Recherche fondamentale
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Évaluation des nouveaux traitements locaux à base de matériaux bioactifs ou d’ARN pour le glioblastome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une craniotomie, une greffe de tumeur cérébrale, puis l'excision chirurgicale de cette tumeur et l'administration de traitements dans la cavité laissée ouverte : 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent de la radiothérapie, des administrations orales, des anesthésies répétées et des hémorragies locales possibles, la tumeur provoquant à terme perte d'appétit, malnutrition et perte de poids. Le porteur écrit qu'aucun médicament testé ces quinze dernières années n'a donné de résultats cliniques cohérents, en partie parce que les modèles de recherche actuels ne reflètent pas la complexité du glioblastome humain, et conclut plus loin qu'"aucune autre méthode" ne pourrait se substituer à l'expérimentation animale. Les souris de l'étude de survie sont tuées quand un point d'arrêt est atteint, ou au plus tard 150 jours après la greffe.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale très agressive, avec une survie médiane de seulement 15 mois malgré des traitements combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Deux principaux obstacles limitent l’efficacité de ces traitements : la barrière cérébrale, qui empêche aux médicaments d’atteindre la tumeur, et les cellules tumorales résistantes aux traitements. Après l’opération, la majorité des récidives surviennent près des bords chirurgicaux, où le microenvironnement favorise la croissance des cellules cancéreuses. Deux approches thérapeutiques locales montrent un grand potentiel : l’implantation de matériaux bioactifs dans le cerveau pour délivrer directement des médicaments anticancéreux et l’utilisation de thérapies basées sur des acides nucléiques pour bloquer les gènes responsables des récidives. Ces méthodes permettent de contourner la barrière cérébrale et d’administrer les traitements de manière ciblée et prolongée. Cependant, bien que les résultats précliniques soient prometteurs, aucun médicament testé ces 15 dernières années n’a donné de résultats cliniques cohérents, en partie à cause des modèles de recherche actuels qui ne reflètent pas suffisamment la complexité du glioblastome humain. Il est donc essentiel de développer des modèles expérimentaux qui reproduisent mieux le microenvironnement post-chirurgical du glioblastome et de tester de nouveaux traitements locaux pour prévenir les récidives. Ce projet proposera deux nouveaux modèles expérimentaux de résection tumorale et évaluera la sécurité et l’efficacité de quatre traitements locaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mettre en place des modèles de GBM pertinents et de vérifier la tolerabilité et l’efficacité anticancéreuse de quatre nouveaux traitements locaux pour une application post-chirurgicale dans le glioblastome. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement du tumeur cérébrale haut grade qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1) acte chirurgical permettant l’intégration de matériel génétique; 2) greffe tumorale ; 3) excision chirurgicale de la tumeur et administration de traitements dans la cavité post-chirurgicale; 4) imagérie nucléaire ou par bioluminescence. Une administration de médicament par voie orale et de la radiothérapie ainsi que des anesthésies répétées sont aussi prévus pour certains animaux. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie ne dépassera pas les 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, la pousse tumorale, l'excision chirurgicale de la tumeur, l'administration de traitements et la douleur liée aux actes chirurgicaux. La manipulation, contention des animaux, les injections répétées d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La résection peut induire des hémorragies locales et avec la craniotomie elles peuvent générer des douleurs post-opératoires minorées par l'administration d'antalgiques. Les souris nude et SCID seront hébérgées en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Les animaux de l’étude de survie seront mis à mort lorsque l'un des points d'arrêts est atteint. Si les animaux n'ont pas atteint ces points au jour 150 post-greffe tumorale ou 120 post-traitement, ils seront mis à mort. Les animaux de l'étude de tolerabilité et de biodistribution dans le cerveau seront mis à mort à des temps prédéfinis pour effectuer des analyses post-mortem.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse des traitements locaux véhiculant des agents chimio thérapeutiques dans de matériaux bioactifs ou des acides nucléiques pour le glioblastome. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes conceptuelles et expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement in vitro . L'étape de validation de l'efficacité du traitement in vivo est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif. Animaux des deux sexes seront utilisés dans les procédures expérimentales.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les souriceaux seront gardés en portée avec leur mère. Les animaux seront observés quotidiennement. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle souris représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles de tumeur que nous étudions vont nous permettre de mimer des mécanismes cellulaires et moléculaires des tumeurs humaines. Un acte chirurgical permettant l’intégration de matériel génétique sera effectué au stade nouveau-né pour induire des tumeurs chez l’animal adulte. Les tumeurs seront greffées ou induites à 7-8 semaines, sur la base de résultats publiés auparavant. Le poids des souriceaux à P1 sera d’environ 2-3 g ; le poids des adultes au moment de l’induction sera d’environ 20-22 g.
Génération d’anticorps monoclonaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
La plateforme fabrique des anticorps monoclonaux à la demande d'équipes académiques et industrielles, à raison de deux souris par antigène commandé. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur rate. Chacune reçoit trois à cinq injections d'une substance immunogène dans l'abdomen, à quinze jours d'intervalle, puis une prise de sang destinée à mesurer sa réponse immunitaire. Le porteur indique qu'un anticorps recombinant est produit in vitro quand c'est possible, juge les banques d'anticorps synthétiques limitées par leur sélection "artificielle et aléatoire", et note que la quasi-totalité des anticorps utilisés chez l'être humain proviennent de l'immunisation d'animaux non-humains.
Objectifs
La génération d'anticorps monoclonaux est la mission de notre plateforme "Ingénierie d'anticorps". Cette mission consiste à générer des anticorps monoclonaux par immunisation de la souris pour les équipes de recherche académiques et industrielles pour leur utilisation en recherche diagnostic et biotechnologie.
Bénéfices attendus
Le projet permet l'obtention d'anticorps monoclonaux hautement spécifiques qui sont des outils indispensables dans la recherche, la biotechnologie, le diagnostic et le développement de traitements thérapeutiques.
Procédures
L'immunisation consiste à injecter un petit volume de substance immunogène dans l'abdomen de souris 3 à 5 fois, à intervalle de deux semaines. Ensuite, un échantillon de sang est prélevé pour évaluer la réponse immunitaire. La souris est ensuite euthanasiée et un prélèvement de la rate est réalisé en vue de la préparation des lymphocytes. Les durées des interventions sur les souris (injections, prélèvement de sang) sont très courtes, de l'ordre de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les injections répétées lors de l'immunisation peuvent provoquer du stress, de la douleur et de l'inconfort. Le prélèvement de sang peut entraîner une douleur et un stress.
Devenir
Les souris immunisées sont euthanasiées puis un prélèvement de la rate est réalisé pour la préparation des lymphocytes.
Remplacement
La génération d'anticorps chez la souris est envisagée lorsqu'il n'existe pas d'anticorps déjà disponible et pouvant répondre au besoin du demandeur. Lorsque cela est possible, un anticorps recombinant est produit in vitro. La production de l'anticorps in vivo chez la souris est remplacée par la production in vitro. Il n'est actuellement pas raisonnable de se passer totalement de l'utilisation des animaux pour la génération des anticorps. Bien que des banques d'anticorps synthétiques existent, la génération d'anticorps monoclonaux par immunisation de souris reste une approche privilégiée. La souris produit des anticorps naturellement optimisés via une réponse immunitaire complète, incluant la maturation d'affinité et la sélection par le système immunitaire. Les banques d’anticorps reposent sur une sélection artificielle et aléatoire ce qui limite la qualité des anticorps. Noter que la quasi-totalité des anticorps utilisés actuellement chez l'homme proviennent de l'immunisation des animaux.
Réduction
Nous réalisons une planification optimisée pour éviter de renouveler les procédures expérimentales. Nous limitons l'immunisation à 2 souris par antigène.
Raffinement
Nos procédures sont réalisées par un personnel expérimenté (plus de 20 ans d'expertise). Les injections et prélèvements moins traumatiques sont privilégiés. Une désinfection locale de la peau est réalisée avant chaque injection ou prélèvement. Les animaux sont suivis quotidiennement tout au long de la procédure et pour minimiser la douleur et l'inconfort, ils reçoivent un traitement analgésique. Les animaux présentant des signes de douleur dépassant le seuil fixé sont sortis du protocole expérimental et euthanasiés.
Choix des espèces
La méthode de génération d'anticorps monoclonaux repose sur la fusion de lymphocytes avec des cellules de myélome. Ces cellules de myélome sont originaires de la souris et n'existent quasiment que pour cette espèce, d'où le choix de la souris pour une question de compatibilité génétique lors la formation d'hybrides cellulaires. Pour l'immunisation, nous utilisons des souris jeunes qui ont un système immunitaire encore en développement, ce qui favorise une meilleure réponse immunitaire.
Rôle de la protéine matricellulaire hevin dans la résilience au stress et la réponse aux antidépresseurs dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour chercher si une protéine du cerveau, l'hevin, prédit la réponse aux antidépresseurs, 4 696 souris vont être utilisées, 3 126 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 570 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'environ 45 minutes sous anesthésie, puis dix jours de défaite sociale à raison d'une séance quotidienne de cinq minutes, puis jusqu'à quatre semaines de tests comportementaux et des prises de sang. Le porteur décrit les effets attendus du protocole de stress, anxiété accrue, anhédonie, retrait social et perte de poids, et signale que les mâles logés ensemble peuvent se battre et se blesser. Les souris qui servent d'agresseuses ou de partenaires d'interaction sont tuées après six à neuf mois d'utilisation.
Objectifs
L’objectif général du projet est de définir le rôle des astrocytes et de la protéine hevin dans la réponse au stress et aux antidépresseurs et de déterminer si hevin pourrait servir de biomarqueur de la réponse aux antidépresseurs dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Le projet s’intéresse aux mécanismes de la dépression, la maladie psychiatrique la plus fréquente chez l’homme (prévalence de 6 à 12 pourcent) Nos résultats attendus aideront à comprendre le rôle des glycoprotéines de la matrice extracellulaire dans la plasticité de la résilience et à identifier le réseau de protéines régulatrices et d'effecteurs qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques pour le trouble de dépression majeure. Plus important encore, nous émettons l'hypothèse que les changements dans les biomarqueurs sanguins de ces protéines, impliqués dans la motivation, la réponse aux antidépresseurs et la neuroplasticité, seraient corrélés aux changements dans les réponses comportementales et émotionnelles chez les individus déprimés (recevant des antidépresseurs) avant et après la réponse thérapeutique. L'identification de biomarqueurs sanguins prédictifs de la réponse future aux antidépresseurs aurait un impact clinique important, permettant aux cliniciens d'optimiser les plans de traitement, d'adapter la thérapie à chaque patient et de personnaliser les plans de traitement afin d'améliorer les chances de réussite des résultats thérapeutiques dans la dépression.
Procédures
Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 45 minutes par souris, accompagnée d’injections d’anesthésiques et d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront également soumises à une procédure de stress répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 5 minutes pendant 10 jours, suivie de tâches comportementales réparties sur une période maximale de 4 semaines, à raison d’un test par jour d’une durée allant de 10 minutes à 1 heure. Les souris ayant subi les stress répétés seront regroupées après la défaite sociale jusqu’à la fin des expériences. Enfin, des prélèvements sanguins et une exposition à un stress aigu pour un test de reconnaissance émotionnelle seront également réalisés.
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Le protocole de stress peut entraîner une augmentation de l’anxiété, une prise de poids, une anhédonie (symptôme psychologique caractérisé par une incapacité ou une diminution marquée à ressentir du plaisir ou de l'intérêt pour des activités ou situations qui étaient auparavant agréables) et un retrait social chez un sous-groupe d’individus. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’une anxiété et une anhédonie si l’hébergement individuel dépasse 6 semaines, ce qui correspond à un stress social. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié et le cerveau collecté pour analyse histologique de l'injection virale ou analyse anatomique. Les souris utilisées pour la défaite ou l’interaction seront euthanasiée après 6 à 9 mois d’utilisation
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, les effets du stress se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. Il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes et des circuits cérébraux dans le cerveau.
Réduction
Un nombre important d’animaux est nécessaire, au total 4696, car, pour plusieurs tests, une seule tâche doit être effectuée par cohorte du fait de l’interférence entre différents tests. Nous avons cependant réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à une analyse prédictive du nombre d’animaux en réalisant un calcul de puissance. Nos travaux passés nous indiquent aussi que ces études comportementales nécessitent entre 40 et 60 souris par groupe expérimental pour atteindre une puissance statistique satisfaisante. Lorsque cela sera possible, un même groupe d’animaux sera utilisé dans plusieurs tests comportementaux. Ainsi un même groupe d’animaux passera par une séquence de comportements allant du moins stressant au plus stressant : 1- Interaction sociale 2- Anxiété 3- Anhédonie 4- Reconnaissance d’objet
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les souris hébergés individuellement seront également dans des cages avec du nid végétal et un igloo. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et manipulation par l’experimentateur puis expériences). Une pesée bi-mensuelle sera effectuée. Un tapis chauffant après la chirurgie stéréotaxique est utilisé. La durée de l’anesthésie est de 60 min. Elles commencent à se réveiller au bout de 60 min et sont réveillées au bout de 90 min. La souris revient à elle peu de temps après la chirurgie. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour nos chirurgies, nous utilisons : a) analgésiques et lubrifiant (protecteur ophtalmique) pendant la procédure chirurgicale b) anesthésiques pour les procédures qui entrainent de la douleur lors de l’injection stéréotaxique. Pour le prélèvement de sang, la procédure ne dure que quelques econdes et ne nécessite pas d’endormissement. Dans le cas où la souris n’est pas controlable, elle sera anesthésiée. La lancette pour éliminer les problèmes liés à l'utilisation d'un scalpel ou d'une aiguille pour prélever du sang sur la joue au niveau submandibuliare. Elle facilite la procédure de prise de sang et permet d'obtenir des quantités constantes de sang, sans risque de blesser la souris.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. L'avantage du modèle murin est qu'il peut être utilisé afin de tirer profit des techniques de transgénèse (souris transgéniques et transgénèse induite par des virus). En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge entre 8 et 20 semaines), pour étudier la plasticité neuronale induite par les drogues chez l’adulte.
Evaluation de la transformation maligne de mélanocytes uvéaux humains modifiés génétiquement par leur capacité de former des tumeurs sur la souris immunodéficiente.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui leur interdit de rejeter les cellules humaines qu'on leur injecte. 270 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Chacune reçoit dans le flanc des mélanocytes humains prélevés dans l'œil de patients puis modifiés génétiquement, passe en imagerie sous anesthésie d'abord toutes les deux semaines puis chaque semaine, subit l'exérèse chirurgicale de la tumeur, puis six mois de suivi pendant lesquels des métastases peuvent apparaître et provoquer une perte de poids rapide ou de l'apathie. Une souris est mise à mort si elle garde une posture anormale, ou si une ulcération ou une surinfection persiste plus de 72 heures malgré les soins.
Objectifs
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. La tumeur primaire est généralement traitée par chirurgie ou radiothérapie, cependant 30 à 50% des patients développent des métastases pour lesquelles il n’existe à ce jour que très peu d’option thérapeutique. Ce cancer se développe à partir des mélanocytes, qui tapissent la couche profonde de l’œil et l’iris. Le modèle actuel de la transformation de ces mélanocytes en mélanome uvéal malin propose l’action de deux altérations successives du patrimoine génétique (ADN). Une première altération favorise la prolifération et la survie des cellules, aboutissant à une tumeur bénigne appelée naevus (grain de beauté) sur le fond de l’œil. Une deuxième altération de l’ADN peut malheureusement survenir, aboutissant au mélanome uvéal. Cette deuxième altération de l’ADN touche différents gènes, impliqués dans des processus biologiques distincts, et impliqués dans des tumeurs de pronostics très différents. Cependant, les mécanismes biologiques précis impliqués dans le développement de ce cancer et notamment dans le développement des métastases restent à élucider. Afin de vérifier le modèle actuel de transformation maligne du mélanome uvéal, et de mieux comprendre les processus biologiques sous-jacents, nous avons établi des lignées de mélanocytes normaux à partir de tissu d’yeux obtenus suite à l’énucléation de patients traités pour leur MU. Dans ces mélanocytes normaux, nous introduisons les différentes altérations de l’ADN identifiées chez les patients afin de reproduire in vitro la transformation de mélanocytes sains en cellules tumorales. Pour valider la malignité et le potentiel métastatique de ces mélanocytes modifiés in vitro, nous allons injecter ces cellules dans des souris immunodéficientes et évaluer d’une part, leur capacité à développer des tumeurs et d’autre part, leur pouvoir à développer des métastases. Les objectifs de ce projet sont de vérifier le modèle actuel de la transformation maligne et d’établir des modèles précliniques qui permettront de tester de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Le mélanome uvéal (MU) provient de la transformation maligne des mélanocytes qui tapissent une couche interne de l’œil. La chirurgie et la radiothérapie sont très efficaces pour contrôler la tumeur primaire oculaire. Cependant, plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique. Malheureusement le pronostic est mauvais au stade métastatique, avec à ce jour un seul traitement ayant démontré un bénéfice, et uniquement pour une fraction des patients. Les retombées attendues des expériences in vivo proposées ici sont (i) de comprendre par l’établissement de modèles cellulaires les mécanismes biologiques en cause dans le développement de mélanome uvéal chez la souris immunodéficiente ; (ii) d’établir des modèles précliniques qui permettront de tester de nouvelles approches thérapeutiques et (iii) de comprendre certains facteurs de prédisposition à ce cancer.
Procédures
Injection sur animal vigile de cellules dans le derme de la souris au niveau du flanc droit, 1 fois en début d’expérience : 10 secondes / 270 souris. Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique, 1 fois toutes les 2 semaines, puis une fois par semaine tout au long de la procédure / 270 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes maximum. Prélèvements sanguins sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant mise à mort / 270 souris - 20 secondes sur animal vigile, 3 minutes avec anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales, d’anesthésiques ou de la molécule permettant de visualiser les métastases, seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur légère pendant la durée d’injection :15 secondes). La croissance des tumeurs greffées sur le flanc peut provoquer une perte de poids ou une gêne pour se déplacer, et ce jusqu’à l’excision de la tumeur. Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau (nuisance modérée) et l’exérèse de la tumeur primaire provocant de la douleur et/ou surinfection bactérienne de la plaie (très rare) durant les premières 48 heures. Par ailleurs, l’anesthésie pendant la chirurgie et l’imagerie provoque la sècheresse des yeux et une baisse de la température corporelle de l’animal (40 minutes) L'apparition des métastases peut provoquer la perte de poids rapide ou apathie chez l’animal (durée : 7 jours maximum)
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’efficacité de la transformation des cellules normales en cellules tumorales par les différentes combinaisons de mutations sera étudiée au préalable in vitro. Des tests classiques de migration, d’invasion et de prolifération seront conduits sur ces cellules. Ces analyses in vitro permettront de sélectionner les lignées ayant les caractéristiques recherchées pour les analyses in vivo et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Cependant, il est indispensable de valider et comparer la capacité de former des tumeurs primaires et des métastases pour ces modèles cellulaires portant différentes modifications. En effet, la souris, en tant qu’organisme vivant intégré et autonome, permet de se rapprocher au plus près du contexte dans lequel se développent les tumeurs des patients. Les modèles murins permettent de reproduire les interactions des cellules tumorales au sein d’un tissu, la croissance tridimensionnelle, ainsi qu’un environnement hypoxique avec un accès limité aux nutriments. De plus, les cellules de mélanome uvéal poussant difficilement in vitro, l’injection chez l’animal est indispensable pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour les expériences envisagées.
Réduction
Dans un premier temps, nous évaluerons le taux de prise tumorale de nos modèles ayant subi toutes les étapes de la transformation maligne. Si le taux de prise tumorale est satisfaisant (greffe d’au moins 2 souris sur 5), nous estimons l’utilisation de 5 souris par groupe comme étant le minimum suffisant pour comparer la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Sinon, la greffe sera faite sur 5 souris supplémentaires par groupe (10 au total), en considérant comme positive la greffe d’au moins 2 souris sur les 10). Si ce taux n’est pas atteint, l’expérience sera considérée comme négative et arrêtée. Dans le cas où ces cellules modifiées ne donnent pas de tumeur in vivo, les cellules normales ou partiellement modifiées (par la seule mutation GNAQ) ne seront pas injectées. Les animaux ayant une prise tumorale sur le flanc au niveau de l’injection seront suivis à long terme, pendant 6 mois après exérèse de la tumeur primaire, par l'utilisation d'imagerie longitudinale pour rechercher une diffusion métastatique. Ceci sera mis en œuvre afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Aucun test statistique n’est mis en œuvre. La réponse recherchée est la prise ou non de la greffe, en fonction des modèles. La taille des cohortes a été déterminée sur le taux d’échec expérimental lors de projets similaires, pour minimiser le taux de faux négatifs tout en minimisant le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : Utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques lors des chirurgies. Prévention du dessèchement des yeux lors de l’anesthésie par application du gel ophtalmique. Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : utilisation de tapis ou lampe chauffants. Addition d’alimentation hydratée en post-opératoire si besoin, hydratation supplémentaire par injection des solutés de réhydratation tel que Ringer lactate à l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie. Si l’animal montre des signes de douleur, des antalgiques lui seront administrés. Les animaux seront surveillés pendant 24h en post-chirurgie et, si besoin, la surveillance peut être prolongée pendant 7 jours, au moins une fois par jour. Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne), il sera mis à mort. Par la suite, les animaux sont surveillés au minimum 1 fois par semaine par le personnel. Pour faciliter le suivi des métastases, nous allons utiliser l’imagerie technique non-invasive sous anesthésie générale. Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne ou ulcération qui durent >72h malgré les soins), il sera mis à mort. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limites au-delà desquels les animaux seront mis à mort
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en cancérogenèse - L’existence de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Le taux de succès des greffes de ce type de cellules humaines dans d’autres espèces comme le poisson-zèbre est trop faible pour envisager leur utilisation dans ce projet. Utilisation de jeunes adultes entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance, mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux. De plus le temps de croissance des cellules tumorales de mélanome uvéal est long, ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.
Exploration, caracterisation et distinction des phenotypes schizophreniques et autistiques dans les modeles murins Scn2a
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six minutes suspendues par la queue, six minutes de nage forcée, trente minutes dans une arène très éclairée, quatre heures par jour de séparation d'avec leur mère pendant dix jours pour les souriceaux de trois à douze jours. 1 434 souris vont être utilisées, 894 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 540 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur cherche à déclencher chez elles des états qu'il rapproche de la schizophrénie et de l'autisme, par le bruit, la litière mouillée, la surpopulation, la contention ou des injections quotidiennes, avant de mesurer le toilettage, l'enfouissement de billes et la réaction à un son fort. Il écrit que l'induction d'un stress étant l'objectif, aucun raffinement n'est prévu pour ces procédures.
Objectifs
Nous étudions des pathologies cérébrales associées à des mutations dans les gènes codant pour des canaux ioniques laissant passer le sodium. Nous avons identifié un patient porteur d’une mutation qui présente une schizophrénie à début précoce. La schizophrénie est une maladie psychiatrique chronique grave chez l’humain et caractérisée par l’apparition de symptômes positifs (délires, hallucinations et discours ou comportement désorganisé) avant l’âge de 13 ans ; il est associé à d’autres troubles comportementaux, comme les Troubles du Spectre Autistique et le trouble du déficit de l’attention. Chez les souris modèle de la même mutation que le patient cité ci-dessus, les jeunes souris présentent des déficits de type autistique associés à des altérations des processus émotionnels et cognitifs, tandis que les souris adultes ne présentent qu'un déficit de communication sociale. Les souris mutantes présentent aussi de la schizophrénie qui est apparemment déclenché par un stress. En particulier, ces souris présentent des signes de psychose aiguë après le transport. Pour ce projet, nous souhaitons approfondir la caractérisation comportementale de ce modèle et d’un second modèle de mutation du même canal ionique servant de contrôle, en mettant spécifiquement l'accent sur les caractéristiques schizophréniques. Nous utiliserons des stress chronique ou aigu chez des souris juvéniles pour tenter d'induire la schizophrénie. Nous ferons ensuite une surveillance comportementale hebdomadaire et une validation finale de la schizophrénie à l'âge adulte. Les évaluations comportementales comprendront des tests pertinents pour les troubles du spectre autistique et pour la schizophrénie. L’objectif du projet est de déterminer si la mutation identifiée chez la patiente schizophrène permet d'observer les symptômes décrits chez les patients humains (troubles du spectre autistique et schizophrénie) alors qu'une autre mutation contrôle ne devrait pas déclencher de schizophrénie. Cela permettra de mieux comprendre les mécanismes pathologiques et d'en déduire de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal est de comprendre comment les mutations du même canal ionique contribuent différemment à l’autisme et à la schizophrénie, ce qui fournira des informations précieuses sur les mécanismes distincts et superposés sous-jacents à ces conditions. Ces connaissances pourraient aider à identifier les interactions génétiques (les mutations) et environnementales spécifiques (les procédures de stress utilisées) qui conduisent au développement de ces troubles et à approfondir dans des études futures les mécanismes cellulaires aboutissant à un comportement normal ou anormal. En fin de compte, les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées pour l’autisme et la schizophrénie. En identifiant et en caractérisant les voies affectées par les mutations, nous pourrions découvrir de nouveaux points d’intervention pour les thérapies pharmacologiques ou comportementales. De telles avancées ont le potentiel d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients touchés par ces troubles neuropsychiatriques complexes.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie de la queue (5 s) afin de connaitre leur génotype. La majorité des animaux seront ensuite soumis à une procédure, et les animaux restants seront utilisés comme simple partenaire. Etant l’objectif du projet, dans chacune des procédures les souris seront soumises à une unique forme de stress parmi un des 4 suivants : - Bruit et cage sur un support mouvant pendant 3h sur 3 jours (souris âgées de 25 à 28 jours), - Répétition d’un unique stress léger parmi plusieurs possibles (litière neuve, mouillée, ou absente, cage, inclinée, contention, présence de congénères inconnus, cage surpeuplée) 1h à 4h chaque jour pendant 24 jours (souris âgées de 25 à 49 jours), - Isolement maternel de souriceaux pendant 4 heures par jour pendant 10 jours (souris âgées de 3 à 12 jours), - Injection quotidienne (durée 3 à 5 s) pendant 10 jours (souris âgées de 25 à 35 jours). Puis une évaluation du comportement afin d’évaluer les conséquences du stress et des mutations sera effectuée à partir de l’âge de 70 jours avec une série de tests. Un unique test utilisé par jour parmi les suivants. Les premiers tests permettent d'évaluer les comportements de type schizophrénique : l’exploration d’une arène très éclairée pendant 30 min, une contention dans un tube pendant deux séances d'habituation de 10 min et pendant la durée du test (environ 20 min) qui consiste en une exposition à un bruit fort précédent un autre son standard, une analyse de comportement automatisée ou les souris seront isolées pendant 3 jours dans une cage classique, une unique injection (durée 3 à 5 s) qui déclenche une hyperlocomotion. La seconde série de tests permet d'évaluer le comportement autistique: mesure du toilettage (20 min) et de l'enfouissement de billes (20 min). La dernière série de tests permet d'évaluer de l'anxiété ou de la dépression: une suspension par la queue pendant une 6 minutes, 6 min de nage forcée dans de l'eau, et 5 fois la possibilité de nager pendant 3 minutes.
Impact sur les animaux
L’utilisation de tests comportementaux permettent de révéler des troubles de type autistique caractérisés par des degrés variables de déficits dans l'interaction sociale et la communication, qui peuvent ou non être accompagnés de comportements stéréotypés et d'anomalies sensorielles. Les différentes interventions vont provoquer un stress et nous nous attendons également à observer des caractéristiques schizophréniques pour un des deux modèles de mutation. Pour évaluer ces symptômes, nous effectuerons une série de tests spécifiques ciblant les comportements de type schizophrénique. Tous les animaux subissent une biopsie sur la queue qui peut provoquer des saignements et un stress léger et passager. Les injections quotidiennes sur 10 jours consécutifs peuvent induire un stress léger et passager ainsi que des irritations cutanées., L'hébergement individuel pendant 3 jours pour un des tests comportementaux peut induire un stress léger des animaux.
Devenir
Tous les animaux produits subissent un prélèvement sur la queue, puis la moitié subiront une procédure modérée puis seront mis à mort. Les animaux restant seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro et ex vivo sur des cellules exprimant des canaux ioniques porteurs des mutations citées ci-dessus, et identifié des mécanismes associés aux mutations. Les modèles animaux sont essentiels pour ce projet car ils nous permettent d'étudier les interactions génétiques (mutations) et environnementales (différents stress) qui causent l'autisme et la schizophrénie dans un contexte d'organisme entier qui ne peut pas être reproduit in vitro. La caractérisation du comportement de souris porteuses des mêmes mutations est une étape essentielle pour valider in vivo ce mécanisme.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Dans toutes les procédures, nous n’utiliserons que les souris mutantes et comparerons les résultats obtenus avec les deux lignées. Les souris non mutées seront utilisées comme souris partenaire. Nous utiliserons les souris mâles et femelles des portées.
Raffinement
Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre dans lequel les animaux peuvent se rassembler. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une feuille de score sera utilisée pour évaluer les nuisances et apporter les réponses adéquates. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils et lors de la séparation maternelle les souriceaux sont maintenus sur une plaque chauffante et couverts par du papier absorbant pour éviter un refroidissement. L'induction d'un stress pendant les différentes procédures étant l'objectif il n'y a pas de raffinement prévu. Utilisation d'une liste de points limites avec des actions précises à mettre en oeuvre.
Choix des espèces
La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Sa petite taille permet également d’optimiser le nombre d’animaux dans le volume contraint des animaleries. Plusieurs tests comportementaux sont disponibles pour une caractérisation approfondie du phénotype de type schizophrénique chez les souris. Nous travaillons déja avec les deux lignées de souris que nous avons au laboratoire, par conséquent nous connaissons bien ce modèle. Dans une des procédures, les animaux seront utilisés dès le 3e jour postnatal, car le stress induit consiste a séparer les nouveau-nés de la mère pendant quelques heures. Pour les autres procédures, les souris seront utilisées entre les 25e et 49e jours postnataux, ce qui correspond à l'adolescence chez l'humain. Cette fenêtre d'âge est la plus sensible au développement potentiel de la psychose et est pertinente pour la schizophrénie humaine à début précoce. Les tests comportementaux seront effectués sur les souris à l’âge adulte (à partir du 70e jour postnatal) afin de laisser le temps à un éventuel phénotype de type schizophrénique de se mettre en place.
Étude de la modulation de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un prélèvement de tissu pour le génotypage et jusqu'à cinq injections par animal, chaque geste sur souris éveillée en moins d'une minute : 1 912 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Parmi elles, des souriceaux d'un à dix jours et des souris de 21 jours. L'objet est d'ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique en modulant l'expression des protéines qui la maintiennent étanche, pour y faire passer des médicaments. Le porteur ne détaille ni la nature des injections ni le calcul qui conduit à 1 912 souris, et se limite à indiquer que les effectifs ont été établis pour être statistiquement suffisants.
Objectifs
La barrière hémato-encéphalique est une barrière physique qui protège le tissu cérébral des toxines et pathogènes susceptibles de circuler dans le sang. Cependant, cette barrière entrave l'administration de médicaments dans le cerveau, et limite ainsi le traitement de diverses pathologies cérébrales. Rendre perméable cette barrière pendant un court instant permettrait l’administration de médicaments pour traiter des maladies cérébrales localement. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La modulation de l’expression de ces protéines pourrait être utilisée pour augmenter la diffusion des médicaments dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l‘intégrité de la barrière hémato-encéphalique, ainsi que son impact durant le développement postnatal et chez l’adulte
Procédures
Prélèvement pour identifier la mutation génétique (< 1 minute) : 1 prélèvement par souris sur souris vigile. Injection (< 1 minute) : Maximum de 5 injections par souris sur souris vigile.
Impact sur les animaux
Douleurs légères et de courtes durée liées aux prélèvement tissulaire pour l'identification de la mutation génétique et aux injections.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
Quand cela s’avère possible, des alternatives à l’utilisation d’animaux vivants sont utilisées. Ainsi, certaines études in vivo ont été remplacées par des études in vitro via l’utilisation de cellules endothéliales cérébrales murine.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Les groupes ont ainsi été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, les procédures se dérouleront sous la surveillance d'expérimentateurs formés. Le prélèvements pour génotypages sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. Des points limites adaptés ont été établis pour chaque procédure. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Cette étude se fera sur des souris de par l’existence de modèles de souris génétique avec modulation de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique Des souris de 21 jours seront utilisé pour les prélèvements pour génotypage. Des souriceaux entre J1 et J10 seront utilisées pour les études de développement postnatal. Des souris adultes entre 2 et 3 mois seront utilisées pour l’étude de la modulation de l’expression de gène sur le maintien de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique.
Etude des mécanismes du développement du ganglion lymphatique impliquant la molécule RANK
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Entre le cinquième et le onzième jour de vie, un fragment de queue est coupé aux ciseaux chirurgicaux sur des souriceaux séparés de leur mère jusqu'à dix minutes, pour le génotypage. Les nouveau-nés subissent ensuite deux gavages, parfois des injections, et les souris adolescentes deux semaines d'injections quotidiennes, l'excipient pouvant irriter la peau. 784 souris vont être utilisées, 624 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 160 un niveau léger, pour comprendre comment le drainage lymphatique gouverne le développement du ganglion. Toutes sont mises à mort en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs organes.
Objectifs
Les cellules immunitaires circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés dans les ganglions par le réseau lymphatique qui draine le tissu. Ce projet vise à mieux comprendre comment le drainage affecte le développement du ganglion lymphatique en utilisant des modèles de souris.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité, l’infection ou le cancer.
Procédures
Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages et dans certains cas à des injections pour une meilleure prise des traitements. Les souris adolescentes seront soumises selon les lots à des injections pendant 2 semaines pour une meilleure action du médicament. Un prélèvement de sang est effectué sur certains animaux. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique.
Impact sur les animaux
Pour le génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires, cela peut donc être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrémité de la queue à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. Le geste dure moins d’une minute par animal. Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’excipient peut provoquer une irritation cutanée. Les injections induisent une douleur légère de courte durée.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles assurent la bonne prise du médicament. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du ganglion lymphoïde. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du réseau et des ganglions.
Gestion de la production de 8 lignées de souris transgéniques utilisées dans le cadre de l’étude de la réponse immunitaire consécutive à l’injection d’AAV
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Nées de huit lignées de souris génétiquement modifiées, dont des lignées immunodéprimées, maintenues en élevage pour alimenter des projets sur la réponse immunitaire aux thérapies géniques, 32 580 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 22 230 d'entre elles seront tuées faute de porter le bon génotype ou d'être du bon sexe, 8 400 partiront vers des projets scientifiques et 1 950 resteront en vie comme reproductrices. La seule procédure déclarée est une biopsie d'oreille de moins de 2 mm au ciseau fin, sur souris éveillée, pour le génotypage. Le porteur affirme qu'"aucune méthode substitutive" n'existe pour reproduire la réponse immunitaire et que les croisements retenus imposent des génotypages auxquels il ne peut se soustraire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de produire et génotyper des animaux transgéniques (dont des modèles immunocompromis), amenés à être utilisés comme animaux d’étude dans des projets visant à mieux comprendre les réponses immunitaires induites après traitement par thérapie génique via des vecteurs viraux et à développer des approches permettant de réduire ces réponses. C’est ainsi que 8 lignées génétiquement modifiées pour différents éléments du système immunitaire sont maintenues en zone d’élevage dans cet objectif.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de fournir des animaux de génotype conforme de manière à satisfaire les besoins expérimentaux des projets d’étude de la réponse immunitaire, assurer le maintien des colonies d’élevage et de prendre à charge le phénotype dommageable des lignées concernées en conditions d’hébergement protégé. Cette demande s’inscrit plus largement dans l’étude des mécanismes de la réponse immunitaire dirigée contre des vecteurs viraux et dans le développement d’approches thérapeutiques permettant de réduire ces réponses immunitaires.
Procédures
Intervention du prélèvement pour identifier des animaux porteurs de la mutation génétique : les animaux subiront une biopsie de moins de 2 mm de diamètre à l'oreille pour le génotypage. Une paire de ciseaux fins sera utilisée à cet effet qui sera désinfectée à l'alcool et rincée à l'eau stérile entre chaque prélèvement. Cet acte est exécuté par du personnel zootechnique entraîné et ne nécessite que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La principale nuisance de ce projet est le prélèvement d’un fragment d’oreille de moins de 2mm de diamètre à des fins de génotypage. La douleur générée est considérée comme légère et passagère. Le phénotype dommageable des lignées concernées, lié au statut immunologique n’est pas exprimé dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation et ne présente de ce fait qu’une gravité légère.
Devenir
Sur 5 ans et pour l'ensemble des 8 lignées, 8400 animaux seront inclus dans des projets scientifiques d’étude de la réponse immune aux produits de thérapie génique. 1950 animaux seront gardés en vie pour les besoins de la reproduction et la gestion des élevages. 22 230 animaux seront euthanasiés car ne présentant pas un génotype d'intérêt ou le bon sexe pour l'expérimentation ou la reproduction.
Remplacement
Chaque projet applicatif fait l'objet d'études préalables in vitro dans le cadre d'évaluation de produits thérapeutiques candidats et de molécules immunosuppressives permettant de réduire la réponse immunitaire . Les réponses immunes, entre autres à l’encontre de produits de thérapie cellulaire et génique, sont la résultante de complexes interactions, impliquant de multiples partenaires cellulaires (lymphocytes, cellules présentant l’antigène…), se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Le système immunitaire, à travers les organes du système immunitaire, mais également le sang et la lymphe, se trouve imbriqué dans tout l’organisme, ce qui lui permet d’en contrôler l’intégrité. Si certaines expériences in vitro permettent d’analyser certains processus et paramètres de ces réponses immunes, seul le modèle animal est à même de mimer la complexité de la réponse immune humorale (production d'anticorps) et cellulaire résultante. Ainsi, il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive aux modèles animaux, en particulier aux mammifères tels que rongeurs, chiens ou primates pour mimer ce qui pourrait advenir chez les patients. De plus, la production de certains animaux nécessite la réalisation de croisements entre non homozygotes, donc la réalisation de génotypages auxquels nous ne pouvons nous soustraire.
Réduction
La production de toutes les lignées de cette demande d'autorisation de projet repose sur des croisements spécifiques et des stratégies d’accouplement qui permettent d’adapter au mieux la production en fonction des besoins expérimentaux des projets scientifiques. En particulier, le nombre de reproducteurs et le nombre de nouveau-nés sevrés sont réévalués toutes les semaines afin de ne produire/conserver que des animaux utilisés dans les projets. Par ailleurs, quand cela est possible, nous mettons en place un schéma d’accouplement optimisé afin de produire un maximum d’animaux présentant les caractères d’intérêt.
Raffinement
D’après la littérature, aucune des modifications apportées aux animaux n’entraine d’effets négatifs ou de maladies dans nos conditions d’élevage et d’expérimentation. En effet, les animaux sont élevés dans un environnement propre et contrôlé, et manipulés dans des conditions protégées. Des seuils d'alerte ont été définis pour détecter rapidement tout signe de malaise, de blessure, ou d'infection chez les animaux dont le système immunitaire est affaibli. Une surveillance quotidienne, assurée 7 jour sur 7, permet d'anticiper ces situations. Pour les génotypages, qui constituent la seule procédure de ce projet, le prélèvement d’un petit fragment d'oreille est réalisé sur des souris éveillées sans provoquer de saignement. Les animaux sont maintenus calmement le temps de la procédure et sont remis dans leur cage. Une surveillance pendant 5 minutes permet de contrôler leur réaction/comportement suite à cette intervention.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types de cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Les animaux sont prélevés à 7 jours.
Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de la prise de poids par un anti-oncogène adipocytaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris qui perdent plus de 5 % de leur poids d'une pesée hebdomadaire à l'autre sont mises à mort, comme celles qui montrent des signes de mal-être. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Elles reçoivent trois semaines de régime riche en lipides, une contention de deux minutes pour la mesure de la masse grasse et, en fin de procédure, une incision de 1,5 mm au scalpel dans la veine de la queue. Le projet doit préciser le rôle d'une protéine dont le porteur affirme qu'elle protège de l'obésité, et il décrit la prise de poids obtenue comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains tout en classant l'ensemble en gravité modérée.
Objectifs
Le diabète de type 2 est un problème majeur de santé publique. Il est en constante augmentation dans notre société. En cause une augmentation de la prévalence de l'obésité, soit une augmentation de la masse du tissu adipeux. Le développement excessif du tissu adipeux perturbe les fonctions de l'adipocyte, cellule majoritaire du tissu adipeux, qui ne peut plus remplir ses fonctions pour le maintien de la glycémie. Lors de l’obésité, on observe un changement d'expression d'un grand nombre de protéines dans l'adipocyte. Nous étudions une de ces protéines dont l'expression est fortement augmentée dans l'adipocyte de souris et de patients avec une obésité. Nos données montrent que l'augmentation d'expression de cette protéine est un mécanisme de protection contre le développement de l'obésité. Notre objectif est d'identifier les mécanismes responsables de cette protection contre l'obésité.
Bénéfices attendus
L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans la protection contre l'obésité. Cela pourrait permettre de proposer cette protéine comme une nouvelle cible pour limiter la prise de poids et ainsi lutter contre l'obésité et ces complications métaboliques telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Les souris seront nourries pendant trois semaines avec un régime riche en lipides. Elles vont subir un seul examen par Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN) d’une durée de 2 min environ, 2 jours avant la fin de la procédure. Elles seront pesées une fois par semaine pendant les trois semaines de régime. Un prélèvement d’une goutte de sang à la veine caudale qui dure moins de 30 secondes sera effectué sur souris vigiles en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Le régime riche en lipides, appliqué sur une courte durée, induit une prise de poids limitée (inférieure à 10 %), sans ni altérations métaboliques à ce stade, et sans impact sur le bien-être des animaux. La mesure de la masse grasse nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. Le prélèvement sanguin est réalisé par ponction de la veine caudale, après une incision d’environ 1,5 mm à l’aide d’un scalpel. Cette procédure est brève et peut entraîner une douleur légère à modérée, de courte durée. L’ensemble des interventions conduit à une classification de la procédure en gravité modérée, en raison du caractère invasif du prélèvement sanguin et du stress associé à la contention.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes.
Remplacement
Nos premières études avaient montré un rôle de la protéine que nous étudions in vitro dans des adipocytes en culture. Les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques sont complexes faisant intervenir un dialogue inter-organe, le système immunitaire, et le microbiote intestinal. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Des études complémentaires dans les souris sont nécessaires pour caratériser les mécanismes.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des d’animaux en excès. Un calcul de puissance a été réalisé pour réduire le nombre de souris par groupe. Nous étudions les souris mâles dans la procédure. Cependant, les souris femelles qui ne sont pas utilisées pour la reproduction, sont utilisées pour préparer des adipocyte en culture, utiles pour comprendre les phénotypes observés in vivo.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe et l'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, papier, bâtonnets en bois) pour favoriser leur confort en limitant le stress. La manipulation des animaux se fait par la technique de "cup" par des expérimentateurs formés. Le suivi du bien-être animal est quotidien par du personnel formé pour identifier rapidement des souris souffrantes. Les souris souffrantes seront mises à mort. Pendant toute la durée de la procédure, les conditions d’hébergement, de manipulation et de suivi restent identiques à celles de l’hébergement. Les deux interventions dans la procédure sont de gravité modérée. Pour la mesure de la masse grasse, les souris rentrent et sortent de façon volontaire du tube de contention, ce qui permet de minimiser le stress. Le prélèvement sanguin unique en fin de protocole est effectué sur la veine caudale, par un expérimentateur expérimenté, afin de garantir une exécution rapide et maîtrisée de l’acte. En cas de blessures, de pertes de poids de plus de 5 % entre les pesées hebdomadaires, et de signes de mal-être, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce est très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en lipide, elle devient rapidement obèse. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux sont étudiés au stade adulte pour étudier le développement de l'obésité induit par un régime riche en lipide. Notre modèle nutritionnel d'obésité consiste à mettre les animaux sous régime riche en lipides à l'âge de 6/7 semaines pour une durée de 3 semaines.
Effets centraux et périphériques de la cocaïne et de la nicotine dans leur potentialité à provoquer la rechute
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun commençant par une heure trente de chirurgie pour l'implantation d'un cathéter et d'un émetteur dans une artère. Soixante d'entre eux passent ensuite seize séances d'auto-administration de cocaïne ou de nicotine, quinze séances où l'appui sur le levier ne délivre plus rien, et huit séances de rechute, à raison de deux heures par séance en cage individuelle. Les cinquante-deux autres reçoivent vingt-deux injections, dont la moitié sous anesthésie. Les bénéfices annoncés, de nouvelles voies thérapeutiques contre l'addiction, restent à l'état de perspective, l'objectif immédiat étant de vérifier une hypothèse sur le rôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle dans le déclenchement de la rechute.
Objectifs
L’addiction aux drogues est un trouble chronique aux conséquences très préjudiciables. La caractéristique déterminante de l’aspect chronique, quelle que soit la drogue, est la très forte probabilité de rechute dans la consommation même apres de longues périodes d’abstinence. Ainsi une nouvelle consommation après abstinence peut être suffisante pour faire rechuter l’individu et ceci quelquesoit la drogue reconsommée. Cette vulnerabilté permanente à rechuter vient du fait que toutes les drogues agissent sur le même circuit cérébral de la récompense et de la motivation. Néanmoins, à côté de ces effets centraux cérébraux, la drogue produit également des modifications du rythme cardiaque, du péristaltisme intestinal, de la pression artérielle…etc. Notre hypothèse de travail stipule que ces signaux périphériques perceptibles très rapidement par l’individu et spécifiques à chaque drogue (ici cocaïne et nicotine) peuvent participer à précipiter la rechute.Le projet à trois objectifs : L’objectif 1 vise à identifier et dissocier les effets périphériques des substances étudiées en utilisant leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau et en mesurant l’activité du cœur via l’implantation d’un capteur en intra-artériel. Nous comparerons leurs effets avec ceux des drogues elles-mêmes. Nous comparerons un état de conscience anesthésié et un état vigile et nous comparerons mâles et femelles. L’objectif 2 vise à démontrer que la cocaïne et la nicotine induisent la rechute dans la consommation de drogues, mais pas leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau. Pour cela nous utiliserons un modele de rechute chez le rat tres proche de ce qui se passe chez l’Homme. L’objectif 3 vise à relier l’absence de rechute observée avec les analogues qui ne passent pas dans le cerveau avec des mesures du cœur très différentes et spécifiques à chaque substance lors de l’absence de rechute. Au niveau opérationnel ces trois objectifs se déclinent en deux procédures.
Bénéfices attendus
D’un point de vue de santé publique, les résultats de ce projet apporteront des informations essentielles pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des addictions aux drogues en mettant en évidence le rôle crucial des signaux périphériques de ces drogues dans le risque de rechute. Il sera alors possible de proposer de nouvelles voies thérapeutiques.
Procédures
112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ pendant 3 sec) en état vigile et 11 injections (1/jour/pendant 3 sec) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de chaque autoadministration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques en hébergement individuel au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages, en hebergement individuel à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute en hébergement individuel de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés. 112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ 3 secondes) en état vigile et 11 injections (1/jour) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de l’auto administration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie longue pouvant induire des douleurs modérées traitées par l’utilisation d’analgésiques. Ils seront ensuite soumis à la possibilité de s’auto-administrer des drogues puis à des sessions d’extinction. Ces sessions où l’animal appuiera sur le levier sans recevoir de drogues peut créer un stress modéré. Enfin la nicotine et la cocaïne peuvent provoqués des effets secondaires sur l’organisme comme des problèmes cardiovasculaires modérés. Lors de ces séances d'autoadministration et d'extinction les animaux sont placés dans des cages spécifiques et en hébergement individuel pendant 2 heures /séances ce qui peut créer un stress modéré. Ils sont ensuite remis en cages collectives jusqu'à la prochaine séance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements de cerveau et récupérer le capteur de télémétrie intra-artériel.
Remplacement
Remplacer les animaux dans ces expériences est difficile car ces expériences mettent en jeu des systèmes biologiques complexes et des comportements spécifiques, comme la recherche de drogue et la rechute. Les interactions entre le cerveau, les organes et les signaux corporels ne peuvent pas être reproduites avec des modèles in vitro ou informatiques actuels. De plus, ces études nécessitent d’observer les effets simultanés et globaux des drogues sur l’organisme entier, ce qui est impossible avec des alternatives. Malgré les progrès dans les modèles alternatifs, les animaux restent indispensables pour comprendre ces mécanismes.
Réduction
L’utilisation d’implants télémétriques permet de multiplier les injections de molécules dans des expérimentations de screening de molécules. Cette technique permet de réduire le nombre d’animaux car il n’est plus utile de multiplier celui-ci par le nombre de molécules. de plus les tests statistiques qui seront fait pourront être pairés réduisant la variabilité inter-individuelle et permettant des tests plus puissants avec moins d’individus.
Raffinement
L’utilisation de la télémétrie permet de raffiner les protocoles éthiques en réduisant le stress et les manipulations des animaux, en permettant des mesures non invasives en continue et en augmentant la qualité des données. Non seulement elle évite d’utiliser beaucoup d’animaux comme dit précédemment mais elle évite aussi les procédures répétées invasives. La chirurgie d’implantation télémétrique est faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux sont surveillés minimum 2 fois par jour pendant 3 jours post-opératoire puis quotidiennement. Grâce à cette technique, les animaux sont ensuite laissés libres de leurs mouvements dans la cage d’hébergement. Les animaux seront hébergés par deux minimum afin de respecter leur caractère grégaire, dans des cages de taille réglementaire avec un milieu enrichi (tunnel, matériel de nidification). Une feuille de scoring pos-opératoire a été faite : elle comporte des points limites généraux et spécifiques permettant une intervention des expérimentateurs en fonction du niveau de gravité
Choix des espèces
Le rat est le modèle le plus communément utilisé pour les expérimentations d’autoadministration. Les connaissances sur celui-ci sont solides et sa physiologie reste, malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Enfin, le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et cathéter intre-veineux). Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte soit entre 7 et 8 semaines. Ils devront faire 225/250gr afin d’avoir le poids recommandé pour l’implantation des capteurs télémétriques.
Impact de l’exposition de facteurs environnementaux sur le développement et la progression des cancers pédiatriques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
8 314 souris vont être utilisées, dont des souriceaux de cinq à dix jours opérés du cerveau pour y recevoir des cellules tumorales. 7 263 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 008 un niveau sévère, 43 un niveau léger, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Chaque animal greffé est ensuite imagé une fois par semaine sous anesthésie et exposé, par l'eau de boisson ou la nourriture, à un fongicide, à un insecticide ou à un régime riche en graisses, avec perte d'équilibre, tête penchée et perte de poids attendues. Le porteur décrit ses organoïdes de cervelet issus de cellules souches humaines comme un moyen de remplacer une partie des animaux, avant de conclure que le modèle souris reste "indispensable".
Objectifs
Les cancers sont la seconde cause de mortalité chez les enfants âgés de 1 à 15 ans dans les pays industrialisés. Parmi eux, les cancers cérébraux sont la deuxième cause de cancers pédiatriques et la cause majeure de mortalité liée au cancer. 2500 enfants et adolescents sont diagnostiqués pour un cancer par an en France. Alors que la moyenne du taux de survie est passée à 80% grâce aux avancées scientifiques et médicales, il existe encore une grande différence dans la réponse aux traitements selon les types de cancer. Pour réduire la survenue du cancer chez les enfants et les adolescents, il est important de mieux comprendre les mécanismes associés au développement et à l’initiation des différents cancers pédiatriques. L’objectif principal du projet est de comprendre les causes et l’origine des cancers agressifs intervenant durant l’enfance. Pour y répondre, l’étude se focalisera sur 2 types de cancer pédiatrique : le médulloblastome et le neuroblastome. L’objectif principal du projet est d’identifier le rôle des polluants et d’un régime riche en graisse dans les causes et l’origine des cancers agressifs intervenant durant l’enfance. L’étude permettra de mieux comprendre les conséquences biologiques de l’exposition aux polluants ou régime alimentaire riche en graisse dans le développement tumoral.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’exposition des polluants et d’un régime riche en graisse dans le développement de cancers pédiatriques permettra de mettre en évidence les effets délétères de ces composés sur la santé et de mieux comprendre les mécanismes associés à l’initiation et la croissance tumorale. Les expositions étudiés dans cette étude regroupent plusieurs familles de composés tel qu’un fongicide, un pesticide et un régime riche en graisse ayant un impact sur la survenue de l’obésité. Le pesticide retenu dans notre étude cible le système nerveux des insectes. Il est autorisé et utilisé au quotidien comme un insecticide chimique par vaporisation sur les vêtements et sur les mammifères (sauf le chat) et l’environnement, Cf : Article « Le Monde » publié le 24/04/25 : Pesticides : l’Anses lance une alerte d’ampleur après un examen des effets de produits toujours autorisés L’utilisation du fongicide étudié est autorisée et est inclus dans de nombreux produits phytosanitaires largement utilisés par les agriculteurs européens. Le taux d’enfants (de 6 à 17 ans) en surpoids ne cesse d’augmenter depuis les années 1990, en 2015 il était de 13%, et 4% des enfants étaient touchés par l’obésité. Actuellement, la surcharge pondérale concerne près de la moitié des adultes: la prévalence du surpoids est de 37% chez les hommes et 27% chez les femmes. A long terme, nous pourrions envisager que cette étude puisse avoir un impact majeur sur l’utilisation de ces composés dans l’environnement.
Procédures
Des cellules tumorales seront implantées dans le cerveau d’animaux sous anesthésie (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris) puis suivi à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Les souris seront ensuite traitées via l’eau de boisson ou la nourriture pendant toute la durée de l'expérience.
Impact sur les animaux
Des cellules seront implantées chez des souris Ces souris développeront des nuisances suite à la chirurgie telesl qu’une perte de poids, des douleurs au niveau du site d’injection, d’éventuelles perte d’équilibre. Ces symptômes peuvent durer jusqu’à 4 jours. Ces souris développeront par la suite des tumeurs et recevront des traitements . Suite à la survenue de la tumeur, une perte d’équilibre, tête penchée, une perte de poids peuvent être observée pendant 2 à 3 jours. Les nuisances liés aux éventuels traitements seront celles liées à l’injection en elle-même, (piqûres : douleur légère de courte durée). . Quand le modèle le permettra, les souris seront suivies de manière longitudinale à l’imagerie, pour cela elles devront recevoir une injection (piqûre : douleur légère de courte durée). Suite à la chirurgie, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe . Les nuisances liées au développement spontanément des tumeurs cérébrales chez les animaux génétiquement modifiés similaire à la survenur de tumeurs cérébrales chez les animaux greffées tel qu’une perte d’équilibre, tête penchée, une perte de poids peuvent être observée et duré pendant environ 2 à 3 jours. Les nuisances attendues suite à l’introduction d’un régime riche en graisse chez les souris sont la prise de poids, des difficultés de mobilité éventuellement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour analyse post-mortem
Remplacement
Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles : des cellules de cervelet , obtenues à partir de souriceaux âgés de 3 à 8 jours ainsi que des lignées cellulaires sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales sont toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. Les travaux dans notre laboratoire sur la génération d’organoïdes de cervelet à partir de cellules souches humaines permettent d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales afin de ne réaliser que les expériences prometteuses in vivo. Cependant, ces modèles in vitro ne récapitulent pas un organisme entier et nous avons donc recours à l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir obtenir des résultats fiables prenant en compte toutes les composantes d’un organisme intégré Des études épidémiologiques couplées à des expériences in vitro sur lignées cellulaires ont permis dans un premier temps de sélectionner les polluants à tester dans cette étude. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (cultures in vitro), l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
1. Pour minimiser le nombre d’animaux tout en cherchant à répondre aux objectifs scientifiques, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Concernant la partie utilisant des modèles de souris modifiées génétiquement, nous veillons à optimiser les croisements pour la génération des lots selon les génotypes attendus. 2. Pour réduire le nombre d’animaux, les expériences seront faites dans un ordre précis permettant de déterminer la dose optimale pour la suite des expériences et/ou de ne pas réaliser la suite des expériences si les premières ne permettent pas d’observer les effets attendus 3. Pour limiter le nombre d’animaux, nous travaillerons par lot de manière à avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe sera de 8 souris quand cela sera possible. Chaque expérience sera répétée 2 fois et une 3ème si nécessaire (= dans le cas où les résultats seront discordants entre les 2 premières expériences réalisées). Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.
Raffinement
Une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser les gestes techniques invasifs ou douloureux. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. La chirurgie est réalisée par du personnel expérimenté ce qui permet de réduire la durée totale de la chirurgie et donc les effets secondaires potentiels ainsi qu'un meilleur rétablissement post-opératoire. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale (par imagerie notamment) et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Des soins support seront mis en place quand nécessaire. Dès atteinte d’un point-limite, non soulagé par les soins,l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle permet également des expériences de greffes ainsi que l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées permettant une bonne modélisation des cancers humains. Les chirurgies seront réalisées au stade de nouveau-nés autour de 5 à 10 jours après la naissance. Le suivi des animaux se fera tout au long de leur vie. Des adultes seront également utilisés dans le cadre de souris immunodéficiente si l’expérience de chirurgie n’est pas concluante sur les souriceaux. Nous étudierons également l’impact des expositions durant le développement en traitant directement femelle gestante, puis sa descendance. Ceci nous permettra d’avoir une étude complète sur l’effet de ces expositions en fonction de l’âge auquel l’organisme a été exposé. Nous nous intéressons plus particulièrement aux stades correspondant au dernier tiers de gestation et au nouveau-né puisque qui représentent des stades d'intérêt pour les cancers pédiatriques.
Analyse de l’intégrité génomique et du microenvironnement tumoral lors du développement du cancer du foie dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Injectées d'un grand volume de solution dans la circulation, ce qui dilate massivement leur foie pendant une trentaine de minutes, 2 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique destinée à provoquer un cancer du foie, puis sont suivies par échographie sous anesthésie pendant trois à six mois, de deux à quinze examens selon les groupes. Le porteur présente ce suivi par imagerie comme une méthode "sans douleur ni intervention lourde" qui évite des mises à mort intermédiaires, alors que les animaux développent des tumeurs hépatiques et peuvent s'affaiblir et perdre du poids. Toutes sont tuées en fin de procédure, les prélèvements post-mortem étant présentés comme la seule voie d'analyse.
Objectifs
Le cancer du foie touche chaque année plus de 900 000 personnes dans le monde et cause environ 800 000 décès, ce qui en fait la troisième cause de mortalité par cancer. Ce cancer grave reste difficile à traiter, car les thérapies actuelles sont peu efficaces, avec un taux de réponse inférieur à 20 pourcent. Cette inefficacité s’explique en grande partie par la grande diversité des tumeurs, qui varient selon les patients et même au sein d’une même tumeur. Pour améliorer la prise en charge de cette maladie, notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes précoces à l’origine du cancer du foie, en particulier ceux impliqués dans la transformation des hépatocytes (les cellules principales du foie). Nous étudions notamment le rôle de certains facteurs clés dans la stabilité du génome et dans la réponse immunitaire locale du foie. Ces recherches, menées sur des modèles animaux pendant 5 ans, pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles pour des traitements plus efficaces.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques actuelles contre le cancer du foie sont restreintes par notre compréhension insuffisante des processus cellulaires et moléculaires qui régulent la prolifération des hépatocytes, ainsi que du rôle du microenvironnement immunitaire dans le développement tumoral. Ce projet de recherche a pour objectif de mieux caractériser ces mécanismes et acteurs afin de concevoir de nouveaux outils de diagnostic et de pronostic pour améliorer la prise en charge des patients, et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques prometteuses.
Procédures
Des animaux auront une injection permettant la perte d’expression de gènes d’intérêt (1 fois, 10 secondes/animal sous anesthésie générale) et recevront également une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). D’autres animaux recevront uniquement une seule injection visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’injection intra-veineuse peut causer une légère douleur de courte durée au point d’injection et présenter un risque de saignement et/ou d’hématomes. Par ailleurs, l’injection d'un grand volume de solution dans la circulation systémique peut conduire à une douleur transitoire dans la région d'injection et conduire à une dilatation massive mais transitoire (inférieure à 30 minutes) du tissu hépatique et une augmentation de la volémie globale. Au cours de l’anesthésie gazeuse lors de l’échographie du foie, une dépression cardio-vasculaire peut se produire ainsi qu’un stress thermique. Enfin, de par le développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général (asthénie, perte de poids...).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 2520 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Nous aurons recours au suivi échographique des tumeurs du foie, une méthode d’imagerie non invasive qui permet d’observer l’évolution de la maladie de manière précise, sans douleur ni intervention lourde. Cette approche, qui permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, évite le recours à des euthanasies supplémentaires à différents stades de l’étude. Elle contribue ainsi à réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Lorsque cela sera possible sans nuire au bon déroulement de l’expérimentation, une anesthésie générale courte sera réalisée avant toute intervention potentiellement douloureuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. Nous aurons recours au suivi échographique des tumeurs du foie, ce qui permettra de suivre l'évolution de l'état de santé des animaux au fil du temps sans nécessiter leur euthanasie à chaque étape, mais également de réduire le stress et les contraintes pour les animaux, tout en améliorant la qualité des données recueillies. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite selon une méthode réglementaire. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.