadre, scientifiquement justifié et nécessaire
Réduction
Dans le cadre de cette étude, une approche méthodologique rigoureuse a été adoptée afin de déterminer le nombre minimal d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques fixés, tout en respectant les principes éthiques de l’expérimentation animale. Cette estimation s’appuie sur une analyse statistique utilisant un test non paramétrique comme le test de Mann-Whiteny qui est un test non paramétrique qui permet de tester si deux échantillons sont issus de populations indépendantes a la même moyenne. Différence attendue: 20 %, SD = 10 %, puissance: 80 %, alpha = 0,05. Ainsi, il a été estimé que 10 animaux par groupe sont nécessaires pour garantir la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Par ailleurs, conformément aux principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), les collaborateurs impliqués dans ce projet s’engagent à recourir à des méthodes alternatives, telles que les cultures cellulaires in vitro, lorsque cela est scientifiquement pertinent. Ces approches permettent de limiter davantage l’utilisation d’animaux, tout en assurant la qualité et la pertinence des données recueillies.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages conformes aux normes réglementaires en vigueur, au sein d’un environnement contrôlé et enrichi. Celui-ci comprendra notamment des cylindres en carton, afin d’augmenter la complexité de l’habitat et de favoriser l’activité physique. Ce dispositif vise à améliorer le bien-être animal et à limiter l’apparition de comportements stéréotypés. Une surveillance rigoureuse sera assurée: état général, prise alimentaire, consommation d’eau, comportement et poids corporel feront l’objet d’un suivi quotidien. Avant les expérimentations, une période d’acclimatation sera instaurée pour permettre aux animaux de s’adapter progressivement à leur nouvel environnement. En complément, une phase de handling doux sera réalisée durant 5 à 7 jours consécutifs avant les tests comportementaux. Chaque animal sera manipulé environ 5 minutes par jour par le même expérimentateur, dans un environnement calme, sans contention ni contrainte, afin d’habituer progressivement les animaux au contact humain. Cette étape vise à réduire le stress lié aux manipulations et à améliorer la fiabilité des mesures comportementales. Les souris seront ensuite placées dans la salle d’expérimentation, en présence de l’expérimentateur, pendant une heure avant le test. Afin de limiter le stress lié à la capture, les animaux seront manipulés à l’aide de tunnels transparents (plastique ou carton) disposés dans les cages. Cette méthode, moins intrusive que la capture par la queue, permet un transfert volontaire des animaux et contribue à une meilleure qualité des données comportementales. Les cages seront enrichies (abris, objets, matériaux de nidification) pour favoriser l’expression de comportements naturels. Une surveillance rigoureuse des points limites permettra de détecter rapidement toute anomalie comportementale (immobilité, prostration, tremblements, troubles locomoteurs, isolement). Si l’utilisation d’un analgésique s’avère nécessaire, nous pourrons utiliser le méloxicam, dont l’efficacité antalgique a été démontrée chez la souris.
Choix des espèces
L’espèce de souris choisie est largement utilisée dans les recherches sur la mémoire et l’apprentissage en raison de son profil comportemental bien caractérisé. Son emploi dans des tests tels que le labyrinthe de Barnes permet une comparaison fiable avec des données existantes, renforçant la validité et la reproductibilité des résultats. La procédure expérimentale prévue a déjà été validée sur cette souche. De plus, sur la base d’une comparaison inter-souches appuyée par des travaux de référence, l’espèce choisie présente une réactivité au stress plus modérée que d’autres lignées, ce qui favorise une expression comportementale plus stable dans les paradigmes cognitifs et émotionnels. Le choix de cette souche est donc scientifiquement pertinent, conforme aux standards de la recherche en neurosciences, et contribue à minimiser les biais expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal, conformément aux recommandations éthiques et réglementaires en vigueur. Les expérimentations seront menées sur des souris ayant atteint une maturité cérébrale complète. À ce stade, leur système nerveux central est pleinement développé, ce qui permet une évaluation fiable des fonctions mnésiques et cognitives. Par ailleurs, la majorité des études sur la mémoire et l'apprentissage utilisent des souris adultes, ce qui assure une meilleure comparabilité et reproductibilité des résultats obtenus.
Caractérisation du rôle de la phospholipase A2 sécrétée de groupe 5 dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pesées, scorées et surveillées tous les jours week-ends compris à partir du septième, les souris reçoivent eau et nourriture en gel quand leurs troubles moteurs les empêchent de s'alimenter. 3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie, proche de la sclérose en plaques, est déclenchée par un rasage et deux injections sous anesthésie, suivies d'une troisième deux jours plus tard, avec une paralysie partielle des membres postérieurs et une perte de poids attendues entre le huitième et le dix-huitième jour. Tout cela pour caractériser le rôle, "totalement inconnu" selon le porteur, d'une enzyme dans deux régions du cerveau, l'identification de cibles thérapeutiques restant une perspective lointaine.
Objectifs
Les phospholipases A2 sécrétées sont des enzymes clés dans le métabolisme lipidique. Chaque enzyme présente des localisations tissulaires et cellulaires uniques ainsi que des propriétés enzymatiques spécifiques, ce qui suggère des rôles biologiques distincts et complexes. Récemment, nous avons découvert qu'une de ces phospholipases sécrétées était exprimée dans 2 régions particulières du cerveau de souris: les plexus choroïdes, qui forment l'interface entre le sang et le liquide cérébrospinal et l'éminence médiane, un organe situé à la base de l'hypothalamus servant de barrière par une communication étroite entre les boucles de capillaires fenêtrés et une population de cellules gliales spécialisées, les tanycytes. Nous souhaitons donc mener des études afin d’étudier le rôle de cette phospholipase dans les processus neuro-inflammatoires et plus spécifiquement dans un modèle murin de sclérose plaques. Si son implication est avérée, nous étudierons alors le potentiel d'un inhibiteur pharmacologique sur ces phénomènes.
Bénéfices attendus
Il est important de mener des recherches approfondies pour comprendre le rôle encore totalement inconnu de cette phospholipase dans le cerveau et en particulier dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un phénomène pathophysiologique commun à un grand nombre de pathologies du système nerveux, telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et l'accident vasculaire cérébral. Cette phospholipase est une enzyme déjà impliquée dans la régulation de l'inflammation en périphérie, mais son rôle dans le cerveau reste largement méconnu. De par son expression très localisée dans ces 2 régions du cerveau chez la souris, comprendre comment cette phospholipase contribue aux processus neuroinflammatoires dans un modèle murin de sclérose en plaques aiderait à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Procédures
Induction de la pathologie avec 1 rasage et 2 injections sous anesthésie (1 fois pendant x 15min) puis 2 jours après : 1 injection sur animal vigile (1 fois pendant x 30 secondes). Génotypage des souris : un prélèvement de queue sera réalisé sur animal vigile (1 fois pendant 10 secondes).
Impact sur les animaux
Biopsie pour génotypage : stress inhérent à la préhension et contention et douleur légère de courte durée lors du prélèvement. Induction de la pathologie : douleur légère de courte durée suite aux injections. Pathologie : entre 8 à 12 jours suivant la phase d’induction, apparition de déficits moteurs des membres inférieurs (paralysie partielle induisant une mobilité réduite et une perte de poids progressive jusqu'à 18 jours post-induction) puis amélioration avec régression des signes durant 1 semaine suivie d’une phase de léger rebond.
Devenir
Après leur production, tous les animaux en expérimentation seront euthanasiés afin de collecter les organes d’intérêt pour réaliser nos dosages et observations histologiques.
Remplacement
Notre projet se base sur des données de transcriptomique spatiale disponibles publiquement qui montrent l'expression ciblée et spécifique d'une phospholipase dans certaines zones cérébrales. Si certaines de ses fonctions sont connues en périphérie (coeur, poumons...), rien n'est encore connu à ce jour sur ses fonctions dans le cerveau, et en particulier sur son rôle dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires d'origine cérébrale (microglie, astrocytes...) et périphérique (cellules immunes sanguines) ainsi que les structures d'interface entre le sang et le cerveau (barrière hématoencéphalique et barrière sang-liquide cérébrospinal). Il s'agit d'un phénomène complexe et multisystémique qui ne peut être modélisé in vitro, in silico ou ex vivo. Ces questions ne peuvent trouver de réponse qu’en étudiant la physiologie d'un organisme vivant entier et la souris est un modèle de choix.
Réduction
Nous utiliserons des mâles et des femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. Nous avons également pu réaliser une étude pilote qui a permis de mettre en évidence un léger retard dans l’induction de la phase inflammatoire, une absence de la phase de rebond et une plus forte perte de poids dans les phases de rémission partielle et rebond chez les souris KO. L’analyse statistique de cette étude nous a donc permis d’évaluer la puissance de cet effet et nous indique de travailler avec des groupes expérimentaux de 10 souris par groupe.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (cachette, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 5 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Les souris auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Les injections seront réalisées par des opérateurs expérimentés. Les animaux seront suivis sur plusieurs critères, comme le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement. Les points limites établis seront scrupuleusement respectés en cas de nécessité. Après immunisation, les souris sont surveillées tous les jours, week-end compris à partir de J7 post immunisation. Elles sont pesées, scorées et de la nourriture et de l’eau gélifiée sont ajoutées dans la cage pour leur permettre de s’hydrater et s’alimenter facilement malgré leurs problèmes de motricité. Enfin, il est à noter que les animaux seront anesthésiés lors de l’immunisation et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour caractériser les fonctions des phospholipases A2 sécrétées. Pour l’une de ces phospholipases, des données récentes sur le cerveau de souris ont montré que son expression est localisée dans des régions très spécifiques, comme chez l'Humain. Les souris déficientes pour ce gène nous permettront donc de tester notre hypothèse de l'implication de cette enzyme dans les processus neuro-inflammatoires, en modulant notamment la composition du liquide cérébrospinal et le recrutement de cellules immunes périphériques. Des études sur l'expression génique de cette phospholipase nous indique qu'elle ne varie pas significativement chez la souris en fonction de l'âge. De ce fait, nous utiliserons préférentiellement des souris jeunes adultes de 8 à 20 semaines pour l’induction de la pathologie. Enfin, le génotypage des animaux sera réalisé sur des souriceaux de 21 jours.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’induction d’une immunité protectrice suite à un traitement par anticorps monoclonaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des souriceaux sont infectés puis reçoivent des injections à trois reprises, aux jours 0, 2 et 5, avant un prélèvement terminal. 216 souris âgées de 8 à 30 jours vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. L'objectif est de comprendre comment un traitement par anticorps monoclonaux déclenche une immunité durable, afin d'améliorer de futures immunothérapies antivirales. Le RNT ne nomme ni le virus, ni l'anticorps, ni la pathologie induite, et affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu au motif que la procédure s'arrête avant l'apparition des symptômes.
Objectifs
Les anticorps monoclonaux (AcM) sont des molécules dérivées du système immunitaire qui ont un fort potentiel thérapeutique (thérapies ciblées). Une quarantaine sont utilisés pour traiter le cancer et les maladies inflammatoires et plus de 300 sont en cours de test clinique. Ils sont maintenant aussi considérés avec un intérêt grandissant pour traiter les infections virales graves comme celles par le VIH (virus de l’immunodéfience humaine), Virus de la grippe, Ebola, Zika, .... Cependant, leurs conditions d’utilisation ne sont pas encore optimisées. L’amélioration des immunothérapies par des AcM est donc un enjeu médical majeur. L'une des découvertes importantes de ces dernières années a été la mise en évidence que le traitement par des AcM des animaux infectés et/ou développant des tumeurs, peut induire une immunité protectrice à long-terme. En d'autres termes, les animaux infectés, ou présentant des tumeurs, et traités par AcM survivent sans signes pathologiques grâce à l'induction d'une forte réponse immunitaire protectrice dirigée contre le virus et/ou la cellule tumorale. Dans ce cadre, il est maintenant important d’idéntifier les mecanismes impliqués afin d'optimiser, à terme, l’efficacité thérapeutique des futures immunothérapies par AcM. Ceci, qui est le but principal de l’ensemble de nos recherches, n’est pas réalisable chez l'Homme. Pour progresser dans cette perspective, les expérimentations animales sont donc indispensables.
Bénéfices attendus
Le projet dévrait permettre d'identifier un rôle clé des IFN-I dans l'induction d'une réponse immunitaire antivirale. Ceci pourrait permettre le développement d'immunothérapies antivirales améliorées basées sur les IFN-I.
Procédures
La procédure inclut des injections à jour 0, jour 2 et jour 5, et des prélèvements terminaux. La durée des injections est de moins de 5 secondes chacune.
Impact sur les animaux
Le projet inclut seulement une procédure de degré léger. On ne s'attend pas à des effets indésirables particuliers sur les animaux car la procédure est arrêtée avant le dévelopement de la pathologie et l’apparation des symptômes. Les seuls effets indésirables potentiels se limitent aux conséquences d'une piqûre d'aiguille au niveau de l'abdomen (irritation très locale et temporaire).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Le but du projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans l’induction d’une immunité antivirale protectrice suite à un traitement par anticorps monoclonaux (AcM) afin d'optimiser, à terme, l’efficacité thérapeutique des futures immunothérapies par AcM. Ceci nécessite un modèle expérimental doté d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique. Ceci étant difficilement possible chez l'Homme, afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables. Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complementaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été défini grâce à un logiciel spéifique pour réduire au maximum leur nombre : 12 souris par condition de traitement sont nécessaires pour atteindre une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les expériences seront réalisées à des temps précoces après infection et traitement, dans la phase pendant laquelle les animaux ne présentent aucun signe pathologique. Les actes techniques réalisés (injections) sont peu invasifs et conformes aux récommendations des textes de référence. Aucun signe de souffrance (changement de comportement, poil hérissé, perte de poids,….) n’est observé après la réalisation de ces actes. Des mesures destinées à réduire la contrainte des animaux ont été prévues : enrichissement du milieu (carrés de cellulose, cabanes, …). Tout au long des expériences, une observation régulière du bien être des souris sera effectuée. Tout animal présentant un événtuel signe de souffrance sera soigné ou euthanasié.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquels des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et des nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet ainsi qu’une souche dérivée dont les animaux ont été génétiquement modifiés pour l’inactivation du récepteur étudiét. A noter que cette dernière ne présente pas un phenotype dommageable et ne nécessite pas un hébergement protégé. Le choix de ces souches est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à l’infection dans le modèle choisi. Le animaux seront utilisés à partir de 8 jours post-naissance jusqu'à 30 jours post-naissance. Plus précisement, les animaux doivent être infectés à cette âge pour avoir des résultats reproductibles en ce qui concerne la propagation virale ainsi que l’initiation et le développement de la pathologie.
Etude de l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique chez le rat et l’hypertension pulmonaire associée à l’hypoxie chronique chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Rats : 1500
1 500 rats et 1 000 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux passant trois semaines enfermés dans un caisson à atmosphère appauvrie en oxygène. Les autres reçoivent une injection destinée à déclencher une hypertension pulmonaire en quatre semaines. Viennent ensuite une échographie, une thermodilution, une mesure de pression artérielle pulmonaire et un prélèvement sanguin, tous sous anesthésie, avant le prélèvement du cœur et des poumons. Le porteur indique que les animaux deviennent essoufflés et inactifs mais estime la souffrance modérée puisqu'ils ne seront pas soumis à l'effort, et renvoie les éventuels essais cliniques à un horizon "plus long terme".
Objectifs
L’hypertension pulmonaire (HTP) est une maladie grave, caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire qui conduit à une hypertrophie cardiaque droite, puis à une insuffisance cardiaque droite, à l’origine du décès des patients. Les traitements disponibles actuellement ne sont pas curatifs. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée curative. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser des modèles animaux (rats, souris) d’HTP expérimentale classiquement utilisés dans la littérature et au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Il existe différents type d’HTP chez l’Homme et nous allons donc utiliser deux modèles animaux pour étudier d’une part l’HTP associée à une hypoxie chronique (HC) similaire aux HTP associées aux maladies respiratoires hypoxémiantes (asthme, bronchite chronique, fibrose…) et d’autre part, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par une injection d'une substance pharmacologique pour étudier l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique (de cause inconnue). A ce jour aucune lignée cellulaire ne rassemble toutes les caractéristiques pathophysiologiques de l’HTP donc nous avons besoin d’utiliser des animaux notamment pour mieux connaitre les mécanismes de cette pathologie ce qui permettra ensuite de tester de potentiels nouveaux traitements et d’évaluer leurs potentiels effets bénéfiques et/ou effets secondaires.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTP/HTAP. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients et adapté au type d’hypertension pulmonaire HTP et/ou HTAP.
Procédures
Pour obtenir le modèle de rat ou souris hypoxiques chroniques, les animaux sont maintenus dans un environnement où l’air contient moins d’oxygène pour une durée de 3 semaines. Pour le modèle d’HTAP idiopathique chez le rat, une seule injection d’une substance pharmacologique appropriée sur animal vigile va induire au bout de 4 semaines de l’HTAP idiopathique. Le potentiel thérapeutique de substances pharmacologiques sera testé sur animal vigile. La fréquence d’injection et donc le nombre d’injections sera ajustée en fonction de la substance considérée. Lorsque l’HTP/HTAP est installée, des mesures in vivo sont effectuées sur chaque animal : -des mesures échographiques sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 10 minutes) -des mesures de thermodilution sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 15 minutes) -des mesures de pressions artérielles pulmonaires sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 20 minutes) -un prélèvement de sang sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes) -après euthanasie, prélèvement du cœur et des poumons (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes)
Impact sur les animaux
Chez l’homme, l’HTP/HTAP n’induisent pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Chez l’animal il a été noté une légère dyspnée et les rats/souris sont généralement assez inactifs. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP/HTAP chez les animaux. Les points d’injection des substances et solvants peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.
Remplacement
Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’hypertension pulmonaire. De plus, étant donné qu’il existe de nombreux types d’HTP associées à diverses maladies (respiratoires hypoxémiantes notamment), il est très difficile d’obtenir des résultats reproductibles sur ce type de tissu (provenant de patients ayant subis une greffe de poumon). Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. De plus, cette pathologie implique plusieurs organes et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux : (1) les rats contrôles utilisés seront les mêmes pour les deux type d’HTP, (2) une partie des utilisateurs utiliseront le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche (dans tous les cas les deux poumons seront utilisés), (3) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (4) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines exposées à l’hypoxie et étirées in vitro pour simuler l’HTP hypoxique. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée et en concertation avec tous les utilisateurs. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche.
Raffinement
Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Le caisson hypobare sera ouvert 3 fois par semaine afin de renouveler l’eau et la nourriture, et d’effectuer le change de la litière une fois par semaine. Un système automatisé permet de modifier la pression atmosphérique progressivement et automatiquement pendant 45 minutes pour le retour à la pression atmosphérique normale ou la mise en hypobarie. Le caisson et les cages sont transparents ce qui permet de surveiller les animaux. Les animaux contrôles seront juste placés dans leurs cages habituelles. A l’occasion de l’ouverture du caisson (3 fois par semaine), tous les animaux seront pesés. Si le décès survenait avant la fin du protocole, le protocole serait également modifié ou arrêté. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. Lors de l’anesthésie un tapis chauffant sera utilisé pour le bien-être de l’animal. Le degré d’anesthésie sera surveillé en permanence.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le choix du rat est également justifié par le fait que le modèle d’HTAP fonctionne difficilement chez la souris. Néanmoins, l’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont moins nombreux chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. L’HTP/HTAP sont des pathologies de l’adulte donc nous utilisons des animaux adultes en fin de protocole.
Effet du blocage de la triglyceridémie sur la réaction microgliale cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un cathéter est posé chirurgicalement dans l'estomac de chaque souris, qui passe ensuite onze jours seule en cage avant de recevoir un repas perfusé directement dans l'estomac pendant trois heures. 220 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude porte sur la réaction inflammatoire qui suit un repas gras chez "l'individu sain dans un contexte de physiologie normale", alors que les animaux observés sont opérés, isolés et alimentés par sonde. Le sang entier et le cerveau doivent être prélevés, ce qui impose la mise à mort de chaque animal.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire après repas (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme et les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les médiateurs biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables de stimuler la réponse des cellules du cerveau cependant d’autres facteurs circulants après un repas pourraient aussi activer la PIR. La stratégie consistera à manipuler la concentration de lipides dans le sang postprandiale et à mesurer la réponse cellulaire cérébrale. La concentration de lipides dans le sang sera suivie par analyse biochimique sanguine, et la réponse cellulaire cérébrale sera mesurée par microscopie sur coupes de cerveau. Nous utiliserons : une solution de nutrition à base d’un régime enrichi en gras, elle sera perfusée dans le tube digestif, ce qui permettra d’élever artificiellement les lipides plasmatiques en l’absence de prise de repas et un agent pharmacologique qui limitera cette élévation des lipides et nous permettra de mettre en évidence une action des autres facteurs sur l’activation de la PIR. Un dosage sanguin des triglycérides au cours du temps sera réalisé aux temps : T0, T1h, T2h, et T3h. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés après mise à mort afin d’analyser la réponse cellulaire cérébrale dans différentes conditions. 220 souris seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie qui durera 30 minutes pour la mise en place du cathéter gastrique. De plus, ils seront placés dans des cages individuelles durant 11 jours. Le jour de l’expérience ils recevront un traitement dans l’estomac (temps = 1.5 minutes) puis la perfusion du repas dans l’estomac dure de 0 à 3 heures. La contention des animaux et les injections pour l’anesthésie générale avant la mise à mort représentent des nuisances sur les animaux dans ce projet. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour la mise en place du cathéter gastrique peut provoquer les nuisances suivantes : - Hypothermie transitoire, induite par l’anesthésie générale - Douleurs post-chirurgie transitoires, induites par la chirurgie - Trouble potentiel du comportement alimentaire et du métabolisme, induit par la chirurgie affectant le tube digestif - Stress lié à l’isolement en cage individuelle - Stress lié à la contention des animaux et aux injections d’anesthésique et de sédatifs avant la mise à mort. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort, en effet la totalité du sang et le cerveau doivent être prélevés.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton ainsi que des frisures de papier qui permettent aux animaux de se cacher. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 8 semaines au moins. D’un point de vue scientifique, la PIR se développe uniquement chez les mâles, de plus cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Rôle des neutrophiles dans l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-sept injections par animal et une ligature définitive de l'artère coronaire pour provoquer un infarctus : 3 072 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 366 d'entre elles et sévère pour 706. S'ajoutent trois échocardiographies sous anesthésie et une douleur post-opératoire décrite comme modérée pendant plusieurs jours. L'objectif est d'identifier les cellules immunitaires qui interviennent dans la réparation du cœur après un infarctus, la mise à mort servant à prélever les organes. Le modèle tue de lui-même environ 30 % des mâles et 15 % des femelles par rupture cardiaque ou arythmie, une mortalité que le porteur qualifie de subite et "sans signe de souffrance préalable".
Objectifs
L’infarctus du myocarde (ou « crise cardiaque ») est une cause de mortalité et d’invalidité majeure. Les mécanismes gouvernant la réparation du coeur après un infarctus ne sont pas entièrement connus. L’inflammation joue un rôle important dans la réparation du coeur après un infarctus, mais les types cellulaires et les acteurs moléculaires impliqués restent méconnus. Ce projet a pour but de comprendre le rôle de certaines cellules de l’immunité sur la réparation du cœur après l’infarctus du myocarde en utilisant un modèle chez la souris. Les animaux subiront un infarctus du myocarde induit par ligature permanente de l’artère coronaire. Des types cellulaires et des molécules spécifiques seront ciblés pour étudier leur contribution à l'inflammation et à la réparation du coeur après un infarctus. La fonction cardiaque des souris sera analysée par échocardiographie. Ce projet permettra d’identifier des nouveaux acteurs inflammatoires du remodelage cardiaque et de potentielles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une meilleure compréhension des mécanismes de la réparation du coeur après infarctus, ce qui constitute une étape essentielle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Intervention chirurgicale sous anesthésie pour induction de l’infarctus du myocarde (1 fois, 30 minutes) - Echocardiographie sous anesthésie (3 fois, 15 minutes) - Injections (jusqu’à 27 fois, quelques secondes)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, douleur légère de courte durée au point d'injection, stress et baisse de température corporelle liés à l'anesthésie, stress lié à l’isolement de courte durée dans la phase post-opératoire et post-échocardiographie ; Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire modérée pendant plusieurs jours; baisse de fonction cardiaque liée à l'induction d'un infarctus du myocarde. Le modèle d’infarctus du myocarde permanent est associé à une mortalité, subite et sans signe de souffrance préalable, causée par rupture cardiaque ou arythmie environ 30% chez les souris mâles, 15% chez les souris femelles).
Devenir
Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études bio-informatique et in vitro pour tester nos hypothèses, la réparation cardiaque après infarctus du myocarde impliquent l’interaction complexe de différents types cellulaires et une interaction entre différents organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers, rendant le modèle in vivo indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est déterminé par d’utilisation d'outils statistiques adaptés. Les différences de mortalité liées au sexe existant dans ce modèle (mortalité accrue chez les mâles comparés aux femelles) ont été prises en compte dans le calcul du nombre d'animaux. Des tests statistiques appropriés pour l’analyse des données obtenues ont été prédéfinis. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal.
Raffinement
Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et anti-douleurs adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure chirurgicale et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante à 37°C dès l’induction de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle puis placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie anti-douleur sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 72 heures, avec administration d'anti-douleurs. Tout au long de la procédure, les animaux feront l’objet d’une surveillance continue par les expérimentateurs, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes de l’inflammation et de la réparation cardiaque post-infarctus du myocarde dans un organisme biologique complexe. Le modèle d’infarctus du myocarde utilisé dans ce projet représente un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, permettant une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. Nous utiliserons des souris adultes, âgées entre 8 et 12 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité.
Evaluation de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle de syndrome X fragile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Jusqu'à 800 séries de sons par session d'enregistrement, jusqu'à 20 administrations dans la vie de l'animal, deux à dix mois en cage individuelle avec contrôle alimentaire : 400 rats porteurs d'une mutation du gène de l'X fragile vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit d'abord une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, qui laisse un connecteur fixé à son crâne dont la cicatrisation doit être surveillée. Les prélèvements sanguins, jusqu'à trois par semaine, se font sous anesthésie générale quand le protocole l'exige. L'objet est d'évaluer par électroencéphalographie des candidats médicaments en cours de développement, le porteur présentant le recours à un modèle animal comme le moyen d'optimiser un développement pharmaceutique qu'il décrit comme long et coûteux.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer des signaux électroencéphalographiques (EEG) dans un modèle animal de syndrome du chromosome X fragile, qui est une maladie génétique entrainant un déficit intellectuel, des troubles du comportement et des anomalies physiques. Les patients présentant le syndrome de l’X fragile présentent des troubles mentaux approchant ceux du spectre autistique : anxiété sociale, hypersensibilité sensorielle, retard mental. Ce syndrome est causé par la mutation d’un gène unique. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue du même gène est disponible, et ce rat mutant présente des caractéristiques qui rappellent fortement le syndrome de l’X fragile. L'électroencéphalographie est un outil de choix pour aborder l’activité cérébrale, en raison de son caractère transposable entre le rat et l’homme. En effet, les activités cérébrales de base sont largement conservées chez les mammifères. Les observations effectuées chez le rongeur permettent donc de prédire des résultats chez l’homme. Il est donc intéressant d’utiliser ce rat mutant pour évaluer des candidats médicaments en cours de développement et visant à améliorer la qualité de vie des patients victimes du syndrome X fragile. Ces candidats médicaments seront évalués sur le rat mutant, et leurs effets seront évalués à travers l’électroencéphalographie. Des marqueurs biologiques mesurés permettront d’évaluer l’impact sur les rats mutants, et permettront de prédire une efficacité chez le patient. Ces marqueurs biologiques seront de deux types. Des marqueurs spontanés seront évalués : les animaux seront laissés libres, éveillés et dans des conditions calmes, sans intervention dans leur environnement. Les différences spontanées entre les rats mutants et contrôles pourront être comparées, et les effets des candidats médicaments sur ces différences seront évalués. Des marqueurs évoqués seront également évalués : les animaux seront toujours laissés libres et éveillés, et des stimulations sonores leur seront présentées. Ces stimulations sonores induiront des réponses neuronales qui seront mesurées et quantifiées. A nouveau, les différences entre les deux types de rats seront comparées, et les effets des candidats médicaments seront évalués.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, l’utilisation d’un modèle animal pertinent est nécessaire. L’utilisation d’une lignée de rats mutants, modélisant le syndrome X fragile humain, permettra de mettre en évidence de nouvelles molécules thérapeutiques susceptibles d’améliorer la qualité de vie des patients victimes de ce syndrome.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Les pulsations sonores individuelles dureront un maximum de 100 ms à une intensité de 90 dB maximum. Ces pulsations sonores seront regroupées soit en paires avec 1 seconde d’écart entre les 2 sons, soit en train de 2 secondes avec un son toutes les 25 ms. Chacune de ces séries de sons pourront être répétées jusqu’à 800 fois au cours d’une session d’enregistrement : jusqu’à 400 fois avant administration et jusqu’à 400 fois après administration. Lors des tests pharmacologiques le nombre d’administrations (durée d’une minute en moyenne) sera limité à 20 dans la vie de l’animal, avec un minimum de 3 jours entre chaque jour d’administration. Lors des tests pharmacologiques en administrations répétées, les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement). Le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 3 par semaine. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 10 mois) et seront soumis à un contrôle alimentaire tout au long de leur hébergement (quelques mois).
Impact sur les animaux
Le modèle de rats utilisé ne présente pas d’effets indésirables aboutissant à une mortalité précoce des animaux. La chirurgie aboutira à la présence d’un connecteur attaché au crâne de l’animal. La cicatrisation autour de ce connecteur devra être surveillée et soignée. Des administrations pharmacologiques nécessiteront la manipulation des animaux, induisant un stress. Au point d’injection, des indurations ou des inflammations locales et temporaires pourront apparaître. Les prélèvements sanguins induiront un stress de contention, une douleur brève au point de prélèvement. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Un stress pourra être induit par l’hébergement individuel et le contrôle alimentaire.
Devenir
Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes, produit par le cerveau dans son ensemble qui ne peut pas être modélisé par un système plus simple (ex. culture cellulaire ou informatique).
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents et garantir la prédiction d’effets transposables à l’humain.
Raffinement
Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Le projet prévoit des procédures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins pré et postopératoires comprenant une anesthésie, des antidouleurs, des anti-inflammatoires et une évaluation clinique quotidienne. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication ont été identifiés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Pour les expériences d’enregistrement EEG en réponse à des stimulations sonores , ces stimulations seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons une lignée de rats mutants, dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients du syndrome de l’X fragile. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.
role des omega-3 dans les altérations cognitives
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Cinq injections intrapéritonéales au sevrage, des régimes carencés en oméga-3, jusqu'à cinq tests comportementaux de quelques minutes à l'âge de trois mois : les procédures s'arrêtent là. 5 498 souris vont être utilisées, dont 3 839 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 659 un niveau léger, toutes tuées pour le prélèvement de structures cérébrales. Le porteur affirme pourtant que les régimes n'impactent en rien le bien-être des animaux non-humains, que les tests ne provoquent qu'une anxiété légère et passagère, et que les souris transgéniques utilisées ne présentent aucune altération de leur état général. Rien dans le texte n'explique ce qui, dans ces procédures, conduit à classer 3 839 souris en gravité sévère, ni comment l'effectif de 5 498 a été établi.
Objectifs
Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme. Cette inflammation est associée à des modifications du comportement et des fonctions cognitives. Les fonctions cérébrales impliquent notamment la communication entre les cellules du cerveau. Cette communication repose entre autres sur des petites vésicules, qui participent aux fonctions cognitives et aux réponses inflammatoires. L’alimentation à laquelle nous sommes exposés tout au long de la vie est clé dans le bon fonctionnement du cerveau et le vieillissement de la mémoire. Certains nutriments tel que les oméga 3 ont un rôle bénéfique sur les mémoires. Cependant, leurs mécanismes d’action pour prévenir ou atténuer les altérations de la mémoire restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les changements de mémoire en lien avec l'alimentation et de déterminer des combinaisons de nutriments pour maintenir la mémoire. Dans ce contexte, le projet de recherche que nous souhaitons développer a pour objectif d’identifier des marqueurs des mécanismes du cerveau associés aux déficits de mémoire.
Bénéfices attendus
Notre étude associe une approche nutritionnelle à une approche comportementale et électrophysiologique dans le cadre de troubles de la mémoire, afin de mettre en avant la communication entre les cellules du cerveau. Elle apportera des connaissances nouvelles visant à mieux comprendre l'origine des troubles de la mémoire en lien avec l'alimentation.
Procédures
Les animaux seront soumis à des régimes carrencés ou équilibrés en oméga-3. Ils seront soumis à maximum 5 tests comportementaux à 3 mois permettant d'évaluer la mémoire, l'anxiété et la motricité de quelques minutes par test. Des injections intrapéritonéales au sevrage seront réalisées (5 injections/1 par jour).
Impact sur les animaux
Certains tests comportementaux génèrent une légère anxiété et du stress passager, sans entrainer d'altération de l'état général des animaux. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Les régimes équilibré, carencé ou supplémenté en Oméga 3 n’impactent en rien le bien-être de l’animal. L’injection intrapéritionéale au sevrage n’induit pas d’effets indésirables en dehors de la douleur liée au geste de l'injection. Les animaux transgéniques utilisés ne présentent pas d'altérations de l'état général de santé.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur le fonctionnement des cellules du cerveau chez la souris. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche de solutions alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et que le travail proposé n'a pas déjà été effectué.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et la genèse de données nouvelles sur le modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. La souris est un modèle pertinent et reconnu en nutrition et déclin cognitif, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement. Le modèle murin de vieillissement présente des similitudes avec le vieillissement chez l'homme et permets de comprendre les mécanismes potentiellement impliqués afin de découvrir de nouvelles méthodes pour vieillir en bonne santé.
Etude de la vascularisation lors de la réparation dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois administrations sous anesthésie générale, puis une quatrième deux jours plus tard sur animal éveillé, suffisent à déclencher chez la souris une maladie qui reproduit en partie la sclérose en plaques. 100 souris vont être utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 20 un niveau léger, toutes tuées pour le prélèvement de tissus. Elles développent des troubles de la marche et de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids, qui atteignent un pic de trois à cinq jours au bout de deux semaines environ, le porteur signalant aussi un risque de lésion cutanée au point d'injection. Le RNT ne nomme à aucun moment les produits injectés pour induire la maladie, ni la grille de score utilisée pour suivre les animaux non-humains.
Objectifs
La sclérose en plaque (SEP) est une pathologie du système nerveux central présentant une démyélinisation et une dégénérescence axonale. La forme la plus courante de la maladie est la forme récurrente-rémittente (RRMS), dans laquelle des poussées répétées de symptômes neurologiques sont suivies de périodes de récupération partielle ou complète. Les altérations de la structure et de la fonction du système vasculaire jouent un rôle essentiel dans les troubles neurodégénératifs chroniques telle que la sclérose en plaques. Des études récentes réalisées en imagerie cérébrale sur des cohortes de patients atteints de SEP ont décrit le remodelage vasculaire pendant la formation et l'évolution des lésions, mais aucune donnée n’existe à ce jour sur l’évolution de la vascularisation lors du processus de remyélinisation, un processus nécessitant un fort soutien métabolique dont les éléments (nutriments, oxygène, prises en charge des déchets..) sont apportés via les vaisseaux sanguins. Notre objectif sera de caractériser précisément les modulations de la vascularisation lors de la remyélinisation en utilisant un modèle murin de la SEP.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaque (SEP) est la seconde cause de handicap chez l’adulte jeune en France, elle touche plus de 120 000 personnes en France, et plus de 2 millions dans le monde. Il n’existe présentement aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet permettra d'étudier le processus de réparation dans un modèle murin de Sclérose en plaques dans l'organisme entier et ainsi de compléter des mécanismes récemment observés par imagerie cérébrale chez les patients. Cela pourrait permettre notamment de mieux comprendre le rôle de la vascularisation et sa modulation dans la physiopathologie de la SEP. A plus long terme, la compréhension des modulations de la vascularisation dans cette pathologie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients et donc améliorer leur prise en charge.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, recevront 3 administrations pour la mise en place du modèle (10 minutes maximum). Deux jours après, ils recevront une deuxième administration ( durée inférieure à 1 minute par animal, vigile). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements d’intérêt pour nos analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Après induction de notre modèle pathologique, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement au bout de 2 semaines environ et atteignent un pic durant 3-5 jours, puis sont suivis d’une récupération partielle ou complète en quelques jours. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation lors de l’induction de la pathologie sera très courte (inférieure à 10 minutes) et sera donc associée à un risque infime de détresse cardio-respiratoire et d’hypothermie. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Lors des injections d’induction de la pathologie, il existe également un risque de lésion cutanée du point d’injection dû à la molécule injectée.
Devenir
Des analyses seront réalisées post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour le prélèvement des tissus d’intérêt.
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la réparation tissulaire dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux et cellules immunitaires sanguines, ainsi que les apports métaboliques en lien avec le réseau sanguin, qui sont des composantes essentielles à étudier de cette pathologie, d’après les travaux en imagerie effectués chez le patient.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 100 maximum, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après la première expérience. Les données obtenues seront analysées avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant du matériel de nidification, une cachette (maisonnette, dôme) et un bâtonnet de bois à ronger. Nous respecterons une période d’acclimatation d’une semaine à l’arrivée des animaux dans l’animalerie avant toute inclusion dans la procédure. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Ils seront observés quotidiennement et surveillés de manière spécifique par l’équipe dès l’induction de la pathologie : afin de surveiller l’évolution des signes cliniques nous utiliserons une grille de score adaptée à notre modèle quotidiennement voir bi-quotidiennement lors de la phase aiguë de la pathologie. Nous mettrons en place une assistance nutritionnelle dès l’apparition de difficultés motrices (alimentation humide ou en gelée, facilement accessible dans la cage). L’induction de la pathologie sera réalisée sous anesthésie pour minimiser le stress et la douleur des animaux et faciliter la réalisation des injections. Des points limites seront définis et respectés pour éviter toute souffrance animale non nécessaire pour la procédure.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, son système nerveux, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle expérimentale développé chez la souris tel qu’utilisé ici, est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie les symptômes et lésions observés chez les patients. Nous utiliserons des souris adultes, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de la pathologie. L’usage de jeunes adultes permet de reproduire les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Caractérisation de la stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique précoce dans des modèles de trisomie 21
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Des souris de seize lignées différentes, porteuses de duplications partielles reproduisant la trisomie 21, vont être utilisées pour repérer les gènes qui lient ce syndrome aux maladies du foie. Elles sont 720, dont 672 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 48 sous anesthésie profonde sans réveil. Ces 48 souriceaux de sept et quinze jours reçoivent une ponction de sang directement dans le cœur et sont tués sans reprendre conscience. Les autres subissent dix semaines de régime appauvri ou enrichi en graisses, avec l'installation possible d'une maladie du foie, des difficultés à se déplacer et une perte de poids, puis des tests d'apprentissage rendus plus attirants par l'acidification de leur eau de boisson, avant d'être tuées pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet adopte une approche interdisciplinaire pour comprendre les pathologies du foie associées à des dysfonctionnements chez les personnes atteintes du Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 (T21). La T21 affecte 1 naissance sur 1 000, c’est la déficience intellectuelle la plus courante et elle est souvent accompagnée de comorbidités comme l'obésité, le diabète et des pathologies du foie. Le projet s'appuie sur des recherches antérieures financées par l'UE, qui ont montré que la pathologie du foie est présente chez 82 % des personnes atteintes de T21 et d'obésité, et chez seulement 45 % des personnes atteintes de T21 avec un indice de masse corporelle moyen. Les études sur des modèles murins mimant la T21 ont révélé que cette pathologie du foie contribue aux troubles cognitifs. Ces modèles présentent une inflammation du foie, une accumulation d'acides biliaires, une diminution du cholestérol et une augmentation de la bilirubine dans le sang. De plus, une suractivation des voies inflammatoires est observée dans divers tissus, y compris le foie, les muscles, les tissus adipeux et le cerveau. L'hypothèse du projet est que la perturbation de la biologie des acides biliaires et du cholestérol, due à la présence de trois copies de certains gènes (Trisomie) au lieu de deux, est un facteur intrinsèque conduisant aux pathologies du foie dans la T21. Le projet utilisera 16 modèles murins de la T21 avec différentes duplications partielles pour identifier les gènes candidats et étudier leurs effets sur le métabolisme et la cognition. L'identification de ces gènes permettra également d'étudier l'origine du dysfonctionnement hépatique au cours du développement, en se concentrant sur la biologie des acides biliaires et du cholestérol de la naissance à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’obésité dans la trisomie 21 (T21). L’identification des gènes du chromosome 21 impliqués et la compréhension du changement dû à l’obesité est essentielles. En effet, de meilleures thérapeutiques peuvent être proposées pour cibler cette obésité et en réduire les conséquences directes sur les différents organes du corps, y compris le cerveau. Cette étude ouvrira la voie à de futures investigations et déclencher de nouvelles voies thérapeutiques. Le développement de médicaments nécessitera une compréhension approfondie de la physiopathologie de l’obesité dans la T21. De plus, seule une analyse et une compréhension détaillées de la régulation de l’obesité fourniront un ensemble de marqueurs moléculaires essentiels au développement d’un candidat médicament. La T21 est toujours la forme la plus courante de déficience intellectuelle. Même après un diagnostic prénatal, la prévalence est toujours d’environ 1 sur 2000 naissances dans les pays industrialisés, alors que dans d’autres endroits, le risque est d’environ 1 sur 700 nouveau nés. En Europe, la T21 est responsable de 8 % des troubles congénitaux et d'environ 17 000 décès dans le monde. Pour les enfants atteints, les chances de survie au-delà de la première année de vie se sont améliorées ces dernières années : 90 % des enfants atteints survivent désormais au-delà de 5 ans. Ce taux montre l'importance du besoin médical d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. Le bénéfice majeur de ce projet sera de documenter les mécanismes génétiques et physiopathologiques aboutissant à l’obésité dans la T21, très peu investigués à ce jour, alors que l’obésité est une comorbidité largement présente chez plus de 30% des individus avec les patients T21.
Procédures
Les souris âgées de 7 et 15 jours auront un prélèvement de sang terminal (sans reveil) intracardiaque sous anesthésie profonde (quelques min) Les souris âgées de 60 jours ou plus auront un prélèvement de sang (5 min) après avoir réalisé ou non des tests de comportement non invasifs pour une évaluation de l’apprentissage et la mémoire. Deux groupes de souris seront nouries avec un régime appauvri ou enrichi en graisses pendant 10 semaines.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la maladie : L’installation d’une maladie hépatique peut entraîner une obésité, certaine gêne/douleur au niveau du foie en cas d’inflammation et/ou de fibrose. Dans le cas extrême d’évolution vers une insuffisance hépatique, les animaux pourraient présenter des signes de fatigue avec difficulté à se déplacer dans la cage et avoir une perte de poids. Nuisances liées au prélèvement de sang : Pour les souris nouveaux nés, le prélèvement de sang sous anesthésie peut engendrer un stress. Pour les souris plus âgées, le prélèvement du sang peut entrainer un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Celles liées aux tests de comportements : Les souris seront soumises à un stress léger lors des tests comportementaux (changement d’environement, changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétent le lait sucré lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Celles liées au régime alimentaire riche ou pauvre en graisses qui entraine : l’installation d’une maladie du foie impliquant une certaine gêne/douleur au niveau du foie en cas d’inflammation. Les animaux peuvent présenter des signes de fatigue (difficulté à se déplacer dans la cage), des crampes musculaires, une perte d’appétit, une perte de poids).
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort à l'issue de chaque procédures et certtains organes seront prélevés pour des études histologiques et moléculaires.
Remplacement
L’étude de perturbations comme les maladies du foie est possible chez la souris qui récapitule plusieurs aspects moléculaires et histopathologiques de la pathologie humaine dans la trisomie 21. Le modèle souris mutante est essentiel pour élucider le rôle des différentes régions du chromosome humain 21 dans les déficits cognitifs et comportementaux observés chez les personnes atteintes de T21, car elles sont très utiles pour reproduire le déficit intellectuel de ce syndrome. Comme l'objectif du projet est d'étudier les comorbidités de la T21, et l'ensemble des processus d'obésité nécessitent non seulement des régulations au sein du tissu mais également des communications inter-organes et avec l'environnement, qui n'existent que dans l'organisme entier. Les organoides ne permettent pas ce niveau d’échange et d'intégration physiologique, d'où l'utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Nos expériences de base sont construites sur des groupes de 16 animaux pour avoir un résultat significatif. Pour les tests de comportement, la taille des groupes a été déterminé grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser, soit 16 (8 mâles et 8 femelles) par groupes pour avoir des résultats significatifs. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 4 animaux de plus dans chaque groupe. D’autre part, la stratégie de croisement utilisées ne produit que les animaux nécessaires au déroulement du projet.
Raffinement
Un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience, Les animaux aiment bien s’y réfugier et il servira aussi à éviter les contentions par la queue tout au long de leur vie, cela limitera le stress chronique. Tout le personnel impliqué est formé pour réaliser le prélèvement de sang et minimiser le stress. Les souris seront évaluées 2 fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués Nous utilisons notamment en score basé sur la mobilité des animaux. Les prises de sang à 7 et 15 jours après la naissance seront réalisées sous anesthésie de manière à limiter l’inconfort.
Choix des espèces
Il existe de nombreux modèles animaux d’obésité mais peu sont ceux qui récapitulent la physiologie, l'histologie, les résultats et les changements transcriptomiques observés chez les humains. Ces modèles sont différents de l’humain, soit parce qu'ils nécessitent des manipulations alimentaires non physiologiques, soit parce qu'ils ne présentent pas de résistance à l'insuline spécifique de la pathologie humaine. Ce qui n’est pas le cas chez la souris. De plus, la souris est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Il existe un grand nombre de modèles murins qui miment la trisomie 21. De plus, son temps de génération associé aux techniques d’édition du génome existantes permettent de réaliser des études complexes et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. Les souris seront utilisées à l'âge 7 et 15 jours après la naissance pour déterminer à quel moment se met en place l’obésité. Les animaux seront placés sous régime spécial, dès 10 semaines d’âge et pendant 10 semaines, soit l’âge adulte,moment où le développement cérébral est achevé. Les animaux seront prélevés à 60 jours après la naissance ou plus pour les groupes qui passeront les tests de comportement, soit l’âge adulte, moment où le développement cérébral est achevé, chez la souris, ce développement du cerveau se poursuit après la naissance.
Repenser la nutrition protéique pour la santé, le bien-être et la robustesse du poussin – évaluation de stratégies nutritionnelles précoces pour améliorer la réponse des animaux à des régimes diversifiés tout au long de la période d’élevage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour réduire l'importation de soja en remplaçant les protéines de la ration des poulets par du tournesol et du colza, 112 poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Seize sont saignés au sinus occipital le jour de l'éclosion, puis tués aussitôt. Les 96 autres subissent trois prises de sang sur animal vigile, à dix, vingt-et-un et trente-cinq jours, avant d'être tués à trente-cinq jours pour le prélèvement de tissus et la pesée de leurs organes. Le projet est présenté comme visant la santé, le bien-être et la robustesse du poussin, et sa fin coïncide avec la durée d'élevage standard d'un poulet de chair.
Objectifs
La nutrition du poussin est délicate du fait du passage d’une alimentation d’origine maternelle à une alimentation d’origine exogène, alors qu’elle contribue de manière importante à sa robustesse en renforçant sa santé digestive. Les apports protéiques pourraient probablement être réduits dans les premiers jours de vie et l’usage de matières premières protéiques locales souvent riches en fibres pourrait être facilité en période de croissance par une alimentation néonatale adaptée. L’objectif général du projet PRESAJE est de proposer des stratégies nutritionnelles précoces du poussin afin de renforcer sa santé et son bien-être, et d’améliorer l’usage de sources de protéines diversifiées et locales, à base de tournesol et colza par exemple, pour réduire l'importation de soja. Nous cherchons à évaluer l’effet d’un choix de stratégies nutritionnelles précoces basé sur les connaissances acquises dans le cadre du projet, sur la santé, le bien-être et la robustesse des animaux, tout au long de la période d’élevage.
Bénéfices attendus
L’objectif général du projet est de proposer des stratégies nutritionnelles précoces du poussin afin de renforcer sa santé digestive et son bien-être, et d’améliorer l’usage de sources de protéines diversifiées et locales. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale fine d’une période du développement de l’animal qui est relativement peu étudiée. La connaissance des besoins nutritionnels du poussin a été expérimentée mais jamais, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Au niveau opérationnel, les attendus sont de : mieux appréhender les besoins du poussin (incluant la période ≤ 7 jours) pour réduire les apports en protéines et apporter les acides aminés de manière à optimiser l’équilibre entre les fonctions adaptatives et productives, et proposer des stratégies nutritionnelles précoces permettant de renforcer la santé et le bien-être des animaux tout en favorisant l’usage de matières premières protéiques locales sur toute la période d’élevage.
Procédures
Une prise de sang au sinus occipital sera effectuée sur animaux vigiles sur 112 animaux. Les animaux prélevés à l’éclosion (n=16) seront mis à mort ensuite. 96 animaux seront prélevés à trois reprises au cours de l’élevage (J10, J21 et J35). Il y aura donc trois prises de sang par animal, espacées dans le temps, qui ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome.
Devenir
Tous les animaux sur lesquels les prélèvements de sang seront faits (soit 112 animaux), seront mis à mort à J0 (n=16) ou à J35 pour des prélèvements de tissus et mesures de poids des organes (n=96), ceci afin de mesurer des biomarqueurs tissulaires en lien avec leur robustesse, santé et bien-être post-éclosion et en fonction des caractéristiques du régime (utilisation de sources protéiques diversifiées).
Remplacement
La connaissance des besoins nutritionnels du poussin sera expérimentée sous l’angle original et complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Les analyses ne peuvent se réaliser que chez l’animal et directement sur l’espèce cible (poule domestique).
Réduction
L’effectif de 112 animaux (16 à l’éclosion et 96 ensuite), la moitié étant des mâles et l’autre moitié étant des femelles a été défini pour permettre de détecter significativement des effets possibles de stratégies nutritionnelles précoces appliquées dans le cadre d’une diversification des sources protéiques sur les performances de croissance et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. L’unité statistique pour analyser les performances de croissance sera le parquet. Huit parquets par groupe sont nécessaires et suffisants pour détecter des différences de consommation d’aliment et d’indice de consommation entre régimes d'après des travaux antérieurs validés et publiés sur l’apport en protéines et en acides aminés chez les poulets en fin de période d’élevage. Ces paramètres seront analysés statistiquement pour comparer les différents traitements. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal. Pour caractériser l’état initial post-éclosion, 16 poussins (8 par sexe) seront utilisés avec prélèvements de sang pour des mesures de biomarqueurs. De même, un effectif de 16 animaux par régime, sexes confondus (2 par parquet, soit 1 mâle et une femelle par parquet), soit 96 animaux, est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes et de la variabilité interindividuelle attendue des paramètres sanguins mesurés : utilisation des résultats d’essais précédents et des avancées méthodologiques d'après des travaux antérieurs validés et publiés.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Le suivi des performances sera fréquent avec des mesures hebdomadaires sur la période étudiée. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur puis les animaux seront élevés jusqu’à 35 jours (durée d’élevage standard).