Recherche fondamentale

Privées de nourriture pendant vingt-quatre ou quarante-huit heures, soumises à différents régimes pendant quatre-vingt-dix jours, puis à un antibiotique dans l'eau de boisson et à un probiotique par voie orale, 1 700 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que le jeûne peut provoquer une perte de poids, un affaiblissement et parfois une hypothermie, et que les antibiotiques peuvent donner des diarrhées passagères. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leurs tissus et leurs organes. Le projet cherche des composés qui miment les effets du jeûne pour déclencher l'autophagie, le bénéfice invoqué visant l'obésité et les maladies métaboliques qui toucheraient, selon le porteur, un quart de la population mondiale.

Objectifs

L’autophagie est un processus physiologique, très conservée au cours de l’évolution, qui régule l’homéostasie cellulaire. L’autophagie est un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies métaboliques, neurodégéneratives et cancers. La restriction calorique est un inducteur physiologique majeur de l’autophagie. Nous avons identifié et sélectionné in vitro des composés capables de mimer les effets biochimiques du jeûne, et qui sont capables, donc, d’induire l’autophagie. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les liens entre nutrition et santé sont de mieux en mieux connus, et le risque de développer de nombreuses maladies - cancer, maladies cardiovasculaires, obésité ou encore de diabète de type 2 – peut être réduit en suivant les recommandations nutritionnelles nationales. Ces résultats permettront d’identifier des nouvelles cibles pour les traitements des pathologies métaboliques et de l’obésité, qui affectent dans le monde environ le 25 pour cent de la population et qui deviennent des problématiques de santé significatives.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à un jeûne de 24h ou 48h. Une partie des animaux sera soumise à différents régimes pour 90 jours. Une partie des animaux sera soumise à des traitements administrés sur animal vigile (2 administrations au maximum en 48 heures, 2 minutes/animal). Une partie des animaux sera soumise (1 fois) à un traitement antibiotique via eau de boisson (pour 3 jours) et, la moitié de ces animaux (vigiles), recevra (1 fois par voie orale, 2 minutes/animal) l’administration d’un probiotique intestinale.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les régimes spéciaux peuvent induire une augmentation et/ou perte d’appétit et de poids. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeûne (pour 24h ou 48h) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. Le traitement avec des antibiotiques peut induire des diarrhées passagères.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du métabolisme systémique et la réponse à la modulation du microbiote intestinal.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1700 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 10 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes, etc). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Les mâles qui se battent seront hébergés individuellement. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Capturés à l'hameçon, anesthésiés quand c'est possible, ouverts pour recevoir une marque acoustique dans la cavité abdominale en moins de cinq minutes, 300 poissons issus d'une liste de trente-trois espèces subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Pour l'une de ces espèces, la marque est enfoncée au trocart dans le muscle de la joue. Tous sont remis à l'eau sur leur lieu de capture, le porteur retenant comme nuisances principales le stress de la capture et la durée de manipulation. Le suivi doit mesurer comment ces poissons fréquentent les parcs éoliens en mer, le plafond de trente individus par espèce ayant été fixé "de manière arbitraire", faute d'approche statistique possible.

Objectifs

Les espèces marines mobiles jouent un rôle essentiel dans la connectivité des paysages marins. Or, le développement des parcs éoliens en mer (PEM) est aujourd’hui en plein essor, générant des modifications d’habitats marins qui peuvent impacter les communautés biologiques. Les poissons, par exemple, peuvent voir leur distribution, leur abondance et leur comportement affectés par les PEM, en raison d'effets directs et d'un large éventail d'effets écologiques sous-jacents, tels que l'effet de récif, l'effet d’agrégation temporaire, l’effet barrière, la perte d'habitat et les perturbations acoustiques, influençant ainsi la dynamique des populations. Ce projet suivra les déplacements de plusieurs espèces de poissons afin d'identifier les patrons d'utilisation par les poissons des habitats naturels et artificiels (et notamment les PEM), d’évaluer le chevauchement des zones fonctionnelles avec les installations en mer et d'aider à concevoir des stratégies de gestion à des échelles écologiquement pertinente. Cet objectif sera atteint grâce à la télémétrie - le suivi des animaux à distance - qui permet de suivre les animaux de l'échelle locale à l'échelle régionale, voire continentale, de quelques minutes à plusieurs dizaines d'années.

Bénéfices attendus

Les zones fonctionnelles des poissons sont vitales pour leur cycle de vie et l’identification de ces zones est indispensable à la gestion durable des ressources en poissons marins. Cependant, leurs localisations restent largement incertaines ainsi que leur utilisation par les différentes espèces et les interactions écologiques qui s'y déroulent. Au vu de la forte croissance du développement éolien en mer et son potentiel impact sur les zones fonctionnelles des ressources halieutiques, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces installations sur les écosystèmes marins. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et ainsi répondre aux questions suivantes : - Les espèces interagissent-elles avec les PEM ? - Comment réagissent-elles à l’implantation d’une structure physique en mer ? - Quelle est la fidélité dans le temps de ces espèces à la zone PEM ? - Quel est le degré de connectivité entre cette zone PEM et les autres habitats marins de la région par ces espèces, au cours des années, et d’une année à l’autre ? - Font-ils preuve d’une fidélité pluriannuelle à certains sites ? Si oui, à quelle saison ? - Comment les conditions environnementales influencent-elles ces tendances ? Il existe très peu de connaissances sur ces sujets pour les espèces de poissons fréquentant les zones de haute mer. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces espèces d’intérêt, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour la mise en place de suivis pérennes des populations au sein des PEM à venir afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines.

Procédures

300 individus issus d'une liste de 33 espèces seront équipés d'une seule marque acoustique interne par individu spécifiquement développées pour les poissons. Pour 32 des 33 espèces, cette marque sera implantée dans la cavité intra-péritonéale par une courte opération chirurgicale (

Impact sur les animaux

Le stress à la capture est l’effet indésirable principal. L’autre effet indésirable est la durée de manipulation du poisson qui sera la plus courte possible.

Devenir

Les poissons sont relachés sur le site de capture pour étudier leur comportement dans leur milieu naturel.

Remplacement

L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial de ces espèces sauvages dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer.

Réduction

Le nombre optimal d’individus à suivre en télémétrie est très fortement dépendant de l’espèce, de son comportement spatial, de la structure des populations qui la compose et des questions auxquelles on veut répondre. Ce nombre est très généralement supérieur à 20 pour de petites populations, et monte rapidement à plusieurs centaines pour d’importantes populations. Dans le cadre de la mégafaune marine, même s’il a été montré que des échantillons de 1 à 10 apportaient une information de comportement spatiale précieuse, un échantillon par espèce supérieur à 10 permettait d’avoir une estimation du comportement spatial bien meilleure, avec un échantillon de l’ordre de 100 nécessaires pour définir des paramètres clés sur l’espèce et les différentes populations la composant. Dans le cas présent, le nombre d’individus a été réduit au minimum en fonction des objectifs de l’étude et défini au seuil de la pertinence scientifique. En l’absence de connaissance sur le niveau de fréquentation spécifique du site ciblé par cette étude et du comportement spatial spécifique des espèces considérées en lien avec la structure flottante, le nombre de 30 individus maximum par espèce a été estimé de manière arbitraire afin d’optimiser les chances de capturer la majorité des comportements spatiaux à l’échelle d’une zone spécifique. Aucune approche statistique n’a pu être réalisée afin de définir le nombre d’individus marqués par espèce en raison de l’étendue de la zone d’étude et de la forte mobilité spatiale des espèces concernées en zone hauturière. Mais, en se basant sur la biomasse de ces espèces pêchées (plusieurs dizaines à centaines de tonnes débarquées), l’impact de ce projet sur les populations semble extrêmement limité. Enfin, en prenant en compte les contraintes de la télémétrie acoustique (ex: probabilité de détection dans un milieu où la transmission du signal acoustique est très variable en fonction de l’environnement, et où les fréquences d’émissions sont toutes les 2 à 3 mn en moyenne et la littérature existante), le marquage de N>30 individus / espèce est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques et des résultats associés aux populations concernées.

Raffinement

Dans le cadre du protocole expérimental, plusieures mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus, lors de la capture (utilisation d’un engin sélectif (hameçon) mis à l'eau durant un temps court pour limiter au maximum le temps où l’animal est en phase « capture », utilisation d’épuisettes en silicone pour les manipulations), ainsi que lors des phases d’anesthésie optimale quand cela est possible (sinon usage de l’immobilité tonique et anesthésiant local) durant les phases pré opératoire, opératoire et post opératoire. Les individus seront surveillés de manière régulière et seront retirés de la procédure dès que seront identifiables des indices comportementaux suspects (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies).

Choix des espèces

Le nombre d’espèces capturables sur la zone d’étude étant extrêmement varié, il est proposé dans cette étude de ne pas cibler d’espèces particulières, mais de (1) fournir une liste d’espèces potentielles, (2) limiter le nombre d’individus rentrant dans une procédure à N= 30 et (3) de limiter le nombre de marque déployée à N= 300, soit un équivalent de 10 espèces à N=30. Ces espèces sont de premier plan, tant pour l'importance de leur exploitation et leur valeur commerciale. De nombreux aspects de leur cycle de vie restent inconnus, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires notamment en lien avec l’impact de l’implantation d’éoliennes dans le milieu naturel. L’acquisition de connaissances sur la dynamique spatiale des espèces est une étape primordiale pour améliorer les connaissances sur l’impact potentiel de ces implantations sur ces populations. La maturité des poissons et des élasmobranches marins (raies ou requins) est très variable d’une espèce à l’autre et est déterminée généralement par leur taille. Afin de limiter l’impact sur la population et le choix de maturité des individus (nécessitant donc la capture, la mesure puis, soit le relâchage ou soit l’inclusion dans une procédure), des individus matures et immatures seront utilisés dans cette expérimentation sans estimation de la répartition en fonction de la maturité. La taille de l’hameçon utilisé permettra de limiter la capture d’individus trop petits ou trop gros.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié d'entre elles passant dix-huit mois sous régime gras avant d'être transportées vers un second établissement pour y subir jusqu'à six tests de comportement. Dans le premier site, elles sont pesées sept fois, injectées, gavées, prélevées à trois reprises, mesurées trois fois pour leur masse grasse et isolées quarante-huit heures en cage individuelle. Les tests portent sur l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices et les capacités physiques, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une avancée potentielle en connaissances et l'identification de cibles pour de futurs médicaments, quand la certitude porte sur dix-huit mois de régime imposé et sur la mise à mort finale pour analyse histologique.

Objectifs

Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.

Procédures

Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d’évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.

Impact sur les animaux

Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal (degré modéré). La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux (degré léger). La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux à l'occasion des prélèvements (degré léger à modéré), ou de leur isolement dans certaines procédures (degré léger). La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements (degré léger), ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement (degré léger à modéré). D'autres nuisances sont la douleur à l'injection (degré modéré), lors des prélèvements (degré léger à modéré), ou à l'occasion de certains tests comportementaux (degré léger à modéré).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.

Remplacement

Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.

Raffinement

Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire (application d’un désinfectant et d’une pommade cicatrisante en cas des blessures superficielles sur la peau) , - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.

Choix des espèces

La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.

Une chirurgie de l'artère carotide de trente minutes, cinq injections pour provoquer un diabète, dix jours de gavages ou d'injections d'inhibiteurs et jusqu'à huit semaines de régime gras : 4 120 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche des cibles pour éviter qu'une nouvelle plaque d'athérome ne se forme après la pose d'un stent, en particulier chez les patients diabétiques. Le porteur ramène les atteintes à une douleur légère et de courte durée pour chaque piqûre, à une irritation pour le gavage et à une perte de poids légère après la chirurgie, alors que ce sont ces gestes cumulés qui fondent la gravité modérée déclarée pour les 4 120 animaux. Toutes sont tuées pour examiner la paroi de leurs artères et les dépôts de graisse qui s'y sont formés.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires restent la première cause de mortalité mondiale dont l’athérosclérose est la principales cause sous-jacente. L’athérosclérose est une maladie qui bouche artères. Elle débute dans l’enfance puis se développe de façon croissante, en fonction de l’âge, du mode de vie, ou de l’acquisition d’autres facteurs de risques comme le diabète, une augmentation du cholestérol circulant ou l’hypertension. La dysfonction endothéliale est la première étape de la pathologie et va favoriser l'infiltration de cholestérol et de cellules immunitaires dans la paroi vasculaire, formant ainsi un amas cellulaire et de graisse qui compose la plaque d'athérome. Cette plaque peut se rompre et entrainer des événements cardiovasculaires graves comme l’infarctus du myocarde. Le traitement de choix pour traiter une plaque d’athérome symptomatique est une approche de chirurgie interventionnelle qui consiste à poser un maillage métallique appelé "stent" pour re-ouvrir le vaisseau et favoriser la circulation sanguine. Certaines molécules qui recouvrent le stent entrainent un défaut de cicatrisation endothéliale conduisant à la mise en place d’une nouvelle plaque d’athérome : ce phenomène est appelé néoathérosclérose. De plus, les patients diabétiques ont un risque significativement supérieur de développer des complications post-angioplastie. Il est donc important de mieux connaître les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués au cours de ces complications post-angioplastie afin de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la cicatrisation endothéliale et empêcher la néoathérosclérose. Plusieurs travaux de notre équipe ont déjà identifié des cibles pharmacologiques appartenant à une famille spécifique de protéines dans les pathologies artérielles et ces protéines pourraient présenter un intérêt thérapeutique intéressant dans ce contexte pathologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pertinentes et efficaces pour prévenir les complications post-angioplastie afin de diminuer le risque cardiovasculaire, notamment chez les patients diabétiques.

Procédures

Tout ou partie des animaux enrolés dans les procédures seront soumis: 1/différents régimes enrichis en gras ou cholestérol pendant 5, 6 ou 8 semaines 2/une chirurgie de l'artère carotide (durée: 30 min) 3/ des injections tous les jours pour induire un diabète (5 jours, 5 injections, durée: 30 sec) 4/ des injections ou des gavages d'inhibiteurs de cibles thérapeutiques (10 jours, 10 injections ou gavages, durée : 30 sec) 5/un prélèvement sanguin le jour de la mise à mort sur animal anesthésié ou animal vigile en fonction des voies de prélèvement (durée: 1 min)

Impact sur les animaux

La piqûre d’une aiguille pour injecter une molécule inductrice du diabète ou les différents inhibiteurs étudiés entraîne une douleur légère et de courte durée. L’injection de la molécule induisant le diabète peut induire une douleur légère de courte durée . L’introduction d’une sonde de gavage sur animal immobilisé par contention peut stresser les animaux et les irriter. La chirurgie peut entraîner une douleur post-opératoire. Une perte de poids légère peut survenir après la chirurgie. Le prélèvement sanguin réalisé sur animal vigile au moment de la mise à mort entraîne une douleur légère et de courte durée.

Devenir

A l'issu de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort pour analyser par la structure de l'endothélium ou les dépôts lipidiques signant la présence d'une nouvelle plaque d'athérome qui s'est développée.

Remplacement

Notre équipe développe des modèles 2D et 3D de vaisseaux sanguins afin d’analyser et de modéliser les structures des artères, afin d’éviter d’avoir recours à des animaux quand cela est possible. Cependant, les processus de cicatrisation endothéliale et de néoathérosclérose sont des contextes pathologiques complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires de la paroi vasculaire, ainsi que des facteurs circulants. De ce fait, les mécanismes étudiés ne sont pas toujours modélisables in vitro, le recours aux modèles animaux est donc nécessaire et indispensable. De plus, dans notre contexte d’étude, une lésion endovasculaire in vivo est la seule approche expérimentale permettant de mimer l’angioplastie chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum, en respectant les exigences des publications, sans nuire aux objectifs du projet et en garantissant des analyses statistiques de qualité. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés en fonction du design de chaque expérience. Par ailleurs, les expérimentations ont été optimisées de manière à regrouper les analyses des artères sur un même animal chaque fois que cela est possible. Des groupes de 20 animaux sont requis pour obtenir une distribution normale et compenser la variabilité entre individus. Le choix du groupe contrôle sera réfléchi afin de pouvoir le comparer à plusieurs groupes expérimentaux. Enfin, les tissus non prélevés chez l’animal pourront être récupérés par d’autres membres de l’équipe ou de l’institut pour optimiser la nécessité d’une mise à mort d’un animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes aux normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement approprié (igloo, bâtonnets de bois, coton, sizzle nest) et un statut sanitaire contrôlé tous les trimestres. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement par du personnel compétent ayant un livret de compétence à jour et formé aux approches de chirurgie. L’état général de l’animal ou la possibilité qu'il ressente de la douleur est évalué quotidiennement. Toute altération du bien-être des animaux sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien être des animaux et le vétérinaire référent pour déterminer les soins ou l'action à appliquer pour réduire le stress, l'angoisse ou la souffrance animale.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés pour les différentes cibles étudiées dans ce projet et permettant de récapituler de façon induite par un régime ou spontanée le développement de l'athérosclérose. De plus cette espèce de rongeur a des propriétés zootechniques (petite taille, un cycle de reproduction court permettant rapidement d’obtenir des générations successives pour les études à long terme) autorisant une mise en oeuvre des protocoles expérimentaux de recherche facilitée et maîtrisée par notre équipe de recherche. Cette espèce présente également des paramètres physiologiques prochesde l’Homme, la plaçant comme un organisme-modèle de choix pour l'étude des pathologies cardiovasculaires. Les animaux enrôlés dans ce projet seront âgés de 7 à 12 semaines. Il est nécessaire d’utiliser des animaux adultes avec un système vasculaire mature.

Une stimulation électrique du cœur qui peut déclencher une fibrillation ventriculaire et tuer l'animal sur la table : 654 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leurs mères reçoivent du tamoxifène par voie orale juste avant la mise bas, produit qui peut provoquer une fausse route ou déclencher l'accouchement, et les nouveau-nés en reçoivent une injection au deuxième jour, avant un tatouage à dix jours et une biopsie de la queue. Le projet vise à comprendre comment un défaut des fibres de Purkinje, 2 % de la masse du cœur, déclenche les arythmies mortelles chez l'humain. Le porteur retient la souris pour sa petite taille, sa facilité de contention, sa gestation de dix-neuf à vingt et un jours et ses portées de six à quinze petits.

Objectifs

Ce projet se déroule sur 2 établissements EU1 et EU2. La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.

Bénéfices attendus

La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.

Procédures

La première intervention consiste au traitement des souris gestantes, juste avant la naissance et par voie orale avec une molécule qui induit les cardiomyopathies chez la descendance (durée : moins d’une minute). La descendance issue de ces mères gestantes recevra une injection du même traitement au 2ème jour après la naissance (durée : moins d’une minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée : moins d’une minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (durée : moins d’une minute). Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU1/2 Ces animaux seront sous anesthésie générale, et leur activité électrique sera analysée au niveau du cœur entier par électrocardiogramme (ECG), au niveau tissulaire par stimulation cardiaque, et au niveau structurel par IRM. Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU2/2.

Impact sur les animaux

Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.

Remplacement

Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.

Réduction

Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.