Recherche fondamentale

315 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant des injections de tamoxifène dans la cavité abdominale dès l'âge de dix jours. Le porteur indique que ces injections précoces peuvent provoquer une douleur légère à modérée, un stress lié à la contention, et des effets sur le développement postnatal, la maturation hormonale et le métabolisme du foie. La mise à mort sert à découper le cervelet en coupes pour y mesurer l'activité cérébrale. Les cibles thérapeutiques évoquées pour l'Alzheimer et l'épilepsie restent au conditionnel, l'objet immédiat étant de cartographier les signaux calciques d'un type de cellule gliale, les astrocytes de Fañanas.

Objectifs

Nous cherchons à mieux comprendre le rôle de certaines cellules du cervelet, appelées astrocytes de Fañanas. Nous allons observer comment elles réagissent et communiquent avec leur environnement, en particulier avec les vaisseaux sanguins. Pour cela, nous utiliserons des souris et des techniques d’imagerie pour suivre leurs signaux en temps réel. Nous veillerons à limiter l’utilisation d’animaux autant que possible et à respecter les règles éthiques en vigueur.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules de Fañanas dans le cervelet, leur régulation des signaux calciques et leurs interactions avec d’autres cellules. En visualisant les dynamiques calciques, nous pouvons cartographier comment les informations sont traitées au niveau cellulaire. Nous utiliserons des techniques d’immunofluorescence pour localiser ces cellules. La recherche pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des maladies comme l’Alzheimer et l’épilepsie. L’utilisation de capteurs génétiques et de techniques d’imagerie avancées favorisera le développement de nouvelles technologies et l’amélioration des protocoles expérimentaux.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales. L'intervention dure en moyenne 1 minute, les animaux seront habitués à la contention avant l'injection.

Impact sur les animaux

1.Injections intrapéritonéales Les injections intrapéritonéales de tamoxifène, réalisées à P10, peuvent induire une douleur légère à modérée et un stress transitoire liés à la contention physique et à la pénétration de l’aiguille dans la cavité abdominale. 2.Effets pharmacologiques du tamoxifène Le tamoxifène, en tant que modulateur sélectif des récepteurs aux œstrogènes, peut provoquer des effets systémiques modérés sur le développement postnatal, la maturation hormonale et le métabolisme hépatique. Bien que transitoires, ces effets doivent être considérés comme potentiellement perturbateurs de l’homéostasie de l’animal, en particulier lors d’une administration précoce. 3. Manipulations répétées Les manipulations nécessaires aux injections et aux prélèvements, bien que de courte durée, peuvent induire un stress comportemental modéré en cas de répétition. Ce stress est lié à la contention, au changement d’environnement et à l’exposition répétée à des stimuli humains, susceptibles de perturber transitoirement les comportements exploratoires ou alimentaires.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de permettre la réalisation de mesures de l’activité cérébrale sur des coupes de cervelet.

Remplacement

Bien que notre étude nécessite l'utilisation de modèles animaux en raison de la complexité des interactions biologiques des cellules de Fañanas à examiner, nous explorons constamment des alternatives pour remplacer du les expérimentations animales là où c'est possible. En effet, il est impossible dans notre cas de faire de la culture cellulaire car les Fañanas ne pousseraient pas. Les mini-cerveaux (organoïdes) sont suffisamment développés pour permettre l’imagerie dans le cervelet, mais ne sont pas encore adaptés à la mesure des courants électriques, ni au developpement des cellules de fananas Cependant nous suivons de près les développements dans les technologies de cultures de cervelet, qui pourraient un jour nous l'esperons offrir des moyens viables de simuler plus précisément les systèmes biologiques complexes sans recourir à l'utilisation d'animaux vivants.

Réduction

Nous nous engageons à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Cela est réalisé par une planification rigoureuse des expériences pour garantir que chaque animal contribue de manière significative aux résultats Avant de commencer les expériences, nous avons réalisé des analyses statistiques approfondies pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables, notamment a l'aide de nombreux articles avec des résultats probants après leurs manipulations d'electrophysiologies. Nous minimiserons le nombre d’animaux utilisés grâce à une planification rigoureuse et à des techniques de pointe telles que l’imagerie fluorescente en temps réel tout en mesurant le courant, permettant de recueillir des données multiples à partir d’un seul sujet, réduisant ainsi le besoin de répétitions.

Raffinement

Notre projet met en œuvre des méthodes visant à raffiner les techniques expérimentales pour minimiser la douleur et la détresse chez les animaux de laboratoire. Cela inclut l'utilisation d'analgésiques et d'anesthésiques pour toutes les procédures potentiellement douloureuses. De plus, nous avons optimisé les protocoles d'injection et les conditions d'hebergement pour garantir le confort des animaux, en réduisant le stress environnemental et social. Les interventions sont effectuées par du personnel hautement qualifié et formé spécifiquement pour manipuler délicatement les animaux afin de minimiser leur angoisse.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles essentiels pour étudier les fonctions neurologiques en raison de leur grande similitude génétique avec les humains (95% des gènes partagés). En effet, l’organisation des cellules de Fañanas est équivalentes à ce que l’on trouve chez l’homme. Les souris peuvent être facilement manipulées génétiquement pour des études ciblées. De plus, leur cycle de vie court et leur anatomie bien documentée facilitent les recherches et les comparaisons précises. Par ailleurs, nous utilisons les souris entre 25 et 35 jours. Au-delà de cette période, la disparition des interneurones peut influencer et biaiser les résultats concernant la communication cellulaire.

Mises à mort à l'issue de leur période d'analyse pour prélever dépôts adipeux, foie, muscles, pancréas, cœur et reins, 60 souris ne sont réutilisées dans aucune autre cohorte. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : tatouage des phalanges et biopsie d'oreille pour le génotypage, cinq gavages quotidiens pouvant irriter l'œsophage, six injections, sept prélèvements de sang à la queue en état vigile, une chirurgie de trente minutes dont le texte admet qu'elle entraîne rarement la mort, et jusqu'à cinq heures d'hébergement à 6 °C, seules, avec des isolements pouvant durer sept heures. L'objet du projet est de comprendre comment la graisse brune produit de la chaleur, piste envisagée contre l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur écrit disposer de lignées cellulaires qui permettront de remplacer les animaux pour produire des adipocytes bruns modifiés, et affirme dans le même temps que les échanges entre le cœur et les organes métaboliques ne peuvent pas s'étudier en culture.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin.

Bénéfices attendus

Une forte prévalence (ou activité) de tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.

Procédures

Les animaux seront tatoués aux phalanges avec biopsie d’oreille pour génotypage. Ils seront soumis à des gavages une fois par jour pendant une semaine, soit 5 gavages au total (10 secondes/gavage). Ils recevront 6 injections au total (10 secondes/injection) et 7 prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutives. Ils seront aussi soumis à une chirurgie de 30 minutes une fois au cours de leur vie, un hébergements au froid (6°C) de 5 heures maximum et des isolements temporaires (maximum 7 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur et des expositions au froid en cages individuelles avec surveillance de la température corporelle. Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Stress et légère douleur lors du tatouage et biopsie d’oreille. - Inconfort lors des pesées (durée inférieure à 1 minute). - Inconfort et/ou stress lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. - Inconfort et/ou légère douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémité de la queue. - Inconfort, légères douleurs et rarement la mortalité (inférieure à 10%) lors des chirurgies sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale. - Stress, inconfort et douleur lors des expositions au froid (5 heures) avec isolement, jusqu'à 7 heures.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation thermique et/ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépôts adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.

Remplacement

Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogenèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.

Réduction

En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 15 animaux contrôles (femelles) et 15 animaux génétiquement modifiés (femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Prenant en compte la plus petite différence biologique interprétable que nous pourrions avoir lors de nos procédures, ainsi que le fait que des études statistiques sont probantes à partir d'un nombre suffisant. Nous avons estimé que pour établir une différence éventuelle entre nos groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus (tenant en compte les non répondeurs éventuels et les pertes possibles lors de la chirurgie), soit 15 femelles contrôles et 15 femelles génétiquement modifiées par cohorte. L'usage de 2 cohortes par procédure est justifié par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuiemains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception des 5 jours post-chirurgie, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La classe de gravité de la procédure utilisée dans ce projet est modérée et n’est pas répertoriée comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Lors de la modification de la température d'hébergment (6°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux.

Choix des espèces

La souris, mammifère proche de l'Homme, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de diverses températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogenèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris débuteront la procédure entre 6 et 10 semaines correspondant au début de l'âge adulte, une période où l'organisme est mature tout en étant encore jeune. À ce stade, la délétion génique est stable, ce qui garantit la fiabilité des analyses phénotypiques et fonctionnelles.

Pour comprendre pourquoi le cœur diabétique répond mal à l'effort, 90 rats reçoivent pendant six semaines une eau de boisson additionnée d'un composé hypertenseur et une alimentation riche en graisses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils courent ensuite vingt minutes sur un tapis motorisé, subissent une échocardiographie sous anesthésie pendant laquelle une molécule leur impose un stress cardiaque pouvant déclencher des arythmies, puis un test de tolérance au glucose de deux heures après mise à jeun. Tous sont tués pour prélever leur cœur et en isoler cardiomyocytes et mitochondries. Une grille de score remplie chaque jour tranche, selon un arbre de décision, entre l'administration d'un analgésique et la mise à mort de l'animal.

Objectifs

La réponse combat-fuite, ou fight or flight response, est une réaction permettant à notre organisme de faire face à une situation de danger. Au niveau cardiaque, cela se traduit par une augmentation de la fréquence et de la force de contraction des cellules du cœur. Il est bien établi que cette capacité d’adaptation du cœur à un stress est altérée dans le cadre de la maladie cardiaque associée au diabète de type 2 (DT2) et plus particulièrement dans la cardiopathie diabétique, caractérisée d'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée (HFpEF). Cette altération pourrait contribuer à expliquer l’intolérance à l’effort, les arythmies cardiaques et, potentiellement, le risque accru de mortalité en situation de stress chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque diabétique. L’objectif de ce travail est de mieux comprendre le rôle de l’altération de la fonction mitochondriale — organite clé dans la production d’énergie du cœur — dans la réponse défaillante du cœur diabétique à un stress. Ce projet se concentrera plus particulièrement sur le rôle d’une petite molécule, le monoxyde d’azote (NO), dans la modulation de la réponse des mitochondries cardiaques face à une situation de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle de cette petite molécule, le monoxyde d’azote (NO), au niveau des centrales énergétiques des cellules du cœur, les mitochondries, dans une pathologie cardiaque encore mal comprise et pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement efficace : l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (HFpEF). Le développement récent de molécules capables de libérer du NO spécifiquement au niveau des mitochondries pourrait ainsi constituer une nouvelle piste thérapeutique prometteuse.

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement pendant six semaines avec avec un composé induisant de l'hypertension (dilué dans l’eau de boisson) et nourris avec un régime riche en graisses. L’association de ces deux traitements induira le développement d’une hypertension artérielle et de troubles métaboliques similaires à ceux observés dans le diabète de type 2. Les animaux seront ensuite soumis à différents évaluations pouvant générer des stress. Un test de course sur tapis motorisé d'une durée d'environ 20 minutes, une échocardiographie de stress sous anesthésie (environ 15 minutes) et enfin une mesure de la glycémie à jeun suivie d'un test de tolérance au glucose à partir de microprélèvements de sang au niveau de la veine de la queue (2h00).

Impact sur les animaux

Le traitement mélangeant régime gras (régime HFD pour high fat diet), afin d'induire des troubles métaboliques, et traitement avec un composé induisant de l'hypertension peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux. Les animaux seront donc surveillés par un personnel habilité et formé pour ce type de procédure expérimentale. Une grille d'évaluation de la souffrance sera utilisée par le personnel qualifié. En cas de souffrance excessive, les animaux seront traités (antalgie ou euthanasie en cas de souffrance trop importante). Le traitement aigu avec un composé permettant de mimer un stress adrénergique, administré lors de l’échocardiographie, peut également affecter le bien-être des animaux. En effet, cette molécule va induire une situation de stress cardiaque (augmentation de la force et de la fréquence de contraction du coeur) pouvant être associé à des arythmies cardiaques. Les animaux seront donc étroitement surveillés et leur rythme cardiaque sera surveillé le temps de l'expérimentation. Un suivi particulier sera réalisé dans les heures suivant le stress, par un personnel formé et qualifié pour ce type d’interventions. Certains animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis de course motorisé. Cette procédure peut être stressante pour les animaux mais afin de réduire le stress, une procédure d'habituation à la course ainsi qu'à l'environnement particulier du tapis de course sera mise en place lors des quelques jours précédant les tests. La mise à jeun des animaux pour la mesure de la glycémie se fera pendant la phase diurne (période pendant laquelle les animaux mangent peu) afin de réduire le stress. Le microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale sera précédé d'une anesthésie locale de la zone de prélèvement avec un anesthésique en crème. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules et des mitochondries isolées, nécessitant l’euthanasie des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress métabolique (régime riche en graisse) et hypertensif (inhibition de la synthèse du NO) sur le remodelage pathologique du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cœurs, des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du cœur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser différentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique). Le nombre d'animaux utilisé par groupe a été préalablement determiné à l'aide d'un logiciel de statistique.

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal. Lors des différentes expérimentations (test de course, echocardiographie de stress, mesure du glucose sanguin) des mesures sont prises pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Ainsi, les animaux seront préalablement familiarisé à l'environnement du tapis de course pendant 3 jours avant le test de course. L'échocardiographie de stress sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront surveillés par enregistrement de leurs rythmes cardiaque et respiratoire ainsi que de leur température corporelle. Enfin, le microprélèvement de sang à la queue des animaux sera réalisé après anesthésie locale de la zone de prélèvement.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications

Tester des molécules maison contre la fibrose pulmonaire suppose d'abord de provoquer la maladie : un inducteur est déposé au fond de la gorge de 576 souris anesthésiées, puis les traitements sont administrés par la même voie, de façon répétée. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour quantifier la fibrose par histologie et dosage du collagène. Le texte signale une perte de poids entre le deuxième et le septième jour suivant l'induction et n'anticipe aucun effet indésirable des traitements. Les souris pèsent au moins 21 grammes, seuil choisi pour limiter la toxicité de l'inducteur, et le porteur conclut qu'aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un "animal entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie sans traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes de cette maladie pour développer de nouveaux médicaments capables de s’y opposer. Le contenu en lipides des tissus pulmonaires de patients malades est différent de celui des patients non malades et a été mise en évidence une surproduction d’une famille de lipides. Nous développons des médicaments capables d’inhiber la synthèse de ces lipides. L’objectif de ce travail est de tester l’efficacité de ces composés à limiter la fibrose pulmonaire dans des modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans un contexte de manque de thérapies de la fibrose pulmonaire le test de nouvelles molécules est crucial. Si les inhibiteurs testés dans ce projet montrent des effets protecteurs contre le développement de la fibrose pulmonaire chez la souris, ces données serviront de base à la poursuite du développement de ces composés chez les patients. Ce projet permettra aussi d’affiner la connaissance des doses efficaces de ces composés et de mettre en évidence la voie d’administration la plus appropriée pour assurer leur efficacité.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose par aspiration oropharyngée. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum. Ce même type d’injection sera également utilisé, de façon répétée, pour l’administration des agents thérapeutiques dans la procédure 2. Aucune nuisance supplémentaire n’est anticipée du fait de la répétition. Les administrations intraveineuses des agents thérapeutiques sont également courtes (environ 20 secondes) et ne nécessitent pas l’anesthésie de l’animal.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est couramment utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose pulmonaire. Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, les souris peuvent perdre du poids. Les administrations intraveineuses peuvent induire une douleur brève (1 sec) au moment de l’insertion de l’aiguille. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement. Nous n’anticipons aucun effet indésirable après administrations des traitements anti-fibrotiques.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines)

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données (test Kolmogorov-Smirnov), nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit). Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal. Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, l’utilisation de souris de plus de 21g permet de minimiser la toxicité des produits inducteurs de fibrose.

Opérées une heure sous anesthésie générale pour recevoir des implants de télémétrie qui enregistrent les contractions de l'utérus, des brebis reçoivent ensuite six injections intramusculaires en trois jours pour les soins post-opératoires. 8 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes replacées en élevage à l'issue et réutilisables dans "d'autres protocoles expérimentaux". L'équipe les suit plusieurs mois au fil de leur cycle, pour tester à terme sur des brebis des contraceptifs non hormonaux destinés aux femmes, et le porteur ajoute que le projet "pourrait permettre d'améliorer les pratiques d'élevage" des brebis inséminées pour la production de fromage. Le résumé ne dit pas si les implants sont retirés avant le retour en élevage, et cite des traitements de synchronisation de l'œstrus parmi les sources de stress sans les inscrire dans la liste des procédures.

Objectifs

Le développement de méthodes de contraception non hormonale chez la femme pour s’affranchir des risques associés aux traitements hormonaux est un sujet central de la recherche reproductive actuelle. L’évaluation de potentiels contraceptifs s’appuie sur des tests pré-cliniques sur modèles animaux de laboratoire de type rongeur. Toutefois le modèle rongeur ne permet pas de réaliser toutes les analyses nécessaires. Des modèles animaux de plus grande taille, comme la brebis, permettent par exemple de quantifier la distribution des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle par une méthode d’imagerie endoscopique. Un contraceptif de type gel vaginal, qui bloque le passage des spermatozoïdes au niveau du col de l’utérus, a été validé chez la brebis par cette méthode d’imagerie en 2023. Les grands animaux peuvent également être équipés d’implants de télémétrie permettant des mesures d’activité physiologique en continu et sans intervention humaine. Afin de valider le modèle brebis comme modèle animal de test de contraceptif, nous devons caractériser un élément important de la reproduction : la physiologie de l’utérus et plus précisément les contractions utérines. En effet, si les spermatozoïdes se déplacent dans le tractus génital par leur mobilité propre, ce sont les contractions utérines qui sont en grande partie responsables de leur remontée vers l’ovaire. Il existe désormais des implants sous cutanés télémétriques qui permettent de mesurer une activité myoélectrique d’un tissu. Des études récentes ont initié la caractérisation par télémétrie de l’activité utérine chez la brebis et la truie. Dans notre projet, nous souhaitons équiper des brebis avec des implants de télémétrie pour quantifier les contractions utérines (fréquence et intensité des contractions) dans diverses conditions physiologiques (stade du cycle) et comparer les résultats aux données existant chez l’humain. Une fois équipées, ces brebis pourront ensuite permettre le test de contraceptifs potentiels à visée utérine.

Bénéfices attendus

1. Biologie fondamentale : Données non biaisées : la télémétrie va permettre d’obtenir des données non biaisées de caractérisation de l’activité utérine chez la brebis car il est attendu que l’interaction de l’animal avec l’humain peut perturber l’activité utérine. Relation statut hormonal / activité utérine : Les mesures d’activité seront réalisées au cours du cycle oestral et permettront de relier le statut hormonal (oestrogènes / progestérone) et l’activité utérine. Nous pourrons également mesurer pour la première fois l’activité de chaque corne utérine en simultané et étudier d’éventuels mécanismes de synchronisation / désynchronisation des cornes utérines. Modèle alternatif à l’éxpérimentation animale : A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificiel (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel. 2. Biologie appliquée : Etude pré-clinique de contraceptifs humains non hormonaux : Dans le cadre d’un large projet de recherche international, des contraceptifs non hormonaux sont recherchés. Le contrôle des contractions utérines par un dispositif non hormonal comme moyen de contraception est une méthode envisagée et pourra s’appuyer sur notre modèle. Amélioration de la fertilité après insémination : La production de fromages de brebis s’appuie presque essentiellement sur l’utilisation de l’insémination animale après synchronisation de l’oestrus. Cette insémination nécessite la manipulation des brebis qui peut altérer l’activité utérine et limiter l’efficacité de l’insémination. Une étude de 2002 a déjà montré que la contention, même limitée, perturbe les contractions utérines et donc potentiellement le transport des spermatozoïdes, facteur clé de la réussite de fécondation. Ce projet pourrait permettre d’améliorer les pratiques d’élevage et l’efficacité de l’insémination.

Procédures

Chaque brebis subira une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’une heure, une injection par voie intraveineuse pour l’induction de l’anesthésie (30 secondes avec contention), et 6 injections par voie intramusculaire pour les traitements post-opératoires (2 injections par jour pendant 3 jours, 1 minute à chaque fois avec contention). Les animaux vivront quelques moments de stress de 5 à 10 minutes lors des déplacements, manipulations et contentions.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une chirurgie qui peut entrainer des douleurs post opératoires. La mise en place des implants va perturber de manière transitoire l’activité utérine. Les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour l’induction de l’anesthésie, puis l’administration des traitements post-opératoires et des synchronisations de l'oestrus. Ces injections par voie intra veineuse et intra musculaire peuvent induire une douleur ainsi qu’un hématome.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont replacés en élevage et pourront être utilisés pour d’autres protocoles expérimentaux ou des phases d'élevage.

Remplacement

La mesure de l’activité utérine de la brebis nécessite la réalisation de mesures chez l’animal vivant. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale. A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificielle (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel.

Réduction

Le projet vise à obtenir des informations provenant de deux types d’implants donc deux lots d’animaux sont nécessaires. Le nombre de 4 animaux par lot a été calculé pour avoir un nombre minimal de 3 animaux par lot en tenant compte d’un éventuel défaut expérimental (chirurgie ou équipement de télémétrie) pour 1 animal sur 4. Les animaux seront analysés pendant plusieurs mois, ce qui permettra d’obtenir des réplicats biologiques sur chaque animal. Les tests statistiques réalisés seront des tests non paramétriques en données répétées car chaque animal sera son propre témoin. Par exemple, au cours du cycle oestral, les paramètres de contraction utérine seront comparés, pour plusieurs cycles successifs, entre le moment de l’oestrus et la phase lutéale au sein de chaque cycle oestral de chaque animal.

Raffinement

Les brebis sont logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée, en groupe social stable. Les brebis proviennent d’un EU fournisseur très proche de notre plateforme ce qui limitera le stress du déplacement. Pour un transit digestif optimal, du foin de qualité sera distribué matin et soir. La douleur est traitée préventivement avant l'acte chirurgical dès induction de l'anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu'à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l'état normal est estimé à 3 à 4 jours post-opératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. De plus, les implants utérins permettront de mesurer en continu la température interne et l’activité locomotrice. Une éventuelle augmentation de la température, signe d’une infection, pourra être détectée et conduire à un traitement antibiotique adapté. L’activité locomotrice sera mesurée comme paramètre de bien être animal. Deux caméras vidéo, présentes dans le logement et couplées aux implants par télémétrie, permettront de suivre les animaux en temps réel dans leur logement et de détecter tout signe de douleur ou mal être. La douleur est également prévenue par l’administration de sérum physiologique stérile et tiédi dans la cavité abdominale : ce geste prévient la formation des adhérences qui peuvent être très douloureuses. Du fait des visites régulières, les animaux seront socialisés et familiarisés à l’humain. Des récompenses après les contentions et manipulations renforceront cette socialisation. Un animal anorexique, prostré, en décubitus latéral prolongé recevra l'administration d'analgésique. Sans réponse physiologique satisfaisante rapide, il sera fait appel au vétérinaire agréé. La décision d’euthanasie par voie médicamenteuse et sous anesthésie sera prise en concertation avec les différents acteurs du projet.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi comme modèle expérimental par ses points communs avec l’anatomie humaine concernant la morphologie du tractus génital femelle et la physiologie utérine. Chez ces deux espèces, les contractions utérines sont sous contrôle nerveux et hormonal (l’oestrogène stimule et la progestérone inhibe les contractions utérines). Les brebis seront des femelles multipares et cycliques pour exprimer une activité utérine d’un adulte capable de reproduction.