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Développement de modèles de Médulloblastome et étude de l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce cancer
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
5 758 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 3 446 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune peut recevoir deux injections par jour ou un gavage une à deux fois par jour pendant un à deux mois, après qu'on lui a injecté des cellules de médulloblastome dans le cervelet ou greffé un fragment de tumeur sous la peau. Des souriceaux subissent la même injection intracérébrale, ce cancer touchant des enfants et le porteur cherchant à en reproduire l'environnement. La tumeur cérébrale provoque perte de poids, tête penchée et troubles de la locomotion, et le porteur conclut qu'après les travaux en culture le passage par un "organisme entier" devient "indispensable".
Objectifs
Le cancer est une maladie qui touche l’ensemble de la population et qui est, encore aujourd’hui, un véritable fléau pour la société. Nous nous intéressons plus particulièrement à un cancer touchant les enfants, le Médulloblastome. Le Médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus commune en pédiatrie. Ce cancer touche entre 100 et 200 enfants chaque année en France. Actuellement, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 80%. Les traitements existants sont la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie mais ils laissent malheureusement d’importantes séquelles. A ce jour, il n’existe aucune thérapie ciblée qui permettrait d’agir sur des marqueurs spécifiques des cellules tumorales de Médulloblastome et ainsi réduire les effets secondaires pouvant être causés par des thérapies conventionnelles avec un champs d’action plus large touchant à la fois les cellules tumorales mais aussi les cellules saines. Ainsi, une meilleure compréhension de la maladie permettrait le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail consiste tout d’abord à comprendre les mécanismes conduisant à l’apparition de ce cancer afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous utilisons des modèles mimant ces tumeurs. Ces modèles peuvent s’étendre de la cellule tumorale en culture jusqu’à l’utilisation de modèles animaux. Nos dernières études nous ont permis d’identifier 5 stratégies thérapeutiques prometteuses pour le traitement du Médulloblastome. Tout d’abord, nous avons montré, par des études bioinformatiques, l’importance de différents gènes dans le développement de ces tumeurs cérébrales. De plus, nous avons mis en évidence, dans des systèmes de culture de cellules tumorales in vitro, que ces 5 stratégies thérapeutiques, basées sur l’utilisation de nouvelles molécules, induisent la mort des cellules tumorales. Il nous est maintenant nécessaire de pouvoir étudier l’efficacité de ces approches in vivo en utilisant pour modèle, la souris. Ainsi, dans le cadre de ces projets, nous étudierons, chez la souris, l’effet de différents traitements sur le développement et la croissance tumorale de différents modèles de Médulloblastome. En conclusion, notre travail pourrait apporter une avancée conséquente dans le domaine du cancer du cerveau chez l’enfant.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes impliqués dans le développement tumoral des différents sous-groupes de Médulloblastome. Et il permettra également de valider l’efficacité de nos approches thérapeutiques in vivo, avec pour finalité une éventuelle transposition à l’Homme si les résultats s’avèrent satisfaisants
Procédures
- Un premier lot de souris sera injecté avec des cellules tumorales sous la peau (durée de l’anesthésie 2min). Dans un 2ème lot, des cellules seront injectées dans le cervelet de souris adultes anesthésiées (15min). Un troisième lot de souris sera constitué de souris génétiquement modifiées. Toutes ces souris seront ensuite traitées soit par 1) injection 3 fois/semaine (1min), 2) injection 2 fois/jour (30sec), 3) gavage (30sec) 1 à 2 fois/jour, 4) injection 3 fois/semaine + gavage 1 fois/jour, 5) injection 2 fois/jour + gavage 1 fois/jour, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. - Dans un 4ème lot, des cellules tumorales génétiquement modifiées ou non seront injectées dans le cervelet de souris adultes sous anesthésie gazeuse (15min) puis le développement tumoral sera suivi au cours du temps. - Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cervelet de souriceaux sous anesthésie (10min). Puis, ces dernières seront traitées à raison de soit 2 injections par jour (30sec) soit 3 injections par semaine, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. - Dans un 6ème lot, des souris anesthésiées seront greffées avec des fragments de tumeurs sous la peau (durée de l’anesthésie : 15min) - Dans un 7ème lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cervelet de souris adultes sous anesthésie (15min). Puis, ces souris recevront un régime alimentaire modifié en acide gras ou non et un traitement par injection 1 fois/semaine, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. Un prélèvement de sang sous anesthésie (< 1min) sera réalisé au moment de la mise à mort. Une partie des animaux des lots 2, 3, 4, 5 et 7 seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort pour remplacer le sang par une solution de fixation (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress modéré de courte durée lors de la contention et de l’initiation de l’anesthésie. Les procédures d’injection de traitements sont susceptibles d’entraîner également un stress et une douleur légère de courte durée chez l’animal. Il est possible que certains traitements entraînent à certaines doses une éventuelle toxicité pouvant causer une perte de poids de l’animal. L’acte chirurgical permettant la greffe tumorale pourra entraîner un stress et une douleur modérée dû à l’incision du plan cutané. De plus, l’injection de cellules tumorales chez l’animal est susceptible d’entraîner un léger stress et une légère douleur de courte durée due à la piqure. Ces animaux transplantés ou greffés développeront par la suite des tumeurs, qui à partir d’un certain volume, pourront entraîner une certaine gêne, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. La greffe des cellules tumorales dans le cervelet des souris pourra entraîner un stress ainsi que des douleurs post-opératoire chez l’animal durant les 3-4 premiers jours. Suite à cette greffe, le développement de la tumeur dans le cervelet des souris entraînera lui aussi des effets indésirables, tels que la perte de poids, une tête penchée et des problèmes de locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés pour des analyses.
Remplacement
Dans un premier temps, des méthodes alternatives telles que des analyses de données de patients nous ont permises d’établir des hypothèses de travail pertinentes en identifiant plusieurs cibles impliquées dans la tumorigenèse des Médulloblastomes. Nous avons préalablement validé ces hypothèses par des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux appropriés devient indispensable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La souris représente un modèle biologique « intégré », permettant d’évaluer une cible dans un système physiologique dans son ensemble et non pas dans un contexte restreint (in vitro). Seule l’utilisation de ce modèle permet donc d’étudier l’efficacité d’une thérapie de manière compréhensive au niveau d’un organisme entier et est donc nécessaire pour les présents projets. De plus, des coupes de cerveau obtenues à partir d’animaux sains seront mises en culture afin d’étudier ex vivo certaines questions scientifiques et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en procédure.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, dès que cela est possible, des expériences préliminaires réalisées sur un nombre restreint de souris permettront de déterminer la fréquence et les concentrations appropriées à utiliser pour les expérimentations de plus grande envergure. De plus, des coupes de cerveau obtenues à partir d’animaux sains seront mises en culture afin d’étudier ex vivo certaines questions scientifiques et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris a été choisi de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés tout en permettant une analyse statistique adéquate et ainsi une robustesse des résultats obtenus
Raffinement
Les procédures ont été réfléchies de façon à réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. En effet, lors d’interventions chirurgicales, les souris seront anesthésiées et des analgésiants locaux et généraux leur seront administrées pré- et post-opératoire. Durant l’opération, afin d’éviter une hypothermie des animaux, ces derniers seront placés sur un tapis chauffant. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris afin d’éviter un assèchement de leur cornée qui peut être causée par l’anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, les souris seront transférées dans une cage propre sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil, puis un gel hydratant et nutritif leur sera fourni afin de faciliter leur récupération post-opératoire. La croissance des tumeurs induites par injection sous-cutanée sera suivie par mesure régulière du volume à l’aide d’un pied à coulisse. Concernant les tumeurs intracrâniennes, la souffrance des animaux pourra, selon les modèles injectés, être anticipée par l’utilisation hebdomadaire de techniques, non invasives, d’imagerie du petit animal, qui permettront d’évaluer leur croissance au cours du temps et ainsi permettre une mise à mort précoce des animaux si cela est nécessaire. Les souris seront surveillées quotidiennement si besoin pour détecter le plus précocement possible la douleur chez ces dernières et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance (perte de poids importante, prostration…), les animaux seront mis à mort. Une grille de score a notamment été définie afin de détecter la souffrance des souris et mettre en place des soins support destinés à la minimiser, ou d’arrêter l’expérience. En cas d’inconfort visible de l’animal, un gel hydratant et nutritif sera déposé dans la cage et une prise en charge analgésique sera effectuée.
Choix des espèces
La souris est un modèle particulièrement adapté pour les expériences menées en oncologie pour valider des cibles thérapeutiques. De plus, à ce jour, uniquement les modèles transgéniques de souris ont pu récapituler les caractéristiques du Médulloblastome. Leur physiologie est proche de l’Homme et la pharmacologie pertinente pour des applications cliniques. L’utilisation de ces modèles permet également de reconstituer un environnement tumoral complexe qui peut jouer un rôle déterminant dans l’efficacité d’une thérapie. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes permet de conserver la signature de la tumeur humaine d’origine tout en l’amplifiant et de minimiser les risques de rejet. Nous utiliserons des souris adultes et des souriceaux selon l’objectif scientifique étudié. Le Médulloblastome étant un cancer pédiatrique, les souriceaux permettront de mimer le plus fidèlement possible l’environnement de ce cancer. Cependant, de par leur petite taille, les voies possibles d’administration des médicaments sont plus limitées chez les souriceaux que chez une souris adulte, empêchant ainsi l’utilisation de certaines molécules nécessaires à ce projet. De plus, l’utilisation de souriceaux implique d’utiliser des souris immunocompétentes car les souriceaux immunodéficients, étant par conséquent plus fragiles, ces derniers ne survivent pas suite à une chirurgie. Ce dernier point nous empêche alors d’étudier des tumeurs humaines qui présentent un risque élevé de rejet dans ces souris. Ainsi, certaines études seront conduites sur des souris adultes dont le système immunitaire est déficient afin de permettre une conservation de la signature de la tumeur humaine d’origine et de minimiser les risques de rejets. Nous utiliserons aussi des souris adultes immunocompétentes lors d’études réalisées sur des souris transgéniques.
Rôle du calcium dans le contrôle astroglial des fonctions hypothalamiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
6 354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les unes reçoivent une perfusion de fixateur dans le cœur sous anesthésie, les autres subissent une heure de chirurgie cérébrale pour l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale, une ponction cardiaque ou des privations de boisson. L'objet du travail est le rôle d'une protéine des astrocytes dans la libération de l'ocytocine et de la vasopressine. Le porteur écrit que les tests comportementaux n'induisent pas de nuisance tout en comptant parmi eux la privation d'eau, et justifie l'effectif de 6 354 animaux par sa seule expérience du domaine.
Objectifs
Les interactions entre neurones et astrocytes sont essentielles aux activités cérébrales, en particulier dans les régions telles que l’hypothalamus, fortement liées au flux sanguin et régulant des fonctions physiologiques vitales. Les astrocytes contactent à la fois les vaisseaux et les neurones, pour détecter et intégrer les changements sanguins et des activités neuronales. En réponse, les astrocytes modulent les neurones adjacents. Cependant, les bases moléculaires qui sous-tendent cette régulation restent obscures. Une protéine fortement exprimée dans les astrocytes est peu explorée et nous émettons l'hypothèse que cette protéine participe à la régulation qui contrôlent l'activité des neurones secrétant l'ocytocine et la vasopressine. Ces dernières sont notamment essentielles à la régulation de fonctions vitales telles que le contrôle de la balance hydrique et la lactation. Nous proposons donc d'étudier si les mécanismes moléculaires qui participent au contrôle ces fonctions. Dans ce projet, nous analyserons les conséquences de la délétion de cette protéine sur : (1) La morphologie des astrocytes, l'activité des astrocytes et l'impact sur l'activité des neurones à ocytocine et à vasopressine. (2) La sécrétion d'ocytocine et de vasopressine au niveau de l'hypothalamus. (3) Le comportement maternel et le contrôle de la balance hydrominérale.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre par quels mécanismes l'ocytocine et la vasopressine sont libérées par l'hypothalamus et l'hypophyse. Comprendre comment ces hormones sont sécrétées permettra de développer de de nouvelles approches pour stimuler la sécrétion endogène de ces hormones dont nous savons qu'elles sont altérées dans certaines pathologies neurodévelopementales.
Procédures
Une perfusion intracardiaque sous anesthésie sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. La durée de cette procédure est de 30 minutes. Des souris seront sujettes à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour analyser les variations cérébrales d'ocytocine et de vasopressine. La durée de cette procédure est d'une heure. Des souris seront également sujettes à une intervention chirurgicale d'une durée d'une heure visant à l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie afin de pouvoir mesurer l'ocytocine et la vasopressine plasmatique. Certain animaux subiront des tests comportementaux de modulation de la prise de boisson par courte privation et des tests d'évaluation du comportement maternel.
Impact sur les animaux
La contention ainsi que l’injection d’analgésique et d’anesthésique peuvent engendrer un stress chez l’animal. Certains animaux seront soumis à une chirurgie sous-anesthésie avec réveil qui peut engendrer une douleur post-opératoire modérée de quelques heures. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations comportementales (prise de boisson, comportement maternel) sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur, cependant, les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux subiront des test comportementaux qui n'induisent pas de nuisance pour l'animal. La perfusion et la ponction cardiaque sont effectués sous anesthésie profonde et terminale de l'animal, sans réveil.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont mis à mort pour l'analyses de paramètres physiologiques ex vivo.
Remplacement
Le but du projet est de comprendre le rôle d'une protéine exprimée dans les astrocytes. Cette protéine interviendrait dans les interactions entre les neurones et les astrocytes pour la régulation de la sécrétion de l'ocytocine et de la vasopressine qui regissent de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales. Dans ce contexte il est necessaire d'utiliser des animaux et un tissu nerveux intact afin de comprendre les mécanismes qui régulent les fonctions physiologiques et comportementales liés à ces neuropeptides hypothalamiques. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous utilisons le nombre de souris total strictement nécessaire pour chacune des stratégies. Ceci correspond à notre expérience dans le domaine pour assurer la validité statistique des résultats.
Raffinement
Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et postopératoire. Les jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animal), et recevront si besoin un analgésique par voie orale ou en injection sous-cutanée. Une grille de score pour évaluer le bien être des souris sera utilisée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standadisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris (délétion des protéines lysosomales). Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois. A ce stade les animaux ont un cerveau qui a fini son développement et les animaux présentent un comportement d’adulte. D’autre part utiliser des souris à partir de cet âge de 2 mois, permet également de pouvoir comparer nos résultats avec la tranche d'âge pour laquelle la plupart des expériences précédentes ont été conduites.
Etude transcriptionnelle des stades de la spermatogenèse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Anesthésiées à dose létale puis perfusées avec un fixateur pendant une dizaine de minutes, 120 souris mâles sont tuées sans reprendre conscience. Quatre y passent chaque jour pendant quinze jours, sur deux lignées mutantes, pour que leurs testicules soient prélevés à des stades précis de la production de spermatozoïdes. Le travail compare l'expression des gènes entre ces mutants et des souris normales déjà utilisées dans un autre projet, avec en perspective l'infertilité masculine et une contraception masculine non chirurgicale. Le porteur affirme que seule une approche impliquant des animaux permet de répondre à ces questions et que le remplacement par des lignées cellulaires est impossible.
Objectifs
La spermatogenèse est le processus par lequel les spermatozoïdes sont produits à partir des spermatogonies (cellules souches des spermatozoides), des cellules souches situées dans les testicules. Ce processus se déroule dans de petits tubes appelés tubes séminifères, à l’intérieur des testicules. Chez la souris, un cycle complet de spermatogenèse dure 35 jours et comprend 12 étapes successives. Dans un testicule normal de souris sauvage, ces étapes se répètent de manière aléatoire tous les 8 jours environ, ce qui permet aux 12 étapes d’être présentes simultanément dans le testicule. Dans le cadre de ce projet, nous travaillons sur des souris mutantes où la spermatogenèse est naturellement synchronisée. Cela signifie que, contrairement aux souris sauvages, seules 1 à 3 étapes du cycle sont présentes simultanément dans les testicules, sans avoir recours à des interventions chimiques. Nous utilisons deux lignées mutantes provenant d’un fond génétique mixte. La première lignée présente des cellules de Sertoli qui ont perdu leur récepteur de l’acide rétinoïque alpha (RARA). La seconde lignée a été modifiée par mutagenèse pour altérer un site de fixation sur RARA, empêchant ainsi son interaction avec les protéines qui permettent d'empecher la répression des gènes. Les testicules de ces mutants seront utilisés pour analyser l'expression des gènes à chaque étape du cycle de la spermatogenèse, en lien avec les mécanismes régulés par l’acide rétinoïque.
Bénéfices attendus
Dans la mesure où la spermatogenèse suit des mécanismes conservés entre la souris et l’Homme, les découvertes réalisées dans ce projet sont pertinentes pour la compréhension de la fertilité humaine. En comparant les profils d’expression génique des souris mutants avec ceux des souris de type sauvage dont nous disposons déjà dans un autre projet réalisé ultérieurement, nous pourrons identifier les gènes essentiels à la différenciation des cellules germinales. Ces résultats fourniront des pistes pour mieux comprendre certaines causes d’infertilité masculine, en augmentation constante dans le monde. De plus, l’étude des mécanismes régissant la signalisation de l’acide rétinoïque pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de contraception masculine non chirurgicale. Mais aussi, l’acide rétinoïque, régulateur clé de la différenciation cellulaire et de l’expression génique, joue un rôle essentiel dans la spermatogenèse, la folliculogenèse et le maintien de la fertilité. Comprendre sa voie de signalisation pourrait offrir de nouvelles perspectives face à la baisse de la fertilité et de la fécondité observées aujourd’hui.
Procédures
Trente minutes avant l'anesthésie, une injection d’analgésique est administrée (en quelques secondes) pour prendre en charge la douleur. Ensuite, une anesthésie et analgésie à dose létale sont réalisées (en quelques secondes) en vue de la perfusion d'un fixateur histologique lors de l'étape finale de la mise à mort. Cette procédure est effectuée sur des souris âgées de 10 à 12 semaines. Les souris sont placées sous anesthésie générale profonde en moins de cinq minutes. La perfusion, qui dure environ dix minutes, conduit à la mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude ne présentent aucun phénotype dommageable lié à leur génotype, et leur développement est normal. La procédure est réalisée sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de garantir l'absence de douleur ou de souffrance. L'anesthésie peut induire un stress et une hypothermie. Les contentions et injections, peuvent entraîner une gêne passagère chez l’animal, cependant des mesures d’analgésie et d’anesthésie sont systématiquement mises en place pour assurer le confort et l’absence de douleur ou de conscience pendant la procédure.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'organes.
Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules qui soutiennent la fonction des testicules et celles qui produisent les spermatozoïdes sont essentielles pour garantir une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le profil d’expression des gènes impliqués dans la spermatogenèse dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont dérégulées chez des mutants. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par des lignées cellulaires (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Dans ce projet, nous utilisons uniquement des souris mâles, car nous étudions la production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse. Ce processus dure 35 jours et se divise en 12 étapes successives. Chez les souris normales, ces étapes coexistent en même temps dans les testicules. Mais chez les souris mutants, seuls 3 à 4 stades sont présents simultanément. Pour analyser toutes les étapes, nous réalisons des prélèvements quotidiens pendant 15 jours, entre les jours 70 et 84 après la naissance. Chaque jour, 4 souris sont utilisées pour garantir la fiabilité des résultats, en prenant en compte les pertes naturelles possibles (comme l'abandon maternel ou le cannibalisme). En tout, nous utilisons 60 souris par lignée, pour un total de 120 souris, le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Cependant, dès que nous obtenons 3 souris montrant les stades nécessaires, le projet est arrêté pour éviter l’utilisation excessive d’animaux.
Raffinement
Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Les mâles sont gardés en groupe de mâles familiers et stables. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal, comme cela est fait dans toutes les cages. Nous surveillons régulièrement le bien-être et l’état de santé des animaux et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment l'administration d'analgésiques qui se fera en cas d’observation de signes de douleur. Toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et la douleur est prise en charge par l'administration d'analgésiques. De plus, des points limites adaptés sont définis pour chaque animal, de manière à assurer qu’aucune souffrance prolongée ne soit tolérée et que des interventions soient effectuées avant que ces seuils ne soient atteints. Ces points limites servent de guide pour l’arrêt de l’expérience ou la prise en charge d’une situation d’urgence.
Choix des espèces
Notre étude cherche à comprendre comment certains gènes fonctionnent mal dans un modèle de souris mutante pendant la production des spermatozoïdes. Nous nous intéressons particulièrement aux interactions entre les différentes cellules des testicules et à l’impact de certaines molécules sur ce processus dans tout l’organisme. Les souris sont choisies pour cette étude car elles partagent 99 % de leur ADN avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires dans les testicules de souris sont similaires à ceux des humains. Nous prélevons les testicules des souris mâles entre 70 et 84 jours après leur naissance. Cela permet d’observer les étapes de la production des spermatozoïdes de manière précise, car prélever plus tôt ne permettrait pas de voir un développement testiculaire suffisant, et attendre plus longtemps pourrait entraîner un blocage de la production. Un cycle complet de production des spermatozoïdes dure environ 35 jours et se divise en 12 étapes. Pendant les 15 jours de notre étude, deux nouvelles vagues de production de spermatozoïdes commencent, mais cela ne correspond pas à deux cycles complets. Chez les souris mutantes, plutôt que d’avoir les 12 étapes présentes en même temps comme chez les souris normales, seules 3 à 4 étapes apparaissent à la fois. En prélevant les souris mutantes chaque jour pendant ces 15 jours, nous pouvons couvrir toutes les étapes du cycle de la production de spermatozoïdes.
Le rôle de l’intégrine dans l’hypercoagulabilité de l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des rats de quatre semaines, pesant une centaine de grammes, reçoivent un traitement qui leur provoque une hypertension des artères pulmonaires. 176 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Chacun subit deux échographies cardiaques sous anesthésie et une injection intrapéritonéale par jour pendant deux à trois semaines, certains recevant en plus une minipompe posée chirurgicalement. Le porteur invoque un "besoin médical critique" et des options thérapeutiques limitées, quand le projet consiste à tester chez le rat des inhibiteurs d'une protéine repérée en culture cellulaire.
Objectifs
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par un rétrécissement des petites artères pulmonaires, entraînant une augmentation de la pression artérielle dans la circulation pulmonaire. Dans ce projet, nous allons tester de nouveaux médicaments susceptibles de ralentir ou corriger les anomalies à l’origine de cette maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles expérimentaux chez le rat qui reproduisent les principales caractéristiques de l’HTAP humaine. L’objectif est de mieux comprendre comment la maladie se développe et d’identifier les mécanismes biologiques sur lesquels les traitements agissent. Cela permettra d’envisager, à terme, de nouvelles approches pour soigner les patients atteints d’HTAP.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical critique en explorant de nouvelles approches thérapeutiques pour l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), une pathologie grave et complexe pour laquelle les options actuelles sont limitées. Avancées thérapeutiques : L’étude permettra d’évaluer si l’intégrine αvβ3 constitue une cible thérapeutique pertinente pour l’HTAP. L’efficacité des inhibiteurs de αvβ3 sera testée afin de déterminer leur impact sur la réduction du remodelage vasculaire pulmonaire et l’amélioration des paramètres hémodynamiques. Compréhension des mécanismes : Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs de αvβ3. En particulier, ils permettront d’analyser leur effet sur la prolifération cellulaire, l’inflammation et la dysfonction endothéliale associées à l’HTAP. Impacts translationnels : Ce projet fournira une base scientifique solide pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’intégrine αvβ3 dans le traitement de l’HTAP. Les résultats obtenus pourraient également ouvrir des perspectives pour élargir l’utilisation de ces inhibiteurs à d’autres pathologies impliquant des mécanismes similaires. En se focalisant sur les mécanismes fondamentaux de l’HTAP, ce projet pourrait non seulement améliorer les résultats cliniques des patients, mais aussi contribuer à l’élargissement des connaissances sur cette maladie. Ces bénéfices attendus représentent une avancée importante vers des traitements plus ciblés et efficaces.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales. Deux échographies cardiaques non invasives seront réalisées sous anesthésie générale légère, chacune durant environ cinq minutes. Ces examens permettront de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’effet des traitements. Un sous-groupe d’animaux subira une courte chirurgie (environ 15 minutes) sous anesthésie générale pour l’implantation d’une minipompe osmotique permettant l’administration continue d’un traitement. Les animaux seront surveillés durant la phase de réveil post-opératoire. Chaque animal recevra une injection sous-cutanée unique en début de protocole, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 2 ou 3 semaines selon la procédure suivie (à l’exception des animaux porteurs de minipompe). Chaque injection est réalisée sous anesthésie locale et dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Les traitements administrés ont déjà été testés et présentent un bon profil de sécurité, avec une toxicité minimale. Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles d’hypertension pulmonaire peuvent provoquer une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie, garantissant l'absence de souffrance. Des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire. Le traitement par des inhibiteurs ciblant cette intégrine a montré une réduction significative de la prolifération des cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire (CML-AP) induite par le Facteur de von Willebrand (vWF). Ces résultats suggèrent un rôle crucial de l’axe vWF/LRP4/αvβ3 dans la prolifération cellulaire associée à l’HTAP. Toutefois, pour valider l’impact de cette inhibition sur le remodelage vasculaire pulmonaire dans un contexte physiologique intégré, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire. Les modèles SuHx et MCT d’hypertension pulmonaire ont été choisis pour leur aptitude à reproduire les altérations pathologiques observées chez l’Homme, notamment le remodelage vasculaire, la prolifération des CML-AP et l’élévation de la pression artérielle pulmonaire. Ces modèles permettent d’induire ces modifications et constitue une approche préclinique pertinente pour tester l’efficacité de traitements. Ces modèles expérimentaux offrent une plateforme robuste pour évaluer les effets des traitements sur la progression de la maladie, mesurer la réduction du remodelage vasculaire et déterminer les implications thérapeutiques potentielles. L’étude des interactions entre les voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs d'intégrine fournira également des informations essentielles sur les mécanismes sous-jacents de cette approche thérapeutique.
Réduction
Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur l’hypertension pulmonaire. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l’évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres retenus pour évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de cibler les analyses sur des mesures précises et pertinentes, limitant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux témoins utilisés dans cette étude seront, lorsque cela est possible, réutilisés pour des analyses complémentaires afin d’optimiser leur usage et éviter l’expérimentation supplémentaire sur de nouveaux individus. Egalement, nous avons inclut dans la procédure 1 une étude pilote afin de déterminer le meilleur candidat médicament pour poursuivre le reste de l'étude avec une seule molécule. Cette stratégie vise à maximiser l’exploitation des données obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. Par ailleurs, les résultats issus de ces expérimentations pourront être valorisés dans le cadre d’autres recherches sur l’HTAP et les mécanismes moléculaires associés, garantissant ainsi une utilisation optimale des ressources animales disponibles
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards et bien établis pour l’étude des maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension pulmonaire. Des rats âgés de 4 semaines et pesant environ 100 grammes seront utilisés, conformément aux standards expérimentaux des modèles validés d’hypertension pulmonaire. Cet âge est requis pour assurer l’induction efficace et reproductible de la maladie dans les protocoles utilisés, tout en permettant une comparaison directe avec les données existantes dans la littérature préclinique. Ce choix permet également d’optimiser la transposabilité des résultats vers des approches translationnelles ultérieures.
Imagerie fonctionnelle de la réponse thérapeutique dans l’arthrose -site 2/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris arrivent déjà opérées, la déstabilisation du ménisque qui provoque leur arthrose étant réalisée par le fournisseur avant leur réception et une semaine d'acclimatation. 80 souris sont utilisées, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la douleur articulaire apparaissant vers la douzième semaine et durant jusqu'à la vingt-quatrième. Trois séances d'imagerie sur 24 semaines suivent l'injection d'un traceur radioactif dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis jusqu'à quarante minutes sous anesthésie. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, leurs articulations devant être prélevées pour analyse.
Objectifs
L’arthrose a un impact majeur sur la qualité de vie des patients et se caractérise par une dégradation progressive des articulations, se traduisant par des douleurs et une limitation fonctionnelle, atteignant l’ensemble des structures de l’articulation, dont le cartilage. Les progrès menés dans la compréhension de l’arthrose ont permis d’identifier des cibles thérapeutiques prometteuses, avec l’émergence de nouvelles molécules visant à prévenir ou à ralentir la progression de la maladie. Malgré d’extensives recherches, aucune approche pharmacologique n’a à ce jour démontré d’efficacité. Les agences règlementaires ont approuvé comme seul critère d’évaluation de l’efficacité des nouvelles molécules le temps écoulé avant le remplacement total de l’articulation en chirurgie. Les auteurs dans ce domaine considèrent que le développement de molécules est limité par le manque d’outils d’imagerie sensibles et spécifiques permettant la quantification réelle de la progression de l’arthrose et l’évaluation de la réponse thérapeutique. Dans ce contexte, ce projet propose une nouvelle approche de ciblage du cartilage par imagerie moléculaire, qui permettra d’aboutir à une méthode innovante, non invasive, d’imagerie fonctionnelle des articulations se basant sur l’utilisation d’un traceur radioactif ciblant le cartilage pour l’exploration en médecine nucléaire. Sur la base de nombreuses études précliniques, notre traceur est un sérieux candidat pour une imagerie sensible et fonctionnelle du cartilage : sa sensibilité et sa spécificité permettront de quantifier des critères fonctionnels au niveau du cartilage, permettant ainsi à la fois une évaluation des signes précoces de la pathologie et de l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques. Afin de démontrer cette hypothèse, notre projet a été soumis avec succès à l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR). Ces expériences seront réalisées dans le respect de la règle des 3R (Remplacer, Réduire et Raffiner), utilisant des conditions de stabulation, de bien-être animal et un nombre de souris optimisés. Une observation journalière des animaux est assurée par la personne chargée de l’expérimentation. Cette observation consiste à vérifier l’état et le comportement général des souris. Lors des procédures expérimentales, les souris seront placées sous anesthésie générale afin d'éliminer toute douleur potentielle et de réduire l'angoisse générée par la manipulation. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de juger de la pertinence de stratégies thérapeutiques ciblant le cartilage dans la prise en charge de l’arthrose.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet multisites seront soumis à différents types d’intervention sur 2 sites différents : - Site 1/2 : chirurgie DMM et traitements par injection intra-articulaire sous anesthésie générale. Ces interventions ont fait l’objet d’une autorisation de projet. Dans ce modèle d’arthrose, la douleur due à la dégradation de l’articulation n’apparait qu’après 12 semaines après l’opération (baisse significative de la distribution du poids sur les pattes arrière chez les souris opérées, par rapport à des souris non opérées. Pour cette raison, la procédure 1, qui va au-delà des 12 semaines, est de classe sévère (douleur modérée, mais qui perdure). - Transport du site 1/2 vers le site 2/2. - Site 2/2 : les souris subiront des procédures d’imagerie, ce qui implique une injection intraveineuse (veine de la queue) sur animal vigil, puis une anesthésie générale maintenue pendant l’acquisition des images (jusqu’à 40 minutes). L’imagerie aura lieu 3 fois au total sur 24 semaines pour la procédure 1.
Impact sur les animaux
Dans notre modèle d’arthrose, la douleur due à la dégradation de l’articulation n’apparaît qu’à partir de 12 semaines après l’opération (baisse significative de la distribution du poids sur les pattes arrière chez les souris opérées, par rapport à des souris non opérées. Cette douleur est modérée mais de longue durée.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, les articulations devant être prélevées pour analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
L’arthrose est une pathologie complexe multifactorielle et qui touche tous les tissus de l’articulation, principalement le cartilage, l’os sous-chondral et la membrane synoviale. Notre projet se concentre sur les interactions entre le cartilage et l’os sous-chondrale et en particulier sur le remodelage de la jonction ostéochondrale. Certains aspects de ces interactions peuvent être mimés par des cocultures entre les chondrocytes, les ostéoblastes et les cellules endothéliales ou bien par transfert de milieux de culture d’un type cellulaire sur un autre type cellulaire. Dans une vision plus intégrée de la maladie et dans un souci de comprendre son développement et sa progression, aucun modèle cellulaire ou moléculaire actuel ne peut remplacer l’approche in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en garantissant des résultats exploitables sur le plan statistique. De plus, l’utilisation de l’imagerie permet de suivre un même groupe d’animaux au fil du temps, chaque groupe étant ainsi son propre contrôle. L’approche par imagerie que nous souhaitons évaluer permet de considérablement réduire le nombre total d’animaux nécessaire.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliquées si besoin. Lors des procédures (EU 1/2: chirurgie, traitements ; EU 2/2 : imagerie), les animaux seront placés sous anesthésie générale. Concernant le transport des animaux entre l’EU 1/2 et l’EU 2/2, un examen clinique sera effectué afin de s’assurer de leur bon état de santé. Les souris seront transportées dans des cages autoclavables bien ventilées, équipées d’une trappe de contrôle visuel, et des gels hydro seront ajoutés pour garantir leur hydratation pendant le trajet. Le nombre d’animaux par cage est limité pour minimiser le stress, avec la mise en place de séparateurs si nécessaire.
Choix des espèces
L’utilisation de modèles murins permet d’intégrer les paramètres d’un organisme entier, ce que qui ne peut être abordé in vitro par des cultures cellulaires. Le modèle d’arthrose induite DMM est développé chez la souris C57Bl/6j WT. Le développement de l’arthrose spontanée a également été observé chez ces souris. Description du modèle d’arthrose par déstabilisation du ménisque médian (DMM) : Le modèle DMM consiste à déstabiliser le ménisque médian par la transsection du ligament méniscotibial médian. Cette déstabilisation engendre une arthrose post-traumatique qui est visible dès 4 semaines post-chirurgie. Les souris développent des lésions cartilagineuses et osseuses sans inflammation de la membrane synoviale. Les études in vivo se feront avec des souris mâles adultes. Le modèle DMM est réalisé par notre fournisseur chez des souris C57BL/6j WT âgée de 12 semaines, matures sur le plan squelettique. Les animaux seront ensuite réceptionnés par notre animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 7 et 24 semaines post-chirurgie.
Prévention de la dermatite atopique par un émollient trilipidique enrichi en oligosaccharide du lait maternel (2’-FL).
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont anesthésiés puis rasés à deux semaines, reçoivent une application quotidienne sur le dos pendant quatorze à vingt-cinq jours, portent ensuite un patch occlusif deux semaines et sont isolés vingt minutes pour la récolte de leurs fèces. Une dermatite atopique est déclenchée à quatre semaines, avec démangeaisons, rougeurs, œdème et excoriations, et les gavages peuvent enflammer l'œsophage. Le produit testé est un émollient enrichi en sucre du lait maternel, dont le porteur espère qu'il ouvrira la voie à un essai clinique, alors que les essais menés chez des nourrissons ont déjà montré que les émollients trilipidiques ne préviennent pas la maladie.
Objectifs
La dermatite atopique (DA) est une allergie, touchant 10 à 15 % des enfants en Europe. Elle est associée à une barrière et un microbiote cutanés altérés et à un dysfonctionnement du système immunitaire.70 % des enfants guérissent naturellement et 30 % souffrent de symptômes persistants avec un risque accru d’autres allergies (asthme, rhinite ou allergies alimentaires :marche atopique). Il n’existe pas de stratégies préventives efficaces pour la DA. Plusieurs essais cliniques ont appliqué des émollients ou des huiles végétales sur la peau des bébés pour renforcer la barrière cutanée afin de limiter l'interaction entre les allergènes et le système immunitaire de la peau. Ils ont observé que les émollients trilipides ne prévenait pas la DA mais améliorait l'intégrité de la barrière cutanée en réduisant la perte d'eau transépidermique (TEWL). À l'inverse, les huiles végétales entravent la formation de structures lipidiques lamellaires dans la barrière et favorisent le développement de l'allergie alimentaire. Même si les émollients renforcent la barrière cutanée, cette approche seule semble insuffisante pour prévenir la DA. Les stratégies thérapeutiques qui ciblent la barrière cutanée, mais aussi le microbiote et le système immunitaire pourraient offrir des approches plus efficaces pour prévenir la DA. Certains sucres du lait maternel (oligosaccharides), peuvent moduler le microbiote intestinal en favorisant l'émergence de bactéries bénéfiques et en réduisant l'abondance des bactéries nocives. Ils peuvent renforcer la barrière intestinale et induire un environnement immunitaire tolérogène. Nous avons démontré chez la souris gestante, l’efficacité d’une supplémentation anténatale avec un sucre du lait maternel sur abrogation complète des symptômes de l'allergie alimentaire chez les petits. Nous disposons également de données préliminaires sur des modèles de culture peau humaine, montrant que l'exposition à un sucre du lait maternel sur des cellules de peau humaine dans des conditions inflammatoires renforce l'expression de l'involucrine (une protéine de la barrière cutanée réduite chez les patients atteints de DA)et de la substance P (ayant des fonctions anti-inflammatoires et de réparation des tissus). Notre hypothèse est que l'ajout de sucres du lait maternel aux émollients pourrait constituer une stratégie efficace pour cibler le microbiote cutané, le système immunitaire et la barrière cutanée et, par conséquent, pour prévenir l'apparition de la DA.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de valider une nouvelle stratégie thérapeutique préventive visant à prévenir l'apparition de la DA à un stade précoce par une intervention cutanée. A l'heure actuelle, il n'existe pas de stratégie préventive efficace pour la DA. L'approche ambitieuse du projet se concentre sur une méthode thérapeutique externe non invasive, facile à utiliser et sûre. Ce projet permettra également de comprendre la physiopathologie de la DA, lors de sa mise en place et de sa prévention. Nous focaliserons principalement notre recherche sur les 3 grands systèmes biologiques dysfonctionnels dans l’allergie : le microbiote (cutané et intestinal), le système immunitaire et les barrières (cutanées et intestinales). Valider cette stratégie chez la souris permettra d’ouvrir la voie à un futur essai clinique.
Procédures
- procédure 1 =souriceaux : anesthésie (15 minutes), rasage (5 minutes) et application journalière d’un traitement topique dorsale (5 minutes) pendant 14 jours puis d’un patch occlusif (5 minutes) pendant 14 jours, isolement pour la récolte des fèces (20 minutes). - procédure 2 = idem procédure 1 + gavage oral (2 minutes). - Procédure 3 : = souriceaux : anesthésie (15 minutes), rasage (5 minutes) et application journalière d’un traitement topique dorsale (5 minutes) pendant 25 jours, isolement pour la récolte des fèces (20 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la gêne liée la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages, les symptômes liés à la mise en place de la DA (prurit, érythème, œdème et excoriations), les anesthésies gazeuses peuvent induire une hypothermie, une hypotension, une hypoventilation ou une hypoxémie, les gavages oraux peuvent induire une inflammation de l’œsophage, l’isolement pour la récolte des fèces ainsi que la prise de poids répétée des mères gestantes peuvent induire un stress.
Devenir
Les animaux seront tous mis a morts à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de la DA ou de l’allergie alimentaire et ainsi valider nos modèles.
Remplacement
Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique (DA), il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum et calculé pour être statistiquement pertinent pour la mesure du score clinique mais aussi avoir assez de matériel biologique pour effectuer non seulement des coupes histologiques mais aussi les mesures des biomarqueurs immuns de la DA dans la peau et dans le sérum. De plus, en effectuant un test de puissance, il nous faut au moins 12 animaux dans chaque groupe pour observer des effets statistiques au niveau du microbiote et du système immunitaire.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Cependant, si nous observons que les souris enlèvent le patch des autres souris présentes dans la cage, alors elles seront séparées et hébergées à 1 souris par cage pour ne pas fausser les résultats du protocole mais aussi pour éviter les risques de blessures et d’ingestion de plastique et de l’allergène.
Choix des espèces
Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique (DA) en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la DA, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris sensibilisées avec des allergènes spécifiques permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Les souris BALB/cJRj femelles reproductrices seront âgées de 6 semaines et les mâles reproducteurs seront âgées de 10 semaines car c’est à ces âges là que nous avons observé la meilleure efficacité de reproduction. L’application topic des émollients se fera chez le souriceau de 2 semaines pour reproduire les applications topics d’émollients chez les bébés dès le plus jeune âge. La DA sera induite chez les souriceaux âgés de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la DA chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie.
Les mécanismes cellulaires impliqués dans le stockage des souvenirs (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cinq semaines d'hébergement individuel pour 125 souris porteuses d'une prothèse fixée sur le crâne : 483 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une ou deux chirurgies cérébrales sous anesthésie, 45 d'entre eux reçoivent quatorze injections en une semaine, et 150 sont conduits vers un second établissement pour y être anesthésiés puis tués, leurs tissus servant à des expériences sur cerveau prélevé. L'objet du travail est de comprendre comment les neurones stockent les souvenirs et par quels mécanismes ils s'effacent. Le porteur reconnaît que l'isolement empêche les souris d'exprimer leur comportement social et qualifie la tâche de mémoire de "légèrement aversive", sans dire ce qu'elle leur inflige.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le stockage de la mémoire à court et à long terme au sein du cerveau des rongeurs. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs, qui ont révélé que certaines propriétés des neurones se modifient suite à une expérience ou une tâche comportementale. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs moléculaires et les processus cellulaires responsables des changements observés. Pour les raisons techniques, le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2
Bénéfices attendus
Notre projet aborde des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de la formation de la mémoire. Grâce à la combinaison d'approches utilisées, le projet permettra : i) une meilleure compréhension du rôle du cerveau dans le stockage de la mémoire, ii) l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l'oubli.
Procédures
Tous animaux subissent à une ou deux intervention(s) chirurgicale(s) (chacun d'une durée < 60 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Certains animaux (125) subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement de ces animaux. 125 animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Ces mêmes animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 15 minutes. Tous les animaux sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportemental se compose de deux séances, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque séance dure 6 à 7 minutes). Certains animaux (45) reçoivent également des injections bi-quotidiennes pendant 7 jours (14 injections en totale). Toutes ces interventions sont réalisées au sein de l' EU1. Certains animaux (150) seront transportés (trajet à pied de 5 minutes) vers une zone annexe de l'EU 2, où ils seront profondément anesthésiés, puis euthanasiés. Leurs tissus seront ensuite utilisés pour des expériences physiologiques aiguës.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces interventions incluent un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Ce projet comprends également un test comportemental légèrement aversif. Ce test comportemental peut être stressant pour les souris. Les injections répétées peuvent également être une source d'inconfort. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 5 semaines. Cela représente un stress, car ils ne peuvent pas exprimer leur comportement social naturel.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet se concentre sur l'étude des mécanismes sous-jacents à la formation et au stockage de la mémoire dans le cerveau. Il comprend les tests comportementaux. Pour mener à bien cette étude, nous avons besoin d'un modèle qui soit : i) complexe et intact, ii) modifiable génétiquement, iii) doté de la structure cérébrale ciblée, et iv) adapté aux approches comportementales complexes et les tests invasifs.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons estimé le nombre nécessaire pour obtenir une signification statistique en nous basant sur des études antérieures et des recherches bibliographiques. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal d'animaux requis pour atteindre les objectifs de l'étude. Pour ce faire, nous avons prévu une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce des données (c'est-à-dire, analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cette approche nous permettra d'ajuster la taille de l'échantillon en fonction des résultats préliminaires et de détecter rapidement tout problème potentiel avec la procédure, afin de modifier notre approche pour les lots suivants si nécessaire. En ce qui concerne l'approche statistique, nous appliquerons les tests appropriés en fonction des caractéristiques de nos données.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne : Les animaux seront surveillés chaque jour pour assurer leur bien-être général. ii) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse (par exemple : état prostré, pelage non toiletté, griffures, etc.). Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures conservatoires (isolement temporaire, administration de glucose, réchauffement en couveuse, soins des blessures, etc.). Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur décidera de l'euthanasie de l'animal, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des zootechniciens si nécessaire. iv) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. v) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. vi) Intégration des techniques de raffinement : Nous intégrerons régulièrement de nouvelles techniques de raffinement en formant les expérimentateurs et en consultant des ressources éducatives visant à renforcer le respect des principes de raffinement. vii) Conditions d’hébergement : Les animaux seront maintenus dans des cages collectives avec un enrichissement comprenant des tubes en carton et du matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris pour les raisons techniques liées à la réalisation du projet. Actuellement, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés tant au niveau comportemental que moléculaire. Les protocoles comportementaux décrits dans ce projet sont déjà validéspour ce modèle. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser de souris plus âgées en raison de l'effet du vieillissement sur la formation de la mémoire. De plus, les souris de moins de 6 semaines (avec un cerveau en développement) peuvent avoir des mécanismes différents sous-jacents à la formation de la mémoire et sont également sujettes à un oubli plus rapide.
Test et quantification de l’effet anticonvulsivant de dispositifs (électroniques) prototypes de neuromodulation chez le rat épileptique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une crise d'épilepsie déclenchée volontairement, 39 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et sont tués dans les cinq minutes qui suivent. La crise dure une seconde et demie, l'animal étant maintenu dans les mains de l'expérimentateur pendant qu'elle survient, après deux heures de chirurgie sous anesthésie et trente minutes d'enregistrement électrique. Tout cela sert à mesurer si des prototypes électroniques délivrant un faible courant bloquent la crise, première étape annoncée vers un dispositif destiné aux personnes épileptiques en impasse thérapeutique. Des simulations numériques ont servi aux premières phases de développement, le porteur concluant qu'elles ne permettent pas d'évaluer l'effet recherché et écartant les modèles in vitro.
Objectifs
Le projet vise à étudier la capacité antiépileptique de dispositifs injectant de faibles quantités de courant électrique sur des rats épileptiques. Ces dispositifs modifient l’activité du système nerveux grâce à une stimulation électrique contrôlée. L’objectif ultime de ces travaux est de développer un nouveau dispositif médical utilisable sur des patients épileptiques.
Bénéfices attendus
Le dispositif testé a pour vocation le développement d’un futur dispositif médical pour traiter des patients épileptiques. La première étape du développement de ce futur dispositif médical, décrite dans ce projet, vise à démontrer l’activité antiépileptique, en aigu, des dispositifs. En cas de succès, nous pourrons poursuivre le développement du dispositif médical. Sur le long terme, nous attendons un bénéfice pour les environ 30% de patients épileptiques en impasse thérapeutique, en leur proposant un dispositif supérieur aux thérapies actuelles. Sur le court terme, ce projet nous permettra d’affiner le protocole des futures procédures expérimentales. Ces dernières permettrons, outre le fait de permettre le développement d’un nouveau dispositif médical, de mieux comprendre le mécanisme d’action de ce type de thérapies modulant l’activité du système nerveux.
Procédures
1/ Chirurgie sous anesthésie et antidouleur (2h sur tous les animaux) : Douleurs légères ; 2/ Enregistrement de données à partir d’électrodes (30 min sur tous les animaux) : Stress léger ; 3 / Déclenchement d’une crise d’épilepsie (1,5 seconde, une seule fois sur tous les animaux) : douleur sévère.
Impact sur les animaux
1/ Douleurs légères liées à la chirurgie 2/ Stress et douleurs durant les procédures de déclenchement de crise d’épilepsie
Devenir
En raison du déclenchement de crises d’épilepsie, ces animaux sont rapidement euthanasiés à la fin du test (dans les 5 minutes). Lorsqu’une convulsion est observée, l’animal est euthanasié immédiatement.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas de tester nos dispositifs. Des simulations numériques ont été utilisées lors des premières phases de développement des dispositifs mais ne permettent pas de tester l’activité antiépileptique.
Réduction
Des simulations numériques ont été utilisées lors des premières phases de développement des dispositifs afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous comparerons nos résultats avec les données historiques du laboratoire qui remplaceront les groupes contrôles.
Raffinement
La douleur de la chirurgie est prise en compte en injectant un antidouleur avant de la démarrer. Les animaux sont euthanasiés rapidement après les tests de déclenchement de crise d’épilepsie pour éviter toute séquelle et douleurs. Les animaux sont maintenus dans les mains de l’expérimentateurs pendant la survenue des crises pour éviter toute chute et choc. Des points limites précoces (perte de poids, défaut d’alimentation ou d’abreuvement, attitude prostrée) seront appliqués pour éviter toute souffrance. En cas de dépassement de ces seuils, une euthanasie éthique sera pratiquée par exposition à une concentration croissante de CO₂.
Choix des espèces
Les rats et souris sont les modèles de référence pour le développement de nouvelles thérapies antiépileptiques, qu’elles soient médicamenteuses ou basées sur des dispositifs. Il n’est pas possible de s’affranchir de ces modèles pour observer l’effet antiépileptique de nos dispositifs. Concernant la souris, elle n’est pas répandue pour tester des dispositifs compte tenu de sa trop petite taille pour certaines chirurgie. Le rat est donc le modèle de choix aujourd’hui. En termes de stade de développement, nous utiliserons des rats de 200-300g, soit des rats adolescents ou jeunes adultes, afin de pouvoir comparer nos résultats avec des données historiques contrôles obtenues sur des rats de ce stade de développement. Il s’agit aussi du stade utilisé dans les études scientifiques avec lesquelles nous souhaitons comparer nos résultats. Enfin, nous avons besoin d’utiliser des rats suffisamment grand pour faciliter la chirurgie sans qu’ils ne soient trop âgés car ils développent du tissus adipeux, gênant pour la chirurgie, avec l’âge
Inhibition de la recombinaison homologue sur la progression tumorale chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et vit dans une animalerie séparée, avant d'être transportée vers celle où se déroulent les expériences. 1 404 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec greffe de cellules tumorales, quinze anesthésies générales et onze injections par animal. Le projet est déclaré deux fois, une fiche par établissement, chacune annonçant 1 404 souris pour tester un agent pharmacologique censé renforcer l'action antitumorale de certaines cellules immunitaires. Toutes sont tuées à la fin, pour permettre les prélèvements.
Objectifs
Ces dix dernières années, les traitements stimulant le système immunitaire (immunothérapies) ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant système immunitaire à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus dans des cellules en culture sont encourageants.
Procédures
Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : -15 anesthésies générales d’une durée de moins de 20 minutes -11 injections, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes
Impact sur les animaux
- douleurs légères : injections des cellules tumorales, injections des traitements. - Stress / anxiété : anesthésies gazeuses - croissance tumorale douloureuse (douleur modérée possible), transport entre 2 animaleries du même site.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences sur cultures cellulaires montrant un effet de la thérapie testée.
Réduction
Un suivi de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base d'une étude statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L'imagerie non invasive sous anesthésie générale sera utilisée pour suivre de la croissance tumorale. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix et de référence pour cette étude car le développement tumoral et de la réponse immunitaire sont très proches de celui de l'être humain. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).
Etudes du métabolisme et du comportement au cours du vieillissement de la souris (Etablissement utilisateur 1/2)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié soumise à un régime gras pendant dix-huit mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe 48 heures seul en cage de mesure de la dépense énergétique, subit sept pesées, une injection, un gavage et trois prélèvements, puis jusqu'à six tests évaluant l'anxiété, l'activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire et les capacités sensorimotrices. La faim liée à la mise à jeun, la peur pendant les manipulations et l'isolement figurent parmi les nuisances déclarées. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'animal entier" et retient la souris pour la facilité d'y invalider des gènes, les corps servant ensuite aux analyses histologiques.
Objectifs
Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladies du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Il étudie aussi l'impact du vieillissement biologique dans la survenue des pathologies avec l'âge et le déclin des fonctions physiques et cognitives. Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes au cours du vieillissement - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme (vieillissement biologique). Le projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira à une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ Dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques de protéines, notamment mitochondriales impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique, sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes du métabolisme lipidique et glucidique et de régulation de la fonction mitochondriale, et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, - Comprendre l'impact du vieillissement sur le fonctionnement des organes, 2/ Dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l’homme: - Identifier des voies de signalisation et cibles thérapeutiques du métabolisme énergétique et lipidique, visant au développement de futurs médicaments.
Procédures
Dans le premier établissement, la moitié des animaux (souris) seront mis sous régime gras pendant 18 mois. Ils subiront, des pesées (7 fois, 30 sec), une injection (5 sec), un gavage (30 sec) et des prélèvements à 3 reprises (5 sec à 3 min), une mesure de la composition corporelle en matières grasses à 3 reprises (4min) et une mesure de la dépense énergétique où l’animal est hébergé seul (1 fois pendant 48h). Dans le second établissement, ils subiront jusqu’à 6 tests de comportements (durée 6min à 30min) afin d'évaluer l'anxiété, l’activité exploratoire, la force musculaire, la mémoire, les capacités sensorimotrices, et les capacités physiques de l’animal.
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. Le changement de régime alimentaire peut induire un stress à l'animal. La faim est une nuisance pouvant survenir lors de la mise à jeun des animaux.La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, à l'occasion des prélèvements ou de leur isolement dans certaines procédures. La peur et le stress peuvent aussi survenir lors la découverte de nouveaux environnements, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant prélèvement. D'autres nuisances sont la douleur à l'injection, lors des prélèvements, ou à l'occasion de certains tests comportementaux.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort à des fins d’analyse et d’études histologiques.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques En parallèle,des tests de culture cellulaire sont à l'étude pour étudier des mécanismes précis et limiter le nombre d'animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est déterminé sur la base de nos études antérieures ou de la littérature correspondante. Dans ce contexte, le nombre d’animaux utilisé dans chaque groupe étudié sera suffisant pour réaliser les analyses statistiques. De plus, plusieurs données scientifiques pourront être obtenues avec un même animal ce qui réduira le nombre d'animaux dans le projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre : - les moyens pour limiter le stress aux animaux seront appliqués: avant les expériences, les animaux seront manipulés et habitués à l’expérimentateur afin de favoriser leur coopération dans les actes non invasifs et non douloureux. Ils seront acclimatés aux différentes conditions expérimentales (pièce, hébergement individuel, et différents expérimentateurs). Les expériences seront réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs. - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur. - des anesthésiques et analgésiques seront utilisés dans les procédures en terminal. Un transporteur agréé pour le transport d'animaux sera réquisitionné. La durée du transport entre les établissements utilisateurs n’excèdera pas les 30 minutes. Les animaux seront transportés dans leur cage d'origine (enrichissement compris) afin de limiter le stress lié au transport. Des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis, - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits, - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après les actes quand c'est nécessaire, - la mise en place de procédures de mise à mort quand c'est nécessaire.
Choix des espèces
La finalité du projet est d'identifier les effets de la mutation de protéines, notamment mitochondriales, impliquées dans la régulation du métabolisme énergétique et le vieillissement. Ainsi, il est indispensable de travailler sur l’animal entier pour comprendre le rôle de ces protéines. Le choix du modèle souris vient du fait que celui-ci offre de larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Il est possible, grâce à ce modèle, d’invalider l’expression des protéines étudiées dans ce projet, et ainsi d'évaluer leur rôle. Nous disposons de lignées murines transgéniques sur ces protéines pour réaliser notre projet. Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides et des glucides sur ce modèle animal. Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'athérosclérose et de la maladie du foie (inflammation et stéatose) sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour démarrer le régime dans les études portant sur l'étude du métabolisme ou de l'athérosclérose. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris et l'impact du régime alimentaire sur l'altération des fonctions au cours du vieillissement de l'animal. Dans les articles scientifiquement, le vieillissement chez la souris, est classiquement étudié chez des souris âgées de 12 à 18 mois.
Gestion partagée et harmonisée de la biodiversité marine transfrontalière par l’utilisation de la télémétrie acoustique
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 460
Sept minutes au maximum entre l'anesthésie, l'ouverture de l'abdomen pour y glisser un émetteur, le prélèvement d'un fragment de nageoire et la remise à l'eau : 490 poissons, dont 30 loups de mer, sont capturés à l'hameçon puis opérés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous relâchés là où ils ont été pris. Le suivi de leurs déplacements doit servir à harmoniser la gestion des aires marines protégées entre la France et l'Espagne. Les espèces retenues le sont pour le volume et la valeur commerciale de leur exploitation, et aucune n'est ciblée précisément, la liste couvrant jusqu'à 28 espèces possibles. Le chiffre de 490 marques ne repose sur aucun calcul, le porteur indiquant qu'aucune approche statistique n'a été réalisée et retenant 20 individus par espèce d'après la littérature.
Objectifs
Le littoral pyrénéen abrite une grande diversité d’espèces et d’habitats à forte valeur économique et patrimoniale. Pour préserver cette biodiversité et ses services écosystémiques (pêche, tourisme, loisirs), des réserves marines et des réglementations ont été mises en place. Cependant, ces mesures restent insuffisantes, car elles ne considèrent pas la région comme une unité écologique, ce qui entraîne la surexploitation de certaines espèces. Grâce à la télémétrie acoustique (technologie composée d’émetteurs acoustiques implantés dans le ventre des poissons après un acte chirurgical sous anesthésie, et d’un réseau de récepteurs acoustiques permettant de suivre le déplacement de ces poissons), le projet vise à améliorer la conservation en intégrant les habitats essentiels et en suivant les déplacements des poissons. L’étude inclura de nouveaux habitats (canyons sous-marins, estuaires, récifs artificiels) et le suivi d’espèces emblématiques comme les requins et les raies. Un diagnostic de l’état de conservation des espèces commerciales sera établi, avec une attention particulière aux stades critiques de leur cycle de vie (reproduction, juvéniles). Les poissons marqués et relâchés au plus vite après l’implantation de l’émetteur acoustique permettront d’identifier leurs déplacements et les corridors écologiques qu’ils empruntent. Ces données seront essentielles pour adapter les réglementations et les mesures de gestion à l’échelle régionale et transfrontalière.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’améliorer les connaissances sur le déplacement, la biologie et le comportement des populations de poissons. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et de mettre en place une conservation et une gestion harmonisée entre les Aires Marines Protégées de deux pays frontaliers.
Procédures
Chaque animal sera soumis à : 1) une capture par des pêcheurs professionnels affrétés pour cette opération (capture à la palangre dérivante de surface, capture à la canne et au leurre artificiel) avec utilisation d'hameçons sans ardillon pour limiter au maximum tout stress et/ou traumatisme (durée de capture et blessure), 2) un acte chirurgical sous anesthésie pour insérer un émetteur dans la cavité abdominale ou sur le dos du poisson, et 3) un prélèvement d'un petit fragment de nageoire caudale ou pectorale. L'implantation de la marque et le prélèvement du petit fragment de nageoire ne se fait qu'une seule fois par animal ; le temps maximum pour l'anesthésie, l'acte chirurgical, le prélèvement de nageoire, le réveil et le relâcher est estimé à 7 mn maximum.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus concernent : 1) un stress dû à la capture, minimisé au maximum par l'utilisation d'hameçon sans ardillon, 2) une douleur modérée due à l’implantation d'une marque (acte chirurgical sous anesthésie) dans la cavité abdominale du poisson (à son réveil) ainsi que le prélèvement d'un petit fragment de nageoire caudale qui peut générer une très légère nuisance supplémentaire pour le poisson mais n’impacte en rien ses capacités natatoires.
Devenir
Les individus prélevés sont relâchés à l’endroit où ils ont été capturés afin de limiter les perturbations comportementales. Tous les individus seront relâchés directement après l’acte chirurgical une fois correctement réveillés.
Remplacement
Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. L’apport de la télémétrie acoustique (détection de la présence de poissons marqués à proximité d’un récepteur) devrait permettre l’amélioration des connaissances sur les habitats occupés par les espèces et leurs mouvements, ce qui permettra à terme d’adapter leur gestion de manière cohérente entre la France et l’Espagne.
Réduction
Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En l’absence de connaissance sur le niveau de fréquentation spécifique du site ciblé par cette étude, le nombre de 20 individus par espèce a été choisi afin de capturer la majorité des comportements spatiaux à l’échelle d’une zone spécifique. Aucune approche statistique n’a été réalisée afin de définir le nombre d’individus marqués en raison de l’étendue de la zone d’étude (réseau régional à l’échelle de la façade Méditerranéenne France-Espagne) et de la forte mobilité spatiale des espèces concernées en zone hauturière. Mais, en se basant sur la biomasse de ces espèces pêchées en Méditerranée (plusieurs dizaines à centaines de tonnes débarquées par an), l’impact de ce projet sur les populations paraît extrêmement limité. Enfin, en prenant en compte les contraintes de la télémétrie acoustique (ex : probabilité de détection) et la littérature existante, un nombre minimum de 20 individus par espèce est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques associées aux populations concernées.
Raffinement
Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors du marquage, incluant la capture (utilisation d’un engin sélectif en direct, l’hameçon sans ardillon, pour limiter au maximum toute blessure et le temps où l’animal est en phase « capture »), ainsi que des procédures d’anesthésie optimales quand c’est possible (sinon utilisation de l’immobilité tonique et anesthésiant local – voir plus bas) durant les phases pré-opératoire, opératoire et post opératoire. Les individus seront surveillés en permanence de manière régulière avec une attention particulière à la respiration branchiale afin de s’assurer de la bonne oxygénation des animaux. Les individus seront retirés de la procédure dès que les points limites seront atteints. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies).
Choix des espèces
Le nombre d’espèces capturables sur la zone d’étude étant extrêmement varié, il est proposé dans cette étude de ne pas cibler d’espèces particulières, mais de (1) fournir une liste d’espèces potentielles, (2) limiter le nombre d’individus rentrant dans une procédure à N= 20 et (3) de limiter le nombre de marques déployées à N= 490, soit un équivalent de 28 espèces à N=20 ou N=10 individus par espèce si celle-ci est étudiée dans d’autres projets de télémétrie acoustique dans le Golfe du Lion. Les espèces de cette liste sont des espèces de premier plan en Méditerranée française, tant pour l'importance de leur exploitation (volume) que pour leur valeur commerciale (€). De nombreux aspects du cycle de vie de ces espèces restent inconnus, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires pour leur gestion. Pour la majorité de ces espèces, l’acquisition de connaissances sur leur dynamique spatiale est une première étape primordiale pour améliorer leur gestion. La maturité des poissons et des Élasmobranches marins (requins et raies) est très variable d’une espèce à l’autre et est déterminée généralement à partir de la taille. Afin de limiter l’impact sur la population et le choix du stade de développement (mature ou immature) de l’individu susceptible d’être choisi (nécessitant donc la capture, la mesure puis soit le relâcher, soit l’inclusion dans une procédure), des individus matures et immatures seront utilisés dans cette expérimentation. La taille de l’hameçon utilisé permettra juste de limiter la capture d’individus trop petits ou trop gros.
Imagerie cérébrale comme nouvel outil d’étude des troubles du spectre autistique chez le rat (EU 1/2) – Modification
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées quotidiennement avec un retardateur de flamme pendant les 42 jours de leur gestation et de leur allaitement, douze rates mettent bas des portées dont les ratons surnuméraires sont déplacés vers d'autres portées ou tués. Les jeunes passent ensuite quatre tests comportementaux, sensibilité sensorielle, activité et anxiété, interactions sociales et comportements répétitifs, destinés à repérer ceux qui présentent le phénotype autistique recherché. Les rats retenus subissent quatre séances d'imagerie cérébrale sous six anesthésies, pour mettre au point une mesure du métabolisme et de l'inflammation du cerveau. 148 rats sont utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 37 ayant été ajoutés après l'échec des premières gestations. Seuls 16 resteront en vie, réaffectés à d'autres projets ou "placés en retraite".
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet a pour objectif à court terme de valider une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin d’à plus long terme mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). L’EU1 sera en charge de la mise en place du modèle et l’EU2 de l’imagerie cérébrale. Un problème expérimental au cours du déroulement du projet nécessite l'ajout de 37 animaux par rapport à la demande initiale.
Bénéfices attendus
Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.
Procédures
Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids (EU1). Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie (EU1). Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point (EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA, d'une durée de quelques secondes, entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée (quelques secondes). Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (au nombre de 4, d'une durée de moins de 30 min chacun) entraine un stress physique mineur de courte de durée.
Devenir
Douze femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 120) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 16 rats (8 femelles et 8 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie. Les première femelles n’ont pas permis d’obtenir des descendants pour réaliser les analyses d’imagerie. Trois femelles gestantes ainsi que de leurs descendants, c’est-à-dire 30 jeunes, seront donc ajoutées à ce projet afin de pouvoir obtenir le nombre final d’animaux nécessaire pour l’imagerie. Par ailleurs, en raison du décalage dans la réalisation des tests, les animaux nécessaires au test de sociabilité ne correspondront plus à l'âge idéal pour réaliser ce test, nécessitant l'ajout de 4 rats adultes. Au final, en sus des 111 déjà demandés et approuvés, nous souhaiterions ajoutés 37 animaux, soit un nouveau total de 148 animaux.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.
Choix des espèces
Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.