Recherche fondamentale

Cinq jours d'administration orale par canule, une injection qui déclenche un état septique ou un sérum toxique pour les reins, puis pour un quatrième groupe un mois de régime hypergras : 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traceur fluorescent leur est ensuite injecté et un capteur fixé sur le dos, avec deux anesthésies successives pour la pose et le retrait, et quelques heures d'isolement. Le porteur annonce les atteintes attendues, irritation de la gorge, saignements, œdème, péritonite, prise de poids massive et pelage gras pour les souris rendues diabétiques, risque d'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, les prélèvements post-mortem étant présentés comme le seul moyen d'obtenir les tissus recherchés.

Objectifs

Les maladies rénales, aigues ou chroniques, sont un problème majeur pour la santé publique, affectant des millions de personne dans le monde. Même si des progrès significatifs ont été réalisés dans l’identification des mécanismes responsables de leur progression, il n’existe aucun traitement spécifique permettant à l’heure actuelle de diminuer ou d’arrêter la progression des maladies rénales de manière probante. Par conséquent, la détection de la maladie à des stades très précoces ainsi que la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques sont d’une importance cruciale pour mettre au point un traitement efficace Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d'une protéine impliquée dans la mort de cellules de petits vaisseaux sanguins dans la maladie rénale. En effet, la surexpression de cette protéine est associée à une dégradation de la fonction rénale dans différents modèles de maladies rénales expérimentales. Plus précisément, nous avons récemment montré que cette protéineest fortement surexprimée dans des cellules qui assurent la fonction de filtration du rein et que cette surexpression conduit à une mortalité de ce type cellulaire dans des cultures de ces cellulesin vitro. L’objectif principal de ce projet est de définir le rôle de la protéine dans l’adaptation fonctionnelle et structurelle du rein en réponse à des agressions aigues et chroniques, glomérulaires ou vasculaires, en utilisant desmodèles de souris transgéniques pour lesquelles une surexpression ou bien une inhibition de la protéine d'intérêt est inductible dans le temps et de manière tissu spécifique. Ces expériences permettront de répondre à ces questions : La surexpression de la protéine peut elle induire ou aggraver la maladie rénale dans plusieurs modèles expérimentaux? A l'inverse, est ce que l’inhibition de la protéine peut ralentir la progression de l’insuffisance rénale ? Peut on mettre en place une stratégie thérapeutique bloquant la surpression de la protéine afin de préserver la fonction rénale dans un contexte pathologique ?

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies rénales chroniques est en constante augmentation, affectant environ dix pour cent de la population mondiale, bien que beaucoup de cas restent non diagnostiqués en raison de leur évolution silencieuse. Une prise en charge précoce et une sensibilisation accrue sont essentielles pour prévenir leur progression vers l'insuffisance rénale terminale, nécessitant dialyse ou transplantation. Nous espérons que notre étude permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur cette protéine et la proposera comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance rénale. Nous effectuerons durant et après ces protocoles différentes analyses fonctionnelles, histologiques, cellulaires et moléculaires afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés . Ainsi, nous espérons faire un pas supplémentaire vers le développement de stratégies thérapeutique ciblant cette protéine afin de ralentir la progression des maladies rénales voire la faire régresser.

Procédures

Un premier lot reçoit une administration orale une fois par jour pendant cinq jours, chaque session durant environ 30 secondes par animal. Ensuite, une administration unique est effectuée à l’état vigile, afin d’induire le modèle septique, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un deuxième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Deux administrations par voie veineuse sont ensuite effectuées sous anesthésie, afin d’induire le modèle, chacune prenant 10 secondes par souris. Un troisième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Une seule administration d’une molécule est ensuite effectuée à l’état vigile, pour induire le modèle, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un quatrième lot reçoit un régime hyper gras. Un inhibiteur génétique leur est administré deux fois par semaine pendant un mois, (30 sec par souris) à l’état vigile. Alternativement, un stimulateur sera ajouté à l’eau de boisson et administré durant 30 jours. Une mesure de la fonction rénale est réalisée sur les trois derniers lots grâce à une nouvelle technique nécessitant une anesthésie gazeuse. Cette procédure inclut l’administration d’un traceur fluorescent et l’installation d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal, pour une durée totale de cinq minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie est nécessaire pour retirer le capteur, ce qui prend environ deux minutes. En fin de protocole, les quatre lots font l’objet d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie (une minute par souris), suivi de l’euthanasie des animaux selon une méthode règlementaire, en vue des analyses et prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Un premier lot d’animaux subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique pour induire le modèle septique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le modèle pourra induire une perte d’activité et de poids et une élévation de la température. Un second lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique de sérum toxique pour les reins associé à un risque de saignement et œdème. Cette administration étant effectuée sous anesthésie générale courte, les nuisances de l’anesthésie sont ici très limitées. Un troisième lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration d’une molécule toxique pour les reins pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Un quatrième lot d’animaux diabétiques sera exposé à un régime riche en lipide qui s’accompagne d’une prise de poids massive, d’un soin altéré avec un pelage gras, d’une activité réduite avec un risque infectieux plus important. Une partie des animaux seront traitée par administrations répétés pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Il y a aussi un risque de péritonite et de saignements liés aux administrations répétées. Une autre partie sera traitée via l’eau de boisson pouvant conduire à une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie des souris. Les trois derniers lots subiront une mesure de la fonction rénale incluant deux anesthésies de courte durée pour la pose et le retrait du capteur pouvant induire un stress, un risque de saignement et d’œdème associé à l’administration du traceur fluorescent nécessaire à la mesure et un stress social lié à l’individualisation durant quelques heures. Tous les animaux subiront un prélèvement sanguin en fin de période de maintien sous anesthésie. L’anesthésie générale pourra conduire à des complications telles que : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de notre protéine cible sur le rein est la modification de la fonction rénale, qui est mesurée soit pas dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter individuelle du phénotype étudié dans nos modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique dédié aux calculs de puissance statistique avec comme paramètre principal la mesure de la fonction rénale. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 620 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour les souris diabétiques il y a des mesures de raffinement supplémentaires, change plus régulier à cause de la polyurie, nombre réduit de souris par cages et bâton à ronger à cause des croquettes molles riches en gras. En dehors d'une courte période d’hébergement individuel limité à deux heures pendant une mesure, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière. L'administration orale aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, la prostration, l'hérissement du pelage. Administration : Il existe aussi un risque de saignement qui sera limité par l’utilisation d’aiguille fines et leur réalisation par du personnel expérimenté. L’anesthésie permet de limiter la douleur pour certaines administrations, qui seront suivies d’une application de gel ophtalmique pour limiter l’inconfort. Pour diminuer les risques de détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique liés à l’anesthésie, les souris seront placées sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce: modèles bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique , plus que dans d'autres espèces. possibilités de tester l'implication de la voie de signalisation de la protéine cible dans l'insuffisance rénale grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. Concernant le stade de développement: Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système rénal mature, tout en ne présentant pas encore des signes de vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

Relever la température hivernale des bassins piscicoles pour réduire la facture de refroidissement, voilà le débouché annoncé à court terme. 225 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 165 d'entre elles étant ensuite réutilisées dans une autre expérience ou versées comme géniteurs dans une pisciculture, les autres tuées pour le prélèvement des ovaires. Chaque poisson est sorti de l'eau, anesthésié, sexé par échographie et pucé sous la peau, et 90 femelles subissent en plus l'introduction d'une canule dans l'orifice génital. La récupération des pontes et du sperme, elle, se fait sans anesthésie, par pression sur l'abdomen, pour ne pas altérer la qualité des gamètes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux entiers, les cultures de gonades ne permettant pas le développement complet des cellules reproductrices.

Objectifs

Les poissons des régions tempérées sont souvent sensibles aux variations de stimuli environnementaux présentant une saisonnalité. Tout écart important de ces stimuli par rapport à une situation normale, à laquelle est adaptée l’espèce cible, pourrait compromettre leur reproduction. Ainsi, le succès de reproduction d’une espèce dépend de sa capacité de résilience face aux écarts de ces stimuli par rapport à une référence. Le contrôle des étapes de production des cellules reproductrices femelles (l’ovogenèse) dépend notamment de variations de température chez la perche commune (Perca fluviatilis). Cette espèce, d’intérêt aquacole, peut être élevée avec succès dans des conditions captives dans lesquelles les variations thermiques saisonnières sont mimées. Il a été montré, dans ces conditions, qu’une exposition prolongée à une température de 6°C (vernalisation) durant l’ovogenèse garantissait l’obtention d’ovules de bonne qualité (avec cependant une très grande variation). En revanche, si la température de vernalisation ne descendait qu’à 14°C, l’ovogenèse s’arrêtait. Nous n’avons aucune donnée pour des températures intermédiaires. Or, dans les conditions environnementales actuelles, des écarts de cette température de vernalisation pourraient apparaitre plus fréquemment. Dans la cascade d’évènements qui lient la température au contrôle de la reproduction, on cite des modifications moléculaires sur l’ADN qui n’induisent pas de mutation. Toutefois la régulation des gènes est modifiée, conduisant potentiellement à des variations du contenu cellulaire. En effet, ces transformations chimiques sont effectuées par des protéines sensibles aux variations thermiques. Ainsi les œufs des poissons pourraient avoir une composition différente qui pourraient influencer leur qualité et la santé de la descendance. Ce projet porte sur la perche commune, un poisson d’eau tempérée dont les conditions de reproduction normales sont connues et reproductibles en bassins. Il est prévu d’étudier le succès de la reproduction lorsque les animaux sont soumis à des températures de vernalisation de 6, 8 et 10°C. En parallèle, les modifications du génome seront étudiées au cours de l’ovogenèse pour comprendre le lien potentiel entre des changements environnementaux et le succès de reproduction chez cette espèce.

Bénéfices attendus

La perche est une espèce d’intérêt aquacole et de haute valeur commerciale dans plusieurs pays européens. Son élevage peut être fait soit dans des étangs où elle est soumise aux variations climatiques conduisant régulièrement à des écarts thermiques en hiver, soit dans des bassins en circuit fermé pour lesquels les variations de température et photopériode (durée du jour et de l’obscurité au cours d’une journée) naturelles sont mimées artificiellement. Dans ce dernier cas, la température hivernale pour la perche commune est réglée à 6°C conformément aux résultats scientifiques obtenus chez cette espèce. L’augmentation du coût de l’énergie conduit les fermes aquacoles à revoir leurs pratiques et il devient souhaitable de déterminer s’il serait possible d’augmenter la température hivernale ce qui permettrait de réduire les besoins liés au refroidissement de l’eau. A court terme, cette information sur la qualité des gamètes mâles (analyse en microscopie) et femelles (analyse du succès de reproduction) en fonction de la température permettra de déterminer s’il est possible de changer la température hivernale. A moyen terme, ces données pourraient être partagées avec d’autres scientifiques pour intégrer des modèles prédictifs de l’effet d’un réchauffement de la température hivernale de 2 ou 4°C par rapport aux conditions normales dans le milieu sauvage ce qui aurait des répercussions tant pour l’élevage en étang que pour la survie de cette espèce en milieu sauvage. Enfin à moyen et plus long terme, ce travail favorisera une meilleure compréhension des interactions entre les variations de température, la qualité des gamètes femelles à l’échelle cellulaire et moléculaire. En effet, il sera intéressant d’étudier simultanément les données sur les régulations moléculaires dans les ovocytes qui pourraient avoir pour conséquence de modifier la composition des œufs et ainsi influencer le succès de développement chez une espèce sensible aux variations de température d’eau douce tempérée.

Procédures

Les poissons du projet seront soumis à une échographie sous anesthésie générale pour déterminer leur sexe (il n’y a pas de dimorphisme sexuel chez la perche). Lors de cette anesthésie, une puce électronique est injectée sous la peau à l’aide d’une aiguille pour pouvoir ensuite identifier chaque individu (sexe et numéro) : 150 femelles et 75 mâles seront ainsi retenus pour le projet. L’ensemble des deux procédures dure 2 à 3 minutes pour chaque individu. Avant la saison de ponte, le stade de maturation ovocytaire des femelles sera déterminé pour évaluer le moment de la ponte des différents individus : pour cela, une canule sera introduite dans l’orifice génital sous anesthésie générale pour prélever quelques ovocytes. Cette procédure dure 1 à 2 minutes et concernera 90 femelles. A la fin du projet, une fécondation artificielle devra être réalisée pour étudier la qualité des pontes. Pour cela, les pontes et le sperme sont récupérés en une minute en exerçant une légère pression sur l’abdomen des individus. Cette procédure est pratiquée sans anesthésie pour ne pas compromettre la qualité des gamètes, et concernera 90 femelles et 37 mâles. Toutes ces procédures sont pratiquées couramment dans les fermes piscicoles.

Impact sur les animaux

Les manipulations de poissons nécessitent de sortir les animaux de l’eau ce qui pourrait engendrer un stress chez les animaux. De plus, l’injection d’une puce électronique et la canulation impliquent des nuisances liées à la l’introduction d’une aiguille ou d’une canule. Cela pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections quelques jours après l’intervention même si ces dernières sont rares.

Devenir

A la fin de l’expérience, hormis les femelles utilisées pour les prélèvements d’ovaires, l’ensemble des perches communes (Perca fluviatilis) seront gardées en vie. Les géniteurs (75 mâles et 90 femelles restantes) seront alors, selon les besoins expérimentaux au laboratoire à la fin de l’expérience soit réutilisés dans une nouvelle expérimentation, soit réhabilités comme géniteurs dans une pisciculture.

Remplacement

L’étude de l’effet de la température sur le contrôle de la production des ovules et spermatozoïdes implique des liens physiologiques entre différents organes parmi lesquels le cerveau, les gonades ou le foie. Ces organes diffusent par voie sanguine des hormones dont la concentration peut varier entre les conditions de vie des poissons (bassins à des températures différentes). Même si plusieurs hormones potentiellement impliquées sont connues, nous ne pouvons pas contrôler l’ensemble de ces signaux extracellulaires. Aussi, il est indispensable de nous assurer une réponse physiologique complète des individus qui permettront des régulations fines de la progression de l’ovogénèse au niveau cellulaire et moléculaire. Cette expérience implique donc de devoir travailler sur animaux entiers. Si les cultures de gonades se sont développées ces dernières années, elles ne permettent pas de réaliser un développement complet des cellules reproductrices.

Réduction

La perche commune vit en bancs dans le milieu sauvage. Pour son bien-être en conditions captives, il est nécessaire de reproduire ce mode de vie tout au long du cycle de reproduction. De plus, il est possible que des interactions comportementales ou à l’aide de phéromones puissent influencer la progression du cycle de reproduction. Nous souhaitons minimiser les différences entre les groupes et avons décidé d’établir des groupes homogènes entre les 3 conditions avec 50 femelles et 25 mâles dans chaque bassin. Une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet de focaliser nos études sur un nombre de femelles et mâles adapté à nos besoins au départ. Le nombre de 50 femelles par condition a été établi en tenant compte des prélèvements tout au long du cycles (20 femelles par bassin pour l’expérience entière), de la mortalité éventuelle observée en conditions d’élevage et du fait que nous voulons mettre en évidence la diversité de qualité des ovules (étude de 15 pontes par condition pour effectuer une analyse statistique fiable). En effet, certaines femelles peuvent ne pas engager d’ovogenèse conduisant à l’absence de ponte. Concernant les mâles, 25 seront placés dans chaque bassin, leur présence est nécessaire pour le bon déroulement du cycle de reproduction. Ce nombre nous permettra de garantir l’obtention de sperme frais pour féconder toutes les pontes étudiées même à partir d’une condition même si les mâles des autres conditions ne sont pas spermiants.

Raffinement

Les procédures de puçage, de sexage ou de canulation peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (canulation ou sexage) ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage). De ce fait, les animaux seront préalablement anesthésiés pour limiter le stress et éviter la douleur. Même si les infections sont rares, les animaux seront surveillés de façon accrue la semaine suivant l’implantation de la puce ou la canulation. Le matériel utilisé est stérile ou désinfecté. Si nécessaire, un protocole de traitement mis en place au laboratoire sera utilisé. Les étapes de prélèvement de sperme ou des pontes chez les femelles sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulé seront stimulés. Ces critères sont visibles dès les premiers instants de manipulation des poissons. L’absence de sperme chez les mâles, ou d’une cloque sur l’orifice génital chez les femelles nous conduira à replacer immédiatement l’animal dans le bassin. La stimulation des individus correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale quelques jours avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin sur quelques jours (6-7 j/par bassin) et nous disposerons de 3 bassins. Cette organisation diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en favorisant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés également.

Choix des espèces

La perche commune (Perca fluviatilis) est une espèce d’intérêt aquacole pour laquelle l’amélioration du contrôle de la reproduction peut avoir des retombées économiques importantes. De plus, contrairement à de nombreux autres modèles, il s’agit d’une espèce à ovogénèse synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément selon un cycle contrôlé par des changements de photopériode et de température. Il est donc possible de comparer l’effet de variations de ces conditions à l’échelle moléculaire et cellulaire ainsi que leurs conséquences sur la génération suivante. Théoriquement, l’ensemble des ovocytes se développent de la même manière mais ce résultat n’a pas encore été démontré au niveau des régulations moléculaires. Les connaissances actuelles sur la progression de l’ovogenèse chez cette espèce sont assez fines pour garantir une comparaison rigoureuse avec la progression de l’ovogenèse en comparant le contenu moléculaire de cellules individuelles lorsque la température varie. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares (qui ne se sont pas encore reproduits). Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondu pourraient provenir de lots différents, et la qualité des pontes est connue pour être affectée par les pontes précédentes. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.

Une injection de cellules dans le foie, par une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, fait pousser des tumeurs chez 280 souris. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un stress lié à la contention et une gêne possible au niveau de la cicatrice. Le porteur affirme pourtant que les tumeurs se développent sans affecter l'animal de manière importante, au motif que le foie est peu innervé et que sa fonction reste intacte. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour collecter leur foie et l'analyser en immunohistochimie et en anatomopathologie.

Objectifs

Le virus de l’Hépatite B (VHB) infecte le foie humain, causant une hépatite virale sévère qui évolue souvent en cirrhose, puis en cancer du foie (carcinome hépatocellulaire, CHC). Le CHC constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, et il n’existe à ce jour pas de solution thérapeutique satisfaisante. Bien qu’il existe un vaccin qui protège contre l’infection par le VHB, plus de 300 millions de personnes sont déjà infectées, et l’on considère qu’environ 1 million de décès sont liés au virus chaque année. Le but de notre projet est de mieux comprendre comment l’insertion du virus dans l’ADN des patients infectés modifie l’organisation des chromosomes, afin d’éclairer les mécanismes par lesquels le VHB augmente fortement le risque de cancer du foie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment le virus de l’hépatite B perturbe le fonctionnement des cellules du foie et favorise l’apparition d’un cancer. En identifiant les mécanismes en jeu, notamment certains gènes qui jouent un rôle clé dans le développement de tumeurs, cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements, plus ciblés et plus efficaces. À terme, ces avancées pourraient non seulement profiter aux personnes atteintes de cancer du foie, mais aussi contribuer à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour d’autres types de cancers, comme ceux du poumon ou du pancréas.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris).

Impact sur les animaux

Les effets sont le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal,et une gêne possible liée à la cicatrice. Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies pour analyses liées au projet (immunohistochimie, anatomopathologie, biochimie,…).

Remplacement

Nous avons réalisé le plus d’expériences possible en laboratoire sur des cellules en culture. Cela nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux. Cependant, pour comprendre réellement comment le virus de l’hépatite B favorise le développement du cancer du foie, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris. En effet, la formation et la croissance des tumeurs dépendent de nombreux facteurs qu’on ne peut pas reproduire entièrement dans une boîte de culture : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes, et la réponse globale de l’organisme. Dès que nous aurons obtenu les informations nécessaires dans ce modèle, nous reviendrons au modèle de lignées cellulaires.

Réduction

Nous avons tout mis en œuvre pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet. En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en limitant à la fois le nombre de cellules testées et le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.

Raffinement

Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi une anesthésie plus légère, réduit la durée de la chirurgie et utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (pathologie chez l'adulte).

1 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par une administration sous anesthésie, suivie d'un gavage quotidien de J8 à J20 ou de sept injections intraveineuses, puis de séances d'imagerie sous anesthésie de quarante minutes avec pose d'un cathéter. Le porteur annonce une inflammation des voies aériennes et une perte de poids dans les jours suivant l'induction, et n'anticipe aucun effet indésirable des traitements ni de l'imagerie. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie pour laquelle il n’existe pas de traitements curatifs. Une des limites de la fibrose pulmonaire est le manque de marqueur permettant d’évaluer la réponse aux traitements. Nous avons démontré la possibilité de suivre l’évolution de la fibrose pulmonaire avec une méthode d’imagerie du métabolisme des lipides. Nous devons maintenant valider son utilisation comme outil pour vérifier l’efficacité des traitements actuels ou en développement de la fibrose pulmonaire. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer une nouvelle technique d’imagerie du métabolisme lipidique: 1/ pour le suivi de l’efficacité des traitements approuvés de la fibrose pulmonaire 2/ pour le suivi de l’efficacité des traitements en cours de développement 3/ pour la possibilité de prédire l’efficacité des traitements testés Ce projet permettra de proposer un outil pour prédire et monitorer l’efficacité des traitements de la fibrose pulmonaire afin d’améliorer la prise en charge des patients avec cette maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront multiples grâce à une approche complète et robuste basée sur plusieurs modèles expérimentaux. Ce projet vise à améliorer la prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire. A court terme, nous pensons que l’imagerie du métabolisme lipidique pourra être testée chez des patients avec fibrose pulmonaire pour valider son utilisation dans l’évaluation de l’efficacité des thérapies actuellement en clinique. A plus long terme, notre méthode d’imagerie permettra de faciliter le développement de nouvelles thérapies de la fibrose pulmonaire, au niveau préclinique et aussi des essais cliniques.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibroseCette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Une partie des animaux recevra des traitements par gavage oral (100µl, quotidiennement de J8 à J20). Ce geste sera réalisé sur animaux vigiles, après contention, et ne durera pas plus de 10 secondes. Une partie des animaux recevra des traitements par injection intraveineuse (100µl, tous les deux jours de J8 à J20, 7 injections au total). Ce geste sera réalisé après contention, et ne durera pas plus de 20 secondes. Tous les animaux seront suivis par imagerie. L'ensemble de cette procédure s'effectue sous anesthésie. Chaque animal aura un cathéter afin de permettre l’injection intraveineuse du marqueur (100 µl). Ceci n’excède pas 2 minutes par animal. Les animaux seront placés dans le système d’imagerie équipé d’un lit chauffant préchauffé et d’un système d’anesthésie gazeuse.La durée totale de la procédure n’excède pas 40 min par souris. A la fin du protocole, les animaux sont analgésiés puis anesthésiés profondément, avant que soit réalisé un prélèvement sanguin puis leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, une inflammation des voies aériennes peut avoir lieu et elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Le modèle de fibrose est associé aussi à une inflammation des voies respiratoires au cours des 6 premiers jours après l’induction. Elle peut être associée à une perte de poids des animaux. Les administrations intraveineuses peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques, ou à l’étape d’imagerie..

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué correspond au nombre minimal requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Ces chiffres ont été déterminé par test statistique, sur la base de données antérieures issues de l’équipe, pour valider la puissance des résultats attendus.

Raffinement

Le personnel impliqué dans ce projet, au-delà de la formation légale à l’expérimentation animal, aura une formation et l’habitude de l’application des procédures et du suivi des animaux spécifique des modèles murins de fibrose pulmonaire. Les transports des animaux seront réalisés dans des boites d’hébergement avec couvercle, entourées d’un sac opaque pour protéger les animaux des changements de luminosité et de température. Après exposition aux facteurs déclenchants de la fibrose, les animaux auront accès à un supplémentation d’alimentation (aliments gélifiés, morceaux de pommes, céréales) afin de limiter la perte de poids. Après chaque étape d’anesthésie à l’isoflurane, les souris seront placées sous lampe chauffante ou tapis chauffant pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale des animaux après anesthésie. Avant la mise à mort, les animaux sont analgésiés et anesthésiés profondément et ne reprennent pas conscience.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience des modèles, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g afin de limiter la toxicité générale des produits inducteurs de fibrose.

Cinq injections abdominales en cinq jours induisent la myopathie, puis chaque souris est transportée une demi-journée vers un second établissement et passe trois examens RMN de quarante-cinq à soixante minutes sous anesthésie, espacés de quinze jours. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour prélever leurs muscles. Le porteur attribue un stress modéré à la perte de poids et de force musculaire ainsi qu'au transport, et affirme que les molécules testées n'induiront pas d'effet indésirable puisqu'elles ont déjà été administrées à des humains ou à d'autres animaux. Une grille de score propre à ce modèle doit fixer les points limites et les critères d'arrêt.

Objectifs

La myopathie à cores centraux est une maladie causée par des mutations dans un gène codant pour une protéine essentielle à la contraction musculaire dont l'absence est mortelle. Chez l'homme, nos études précédantes ont montré qu'une réduction de sa quantité en dessous de 50% conduit à une myopathie à cores centraux dont la sévérité augmente avec la quantité de protéines manquantes. Nous avons développé et caractérisé un modèle de souris qui reproduit cette maladie et ses mécanismes. Il n’existe actuellement aucun traitement contre cette maladie. Cependant, différentes molécules, déjà testées chez l'homme ou la souris pour d'autres pathologies, présentent un potentiel thérapeutique fort pour la myopathie à core car elles agissent sur les mécanismes identifiés dans ce modèle. Il apparaît donc opportun d'évaluer les répercussions fonctionnelles au niveau du muscle de l'administration de ces molécules dans un modèle animal parfaitement caractérisé de cette pathologie. C'est l'intérêt de ce projet qui vise à étudier chez l'animal dans son intégrité les effets des traitements sur le métabolisme et la fonction musculaire chez un modèle de souris souffrant de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester des approches thérapeutiques susceptible d’améliorer les performances musculaires chez un modèle de souris de la myopathie à cores centraux. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette myopathie, ce projet est une première étape indispensable avant l’application à l’homme.

Procédures

Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs, avec, pour chaque animal, un seul transport entre les deux établissements dans un véhicule dédié (durée environ 1/2 journée) . Chaque animal subira cinq injections (une par jour, durée: moins de 15s/injection) dans l'abdomen et trois explorations strictement non invasives par RMN. Ces explorations, espacées entre elles de 15 jours, auront une durée de 45-60 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

1/ Les injections dans l'abdomen pour induire la pathologie pourront entrainer une petite irritation au site d'injection et un stress léger. 2/L’induction de la pathologie pourra engendrer un stress modéré lié à la perte de poids et de force musculaire. 3/ Le transport des animaux d'un établissement à l'autre pourra engendrer un stress modéré. 4/Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. Le traitement n'induira pas d'effet indésirable car les molécules testées ont déjà été utilisées chez l'homme ou l'animal sans effet indésirable observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet afin de réaliser des prélèvements post-mortem de muscles sur lesquels seront réalisées des analyses. Cette étape est indispensable pour caractériser chez chaque animal l’état d’avancement de la pathologie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer de façon non invasive et à différents temps lors du développement de la maladie si les molécules testées permettent d’améliorer les performances des muscles atteints de myopathie à cores centraux. Le métabolisme et la force musculaire que nous allons étudier mettent en oeuvre une communication entre différents organes, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux au cours de l'évoution de la pathologie ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours à la RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal les mesures dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques qui auraient nécessité d'euthanasier des animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser les mesures sur muscles. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux controles seront utilisés pour le test de deux molécules afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les injections seront réalisées par du personnel formé, le geste sera rapide et précis. Le transport des animaux entre les deux établissements sera réalisé par un transporteur agréé avec une livraison dans la foulée du chargement. Le suivi en RMN sera réalisé sur animaux anesthésiés afin de réduire le stress des animaux. Enfin, une grille de score spécifique à ce modèle de souris de la myopathie à cores centraux a été établie et permettra l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui ait une physiologie proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable, c'est pour cela que la souris a été choisie. Les animaux seront utilisés au stade adulte (ils seront âgés de 8-10 semaines au début du projet) afin de pas avoir d'interférence avec le développement musculaire, et parce que l’induction de la pathologie ne peut se faire que dans les fibres musculaires adultes.

Une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans le foie, sous anesthésie, de cinq à dix minutes, est pratiquée sur des souris dont une partie a déjà reçu une injection à quinze jours de vie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie et leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet d'une protéine du virus de l'hépatite B sur les cellules immunitaires qui entourent la tumeur, à un stade précoce de cancer du foie. Le porteur annonce des douleurs de suture et des complications per-opératoires possibles, hypothermie et saignement, et mentionne l'injection pratiquée à quinze jours de vie sans jamais dire ce qu'elle contient.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se développe souvent sur un terrain cirrhotique associé à une inflammation chronique. Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du CHC. Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de développer des travaux, portant sur l'impact de ces formes virales, via la modulation de la réponse immunitaire, au cours de la carcinogenèse hépatique. L’un des mécanismes semble passer par la modulation de l'infiltration immunitaire intratumorale. L'objectif est de caractériser la composante immunitaire dans le microenvironnement tumoral (TME) en présence de ces différentes formes virales. A l'aide de nouvelles approches et modèles expérimentaux, le mécanisme de l'impact pro-tumoral de ces formes virales du VHB à un stade cancer du foie précoce sera étudié. Ce projet présente l'avantage d'étudier spécifiquement le stade précoce du CHC établi (3 semaines post-transplantation)

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la carcinogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge de carcinome hépatocellulaire de patients. La principale hypothèse est qu'une protéine du VHB module le micro-environnement tumoral facilitant l’activité pro-tumorale de certaines sous populations immunitaires. Grâce aux modèles murins, la modulation de l'activité et/ou du recrutement de l'infiltrat immunitaire intra/péritumoral par cette protéine virale, exprimée dans les hépatocytes, sera déterminée. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre de bloquer ces interactions intercellulaires et, en conséquence, la progression du carcinome vers un stade tardif.

Procédures

Une injection unique à 15 jours de vie (une fois par animal concerné, d'une durée de 5 secondes) sur souris vigiles. Une injection de cellules tumorales du foie murin sera réalisée par greffe : cette transplantation chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et couverte par des antalgiques en pré-opératoire, et en post-opératoire. Cette intervention ne sera réalisée qu'une fois par animal et sa durée est évaluée entre 5 à 10 minutes. Une euthanasie sera réalisée à la fin du projet de recherche à l'aide d'une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et une douleur de courte durée au site d’injection ou encore une inflammation locale. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. La greffe au niveau du foie implique une chirurgie, les souris pourront donc éprouver de la douleur au niveau des sutures des plans cutanés et musculaires, ainsi que les complications per-opératoires (hypothermie, saignement) malgré une prise en charge médicamenteuse adaptée.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié sous anesthésie afin de prélever le foie et la rate et permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux en utilisant une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous avons précédemment réalisé des cultures cellulaires en utilisant des modèles 2 et 3 dimensions de différentes lignées cellulaires et d'hépatocyes primaires afin d'étudier in vitro l'impact de l'expression de protéines du virus de l'hépatite B (VHB) sur la progression tumorale. Nous avons développé un modèle de co-culture en transwell permettant d'étudier les interactions entre les cellules d'hépatome exprimant ou non ces protéines du VHB et une sous-population immunitaire. Cependant, la mise en place d'un modèle in vitro récapitulant l'ensemble de la réponse immunitaire innée et acquise hépatique n'est pas encore disponible, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers le modèle in vivo pour étudier l'impact de la présence d'une des protéines du VHB sur l'activation des différents acteurs du système immunitaire au cours du carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Un total de 840 animaux seront inclus dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Des souris contrôles seront réutilisées, si possible, entre différentes procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A l'issue des procédures, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate, éventuelles métastases tumorales) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin génétiquement identique (syngénique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons explorer. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie soit de 7 à 10 semaines de vie. L'établlissement d'un cancer du foie au stade précoce nécessitera une période allant de 3 semaines à 6 mois de suivi selon les différents modèles expérimentaux.