Recherche fondamentale

Tuées à la fin du protocole pour des analyses post-mortem, ou réutilisées dans un autre projet pour 65 d'entre elles, 390 souris sont soumises à un régime gras dès l'âge de quatre semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent 28 jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen, des gavages, sept prélèvements de sang en deux heures par une incision de la queue, et trois minutes de contention dans un tube d'imagerie. Le porteur indique que le régime gras prolongé peut altérer leur mobilité et créer un état dépressif et de l'anxiété, et prévoit que les souris écartées du protocole après le régime soient utilisées pour l'enseignement ou des mises au point techniques.

Objectifs

Afin d’améliorer la quantité trop importante de sucre dans le sang, chez le diabétique de type 2, plusieurs approches médicamenteuses sont possibles. Parmi elles, il existe une famille de molécules proches d’hormones naturellement produites par l’intestin. A l’heure actuelle, les médicaments de cette famille sont nombreux sur le marché, mais ne cible généralement qu’un seul site d’action. La molécule de cette étude est la première capable de cibler deux sites à la fois, lui conférant ainsi un potentiel thérapeutique plus important que les médicaments actuellement le marché. L’avantage d’avoir deux cibles réside dans le fait que des mécanismes d’action différents et complémentaires pourraient exister et donc permettre une efficacité supérieure. L’étude de l’action de ce type de médicament a mis en lumière le fait qu’en plus d’améliorer le diabète, elles étaient capables d’améliorer le métabolisme des graisses, souvent perturbé chez le diabétique. En effet, l’accumulation de graisses dans le foie, est un phénomène courant chez le diabétique et a des effets délétères sur l’organe mais aussi sur le diabète en général. Le but de ce projet est d’identifier comment la molécule étudiée dans ce projet ciblant deux sites améliore le métabolisme à la fois du sucre et des graisses chez un modèle de souris obèse/diabétique et en particulier d’identifier quels sont les mécanismes d’action permettant ces améliorations au niveau du foie en essayant de discriminer l’implication de l’un ou l’autre site d’action. Pour permettre la mesure des paramètres pertinents pour cette étude, ce projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type 2 et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un site d’action et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi les effets. Les études préliminaires sur les effets de la molécule de cette étude semblent montrer une efficacité accrue en raison de sa capacité à cibler simultanément les deux sites d’action. L’intérêt d’un tel ciblage est que l’activation des deux sites entraîne des effets différents et complémentaires. Là où deux molécules étaient nécessaires, avec la molécule de notre étude une seule serait suffisante. De plus, d’un point de vue « pratique », les études montrent qu’une prise hebdomadaire chez l’Homme est suffisante pour permettre d’avoir les effets escomptés. Néanmoins, certains effets bénéfiques en relation avec le métabolisme lipidique et notamment avec un site d’action particulier restent à déterminer En résumé, le développement et la compréhension du mécanisme de la molécule de cette étude devrait permettre de contrôler plus efficacement le diabète de type 2 et d’apporter un confort au patient par l’administration d’une prise hebdomadaire unique de la molécule.

Procédures

Pour les tests nécessitant un gavage, les animaux vigils recevront un bolus unique par gavage. Cette manipulation prendra une dizaine de secondes. Pour chaque test nécessitant des mesures sur le sang, un prélèvement de sang se fera sur animaux vigiles et consistera : - en un prélèvement unique de 100 µl sur 2 minutes à J-4. - ou de 7 prélèvements de 30 secondes sur 2h à J+25 ou J+27 selon le test utilisée Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par injection dans la partie abdominale sur les animaux vigils, qui auront été habitués à leur manipulateur. Cette intervention prend moins de 10 secondes par animal. En ce qui concerne l’imagerie, les souris, vigiles, seront insérés dans un tube permettant la contention et la mesure indolore durera 3 minutes. Toutes les interventions citées ici exceptée la dernière se tiendront dans l’EU1, La technique d’imagerie se tiendra dans l’EU2.

Impact sur les animaux

En plus d’une perturbation du métabolisme, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer la capacité des animaux à se Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Les gavages nécessitent la contention de la souris, celui-ci peut provoquer un stress. De plus le gavage peut provoquer une fausse route. Les prélèvements de sang au cours des différents test de tolérance (glucose, insuline et lipides) nécessitent une petite incision à la queue qui peut provoquer une douleur légère et passagère. L’imagerie se fera par insertion de la souris dans un tunnel sombre qui permet la mesure. Cet environnement étroit et nouveau, peut entraîner un stress durant la mesure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux. Les animaux qui ne seront pas entrés dans le protocole de traitement, suite au régime serviront pour l’enseignement ou des mises au point techniques.

Remplacement

L’obésité et le diabète de type 2 sont des maladies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du sucre dans le sang, ce qui a des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences de cette pathologie, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. Par ailleurs l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, issus des animaux obèses diabétiques nous permettra de mieux comprendre l’impact direct des traitements sur les différents organes et évitera l’utilisation d’un certain nombre d’animaux supplémentaires pour les études in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de tester beaucoup de doses, ni de multiplier les temps de traitements pour ce type de molécule. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante. En ce qui concerne le travail in vitro nous avons essayé d’optimiser le nombre pour permettre de travailler sur l’ensemble des tissus d’intérêts aux différentes doses et temps escomptés. Grâce à notre expérience de ce type de traitement et au nombre important d’animaux issu de la partie préliminaire (suite au régime et avant la division en groupe pour le traitement), nous pourrons limiter les tests à une partie seulement des souris : petit nombre d’animaux pour avoir des résultats significatifs. Notre expérience dans ces techniques in vitro nous permet de rationaliser ce nombre pour ne pas multiplier les conditions expérimentales.

Raffinement

Par expérience, nous appliquerons des conditions optimales à l’obtention du modèle en permettant de maintenir le bien-être nécessaire. Afin d’éviter le stress de l’isolement, les animaux seront plusieurs par cage (5 à 10). De plus, les animaux auront à disposition dans les cages des objets permettant l’enrichissement nécessaire : des tunnels en plastique permettront de diminuer le stress et de réduire l’ennui en stimulant l’activité et permettant un sentiment de sécurité. De plus de la « frisette »de carton, permettra aux animaux de créer un nid et de s’y réfugier, renforçant le bien-être et ce sentiment de sécurité. Les animaux auront libre accès à un biberon d’eau et des objets d’enrichissement de milieu seront placés dans les cages. Une partie de la nourriture pourra directement être placée dans la cage pour permettre aux souris obèses ayant des problèmes de mobilité d’avoir accès à la nourriture plus facilement. Les tunnels d’enrichissement seront aussi placés à proximité de la nourriture et l’eau pour permettre aux souris de monter sur ces objets et de leur donner un accès plus facile. Pour ce qui est de l’anesthésie, nous utiliserons un anesthésique chimique lors des procédures 2, 3 et 4 qui se tiendront dans l’EU 1 et un gaz anesthésiant lors de la procédure 1 qui se tiendra dans l’EU 2. Pour le transport des animaux entre les deux EU (fin de procédure 1), les souris seront mises dans une cage contenant du coton avec un couvercle filtrant et transportées dans l’EU2 qui se trouve en face du lieu où les souris sont hébergées (EU1). Le temps de trajet estimé est de moins de 5 minutes. Au cours de ce transport, les cages seront mises dans un sac noir afin de préserver les souris de l’environnement extérieur en termes de température et de stress. Nous veillerons aussi au points limites du projet engendré par le diabète de type 2 qui consiste principalement en une déshydratation, en veillant à réhydrater ces derniers en cas de besoin. Enfin, en ce qui concerne les traitements et prélèvements, le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaires au bon déroulement du prélèvement de sang servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des injections intrapéritonéales. Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie est le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Les animaux utilisés seront des jeunes males de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifient par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Par conséquent, les traitements qui auront lieu par la suite seront réalisés sur ces mêmes souris devenus adultes (20 semaines)

Des cellules tumorales sont injectées directement dans le rein gauche de chaque souris après incision du dos, puis la tumeur est suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie pendant un mois. 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever reins et poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie cette chirurgie de "mineure et quasi non-invasive", et décrit par ailleurs une incision douloureuse et inflammatoire, une perte de poids liée à la croissance de la tumeur et des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires. Cette dérive métastatique vers les poumons fait partie de ce qu'il attend du modèle.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) représente 80 pourcents des cas de cancer du rein. Malgré les avancées des dernières années en matière d’analyse transcriptomiques, la compréhension des mécanismes mis en jeu reste nécessaire pour raffiner les approches thérapeutiques mises en place. La récente découverte de l’expression intrinsèque augmentées des proteines du complément chez les cellules tumorales suggèrent des fonctions non-canoniques essentielles à la formation et l’agressivité des cellules tumorales rénales, et corrèlent notamment avec un pronostique défavorable chez les patients. Cependant, les mécanismes connectant les protéines du complément à la physiologie des cellules tumorales restent encore incompris. L’objectif de ce projet est de comprendre l’implication des proteines du complément intracellulaire exprimées par les cellules tumorales. Pour répondre à cet objectif, nous proposons de créer un modèle murin d’injection de cellules tumorales rénales contrôles ou invalidées pour des gènes du complément candidats, implantées directement au niveau du rein gauche de la souris. Cette méthode nécessitant une chirurgie cutanée mineure et quasi non-invasive à l’avantage de recréer l’environnement primaire des tumeurs, et dans lequel nous pouvons observer une progression tumorale similaire à celle observée chez l’homme. Ainsi, la mise en place de ce modèle orthotopique est pertinent pour l’analyse et l’étude de la fonction des proteines du complément intrinsèque aux tumeurs. De plus, il permettra d’étudier la tumeur dans son ensemble, à savoir la mise en place et les interactions existantes entre les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral. Ce projet permettra la compréhension des mécanismes qui sont mis en jeu et sera utile pour l’étude de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

La prévalence du cancer du rein atteint 3 pourcents parmi tous les types de cancer, avec la plus forte incidence observée dans les pays occidentaux. Parmi eux, le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) représente plus de 80 pourcents des cancers du rein. Malgré les récentes avancées dans la compréhension du système du complément, ses fonctions au niveau intracellulaire restent encore méconnues. De part son impact observé sur la progression tumorale des patients atteints de ccRCC, et de part la disponibilité modèle tumorale murin reproduisant la progression observée chez l’homme, les benefices attendus sont d’avoir une meilleure compréhension de l’impact des gènes du complément sur la progression tumorale. Les tumeurs récuperées serviront de matériel de départ pour différentes analyses qui permettront de déterminer les mécanismes cellullaires impliqués mis en jeu. Notamment, certaines données préliminaires suggèrent que le complément intracelllulaire agit différemment dans les cellules cancéreuses comparé aux cellules saines. Avec l’essor de récentes thérapeutiques ciblant l’action des protéines du complément, nous pourrons à terme tester des inhibiteurs validés chez l’homme dans d’autres pathologies, pour une redirection thérapeutique.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention est nécessaire afin d’injecter les cellules tumorales dans le rein gauche (moins de 10 minutes). Apres injection, la progression tumorale sera mesurée 2 fois par semaine par imagerie non invasive via la bioluminescence effectuée sous anesthésie générale (environ 5 minutes pendant 1 mois maximum). Le suivi de la progression tumorale jusqu’à la fin de l’experience durera 1 mois maximum.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales directement délivrées au niveau du rein requiert une chirurgie cutanée faiblement invasive nécessitant le recours à un traitment anesthésique et analgésique. L’incision réalisée au niveau du dos pourrait être source de douleur et d’inflammation. Les souris peuvent avoir faim ou soif après la chirurgie et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée en raison d’une réduction de la mobilité conduisant à une perte de poids. L’animal pourra présenter des signes de douleurs, de difficulté respiratoire en cas de métastases pulmonaires. Le suivi des animaux par imagerie impliquera des anesthésies fréquentes de courte durée pouvant générer un stress des animaux en raison des manipulations et un stress thermique du fait de l’anesthésie. L’ensemble de la procédure peut conduire à une perte de poids au cours du protocole, qui sera contrôlé par une pesée quotidienne des souris.

Devenir

Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les reins et le poumon dans le but d’analyser par des techniques de laboratoire les cellules tumorales et le profil des cellules immunitaires infiltrants la tumeur.

Remplacement

Nos expériences préliminaires de co-cultures in vitro suggèrent que l’abaltion des génes du complément intracellulaire chez la tumeur influence également la réponse immunitaire, améliorant la réponse anti tumorale. Cependant, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu (l’ensemble des cellules immunitaires, la vascularisation…). En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et les cellules immunitaires infiltrant la tumeur dans sa globalité. Les tumeurs seront ensuite collectées et analysées pour comprendre le comportement des cellules tumorales in vivo ainsi que les cellules du système immunitaire infiltrantes. Des experiences supplémentaires in vitro seront utilisées pour corroborer les observations faites in vivo.

Réduction

Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 16 souris par groupe. Nous utiliserons des techniques d'imagerie non invasive pour mesurer le volume tumoral et pour l’apparition des métastases aux cours du temps. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 288. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.

Raffinement

Le raffinement implique l’optimisation de l’expérimentation afin de réduire et ou supprimer la détresse et la douleur des animaux. Afin de supprimer le stress des souris liés à un changement d’hébergement, nous respecterons le délai réglementaire de 8 jours minimum entre l’arrivée des animaux et la première manipulation de ces derniers dans le cadre de l’expérimentation. De plus, les souris seront hébergées dans des cages avec un milieu enrichi et limitées à 5 pour s’assurer d’un espace vital suffisant pour diminuer le stress. Au démarrage de la procédure, les dispositions nécessaires seront prises pour supprimer la douleur pendant l’instillation de la tumeur et soulager l’animal en phase de récupération. Ainsi, les souris seront sous anesthésie complète, combiné à un analgésique lors de l’acte chirurgical. La potentielle hypothermie induite par un endormissement prolongé sera prévenue par le maintien de la température de la souris à 37 degrés Celcius à l’aide d’un tapis chauffant. La micro-incision réalisée pendant l’opération nécessitera l’application de colle tissulaire pour permettre une cicatrisation complète. Au réveil, de la nourriture liquide sera placé au sol de la cage pour faciliter leur alimentation et leur ré-hydratation post-opératoire. Le temps estimé de l’opération est de moins de 10 minutes. La surveillance s’effectuera par le manipulateur à chaque mesure de suivi par imagerie non invasive des cellules tumorals par bioluminescence, 2 fois par semaine, en complément des surveillances quotidiennes opérées par le personnel de l’animalerie. Lors des mesures de la progression tumorale par imagerie, les souris seront endormies par anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide dès l’arrêt de la procédure. Afin de prévenir la baisse de température corporelle due à un endormissement prolongé pendant les acquisitions d’images, les souris seront placées sur un tapis chauffant à 37 degrés Celcius. Le temps de cette procédure est estimé à 5 minutes

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences dans un systeme in vivo complexe et s’intègre dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Le modèle utilisé ici, récemment décrit dans la litterature, combine une approche rapide et peu invasive tout en récapitulant au mieux le tableau clinique observé chez l’homme avec l’implantation d’une tumeur primaire rénale et l’observation d’une dérive métastatique pulmonaire. Nous utilisons des souris couramment utilisées pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral porteur du génome de l'hépatite B leur est injecté dans une veine, puis, selon les groupes, elles reçoivent deux fois par semaine pendant quatre semaines un produit provoquant une fibrose du foie, une injection unique déclenchant un cancer du foie, ou des anticorps détruisant une partie de leurs cellules immunitaires. Certaines subissent ces injections dès quinze jours de vie. Le porteur écrit que ces atteintes hépatiques entraînent des nuisances "inexistantes ou minimes", et affirme que le modèle murin est "indispensable" puisque aucun modèle in vitro, même un organoïde multicellulaire, ne reproduit les échanges entre le foie et le système immunitaire.

Objectifs

L'infection par le Virus de l'hépatite B (VHB) a touché plus d'un milliard de personnes dans le monde et est responsable d'infection chronique pour 250 millions de personnes, aujourd'hui. Ces infections chroniques peuvent conduire à la cirrhose et au cancer du foie. Environ un million de personnes décèdent tous les ans de cette infection virale. Il est donc essentiel de comprendre cette maladie virale afin de développer de nouvelles approches théraputiques. Notre projet de recherche basé sur nos précédents travaux, porte sur l'impact de l'expression d'un des gènes du VHB sur la pathogenèse hépatique et notamment en modulant la réponse immunitaire. Nous souhaitons évaluer le rôle de ce gène viral et les mécansimes associés en utilisant des virus complets ou délétés sur ce gène. Le modèle murin est indispensable pour évaluer les nombreuses interactions existantes entre les cellules du foie infectées et les cellules de l'environnement hépatique dont les cellules immunologiques. Cependant, le modèle murin n'étant pas infectable par le VHB. C'est pourquoi, nous avons généré des vecteurs viraux modifiés génétiquement qui sont d'une part, capables d'infecter le foie des souris et d'autre part, d'exprimer soit le génome complet soit un génome partiel du VHB. Ces vecteurs viraux et les modèles murins nous permettront ainsi d'évaluer l'impact d'une des protéines virales sur la pathogenèse hépatique et de déterminer le rôle de la réponse immunitaire dans cette progression.

Bénéfices attendus

Nos données acquises nous éclairerons sur la pathogenèse hépatique et le risque de développement du cancer du foie associé à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Elles pourraient conduire à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'infection par le VHB et des complications hépatiques associées chez les patients infectés par le VHB.

Procédures

Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé après anesthésie (par injection pendant 5-10 secondes par voie intra-péritonéale) sur l'ensemble des souris incluses. Ce transfert sera réalisé par une unique injection par voie intra-veineuse (injection de 5-10 secondes). Parmi ces animaux, un groupe de souris vigiles sera soumis à une injection intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 4 semaines d'un réactif générant une fibrose hépatique. Un autre groupe également vigile sera soumis à une injection unique intra-péritonéale (5 à 10 secondes) d'un réactif générant un cancer du foie. Un troisième groupe de souris vigile aura été pré-immunisé par une injection intra-veineuse unique (de 5 à 10 secondes). Un dernier groupe de souris vigiles subira une déplétion de sous-population de cellules immunitaires par injections d'anticorps par voie intra-péritonéale (5 à 10 secondes) deux fois par semaine pendant 1 à 2 semaines. Au cours de cette étude, nous serons également amenés à prélever du sang (1 à 5 minutes). Le nombre de prélèvement de sang varie de 1 à 2 selon le temps d'expérimentation (de 7 semaines à 6 mois) de chaque procédure. Les animaux seront anesthésiés avant ce prélèvement de sang. A la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux pourrait engendrer un stress thermique. L’induction des pathologies hépatiques sont bien connues et ont montré des nuisances légères ou modérées de l'atteinte hépatique. La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et pourraient conduire à une douleur légère de courte durée au site d'injection au moment du geste. L'administration de différentes drogues pourrait induire une inflammation, une fibrose et un cancer hépatique. Néanmoins, compte tenu des court temps expérimentaux effectués et/ou du faible impact de certaines des drogues utilisées, les nuisances cliniques seront inexistantes ou minimes. Ils pourraient éventuellement générer quelques troubles digestifs transitoires et rapidement réversibles. Les prélèvements sanguins pourraient être source de stress au moment de l’anesthésie et conduire à des saignements/hématomes.

Devenir

Pour l’ensemble des animaux inclus dans ce projet, l'euthanasie est requise afin de prélever des échantillons biologiques (foie, rate,...) pour permettre de réaliser de nombreuses analyses expérimentales post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) et, ainsi, répondre à la question scientifique posée. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

De précédents résultats effectués sur des hépatocytes primaires humains (PHH) in vitro suggèrent un rôle du VHB dans le recrutement et l'activation des différents intervenants du système immunitaire intra-hépatique. La mise en place d'un modèle in vitro récapitulant la réponse immunitaire innée et acquise, le recrutement des cellules de la moelle osseuse, ainsi que les interactions entre le foie et le système digestif (interactions essentielles à la pathogenèse hépatique) n'est pas réalisable à ce jour in vitro, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces travaux dans un modèle in vivo afin étudier l'impact du VHB sur le recrutement et l'activation des différents acteurs du système immunitaire, par interaction directe et/ou indirecte avec les hépatocytes infectés.

Réduction

La réduction de l'échantillonnage d'animaux est liée à l'approche statistique qui nécessite 30 souris par condition afin d'évaluer une différence significative entre les groupes par des tests statistiques. Le nombre total d'animaux sera de 1050 souris. Ce nombre a été évalué selon un calcul de puissance adapté en prenant la somme de toutes les expérimentations prévues dans ce projet de recherche. A l'issue de ces expérimentations, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate...) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris et ainsi de répondre aux questions scientifiques soulevées.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin syngénique (de génome identique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons étudier ici. Les animaux nés dans notre établissement seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie pour l'initiation du cancer du foie, soit au moment ou quelques semaines après le sevrage pour les autres types d'expérimentation. Les souris adultes provenant de notre fournisseur seront de même fond génétique que les souris provenant de notre établissement. Ces souris seront acclimatées à notre environnement expérimental au moins une semaine avant inclusion dans une de nos procédures. Ces souris seront identifiées à l'inclusion dans une de nos procédures.

Jusqu'à 46 jours d'injections quotidiennes, 25 jours de L-Dopa, puis cinq séances de deux heures enfermée dans un cylindre de plexiglas pour observation, voilà ce que traverse chaque souris de ce projet. 13 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après une chirurgie cérébrale de trente minutes injectant une toxine qui détruit leurs neurones dopaminergiques. La L-Dopa provoque ensuite les mouvements anormaux recherchés, que le porteur décrit comme pouvant gêner l'accès à l'eau et à la nourriture pendant deux à trois heures après chaque injection. L'effectif intègre des lots prévus pour refaire une troisième fois les expériences en cas de résultats discordants, et le porteur annonce que la "production" d'animaux sera réduite si moins de molécules sont retenues.

Objectifs

Le traitement classique des symptômes de la maladie de Parkinson est la L-Dopa. Au début du traitement la L-Dopa réduit les symptômes moteurs, mais après quelques années de traitement, des mouvements anormaux involontaires handicapants, appelés dyskinésies et induits par L-Dopa, se développent. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de molécules anti-dyskinétiques déjà commercialisées, ou non, sur ces mouvements involontaires dyskinétiques induits par le traitement chronique par L-Dopa. Ce projet permettra aussi d‘évaluer un potentiel effet protecteur de ces mêmes molécules sur les neurones atteints lors de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente au monde. Originairement considérée comme une maladie des personnes âgées, elle est de plus en plus diagnostiquée avant l’âge de 65 ans, notamment comme dans les formes génétiques étudiées ici. Les seuls traitements disponibles sont symptomatiques, mais malgré leurs efficacités dans la réduction des symptômes moteurs, ils induisent des effets indésirables comme les dyskinésies qui sont des mouvements anormaux. D’où la nécessité d’explorer de nouvelles thérapies. Ce projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie de la maladie de Parkinson et des dyskinésies induites par le traitement par L-Dopa. Ces recherches thérapeutiques sont en amont d’une application pratique en médecine humaine et requièrent une expérimentation animale afin d’apporter la preuve de concept concernant leur efficacité. Il est à noter que si la preuve de concept est apportée dans le domaine de la maladie de Parkinson, des approches similaires pourront être développées pour soigner d’autres maladies neurologiques. En étudiant l’expression des gènes dans certains régions du cerveau après traitement, on espère pouvoir mieux comprendre les mécanismes d’action de ces molécules anti-dyskinétiques que nous allons utiliser dans ce projet et identifier des nouvelles cibles thérapeutiques pour la prise en charge de la maladie de Parkinson. Les résultats de ce projet pourront également participer à un développement clinique chez les patients parkinsoniens.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie, pour une injection dans une zone spécifique du cerveau pour la mise en place de notre modèle. Elle durera 30 minutes environ. Les animaux recevront des injections des molécules à évaluer (1 fois par jour pendant 46 jours maximum, seulement pour les groupes d’animaux qui seront traités avant la chirurgie) et du traitement de la maladie de Parkinson (L-Dopa, 1 fois par jour pendant 25 jours maximum). Les animaux seront placés chacun dans des cylindres en plexiglas pour pouvoir être observés, 5 fois pendant les 25 jours de traitement par L-Dopa, et pour une durée maximale de 2 heures, afin d’évaluer l’intensité des mouvements anormaux induits par la L-Dopa et l’action des molécules sur cette intensité. Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque de douleur dans les heures ou les jours suivants. De plus l’injection réalisée pour la mise en place du modèle pourra générer un retard de récupération transitoire pour l’animal (difficultés transitoire motrices causant des difficultés pour s’abreuver et s’alimenter et engendrant des pertes de poids). L’anesthésie générale nécessaire pour la chirurgie génèrera une hypothermie et une sécheresse oculaire, elle pourra également être associée à des problèmes cardiorespiratoires. L’injection du traitement pour la maladie de Parkinson (L-Dopa) générera des mouvements anormaux (dyskinésies) pouvant générer un stress et pouvant aller jusqu’à provoquer des difficultés à s’alimenter et s’abreuver pour l’animal de façon très transitoire, dans les 2 à 3 heures suivant l’injection de la L-Dopa puis l’animal reviendra à son état habituel. Le changement d’environnement pour les tests comportementaux pourrait provoquer un peu de stress. Les injections peuvent également générer du stress et une douleur légère et de courte durée. Pour les injections répétées il existe un risque d’induration de la zone injectée, d’inflammation ou d’hématome.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus d’intérêt pour permettre les analyses afin de répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Notre projet propose d’étudier les conséquences de la mort des neurones dopaminergiques et sur d’autre partie du cerveau, et de trouver de nouveaux traitements pour les pallier. Le fonctionnement de ces neurones et leurs implications dans la production des mouvements normaux ou anormaux ne peut, à ce jour, pas être évaluée avec des modèles in vitro (cellulaires) ou computationnels. Le projet étudie des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu'à l'aide d'études sur l'animal. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement à réévaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués sera de 13896 maximum. La taille des groupes expérimentaux est estimée en se basant sur des travaux précédents. 15 à 22 animaux par groupe seront nécessaires dans le cadre de ce projet pour obtenir des effets statistiquement significatifs dans les réponses que nous proposons de tester. Ces lots ont été définis en utilisant des tests statistiques afin de limiter au strict minimum les effectifs par groupe tout en obtenant des résultats statistiquement exploitables. En fonction des besoins expérimentaux pour les projets de recherche il est possible que nous produisions moins d’animaux que prévu. Par exemple, ce nombre inclut les lots expérimentaux nécessaires pour effectuer les procédures une troisième fois en cas de non-concordance lors de l’expérience de vérification des résultats initiaux. Ces lots ne seront utilisés qu’en cas de résultats non concordants lors des deux expériences. La production d’animaux sera réduite et adaptée en fonction du nombre de molécules anti-dyskinétiques qui seront sélectionnées lors des premiers résultats sur un nombre réduit d'animaux et le nombre total d’animaux s’en verra réduit. Tous les animaux participant à ces procédures conduiront à des analyses biochimiques en rapport avec les comportements observés, afin de réduire le nombre d’animaux qui auraient été utilisés si les analyses biochimiques étaient effectuées sur d’autres lots. Les doses de traitements et le schéma d’injection de toxine intracérébrale seront également optimisés pour limiter le nombre d’animaux qui ne développeraient pas de dyskinésies et qui ne pourraient pas être inclus dans les groupes expérimentaux après chirurgie, cela permettra de réduire le nombre total d’animaux opérés pour obtenir le bon nombre dans groupe expérimental.

Raffinement

L'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour réduire au minimum la douleur et l'inconfort des animaux. Les souris provenant d’un fournisseur externe seront placées dans une salle d’acclimatation pendant au moins 6 jours avant toutes utilisation. Les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h à changement progressif. L'eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un carré de coton pour nidifier ainsi qu’un bâtonnet à ronger seront placés dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Si besoin, lors d’un petit effectif ou de tension dans le groupe un complément d’enrichissement peut être apporté par des maisonnettes ou des lanières de kraft. Les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie un processus de déclaration au comité interne responsable du bien-être animal et à l’équipe de recherche est mis en place pour assurer la meilleure prise en charge des animaux. Pendant les procédures, les animaux seront observés, manipulés et pesée régulièrement. La chirurgie sera réalisée chez des animaux endormis et avec traitements anti-douleur adaptés. On maintiendra la température de l’animal à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant au cours de la chirurgie. Un gel oculaire sera mis en place pour éviter toute sécheresse oculaire. Après la chirurgie, les animaux recevront de la nourriture gélifiée et/ou réhydratée pour faciliter leur récupération, éviter de la déshydratation ou une perte de poids trop importante. Ils seront surveillés jusqu’à 2 fois par jour en période post-chirurgicale et seront pesés tous les 1-2 jours après chirurgie et jusqu’à récupération de leur poids initial. Le suivi que nous mettrons en place devrait permettre de détecter précocement tout signe de souffrance et mettre en place la prise en charge adaptée. L'évaluation de la douleur et de la détresse sera réalisée en observant l'aspect des souris et leur comportement. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Pour les traitements injectés, nous vérifierons la souplesse de la peau avant injection et nous changerons de site d’injection chaque jour. Une partie des animaux sera euthanasiée par injection d’un agent euthanasiant, cette injection sera précédée d’une pré-sédation afin de réduire le stress et la douleur induits par l’euthanasiant.

Choix des espèces

Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement, notamment la maladie de Parkinson et donc la dyskinésie induite par traitement avec la Lévodopa. Pour l’études des dyskinésies, la méthode de lésion sélective des neurones dopaminergiques avecune toxine est très efficace et maitrisée chez cette espèce depuis de nombreuses années. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés qui sont fortement impactés par la dégénérescence des neurones dopaminergiques, ce qui en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la maladie de Parkinson. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et humains, ce qui permet relativement facilement d’extrapoler les mécanismes découverts chez la souris à l’humain. La maladie de Parkinson étant une maladie qui touche les adultes, les expériences auront lieu que chez des animaux adultes adultes âgés de 6 à 10 semaines environ, afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux.

Les souris sont mises à mort dès que se confirment une démarche saccadée et une perte d'équilibre, avant que s'installe une paralysie des pattes arrière. 50 souris de la lignée M83, modifiées génétiquement pour produire une forme humaine de l'alpha-synucléine, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont gardées jusqu'aux premiers troubles moteurs d'une maladie qui, selon le porteur, se déclare entre 8 et 22 mois, et subissent sous anesthésie une ponction cardiaque de deux minutes au plus. Le porteur présente le sang comme "une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau", et le bénéfice annoncé se limite à une identification de marqueurs qui "ouvrirait la voie" à d'autres recherches.

Objectifs

Le projet vise à identifier des biomarqueurs sanguins dans un modèle de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson. Les vésicules extracellulaires sont des petites structures libérées par les neurones et qui sont retrouvées dans le sang. Leur présence dans le sang de souris offre une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau. L'étude des vésicules extracellulaires neuronales dans le sang de ces souris M83 par des méthodes biochimiques permettrait d'identifier des biomarqueurs de maladie. Ces derniers sont des indicateurs biologiques de l'état pathologique du cerveau de la souris, et ils peuvent être utiles au diagnostic précoce de maladies neurodégénératives ou refléter l’existence de maladies différentes sur le plan lésionnel et clinique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable par simple prélèvement sanguin et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les animaux sont soumis à une anesthésie, ainsi qu'à une ponction cardiaque d'une durée de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

L’apparition des signes cliniques moteurs se manifeste par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort compassionnelle des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort, dès l’apparition des premiers symptômes, afin de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet qui vise à rechercher des biomarqueurs dans le sang ne peut être réalisé que sur animal vivant. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour évaluer le potentiel de ce type d'approche.

Réduction

Le projet complet prévoit un total de 50 souris, maintenues jusqu’à l’atteinte des points limites définis. La quantité de prélèvements issus de ces souris est jugée suffisante pour permettre la réalisation d’extraction de vésicules extracellulaires neuronales, et mener à bien nos analyses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé par groupe de 5 souris de même sexe, et originaires de la même portée, et maintenus dans un environnement enrichi (dômes en plastique, buchettes en bois et éléments de nidification) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements sont renouvelés chaque semaine, et la litière en rafle de maïs changée de façon bi-hedomadaire. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. Le test de suspension par la queue montre une dégradation de l’écartement des pattes postérieures. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Lors de la ponction intracardiaque, une analgésie est réalisée 30 minutes avant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris M83 sont des souris modifiées génétiquement et qui produisent une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. Elles développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement, entre 8 et 22 mois. Elles constituent un modèle pertinent de la maladie de Parkinson chez l'homme.

Une chirurgie à la tête d'une heure trente au plus, avec injection et implantation d'une fibre, et huit semaines dans une cage partagée par des séparateurs transparents : 104 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. Elles sont exposées deux heures par jour à de l'alcool dilué dans l'eau, puis à de l'alcool additionné d'une substance amère, pendant quatre jours suivis de trois jours de pause, pour comparer la consommation des mâles et des femelles et l'activité des neurones de l'insula. Le porteur signale une intoxication qui "disparaît 30 minutes après la fin de la prise" et un hébergement qui "peut engendrer du stress". Il justifie le choix de la souris par la comparaison avec les travaux existants : "la majorité des études se font sur ce modèle".

Objectifs

L’objectif du projet est de 1) étudier les différences de consommation d’alcool chez les souris mâles et femelles et 2) d’étudier l’activité des neurones du cortex insulaire (insula) antérieur et postérieur dans ces différences.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones du cortex insulaire antérieur et postérieur dans les différences mâles/femelles sur la consommation d’alcool chez la souris. A long terme, ce projet permettra d’ouvrir la voie vers la compréhension des régions cérébrales impliquées dans les différences sexuelles dans l’addiction à l’alcool, et de mettre en place de nouvelles prises en charges personnalisées chez l’humain, en prenant en compte le sexe.

Procédures

Les souris seront opérées à l’âge adulte (semaine 10) avec une durée maximale de chirurgie de 1h30, suivie d’une période de récupération de 4 jours. Les animaux seront exposés à de l’alcool dilué dans de l’eau, puis de l’alcool supplémenté d’une substance amère, durant 2h/j pendant 4 jours suivi de 3 jours de pause sans mesure de la consommation. Les animaux seront hébergés dans une même cage, séparés par des séparateurs perforés et transparents pour qu’ils puissent se voir et se toucher. Cet hébergement durera 8 semaines.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de fibre. La prise d’alcool peut engendrer une intoxication qui disparaît 30 minutes après la fin de la prise. L’accès à l’alcool étant limité à 2h/jours, les animaux ne développent pas de syndrome de sevrage. L’hébergement avec des séparateurs peut engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de l’activité des neurones au cours de la consommation d’éthanol. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture de cellules ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de l’analyse comportementale et de l’activité de notre région cérébrale d’intérêt. Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous nous sommes également appuyés sur la bibliographie.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole et améliorer le bien-être des animaux, les mesures suivantes seront appliquées : 1. Les cages seront enrichies avec un nid cotonné pour améliorer leur confort. 2. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée par le personnel animalier, y compris les week-ends et jours fériés. Avant le début de l’expérience, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par l’expérimentateur, qui passera ensuite à une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérience. Les observations incluront la vérification de la capacité de l’animal à s’alimenter, son poids, son comportement, sa vivacité et l’état de son pelage. 3. Pour prévenir la douleur pré-opératoire, un analgésique sera administré. 4. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. 5. Après la chirurgie, un sérum physiologique stérile sera administré pour éviter la déshydratation, et de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. 6. Le poids, l’état de l’animal, et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant 4 jours suivant la chirurgie. Des points limite adaptés ont été mis en place pour toute la durée du protocole.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des régions cérébrales impliquées dans l’addiction aux drogues incluant l’alcool, puisque la majorité des études se font sur ce modèle. Il est donc nécessaire de travailler sur la souris, pour pouvoir comparer nos résultats avec les études précédentes et actuelles. De plus, notre région cérébrale d’intérêt (l’insula) possède la même structure chez la souris que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des souris âgées de 10 semaines.

Un fragment de rein prélevé sur une souris est greffé sous la capsule rénale d'une autre, au cours d'une opération d'environ une heure sous anesthésie. 68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 36 d'entre elles reçoivent en plus six à quinze injections dans l'abdomen, dont le porteur indique qu'elles peuvent devenir gênantes à force d'être répétées au même endroit, la douleur de l'opération durant deux à quatre jours. Jusqu'à 32 souris sont opérées sans qu'aucune question scientifique leur soit rattachée, uniquement pour que l'équipe apprenne le geste chirurgical, avec une première évaluation du niveau atteint après seize greffes.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe qui se rapproche davantage des greffes d’organes chez l’humain, de voir s’il est possible de suivre le rejet sans intervention lourde, et d’utiliser ce modèle à l’avenir pour tester des traitements. La greffe de peau est le plus souvent utilisée pour étudier le rejet de greffe car elle est facile à réaliser, fonctionne bien dans la majorité des cas et permet de voir le rejet sans autres interventions. Cependant, la greffe de peau ne reflète pas totalement ce qui se passe lors d’une greffe d’organe. En effet, les cellules immunitaires et l'irrigation par les vaisseaux sanguins sont différents. Ainsi, les réactions du corps face à ces greffes ne sont pas identiques. Des études montrent que le rejet n’évolue pas de la même manière selon qu’il s’agisse d’une greffe de peau ou d’un organe comme le rein ou le cœur. Mais les modèles de greffes d’organes ont leurs limites, car les chirurgies sont complexes et le rejet difficile à estimer. Notre projet propose une alternative qui est la greffe sous-capsulaire rénale. Cette méthode consiste à greffer un petit morceau de tissu de rein sous l'enveloppe du rein du receveur. Elle est rapide à réaliser, il n'y a pas besoin de raccorder les vaisseaux et une l'incision sur le côté de l'animal est petite. Cette technique commence à être explorée comme modèle de greffe rénale. Pour améliorer le suivi de rejet de greffe, nous testerons une méthode pour observer le rejet sans procédure chirurgicale, l’imagerie in vivo. Cela permettrait d’observer directement le rejet sur un même animal à différents moments. En résumé, ce projet développera un modèle de greffe plus pertinent et pour lequel le rejet est plus facile à suivre. Cela afin de mieux étudier le rejet des greffes d’organes.

Bénéfices attendus

Apprendre à réaliser la greffe sous-capsulaire nous permettra de mieux comprendre les mécanismes du rejet et de tester nos hypothèses. Ce modèle se rapproche davantage de la greffe de rein chez l’humain. Pour en tirer le meilleur parti, nous devons développer une méthode permettant de suivre l’évolution de la greffe à différents moments. Cela nous aidera non seulement à obtenir des résultats plus précis, mais aussi à réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos prochaines expériences.

Procédures

Nous allons réaliser une greffe de tissu rénal sur 68 souris. Ce tissu sera placé sous la fine membrane qui entoure le rein. L’opération, pratiquée sous anesthésie, durera environ une heure par animal. Parmi ces 68 souris, 36 recevront ensuite un traitement sous forme d’injections dans le ventre. Ces injections seront données tous les deux jours pendant une semaine, puis deux fois par semaine. Chaque injection durera environ 3 minutes. Les souris seront réparties en plusieurs groupes : •32 souris recevront uniquement la greffe, sans traitement. •12 souris recevront la greffe et 6 injections. •12 souris recevront la greffe et 10 injections. •12 souris recevront la greffe et 15 injections

Impact sur les animaux

Dans ce projet, une opération sera réalisée sur des souris : un morceau de rein d’une souris sera greffé sous la fine couche qui entoure le rein d’une autre souris. L’ouverture nécessaire est de petite taille. Comme pour toute opération, cela peut provoquer une douleur pendant quelques jours (2 à 4 jours). Les animaux seront anesthésiés pendant l’intervention, c’est-à-dire endormis, ce qui peut aussi être un peu stressant pour eux au réveil. Après l’opération, certaines souris recevront un traitement pour empêcher leur corps de rejeter la greffe. Ce médicament sera injecté dans le ventre plusieurs fois par semaine. Ces piqûres ne sont pas très douloureuses, mais comme elles sont répétées au même endroit, elles peuvent devenir gênantes pour l’animal. La dose de traitement utilisée est la même que celle utilisée pour les patients humains, et ce traitement ne provoque pas d’effets secondaires connus à cette dose. Si le corps de la souris rejette la greffe, cela peut aussi causer de la douleur, qui sera surveillée et soulagée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience afin de réaliser les prélèvements terminaux. Le prélèvement des reins est nécessaire pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Jusqu’à maintenant, nos recherches sur le traitement du rejet de greffe ont été menées en analysant des échantillons prélevés chez des patients greffés et à l’aide d’expériences en laboratoire sur des cellules humaines. Ces approches nous ont permis d’identifier certains mécanismes du rejet, mais elles ne reflètent pas toute la complexité du corps humain. En laboratoire, il est très difficile de reproduire le comportement des cellules dans un organisme vivant : on ne peut pas observer comment elles se déplacent, interagissent entre elles, ou passent par les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire. Les modèles informatiques, quant à eux, ne peuvent pas encore simuler de manière fiable ces phénomènes très complexes. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant. Nous proposons d’utiliser un modèle de greffe de'un morceau de rein d’une souris dans le rein d'une autre souris. Cela est déjà décrit dans la littérature scientifique, et permet de mieux reproduire ce qui se passe dans une greffe d’organe chez l’humain. Ce projet a pour but de mettre au point ce modèle afin qu’il puisse ensuite servir à tester l’efficacité de nouveaux traitements contre le rejet de greffe.

Réduction

Nous avons fait en sorte de réduire au maximum le nombre de souris utilisées dans ce projet. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur les résultats d’autres équipes, afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaires pour apprendre correctement la chirurgie. Nous avons mis en place des points de contrôle réguliers pour évaluer les progrès et arrêter l’apprentissage dès que le niveau requis est atteint. Une première évaluation aura lieu après 16 greffes. Si 7 greffes sur les 8 dernières sont réussies, cela confirmera que l’apprentissage est suffisant. Si ce n’est pas le cas, l’apprentissage pourra se poursuivre jusqu’à un maximum de 32 animaux, avec des évaluations toutes les 4 greffes. Pour la suite du projet, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir de données publiées dans la littérature scientifique. Le calcul a été réalisé selon une méthode reconnue qui permet de s'assurer que les résultats obtenus seront fiables tout en utilisant le moins d'animaux possible. Ce calcul a conduit à des groupes de 6 souris, ce qui permet d’avoir des résultats significatifs sans surutiliser d’animaux.

Raffinement

Les greffes seront réalisées sous anesthésie générale, ce qui signifie que les souris seront complètement endormies pendant l’opération et ne ressentiront aucune douleur. Pour leur confort, elles seront placées sur un tapis chauffant pendant toute la durée de l’intervention et jusqu’à leur réveil, afin de maintenir leur température corporelle. Un traitement contre la douleur sera donné avant et après l'opération. Les souris recevront également une nourriture adaptée, posée au sol, surtout si elles ont du mal à se déplacer. Le bien-être des animaux sera contrôlé tous les jours pendant la première semaine, puis au moins trois fois par semaine par la suite. Une grille d’évaluation spécifique sera utilisée pour repérer les signes de douleur ou d’inconfort. En fonction du score obtenu, des soins ou un traitement contre la douleur seront apportés.

Choix des espèces

Ce projet a pour but de mieux comprendre pourquoi, malgré un traitement spécifique, certaines greffes de rein sont rejetées par le système immunitaire. Pour cela, nous utilisons un modèle chez la souris, car c’est l’un des seuls moyens de recréer les conditions complexes d’une greffe dans un organisme vivant. Les expériences en laboratoire, sur des cellules isolées, ne suffisent pas : elles ne permettent pas de reproduire les déplacements des cellules ni l’environnement complet du tissu greffé. De plus, les animaux non mammifères n’ont pas un système immunitaire assez proche de celui de l’humain. Le modèle souris nous permet de contrôler précisément les différences entre donneur de greffe et receveur de cette greffe, et il existe déjà des méthodes bien établies pour ce type de greffe. C’est donc le modèle le plus adapté pour cette première phase de recherche Les souris utilisées dans ce projet auront entre 2 et 3 mois (jeunes adultes), car des études ont montré que le traitement testé fonctionne mieux à cet âge. Chez des souris plus âgées, ce traitement est moins efficace.