Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des effets des ultrasons sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une session d'ultrasons de trente secondes à une minute, précédée d'une injection de microbulles de gaz par un cathéter, puis trente minutes d'imagerie sous anesthésie, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet existe parce qu'une étude précédente de la même équipe a laissé la moitié des animaux léthargiques après la séance d'ultrasons, des hémorragies cérébrales étant retrouvées chez 80 % de ceux qui ont ensuite été tués et examinés. Le porteur maintient que la technique est "prometteuse" et déjà en voie d'utilisation chez l'être humain, tout en cherchant à caractériser la neuroinflammation qu'elle provoque. Toutes les souris sont tuées pour des analyses complétant l'imagerie.
Objectifs
Le traitement des pathologies neurologiques, en particulier des maladies neurodégénératives, est limité par la présence de la barrière cérébrale qui complique le passage de molécules thérapeutiques au niveau du cerveau. Pour pallier cela, l’utilisation de la technique des ultrasons thérapeutiques semble une approche prometteuse. Cependant, lors d’une de nos précédentes études combinant l’utilisation des ultrasons, des microbulles et d’un composé thérapeutique, nous avons constaté un état léthargique chez environ 50% des animaux dans les heures suivant la session d’ultrasons. Après euthanasie de ces animaux, nous avons constaté, chez 80% des animaux, l’apparition d’hémorrhagie cérébrale. L’objectif de cette étude est donc de s’intéresser aux effets de ce schéma thérapeutique sur le cerveau et notamment sur l’inflammation. En effet, une augmentation locale de l’inflammation cérébrale suite à l’application des ultrasons associés aux microbulles est reportée dans la littérature. Nous souhaitons donc expliquer les effets des US après une ou deux sessions d’ultrasons grâce à l’imagerie basée sur la radioactivité et à l’analyse des molécules impliquées dans l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet va apporter des informations sur les effets des ultrasons cérébraux aigus et subaigus, notamment sur la neuroinflammation. En effet, l’utilisation des ultrasons pour perméabiliser la protection cérébrale est en voie d’utilisation chez l’homme et nous souhaitons caractériser la neuroinflammation induite. Cette étude vise à développer des nouveaux traitements dans les maladies neurologiques chez l'Homme
Procédures
Les animaux auront une session d’ultrasons d’une durée de trois minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection de microbulles de gaz (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ce groupe aura également une session d’imagerie TEP d’une durée de 30 minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection du radiotraceur (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ces animaux seront maintenus en contention lors du prélèvement sanguin en sous-mandibulaire (1 minute).
Impact sur les animaux
Injection des différentes molécules : un hématome au niveau de la queue à la pose ou au retrait de l’aiguille peut être ressenti. Session d’ultrasons : les souris ayant reçu les ultrasons peuvent présenter des difficultés à récupérer dans les heures suivant la session d’ultrasons. L’apparition d’hémorragies cérébrales est également possible du fait de la ou des sessions d’US.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études ex vivo complémentaires aux études d’imagerie.
Remplacement
Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie utilisée basée sur la radioactivité est intégralement transférable à la clinique. A l’heure actuelle il n’existe de méthode alternative permettant d’étudiant les conséquences de l’ouverture de la barrière de protection sur le tissu cérébral.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 20 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter par sexe, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Des analyses statistiques seront réalisées dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés quotidiennement. En cas de blessures, la plaie sera nettoyée et désinfectée jusqu’à la cicatrisation complète. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Le protocole expérimental sera mené avec une attention particulière portée au bien-être animal, notamment grâce à l'application de points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en condition normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra utilisée en imagerie reposant sur la radioactivité. Adulte (6 mois) car les traitements US en clinique, notamment pour les maladies neurologiques, ne concernent que des sujets adultes. Les groupes d’animaux seront composés à 50% de mâles et 50% de femelles afin d’éviter les biais dus au sexe.
Rôle des protéines de liaison à l’ARN dans le développement de tumeurs chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un écoulement de sang ou un ulcère sur la tumeur déclenche la mise à mort de l'animal. 2 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Prélevées à la queue à six jours pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes cinq jours d'injections ou de gavage, une irradiation de dix minutes, un transfert de cellules par une veine derrière l'œil, une greffe de cellules tumorales, puis un suivi de la tumeur pendant deux à huit semaines. Le porteur indique que la suppression des protéines étudiées dans les lymphocytes T peut déclencher une auto-immunité avec amaigrissement, inflammation de la peau, prostration et perte d'activité sévère, auquel cas les souris sont tuées et le traitement raccourci à cinq doses.
Objectifs
La modulation des réponses immunitaires par les lymphocytes T grâce aux immunothérapies est à présent mise en place comme un traitement standard contre divers cancers. Dans ce contexte, l'activation des lymphocytes T dépend d’une régulation hautement dynamique des programmes génétiques pour la production de molécules effectrices qui éliminera les cellules tumorales. Nos données préliminaires montrent que les fonctions effectrices et régulatrices des lymphocytes T sont modulées par les protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous émettons l'hypothèse que les RBPs sont essentielles pour le développement de la réponse antitumoraux par les lymphocytes T. Avec l'utilisation de modèles de souris transgéniques, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l'amplitude et l’étendue des réponses immunitaires contre les tumeurs. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 - Comprendre la fonction des RBPs pour la maintenance de populations de lymphocytes T saines. 2 - Étudier l’importance de ces protéines pour l’activation des lymphocytes T effectrices et régulatrices dans la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous avons sélectionné les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 comme modèles pour évaluer l'importance des mécanismes post-transcriptionnels clés des ARNm jusqu'à la synthèse des protéines. Pour certains cancers, l’expression de TIA1 et TIAL1 dans les lymphocytes T a été utilisé comme un marqueur pronostique, mais sa fonction moléculaire reste inconnue. G3BP1 et G3BP2 sont des protéine impliques dans l’apparition de cancer. Donc, nos études apporteront d'importantes connaissances sur la biologie de ces protéines et sur le fonctionnement des lymphocytes T qui permettra de mieux optimiser les stratégies pour la détection ou traitement de cancers.
Procédures
Les animaux sont soumis à une contention de 3-5 minutes pour un prélèvement de tissu (queue) lorsqu’elles ont 6 jours pour le génotypage (détermination des modifications génétiques) et, dans certains cas, un prélèvement du sang. Les animaux transgéniques n’expriment pas les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 dans les lymphocytes T après un traitement spécifique par injection intra-péritonéale ou gavage oral (chaque intervention dure 2 minutes) pendant 5 jours, ou par régime alimentaire (sans manipulation). Ils serviront comme modèles tumoraux ou de donneurs de cellules T pour nos expériences de transfert cellulaire. Le transfert de cellules se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par une injection de 100-200μL en voie intraveineuse, par injection rétro-orbitale. Certains animaux seront irradiés, une fois pendant maximum 10 minutes, avant la reconstitution du système immunitaire avec le transfert de cellules souches par injection intraveineuse de 100-200μL dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes. Dans les modèles de cancers murins, l'implantation des cellules tumorales se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par injection sous-cutanée (sc) au niveau du flanc. Les animaux sont soumis à une contention de 2-3 minutes pour mesurer la tumeur tous les 2-3 jours (pendant 2-8 semaines selon les expériences) jusqu’au point d’analyse. Toutes les souris seront euthanasiées avant le prélèvement des organes le jour du point d’analyse.
Impact sur les animaux
Pour minimiser les effets indésirables, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales, puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de une taille tumorale maximale. Parfois, des nécroses peuvent apparaître au centre de certaines tumeurs et commencer à s’ulcérer ou à saigner. Si se le cas, les souris seront suivies par le/la vétérinaire. L’apparatition d’écoulement de sang ou d’ulcère avec un écoulement de liquide est un point limite, et le souris seront euthanasiées. Pour les animaux transgéniques qui n’expriment pas nos protéines d'intérêt dans les lymphocytes T, il y a la possibilité de développer un épisode d'auto-immunité associé à une perte de lymphocytes T régulateurs. L’auto-immunité peut être caractérisée par un amaigrissement, une inflammation cutanée, une peau rugueuse et/ou squameuse, une déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés, une absence de toilettage, ou une absence d’activité sévère. Si les animaux présentent un des phénotypes cités en amont, ils seront euthanasiés et nous remplacerons le traitement continu par un traitement limité à cinq doses de médicament (1 par jour durant 5 jours) où la perte de poids sera inférieure à 5 %, sans aucune inflammation cutanée et une activité physique normale. Nous n’avons observé aucun autre phénotype dommageable lié aux croisements de lignées génétiquement modifiées. Dans tous les cas, la santé de l’ensemble de nos souris sera surveillée au minimum 3 fois par semaine et les souris seront euthanasiées si elles perdent plus de 20% de leur poids initial ou présentent une posture voutée ou prostrée, des poils hérissés, des salissures ou écoulements ou une absence de toilettage. La souffrance, la douleur et le stress associés à la manipulation d'animaux, l’injection de substances et cellules (nuisances légères), l'irradiation de souris (nuisance modérée), et de prélèvement de sang et/ou d’une biopsie pour le génotypage (nuisances légères) sont limités en raison de la formation constante de notre personnel.
Devenir
Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés à la fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Les réponses immunitaires contre le cancer sont des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains et permettent l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures se limiteront à la description des interactions moléculaires entre nos RBPs et l’ARN.
Réduction
Nous suivons les directives ARRIVE afin de garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d'animaux. La stratégie d'élevage produit le même nombre des souris tests et contrôles. Les souris sont classées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d'animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. Sur la base de nos données préliminaires, pour avoir la plus grande puissance statistique, nous aurons besoin de 7 souris par groupe. Pour la reproductibilité de résultats concluants, nous répéterons chaque expérience 3 fois pour permettre un test statistique et une bonne reproductibilité. Finalement, dans certains cas, le transfert des lymphocytes T matures ou la reconstitution du système immunitaire avec des cellules souches permettra la reconstitution des lymphocytes T chez plusieurs souris réceptrices non-transgéniques, réduisant ainsi l'élevage des animaux transgéniques.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 maximum dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. Les souris ne seront jamais laissées seules dans leur cage. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. De l’essuie-tout, des copeaux et du rouleau en carton et une maison en plastique rouge sont rajoutés en tant qu’enrichissements pour permettre aux souris de se détendre. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens dès leur naissance. Les animaux disposent d'une semaine d'acclimatation avant le début du protocole. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Dans chaque procédure, nous avons mis en place des points limites (activité, posture, aspect et/ou respiration anormale, amaigrissement, inflammation cutanée, présence d'une anomalie ou avec une tumeur de taille anormale [ayant atteint 1500mm3], ulcère ou sanglante). Si l’un de ces critères est atteint, les souris seront euthanasiées. Les utilisateurs ont reçu des formations spécialisées et officielles qui leur permettent l’évaluation des souris et le raffinement des procédures. Les zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que les grimaces, l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage. L’anesthésie gazeuse (2% isoflurane + mélange air/oxygène, débit : 2 L/min pour la boîte et 0.2 L/min pour le masque) sera utilisée pendant le prélèvement du sang ou l’injection des cellules pour réduire le stress.
Choix des espèces
Les mécanismes moléculaires régulés par les protéines de liaison à l'ARN étudiées dans ce projet, ainsi que la dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris sont similaires à celle observées chez l'homme. Donc, nos modèles de souris nous permettent d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Tout particulièrement, nous pouvons évaluer le maintien et le fonctionnement des cellules lymphoïdes dans un environnement tumoral complexe et difficile à modéliser in vitro, et ainsi analyser l'impact des réponses immunitaires systémiques en dehors du site tumoral. Toutes les procédures seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Impact des macrophages sur la matrice extracellulaire tumorale et la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une tumeur greffée sous la peau du flanc, puis mesurée tous les deux jours pendant treize jours, 1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyses post-mortem, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 188 un niveau modéré. Selon les groupes, elles reçoivent jusqu'à trois injections d'un agent qui détruit leurs macrophages, ou cinq injections d'immunothérapie, et le porteur signale diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans un des modèles, ainsi qu'une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience. Le projet cherche à comprendre comment les macrophages modifient la matrice qui entoure la tumeur et gêne l'entrée des cellules immunitaires. Les souris employées sont génétiquement modifiées et les tumeurs greffées choisies pour leur résistance variable aux immunothérapies, le porteur jugeant la similitude des systèmes immunitaires humain et murin suffisante pour parler de modèle "idéal".
Objectifs
Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.
Procédures
1-Greffe de cellules tumorales: 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis suivi de la croissance tumorale pendant 13 jours maximum (J3-5-7-9-11-13), sur maximum 1108 animaux 2- Injections d’un agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, 3 injections à J3-5-7 ou 9-11-13, sur maximum 458 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 3- Traitement par un autre agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, une injection à J3 ou à J9, sur maximum 96 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 4-Traitement d’immunothérapie (ou contrôle), non douloureux : une injection à J10-13-16-19-22 sur 160 animaux. 5-Traitement (ou contrôle), non douloureux, sous anesthésie générale : une injection à J10-11-12-13 sur 192 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes).
Impact sur les animaux
Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.
Réduction
Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Evaluation d’une nouvelle génération de microbulles pour la délivrance de médicaments dans le cerveau de rat par sonoporation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, chaque animal étant tué avant tout réveil. Chacun reçoit cinq injections, dont celles de microbulles de gaz et d'un colorant, avant une exposition du cerveau aux ultrasons de trente secondes, et il est tué une heure plus tard pour mesurer la quantité de colorant passée dans le tissu cérébral et l'étendue des microhémorragies. Le projet compare quatre solutions de bulles de taille unique, l'application aux tumeurs cérébrales et aux maladies neurodégénératives restant une perspective. Le porteur décrit des mesures acoustiques et un modèle cérébral en trois dimensions déjà réalisés, et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du système cérébrovasculaire.
Objectifs
A ce jour, la délivrance de médicament dans le cerveau par ultrasons exploite principalement des solutions de bulles de gaz de taille très hétérogène. Lorsque nous appliquons une séquence ultrasonore donnée sur une telle population de bulles, nous constatons que nous activons seulement une fraction de ces bulles, limitant ainsi l’efficacité de la délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons. De plus, leur utilisation ne nous permet clairement pas de distinguer les deux principaux régimes ultrasonores responsable de la perméabilisation des tissus, à savoir celui qui est considérée comme le plus sûre pour les tissus et le régime, qui endommagerait les tissus. Dans ce contexte, nous proposons d’exploiter des bulles de taille unique. En effet, nos données préliminaires in-vitro ont montré qu’utiliser de telles bulles permet de solliciter l’ensemble de la population de bulles et de mieux contrôler les deux régimes ultrasonores précédemment cités. Ce projet vise à : Objectif 1 - Évaluer 4 solutions de bulles de taille unique à perméabiliser efficicament le tissu cérébral, en mesurant l’accumulation d’un colorant par histologie, et sans induire des dommages tissulaires (microhémorragies tissulaires), qui seront analysés en histologie, 1 heure après traitement. Objectif 2 - Comparer cette efficacité et cette inocuité à celle d’une solution de bulles de taille très hétérogène.
Bénéfices attendus
Les ultrasons ont émergé comme une stratégie prometteuse de délivrance intracérébrale de médicaments. Cependant, l’utilisation de bulles de gaz de différentes tailles ne permet pas de toutes les activer dans un régime ultrasonore pour assurer une délivrance sûre et efficace de médicaments par ultrasons. L’exploitation de bulles de taille unique pourrait ainsi permettre de contourner les limitations des bulles de différentes tailles et de développer ainsi des protocoles de délivrance sûre et efficace de médicaments dans le cerveau par ultrasons pour le traitement de tumeurs cérébrales et de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Procédures
• Injection de la solution anesthésique, de la solution analgésique, du liquide physiologique, de bulles de gaz, de colorant – 5 injections - 2 min • Exposition du cerveau aux ultrasons – 30 s
Impact sur les animaux
Nuisance 1 – Manipulation des animaux est une source de stress. Nuisance 2 – Positionnement des animaux dans le cadre d'expérimentation est une source de stress. Nuisance 3 – Le point d’injection de la solution d’anesthésie est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 4 – Le point d’injection du liquide physiologique, de bulles de gaz et du colorant est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 5 – Perméabilisation du tissu cérébral est une source de stress. Nuisance 6 – Le point d’injection de la solution d’analgésie est susceptible d'être douloureuse.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort 1h post-injection de la solution de colorant afin de quantifier le colorant dans le tissu cérébral et de mesurer la présence de dommages tissulaires.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons caractérisé et comparé des solutions de bulles de gaz de taille unique et de taille hétérogène sur des bancs de mesures acoustiques. Nous avons ensuite validé leurs propriétés à perméabiliser le tissu cérébral sur un modèle 3D in-vitro. Ces deux approches ont permis de réduire le nombre de paramètres acoustiques et la concentration et la taille de bulles. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer la perméabilisation du tissu cérébrale par ultrasons en exploitant des bulles de taille unique in-vivo. Par conséquent, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d’étude in-vitro ou in-silico car à ce jour, aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système cérébrovasculaire in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, cette étude nécessite 96 rats. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer l’efficacité de la délivrance intracérébrale de colorant et l’innocuité de la procédure. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Une augmentation de 20% de la quantité de colorant dans le tissu cérébral et 2) Une augmentation de 10% de la quantité de dommages tissulaires (microhémorragies cérébrales).
Raffinement
Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Lors de la semaine d’acclimatation, l’habituation à la préhension/contention en renforçant nos actes sera réalisée par l’administration de friandises. Ils seront hébergés en groupe (2/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant). Les animaux seront observés une fois pour jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Après une semaine d’acclimatation, les rats seront anesthésiés par une injection d’une solution d’anesthésie et placés dans une boîte pendant 5 min. Dès que les rats auront des signes d’endormissement, ils seront sortis de la boîte et placés sur une couverture chauffante dans un cadre d'expérimentation. Une protection occulaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant les procédures. Sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort par injection d’un agent euthanasiant vétérinaire.
Choix des espèces
Dans la littérature et dans notre laboraoire, les rats âgés de 6 semaines, physiologiquement mâture sont couramment utilisés pour le développement de protocole de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons en raison de l’existence de modèles rongeurs de cancers cérébraux, de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Étude du rôle du système neurovasculaire méningé sur la clairance cérébrale dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement des tissus, dont 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les lots, elles subissent une chirurgie du cou pour boucher des veines, une ou deux injections dans une zone précise du cerveau, et jusqu'à trois heures d'anesthésie par intervention, avec des risques de lésions de la cornée et de chute de température. Le porteur compte dans cet effectif les souris consacrées à l'entraînement des opérateurs. Il affirme que les organoïdes ne reproduisent ni la régulation du flux veino-lymphatique ni les réponses physiologiques globales, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans l’enveloppe la plus externe du cerveau, appelée dure-mère. Ils sont aujourd’hui considérés comme jouant un rôle important dans certaines maladies neurologiques. Situés en dehors du tissu cérébral, ces vaisseaux suivent le trajet de certains vaisseaux sanguins dans cette enveloppe. Des études ont montré que la circulation sanguine dans le cerveau peut influencer leur bon fonctionnement ainsi que l’élimination des liquides présents autour du cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces vaisseaux lymphatiques et de la circulation sanguine dans l’élimination de certaines substances produites par le cerveau, dont l’accumulation est impliquée dans plusieurs maladies dégénératives. Pour cela, deux approches seront mises en œuvre chez la souris : -Une première approche consistera à modifier l’activité des vaisseaux lymphatiques en injectant une substance dans le liquide entourant le cerveau. -La seconde approche visera à réduire le flux sanguin du cerveau en occluant certains vaisseaux veineux du cou. Ces modèles permettront d’étudier l’élimination des déchets cérébraux en utilisant des traceurs injectés soit dans le liquide qui entoure le cerveau soit directement dans le cerveau. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ce système d’élimination et leur lien possible avec les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Le drainage des fluides cérébraux joue un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en permettant l’élimination de substances qui, si elles s’accumulent, peuvent devenir nocives. Ce processus contribue notamment à limiter l’apparition de certaines maladies liées au vieillissement. Des structures situées autour du cerveau, comme certains vaisseaux sanguins et lymphatiques, participent activement à ce mécanisme de nettoyage. Bien que leur implication ait déjà été mise en évidence, les interactions précises entre ces systèmes restent encore mal comprises. En étudiant plus en détail leur rôle, ce projet vise à mieux comprendre les processus d’élimination cérébrale et à explorer de nouvelles pistes pour améliorer ce mécanisme. À terme, cela pourrait ouvrir la voie à des approches innovantes pour retarder ou limiter le développement de certaines pathologies neurologiques.
Procédures
Un premier lot d’animaux aura une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum) puis recevront ensuite une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau (une fois, 3h d’anesthésie maximum). Un deuxième lot aura une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum). Un troisième lot aura deux injections avec un intervalle de 4 semaines, au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 ou 3 heures d’anesthésie maximum par intervention). Un quatrième lot aura deux injections avec un intervalle de 16 jours au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum, réalisée 2 fois), et dans l’intervalle une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une ou plusieurs interventions chirurgicales au niveau du cou ou du cerveau qui peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires chez les animaux, notamment dans les deux jours suivant l’opération. Des signes comportementaux inhabituels tels que l’agitation, la prostration ou une mobilité réduite peuvent être observés à court terme. Il est également possible d’observer des effets secondaires oculaires : gêne oculaire, lésions de la cornée. Enfin, il existe des risques liés à l’anesthésie générale tels que la baisse de température corporelle, sécheresse oculaire ou rares réactions cardio-respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet. L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire et le drainage des fluides cérébraux, nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques globales à une altération fonctionnelle. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
Pour répondre aux exigences du plan expérimental, un total de 1310 souris sera nécessaire. Ce nombre prend en compte plusieurs facteurs, notamment les différentes procédures à réaliser, les analyses post-mortem, les risques de perte liés aux chirurgies, ainsi que les souris requises pour l'entraînement et la formation des opérateurs afin de garantir des interventions standardisées et maîtrisées. Un calcul de puissance statistique rigoureux a été effectué pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires par groupe, en tenant compte des variations expérimentales attendues et des hypothèses formulées. Ce calcul vise à minimiser autant que possible le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Ainsi a été défini qu’un nombre minimal de 10 à 15 souris par groupe serait nécessaire pour chaque condition ou type d’analyse. Par ailleurs, ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats intermédiaires obtenus au cours de l’étude. Ces analyses intermédiaires permettront d’évaluer la nécessité de poursuivre certains volets expérimentaux ou, au contraire, de réduire le nombre d’animaux requis, en optimisant les procédures en fonction des données déjà collectées. Pour l’analyse des données, nous utiliserons des tests diagnostiques adaptés aux caractéristiques des échantillons et à leur distribution statistique, afin d’assurer une interprétation précise et rigoureuse des résultats. Cette approche garantit une utilisation raisonnée et éthique des modèles animaux tout en maximisant la qualité scientifique des conclusions.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée, en groupe et avec un accès à un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification et bâtonnets de bois à ronger). Les paramètres environnementaux, tels que la lumière, la température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Ils auront un accès permanent à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Ils seront observés quotidiennement et toute anomalie sera consignée et transmise à l’équipe de recherche, au vétérinaire et à la structure chargée du bien-être animal pour la mise en place d’une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous maintiendrons la température des animaux tout au long de leur anesthésie et appliquerons un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Une injection de sérum physiologique sera également réalisée pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Nous assurerons une surveillance renforcée dans la période post-opératoire ou après les prélèvements sanguins afin de nous assurer de la bonne récupération des animaux. En post-opératoire nous utiliserons un cahier opératoire qui sera rempli le jour de l’intervention, consignant les observations per-opératoires et post-opératoires immédiates, ainsi que les suivis à un, deux et huit jours après la chirurgie. Nous utiliserons également une grille de surveillance pour évaluer la douleur et détecter toute atteinte de points limites. Ce suivi permettra de détecter tout signe de stress ou de douleur
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent au nettoyage naturel du cerveau, en éliminant certains composés qui peuvent s’y accumuler. Pour cela, un modèle animal est nécessaire. Des souris seront utilisées, car ce modèle est bien adapté à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral y sont maîtrisées. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures expérimentales seront menées sur des souris adultes âgées de 2 mois à 1 an, une période durant laquelle la croissance de la boîte crânienne est achevée, permettant une précision optimale lors des interventions, et où la taille corporelle favorise de bonnes conditions opératoires. Cet âge garantit également que certaines structures impliquées dans la circulation des fluides cérébraux sont encore pleinement fonctionnelles. Tous les animaux seront identifiés par tatouage (au niveau des phalanges) dès leur arrivée au laboratoire, à un âge minimal de 6 semaines.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant une trentaine de minutes pour une électroporation in utero qui modifie le cerveau des embryons qu'elles portent. 288 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées, les souriceaux pour prélèvement de tissus, les femelles opérées parce que le porteur écarte une seconde intervention "pour raison éthique", les reproducteurs âgés faute de possibilité de replacement. Deux mutations d'un gène du développement cérébral produisent chez ces souris des défauts de comportement social que le porteur rapproche des troubles du spectre autistique. Il indique que les tests de comportement social sont bien établis dans cette espèce, sans nommer un seul de ceux qu'il emploiera.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris. Le projet nécessite une prolongation dans son exécution sans ajout d’animaux et un changement des deux Etablissements Utilisateurs (MODIFICATION).
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Comparaison de deux méthodes pour étudier la fonction gastro-intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Le gavage par sonde gastrique remplacé par une bille sucrée à avaler seule, 48 souris vont être utilisées pour comparer les deux méthodes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune est mise à jeun douze heures à deux reprises, isolée six heures à deux reprises, contentionnée et gavée, et subit une biopsie de l'oreille. Toutes sont tuées à la fin pour prélèvement d'organes. Le porteur inscrit ce travail dans une démarche d'amélioration du bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'il est "indispensable" de décrire au préalable la méthode la moins invasive.
Objectifs
La motilité gastro-intestinale (GI) est un processus physiologique complexe permettant la progression des aliments dans le tube digestif. Ce mécanisme est essentiel pour assurer les fonctions GI. Des perturbations de cette motilité sont fréquemment observées dans les maladies GI mais pas seulement. Actuellement, les expériences de mesure du transit intestinal chez les souris de laboratoire constituent le principal modèle d’étude pré-clinique pour la motilité intestinale. Ces études se basent sur des expériences au cours desquelles les animaux ingèrent un composant coloré, puis sont observés jusqu’à obtention de la première fécès colorée. Dans la majorité des cas, l’ingestion du composant coloré se fait par gavage à l’aide d’une sonde gastrique. Cela nécessite de contentionner correctement l’animal et de maitriser le geste nécessaire à l’insertion de la sonde. Ces manipulations sont généralement sources de stress pour l’animal et pour l’expérimentateur. Il semble cependant possible de s’affranchir de ces contraintes, en fabriquant (à partir de rouge carmin, d’agar et de sucrose) des croquettes que les souris vont manger spontanément. L’objectif du projet est de comparer les résultats obtenus et leur reproductibilité en fonction de la méthode utilisée (gavage gastrique ou prise spontanée), et de déterminer si la prise spontanée peut se substituer au gavage par sonde.
Bénéfices attendus
Si les données en prises spontanées sont fiables et reproductibles, ce projet permettra de s’affranchir des contraintes liées au gavage gastrique par la suite. Ce projet s’inscrit dans la démarche d’amélioration du bien-être animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à: mise à jeun (2 fois, 12h) ; contention et gavage (1 fois, moins d'une minute) ; un isolement (deux fois, 6h). La biopsie est un geste qui consiste à prélever un petit morceau de tissu, ici au niveau de l’oreille.
Impact sur les animaux
Risque (faible) l'inflammation/infection consécutif à la biopsie : traitement local Risque de fausse route lors du gavage : mise à mort immédiate de l'animal Stress lié à la contention et à l'isolement Perte de poids lié à la mise à jeun
Devenir
A l'issue de projet, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
De nombreuses pathologies présentent des deficits au niveau du transit intestinal. Les modèles de ces pathologies sont majoritairements des modèles souris. C’est pourquoi afin d’utiliser ce symptome comme marqueur d’efficacité dans les traitements pré-cliniques il est indispensable d’en d’écrire au préalable la méthodologie la plus appropriée et la moins invasive pour aller mesurer la durée du transit.
Réduction
Les animaux utilisés pour ce projet sont issus du surplu d’animaux sains obtenus dans les croisements nécessaires à l’obtention d’animaux expérimentaux dans d’autres projets menés. Afin de diviser par deux notre nombre d’animaux nécessaire nous avons choisis de mesurer la durée du transit avec les deux méthodes pour chaque animal. Les données obtenues feront l’objet d’une évaluation statistique préliminaire. A ce moment là, si la différence est suffisament importante et montre une différence statistique nous n’augmenteront pas le nombre d’animaux à passer en expérimentation.
Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit. La manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress. Une période d’habituation à l’expérimentateur est prévue. En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Le rouge carmin est un colorant non toxique utilisé chez l’homme pour étudier la durée du transit intestinal en médical. Nous avons mis au point un système de vidéo pour surveiller les animaux à distance sans avoir à les déranger lors de l’expérimentation. Suite à la restriction de nourriture durant 12h, une attention particulière sera portée sur le poids des animaux dans les jours qui suivent la session de mesure du transit. Pour ce projet, des points limites stricts et spécifiques ont été définis. En cas de besoin, des antalgiques de type anti inflammatoires pourront être administrés aux animaux.
Choix des espèces
De nombreuses pathologies présentent des deficits au niveau du transit intestinal. Les modèles d’études de ces pathologies sont souvent des modèles souris. C’est pourquoi afin d’utiliser ce symptome comme marqueur d’efficacité dans les traitements pré-cliniques il est indispensable d’en d’écrire au préalable la méthodologie la plus approprié pour aller mesurer la durée du transit. Aucun modèle in vitro ne permet de décrire la motilité intestinale dans sa physiologie complète. Les animaux seront utilisés à 50 jours de vie et à 100 jours de vie. Nous avons opté pour un stade juvénile et un stade adulte car la physiologie animale change entre ces deux périodes de vie et il est possible que nous observions des différences. De plus les symptômes gastro-intestinaux ne s’exprimment à différents stades suivant la pathologie. De ce fait, nous choisissons de couvrir les deux stades majeurs.
Maintien et caractérisation de souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle de l’inflammation dans un modèle de pathologie de la prostate. 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Issues de l'élevage de lignées génétiquement modifiées réparti sur deux établissements, 6 336 souris vont être utilisées, 280 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 6 056 d'un niveau léger. Tous les nouveau-nés subissent une biopsie de la queue pour le génotypage, et une partie reçoit des injections dans le ventre tous les dix jours pendant huit semaines, ou un gavage quotidien pendant vingt-huit jours, geste dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage. Seuls les mâles entrent en procédure, les femelles qui ne servent pas à la reproduction étant tuées, comme les animaux dont le génotype ne présente pas d'intérêt pour l'étude. Le porteur affirme qu'aucun système ne reproduit l'hyperplasie de la prostate ni la dynamique des cellules immunitaires dans l'organe, et juge le recours à la souris "indispensable" après des essais préliminaires sur cellules.
Objectifs
L’hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) est une maladie touchant un homme sur deux à l’âge de 50 ans et près de 100% à 80 ans. Le nombre de patient est destinée à augmenter avec le vieillissement de la population. Malgré sa fréquence, cette maladie inflammatoire reste méconnue et peu de traitements sont actuellement disponible. Récemment, il a été montré qu’une molécule était impliqué dans le développement de cette maladie et qu’elle était associée à l’inflammation. Cette étude a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition de différents composants de l’inflammation et de cette molécule en comparaison avec le traitement actuel. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Afin de trouver de nouvelles approches thérapeutiques, il est nécessaire d’identifier les facteurs impliqués dans le développement de la maladie. Ce projet permettrait de définir, in vivo, chez la souris, si l’inhibition de ce facteur ou de composants de l’inflammation limiterait le développement de la maladie. Dans un second temps, nous comparerons ces approches thérapeutiques au traitement actuel donné aux patients. Enfin, si les résultats sont positifs, nous mesurons le potentiel effet bénéfique d’une approche combinée de nos candidats avec le traitement actuel.
Procédures
Dans les deux établissements utilisateurs, tous les nouveau-nés subiront une biopsie caudale de 1 à 2 millimètres. Une partie des animaux subiront soit des injections intra-péritonéales (de quelques secondes) tous les dix jours durant 8 semaines ou quotidiennement durant 28 jours ; soit des traitements par gavage (de quelques secondes) tous les jours pendant 28 jours.
Impact sur les animaux
Certaines souris sont immunodéficientes et ont un risque infectieux plus élevé. La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Le gavage répété comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivé de la solution dans le poumon entrainant des signes de détresse respiratoire.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort. Quelques femelles seront utilisées pour les accouplements puis mises à mort. Les autres femelles non gardées seront mises à mort. Parmi les animaux générés, seuls les mâles iront en procédure. Au sein des mâles, chaque animal sera mis à mort suite à un génotypage ne présentant pas d’intérêt pour l’étude, à des prélèvements post-mortem, à un score supérieur ou égal à 4 de la grille de score de points limites, un score maximal dans un seul des points limites, à la fin de la durée de traitement prévue.
Remplacement
Selon le principe du Remplacement, des études préliminaires ont été menées sur des modèles cellulaires in vitro afin d’évaluer la pertinence et la durée des traitements choisis. Pour répondre à nos questions, l’utilisation de modèles de souris est indispensable car aucun système ne permet de reproduire le développement de l’hyperplasie bégnine de la prostate ni les interactions avec les différentes cellules immunitaires qui ont une grande dynamique au sein d’un même organe et dans le corps.
Réduction
Selon le principe de réduction, le nombre d’animaux utilisé a été calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes.
Raffinement
Tous les animaux sont maintenus en groupe sociaux dans un environnement enrichi. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis selon des grilles de score. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologies. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests sur modèles cellulaires et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car il reproduit fidèlement la pathologie étudiée et nous permet d’essayer de la traiter.
Etude du rôle de la protéine auxiliaire β3 des canaux sodium dépendant du potentiel (NaVβ3) dans la réponse aux variations de pression et de flux (modification 2 )
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une grille de score des points limites accompagne chaque étape, avec une surveillance renforcée jusqu'au troisième jour parce que la ligature de deux artères du ventre peut provoquer une occlusion intestinale. 876 souris vont être utilisées, toutes tuées pour l'examen de leurs vaisseaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 540 d'entre elles et modéré pour 336. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage, puis selon les groupes l'implantation d'une minipompe délivrant de l'angiotensine II pour provoquer une hypertension, une ouverture de l'abdomen avec ligature d'artères, un régime enrichi en graisses ou une mesure quotidienne de pression de quinze minutes sous contention. Le porteur affirme avoir réduit l'effectif au minimum et estime que 876 animaux "au maximum" seront nécessaires, sans détailler le calcul qui aboutit à ce nombre.
Objectifs
Les canaux sodium dépendant du potentiel (canaux NaV) sont des déterminants moléculaires majeurs de l'excitabilité cellulaire et sont impliqués dans la genèse et la propagation des potentiels d’action et le couplage excitation-contraction au niveau cardiaque. Ils sont composés de deux sous-unités, une sous-unité α formant le pore et une sous-unité β, auxiliaire, impliquée dans la régulation de l’activité du canal. Ils sont aussi exprimés dans des cellules dites non excitables comme les cellules vasculaires où leur rôle n’a pas encore été bien caractérisé. Récemment, nous avons montré que la dilatation-flux dépendante des artères de résistance de souris était potentialisée lors d’un traitement avec le bloqueur des canaux NaV, la tétrodotoxine. Ces résultats suggèrent que les canaux NaV vasculaires seraient impliqués dans la perception et la transduction du flux vasculaire. Nos travaux in vitro ont pu mettre évidence que la sous-unité auxiliaire des canaux NaV, NaVβ3, voit son expression augmentée dans la cellule endothéliale en réponse à un flux laminaire physiologique et non lors d’un flux oscillatoire perturbé pathologique, propice à un environnement inflammatoire et au développement de plaques d’athérome. Dans l’objectif de valider le rôle fonctionnel de NaVβ3 dans la mécanotransduction et la vasculoprotection, nous souhaiterons utiliser le modèle KO pour Scn3b (qui code pour la protéine NaVβ3) chez la souris et explorer si une délétion de NaVβ3 entraîne une modification dans la réponse à une augmentation de pression ou à une variation de flux et de dépôt de plaques d’athérome induite par le flux. (modification 2) De plus, des mutations dans le gène codant pour SCN3B chez l’homme entraine des arythmies cardiaques (syndrome de Brugada), Nous souhaiterions donc également mesurer si les souris déficientes pour Scn3b présentent un défaut de la fonction cardiaque.
Bénéfices attendus
Si NaVβ3 a un impact sur la physiopathologie de l’HTA ou de l’athérosclérose, alors il pourra être alors identifié comme une cible thérapeutique comme les canaux NaV le sont déjà dans certaines formes d’épilepsie et d’arythmie. Nous souhaitons inclure non pas que des mâles dans nos procédures mais également des femelles .
Procédures
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. L’ensemble des animaux seront génotypés suite à la biopsie d'oreille obtenu lors du marquage international. Ce marquage induit une douleur légère et de courte durée. Pour l’ensemble des animaux qui subissent une chirurgie, celle-ci est réalisée sous anesthésie générale en présence d’analgésique. Pour le modèle d’hypertension artériel, 432 animaux subiront une chirurgie légère consistant à une implantation de minipompe osmotique avec de l’angiotensine II pour 216 animaux, soit des animaux subissant la même chirurgie mais sans implantation de pompe pour les 216 autres animaux. L’intervention chirurgicale dure en moyenne 10 minutes et chaque souris ne la subit qu’une fois. L’ensemble des 432 animaux auront une mesure de la pression artérielle par pléthysmographie. Les mesures sont débutées 2 semaines avant le début de l’induction de l’hypertension. La première semaine est une semaine de socialisation et d’habituation au système. Ensuite les séries de mesure seront analysées et permettront d’obtenir une pression basale 7 jours avant la chirurgie puis 14 ou 28 jours après la chirurgie. La prise de pression est répétée chaque jour et dure 15 minutes. Pour le modèle de ligature d’artères mésentériques, l’ensemble des 300 animaux subiront une chirurgie modérée. Les animaux sont placés sur le dos, l’abdomen est ouvert et deux artères sont ligaturées. L’artère intermédiaire adapte son flux et l’augmentera. Après chaque chirurgie, les souris sont surveillées à l’aide de la grille d’évaluation et si besoin une nouvelle injection d’antalgique sera réalisée. Pour la mise en place du modèle d’athérosclérose, l’ensemble des 108 animaux subiront un régime avec une nourriture Western Diet indiqué dans la formation des plaques d’athérome chez les souris KO pour le récepteur aux LDL sous forme de granulés ad libitum pendant 16 semaines. Cette procédure est non invasive et indolore pour l’animal. (modification 2) L’évaluation de la fonction cardiaque, nécéssite l'ajout de 36 animaux qui subiront une chirurgie modérée. Une incision cutanée sera réalisée sur la partie abdominale, et une poche sous- cutanée sera créée à l'aide de ciseaux à bouts ronds, afin d'accueillir le transmetteur télémétrique. La mesure de l’électrocardiogramme sera réalisée 7 jours après la chirurgie sur une durée de 24 heures puis 10 minutes pendant le test de stress (nage).
Impact sur les animaux
Pour le génotypage, les animaux sont conventionnés et la perforation de l'oreille pour le marquage international est réalisé et dure maximum 5 minutes. La gène est une douleur légère et de courte durée. Une chirurgie légère ou modérée n’entraine que tres peu de douleur car ces procédures sont accompagnés d’une analgésie pré et post opération par l’injection de buprénorphine. Les animaux sont surveillés au réveil , dans les premières heures suivant l’opération puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à la grille de score des points limites . La procédure 2 pouvant engendrer un risque d’occlusion intestinale jusqu’à J3, Une attention plus particulière sera portée sur ces animaux grâce à la grille de score des points limites. Les modèles d’hypertension artérielle et d’athérosclérose ayant pour but de créer un modèle pathologique non sévère, les animaux seront également surveillés mais d’après notre expérience, peu ou pas de signes de mal être sont associés et seront dans tous les cas évalués. Enfin, la prise de pression artérielle par pléthysmographie engendrant un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.Pour la télémétrie, les souris subiront une chirurgie modérée sous anesthésique et avec antalgique, placées sur un tapis chauffant à 37°C pour éviter l’hypothermie. 7 jours de récupération après opération avec un suivi de poids sera réalisé. La mesure de l’ECG pendant 24 heures n’entraine pas d’inconfort chez l’animal. Lors du test de stress, les souris seront retirées au moindre signe d’inconfort.
Devenir
Mise à mort des animaux de toutes les procédures en vue de l’exploration des vaisseaux : Réactivité vasculaire et histomorphologie et étude transcrits et protéines .
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de Scn3b dans la physiopathologie vasculaire et la fonction cardiaque. En effet, la physiologie et physiopathologie du vaisseau ainsi que la physiologie cardiaquemet en jeu les systèmes immunitaire et nerveux. Les modèles cellulaires ne permettent en physiologie vasculaire que d’évaluer le mode d’action au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe voire à l’organisme. De plus, il n’existe pas de modélisation mathématique dans ce domaine.
Réduction
Nous avons reduit au minimum le nombre d'animaux pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Nous avons estimé que 876 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animau , enrichies par des jouets (rouleau de sopalin, maison). Les animaux sont surveillés au quotidien par le personnel de l'animalerie. Le poids des animaux est suivi en fonction de leur croissance et des procédures opératoires. Pendant tout le protocole, la douleur générée par les gestes chirurgicaux et/ou le stress sera evaluée et prise en charge etla mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie de ce projet utilisera des souris génétiquement modifiées pour Scn3b et Ldlr (KO). La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle bien décrit, bien documenté et utilisé dans le monde entier. Ainsi, les résultats peuvent être comparés d’un laboratoire à un autre. Enfin, les modèles d’HTA et d’athérosclérose chez la souris sont proches de la pathologie développée chez l’homme (augmentation de la pression artérielle, hypertrophie cardiaque, remodelage structurel et fonctionnel des artères pour l’HTA, dépôt de plaque d’athérome pour l’athérosclérose). Enfin, au laboratoire, nous avons un excellent recul sur ces modèles. Les souris C57BL/6N mâles et femelles seront âgés de 3 à 5 mois puisque nous avons déterminé au laboratoire que l’étude des artères doit se faire sur des animaux adultes et matures, d’âge moyen de 3 à 5 mois.
Rôle des cellules endotheliales cuboidales de veinules post-capillaires (High Endothelial Venule ou HEV) dans la recirculation des lymphocytes T dans un contexte de lymphome B chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Porteuses d'un lymphome qui gonfle leurs ganglions et réduit leur mobilité, 2 191 souris reçoivent une à trois injections, dont une chimiothérapie, et une partie subit une chirurgie puis une à deux heures d'imagerie sans jamais être réveillée. Toutes sont tuées à l'issue, les ganglions étant prélevés pour analyse, et 1 658 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère. L'objectif reste descriptif, comprendre comment le traitement donné aux patients modifie les vaisseaux du ganglion envahi. Le porteur ramène pourtant les atteintes au stress de la pesée et de la contention, alors qu'il indique par ailleurs que le lymphome provoque douleur, sensibilité des ganglions et perte de mobilité.
Objectifs
Les veinules cuboidales ou HEV sont des vaisseaux sanguins particuliers qui constituent les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans la plupart des organes lymphoides secondaires comme les ganglions lymphatiques et sont indispensables pour le bon fonctionnement du système immunitaire. Lorsque les cellules d'un lymphome (cellules cancéreuses) envahissent un ganglion, l’organisation du ganglion est détruite, ces vaisseaux disparaissent et le système immunitaire du patient est donc affecté. Le traitement utilisé chez les patients atteints de lymphome est une chimiothérapie associée à un anticorps thérapeutique. Ce traitement permet de réduire le lymphome et de détruire les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients rechutent et l’objet de ce projet est donc d’étudier en utilisant le modèle souris comment le traitement utilisé chez les patients module la vascularisation du ganglion infiltré par le lymphome, et de déterminer si ces changements peuvent être utiles pour améliorer la prise en charge des patients notamment lors des rechutes.
Bénéfices attendus
Comprendre à l'aide d'un modèle chez la souris les effets de la chimiothérapie sur les vaisseaux des ganglions infiltrés par une tumeur de type lymphome afin de mieux choisir les traitements à administrer aux patients qui répondent moins bien ou qui rechutent.
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1, 2 ou 3 injections (La durée de chaque injection allant de 10 secondes à quelques minutes mais toujours < 5min chacune). Certains animaux auront trois injections puis seront anesthésiés pour la réalisation d'une procédure de chirurgie dont la durée est de moins d'une heure et d'imagerie par microscopie dont la durée est de 1 à 2h cette chirurgie et imagerie se faisant sans réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé développe des cancers au niveau des ganglions appelés lymphome. Ce lymphome peut provoquer de la douleur à l’animal, sensibilité au niveau des ganglions et une perte de mobilité liée notamment au gonflement des ganglions au niveaux de l'aine ou du creux axillaire. Les souris qui subiront des injections subiront du stress lié à la pesée et à la contention nécessaire à l'injection. Les souris qui reçoivent la chimiothérapie ou qui sont anesthésiées pour une chirurgie sans réveil peuvent aussi subir un stress au moment de l'injection.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car les analyses nécessitent le prélèvement des ganglions.
Remplacement
A l’heure actuelle, les procédures réalisées sur l'animal dans le cadre de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, les veinules cuboïdales des ganglions ou HEV sont dépendantes de l'environnement du ganglion lymphatique. De ce fait, toute étude in vitro est actuellement non envisageable. De plus, ces cellules sont associées à une fonction particulière qui permet la recirculation des lymphocytes qui sont des cellules majeures dans la surveillance immunitaire, et cela ne peut également être évalué qu’in vivo. Par conséquent, l’ensemble des études sur ces veinules se font exclusivement chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 15 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Enfin, le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure est possible uniquement si les résultats de la précédente procédure le justifient.
Raffinement
La stratégie de raffinement est premièrement fondée sur l’utilisation de points limites précoces, prédictifs et adaptés. Le suivi des animaux est réalisé par les expérimentateurs ou l’équipe de zootechnie quotidiennement (aspect externe, comportement, palpation des ganglions périphériques). Les procédures d'injections ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Les injections se font sous anesthésie locale et les chirurgies sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique. Les conditions d’hébergement et les méthodes expérimentales utilisées sont les plus appropriées pour réduire au maximum toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est lié au fait que les ganglions lymphatiques ne sont véritablement apparus au cours de l'évolution qu'à partir des mammifères. La souris est donc le plus petit mammifère adapté à l'étude des veinules cuboïdales dans le cadre des lymphomes. Seuls des adultes âgés d'un minimum de 6 semaines sont utilisés car le développement de ces ganglions et du système immunitaire mature est tardif.
Role de l’acétylcholine sur l’attention
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
268 rats vont être utilisés et tués, dont 40 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil pour enregistrer l'activité de leurs neurones. 180 subissent une chirurgie intracérébrale d'une heure, avec un stress au réveil, une perte de poids et des douleurs les premiers jours, et 48 réalisent chaque jour pendant soixante et onze jours un test d'attention d'une heure, sous restriction alimentaire pendant toute cette période. Le projet vise à comprendre comment l'acétylcholine agit sur la concentration dans le cortex frontal, avec l'idée lointaine de mieux traiter les troubles de l'attention. Tous finissent par une chirurgie terminale, leur cerveau étant récupéré pour analyse.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une substance dans le cerveau, appelée l’acétylcholine participe à la concentration. Elle agit surtout dans une partie du cerveau appelée le cortex frontal, qui est important pour l’attention. Contrairement à ce que l'on pensait, ses projections vers le cortex frontal ne sont pas diffuses, mais bien organisées en sous-régions. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces différentes voies agissent et influencent l’attention, notamment en mesurant l’activité des neurones qui libèrent de l’acétylcholine. Une partie de l’étude se concentre sur l’établissement des conditions nécessaires pour tester l’attention de manière expérimentale chez des rats, avant de pouvoir manipuler ces voies pour étudier leurs effets dans des situations attentionnelles spécifiques.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est qu'il pourrait améliorer la compréhension de la manière dont certaines zones du cerveau, en particulier celles liées à l’attention, fonctionnent et interagissent entre elles. La compréhension de chaque région spécifique du cerveau contribuant à l’attention pourrait ainsi ouvrir la voie à de meilleures stratégies pour traiter des troubles attentionnels ou des problèmes liés à l’attention dans des pathologies psychiatriques.
Procédures
48 animaux vigiles réaliseront 1 test comportemental : d’une durée de 1heure tous les jours pendant maximum 71 jours. 180 animaux anesthésiés auront une chirurgie intracérébrale d'une durée d'1 heure. 40 animaux anesthésiés 1 chirurgie sans réveil pour l’enregistrement des neurones. 268 animaux auront une chirurgie terminale.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test. La chirurgie peut induire un stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical. Lors du suivi post chirurgical, l’animal peut ressentir un inconfort lors de l’injection d’analgésique en sous cutané. La restriction alimentaire durant 71 jours lors du test peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse.
Remplacement
Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons aux modifications de réseaux neuronaux et aux comportements associés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie soit 48heures de couverture antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour les tâches attentionnelles. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (7 semaines) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés.
Etablissement d’une biobanque d’hémopathies malignes humaines par des approches de xénogreffes chez la souris immunodéficiente..
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, encore affaibli par un traitement supplémentaire, pour que des cellules de leucémie humaine se développent dans leur corps. 1 945 d'entre elles reçoivent cette greffe puis jusqu'à huit prélèvements de sang sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles développent la maladie transplantée et sont toutes tuées à la fin, pour mesurer où en était la progression du cancer. L'établissement se présente comme prestataire de services et vend ces modèles à des laboratoires publics ou privés, une biobanque de leucémies humaines entretenue dans des corps de souris.
Objectifs
Les leucémies et maladies apparentées sont aujourd’hui le plus mortel des cancers du sang. Ces pathologies, en tout premier lieu les leucémies aiguës myéloblastiques, affectent 2,3 millions de personnes dans le monde et font partie des cancers les plus dévastateurs. Pour une incidence annuelle de 467.000 cas, les leucémies tuent environ 310.000 personnes chaque année. Le besoin médical insatisfait concernant les hémopathies est donc considérable. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de mettre en place une stratégie expérimentale qui permettra de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles molécules innovantes avec un fort potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouvelles molécules avec un fort potentiel thérapeutique à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-cancérologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules cancéreuses humaines (1 injection durant 2min / animal) puis subira des prélèvements sanguins (au maximum 8) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 14 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, une partie des animaux recevra l’injection de thérapies de référence de la pathologie dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du traitement (devenir du medicament après son administration dans l’organisme) choisi (au maximum 1 injection/jour/4semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une pathologie cancéreuse humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 8 espacés de 15 jours) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 2 procédures afin de pouvoir caractériser la progression de la pathologie développée.
Remplacement
La régulation de l’ensemble des mécanismes qui assurent la production continue et régulière des différentes cellules sanguines, que ce soit de façon normale ou pathologique, implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux et spécifiques à ces cellules. Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro . Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance des tissus voisins, du contexte immunitaire, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro. A l’inverse, sur le plan physiopathologique, la transplantation d’une leucémie se développant ensuite chez un animal présente des caractéristiques hautement similaires à celles de la pathologie humaine dont elle est issue, avec une complexité impossible à reproduire in vitro. Ainsi, le passage dans un modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettrait pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-cancéreuse ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir la mise en place et la caractérisation de modèles précliniques de pathologies malignes humaines. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. Les échantillons générés dans le cadre de ce projet seront, une fois leur caractérisation effectuée, rendu accessible à la communauté scientifique, sous conditions strictes inhérentes à l'origine et à l'utilisation des prélèvements d'origine humaine, au travers d’un consortium de 27 entités académiques françaises qui a pour but de favoriser le développement de nouvelles solutions thérapeutiques et diagnostiques destinées aux leucémies et maladies apparentées. Cette mutualisation au sein de la communauté scientifique française sera un moyen efficace de réduire globalement le nombre d'animaux rentrant en expérimentation puisqu'ainsi, il ne sera plus nécessaire à chaque laboratoire de générer ses propres modèles précliniques de ces pathologies.
Raffinement
Afin de réduire au minimum l’inconfort qui pourrait être ressenti par les souris qui ont un phénotype dommageable lié à leur système immunitaire déficient, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes (portoir ventilés, enceinte de change stérile, alimentation stérile, boisson acidifiée…). L’induction supplémentaire mais transitoire de leur déficience immunitaire nécessaire à la transplantation de cellules humaines sera compensée par une antibiothérapie préventive. Le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie volatile. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines dont le système immunitaire est déficient constitue un avantage déterminant pour le développement de pathologies humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules cancéreuses humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.