Recherche fondamentale

73 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple négatif humain leur sont greffées dans les tissus mammaires, puis la tumeur est mesurée deux fois par semaine, jusqu'à cinq fois quand elle grossit assez pour gêner leurs déplacements et leur couper l'appétit. Le projet vise à confirmer sur un animal vivant ce que des cultures cellulaires ont déjà montré. Les retombées pour les malades sont renvoyées à une phase ultérieure de recherche, le porteur affirmant par ailleurs que seul un "organisme entier" permet de suivre la dissémination d'une tumeur et concluant que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

Parmi les différents types de cancer du sein, le cancer triple négatif (TNBC) est l’un des plus difficiles à traiter. Contrairement à d'autres formes, il ne répond pas aux traitements ciblés habituels, et la chimiothérapie y est souvent peu efficace. Ce type de cancer est donc particulièrement agressif et a un risque plus élevé de récidive ou de propagation à d’autres organes (métastases). Nous avons découvert qu’un certain gène, est quatre fois plus souvent altéré dans les formes avancées et métastatiques de ce cancer que dans les formes précoces. Cela nous a poussés à penser qu’il pourrait jouer un rôle dans la capacité du cancer à se propager. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons créé en laboratoire des cellules cancéreuses issues d’un cancer du sein triple négatif reproduisant cette altération génétique. Nous avons observé que ces cellules devenaient plus agressives : elles bougent plus facilement, s'accrochent moins aux autres cellules (ce qui facilite leur dispersion dans le corps), résistent mieux à certains stress, et sont capables de survivre même dans des conditions difficiles (manque de nutriments). Ces résultats suggèrent que les mutations de ce gène pourraient rendre les cellules cancéreuses plus agressives capables de former des métastases plus facilement. Nous souhaitons maintenant vérifier ces observations dans un modèle vivant (chez l’animal), pour confirmer que cette mutation augmente bien le risque de métastases. Les résultats attendus viendront compléter nos travaux in vitro pour suggérer que la détection d’altérations du gèe étudié dans des tumeurs TNBC est un marqueur de risque accru de dissémination métastatique et de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet de validation préclinique vise à confirmer l’implication des altérations d'un gène dans la promotion de la dissémination métastatique des cellules TNBC. Les informations attendues sont essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle visant à déterminer si le gène étudié pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif et aux traitements limités.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Le développement du modèle de TNBC métastatique nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances pour les souris. La greffe des cellules, sous anesthésie locale, engendre du stress et de la douleur légère chez l'animal. Le suivi longitudinal individuel de nos souris (2 fois par semaine puis 5j/semaine si nécessaire) avec la mesure de la taille tumorale peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps par habituation. Si la tumeur devient plus volumineuse (volume cumulé), elle peut limiter la mobilité de la souris, affectant ainsi son comportement et son bien-être général, avec des effets modérés pouvant entraîner une perte d'appétit.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leur dissémination à d’autres organes distants. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans la dissémination métastatique dans les cancers du sein de type triple négatif.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux seront surveillés quotidiennement et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permettra de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. En cas de besoin, ils reçoivent une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Les animaux bénéficient d’enrichissement environnemental dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Les interventions seront faites sous anesthésie, avec analgésie adaptée. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant au suivi régulier de l’état de santé des animaux. Des points limites précoes ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous implanterons des cellules tumorales humaines. L'espèce souris est l'espèce de choix en oncologie préclinique. Pour ce projet, le fait qu'il soit possible d'utiliser des animaux immunodéficients bien caractérisés dans cette espèce est crucial. De plus, de précédentes études au laboratoire ont été réalisées sur ce modèle de souris. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures (souris adultes).

Toutes tuées pour que leurs tumeurs soient prélevées, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales, dont la croissance est mesurée quatre fois par semaine pendant douze à quinze jours, puis trois injections d'un composé au fer en cinq jours, associées ou non à des séances quotidiennes de radiothérapie. Le porteur signale que l'irradiation du site tumoral peut provoquer une brûlure et que la tumeur peut gêner la locomotion, atteintes qu'il qualifie de légères. Il présente le projet comme une étape de pré-maturation destinée à positionner ce composé comme agent thérapeutique, le bénéfice annoncé pour les patients, moins de séances de radiothérapie, restant à démontrer.

Objectifs

Le cancer est une maladie de plus en plus fréquente, causant environ 10 millions de décès en 2020. Parmi les thérapies anticancéreuses, la radiothérapie est un traitement clé, utilisé chez près de la moitié des patients pour cibler et éliminer les tumeurs. Cependant, elle peut aussi affecter les cellules saines, entraînant des effets secondaires. Les séances sont donc réparties sur plusieurs jours pour limiter ces impacts. Afin de réduire ces effets secondaires tout en maintenant l'efficacité du traitement, nous travaillons sur une molécule prometteuse capable de renforcer l'action de la radiothérapie. Ce composé pourrait rendre certaines cellules cancéreuses plus sensibles aux effet de la radiothérapie. Après des résultats encourageants en laboratoire, notre objectif est de confirmer son efficacité sur des modèles de tumeurs. Si cela se confirme, cela permettrait de diminuer le nombre de séances, améliorant ainsi le confort des patients. Le projet se déroulera dans 2 Établissements Utilisateurs (EU).

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet pré-maturation afin de pouvoir positionner un nouveau composé comme agent thérapeutique pouvant potentialiser l’efficacité de traitements anticancéreux par radiothérapie.

Procédures

-1- Injection de cellules tumorales (UE1): Chaque souris reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales pour initier la croissance tumorale. La manipulation est réalisée sous anesthésie par injection (durée environ 5 minutes par animal) -2- Croissance tumorale (UE1): Durée de 12 à 15 jours pour atteindre un volume suffisant. Les souris subissent un suivi 4 fois par semaine (prise de poids, mesure tumorale avec un pied à coulisse, durée 5 minutes) -3-Traitement (UE1): Chaque souris reçoit 3 injections du médicament sur une durée de 5 jours. Les injections sont associées ou non à des séances de radiothérapie quotidienne (5 séances par jour), (UE2). Toutes les manipulations sont réalisées sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs sur le flan peut engendrer une légère gène lors de la locomotion du fait de l'encombrement de la tumeur. La contention sur animal vigile réalisée lors de la mesure de la tumeur au pied à coulisse peut engendrer un léger stress. L'irradiation sur le site tumoral peut engendrer une légère brûlure. Une légère douleur peut persister aux points d'injections

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Ce projet est basé sur des études préliminaires réalisées sur cellules en culture montrant un effet fort du composé testé sur les cellules cancéreuses. Toutefois, ces études sur cellules ne permettent pas de prendre en considération l’impact des tissus autour de la tumeur sur la réponse au traitement anticancéreux. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en compte ces paramètres, En effet, il n'existe pas d'autre modèle capable de reproduire, de façon fiable, l'ensemble de ces paramètres. C'est pourquoi, la planification d'expériences in vivo est une étape indispensable pour la suite de ce projet.

Réduction

L'effectif du nombre d'animaux requis, par groupe expérimental, a été calculé statistiquement en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire. Ces données, ont permis de montrer un effet fort de ce type de traitement sur le développement de tumeur. C'est pourquoi, basé sur ces données et sur nos analyses statistiques, ce projet a été défini en utilisant le nombre minimal de souris requis pour pouvoir interpréter correctement les résultats obtenus.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont prévues pour l'hébergement d'animaux immunodéficients. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés. Des critères d'arrêt anticipé de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés.

Choix des espèces

Le modèle de souris sélectionné est le plus adéquate car il permet d’éviter les rejets de greffes de cellules cancéreuses humaines. Ce modèle permet donc d’induire le développement d’une tumeur et étudier l'impact de traitement anticancéreux.

Pour mesurer l'effet de l'obésité sur l'apparition de lésions précancéreuses du pancréas, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 172 sont tuées, dont les femelles allaitantes mises à mort au sevrage parce qu'elles ne peuvent pas porter une seconde portée, et 128 femelles sont transférées vers un autre projet d'imagerie. Les souriceaux subissent une coupe du bout de la queue pour génotypage, et un groupe est rendu obèse par un régime gras de l'âge de quatre à six semaines jusqu'à seize semaines, puis reçoit du sucre par gavage et six piqûres de la queue en deux heures pour mesurer sa glycémie. Le porteur explique avoir choisi des femelles allaitantes pour faire passer le produit par le lait maternel, ce qui évite de manipuler les souriceaux et déplace l'administration sur les mères.

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer de plus en plus fréquent et serait la deuxième cause de mortalité par cancer en 2030. Il est souvent diagnostiqué à un stade tardif et sa mortalité est importante avec une survie à 5 ans tous stades confondus estimée à 11 % en 2024. De plus, la prévalence de l’obésité est en augmentation, particulièrement dans les pays développés. La corrélation entre obésité et cancer du pancréas est établie chez l’homme sur des données épidémiologiques, mais il existe à ce jour peu de données sur les mécanismes biologiques, cellulaires et moléculaires impliqués. Le but de cette étude est donc d’étudier l’impact de l’obésité sur l’apparition de lésions précancéreuses pancréatiques (donc avant la formation d’un cancer) à l’aide de 2 modèles de souris mimant 2 types de lésions précancéreuses.

Bénéfices attendus

L’étude des processus de développement et d’évolutivité de ces lésions précancéreuses du pancréas dans un contexte d’obésité est une des clés pour développer un meilleur dépistage et des traitements précoces, plus personnalisés et plus efficaces pour les patients.

Procédures

On génère les souris d’intérêt par croisement afin d’obtenir les modifications génétiques nécessaires à la formation des lésions pré-cancéreuses. Un produit est administré une fois par jour pendant 4 jours aux souris femelles allaitantes, soit par gavage, soit par injection dans le ventre. Cette manipulation dure moins de 15 secondes et permet au produit de passer dans le lait maternel afin que les souriceaux allaités le reçoivent indirectement. Ce produit permet ainsi d’induire l’activation de la modification génétique des souriceaux et de favoriser le développement des lésions pré-cancéreuses une fois l’âge adulte atteint pour étudier les causes du développement et de la progression de ces lésions. On effectue un prélèvement d’un petit bout de queue chez les souriceaux pour le génotypage, c'est à dire l'identification des modifications génétiques induites chez chaque animal. La manipulation est très rapide (moins de 30 secondes) et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Un groupe de souris se nourrira d’un régime spécial riche en gras à base de croquettes de l’âge de 4-6 semaines jusqu’à 16 semaines afin d’induire une obésité. On donne ensuite du sucre par gavage à la souris afin de déterminer si elle est diabétique ou non (taux élevé de sucre dans le sang) en mesurant ensuite le taux de sucre via une goutte de sang prélevée au bout de la queue en moins de 5 secondes (au total, 6 gouttes de sang sur une période de 2 heures). Enfin, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie générale avant l’euthanasie de l’animal, la durée du prélèvement étant de moins de 30 secondes. On euthanasie les animaux à l’âge de 16 semaines afin qu’ils aient le temps de développer les anomalies du pancréas et de prendre du poids avec le régime riche en gras.

Impact sur les animaux

Le traitement des souris allaitantes peut entrainer une légère perte de poids transitoire. Le prélèvement d'un petit bout de la queue chez les souriceaux peut entrainer une légère douleur transitoire et un léger saignement. Un groupe de souris se nourrira d’un régime spécial riche en gras afin d’induire une obésité qui provoque une légère baisse de la capacité de mouvement des souris. Le prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue de la souris nécessite une contention qui est une légère source de stress et provoque une légère douleur transitoire.

Devenir

Les souris allaitantes seront euthanasiées au sevrage des souriceaux car elles ne peuvent pas être réutilisées une seconde fois pour une nouvelle portée. Les souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôles) seront euthanasiées à 4 mois afin d’étudier le développement et la progression des lésions précancéreuses pancréatiques en rapport avec l’obésité. Les 128 femelles restantes seront réutilisées dans un autre projet concernant la détection en imagerie des lésions prénéoplasiques pancréatiques (Apafis en cours d’écriture).

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement des lésions précancéreuses pancréatiques, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur organoïdes de souris (mini-version d’un organe cultivée en laboratoire à partir de cellules, qui imite certaines de ses structures et fonctions), ou issus de prélèvements de lésions humaines sont également possibles en complément mais ne peuvent pas remplacer cette étude avec ce modèle physiologique. Les retombées de ce travail sont utiles du point de vue des implications diagnostiques et thérapeutiques à terme chez l'homme, mais aussi d’un éventuel dépistage précoce.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal de souris, déterminé par des résultats obtenus précédemment et dans les publications scientifiques pour ce type d’analyse, et qui permet d'obtenir des résultats avec une puissance statistique permettant la validation de l'étude.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des conditions optimales d'élevage, en portoirs ventilés. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant être isolés car ce sont des animaux qui vivent en groupe. La température, le taux d’humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi régulier de l'expérimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de différents éléments bien définis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'éviter toute souffrance des animaux (suivi de ce qu’on appelle les points limites). Enfin l’euthanasie des animaux est réalisée sous anesthésie avec administration d’un traitement antidouleur.

Choix des espèces

Les souris modifiées génétiquement sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes biologiques et cellulaires de pathologie humaine. L’objectif du projet est d’étudier l’impact de l’obésité sur le développement et l’évolutivité de lésions pré-cancéreuses pancréatiques grâce au modèle de souris et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, ainsi que de proposer des stratégies diagnostiques et de dépistage. Nous utilisons des femelles allaitantes car cela permet d’induire la modification génétique chez les souriceaux sans avoir à les manipuler directement. Les femelles « allaitantes » auront au moins 60 jours lors de leur mise en accouplement. Le temps de gestation moyen est de 21 jours. Le temps d’allaitement moyen est de 30 jours. Au sacrifice, les femelles souris allaitantes seront euthanasiées à environ 17 semaines de vie. On laisse les lésions pré-cancéreuses se développer dans ce modèle de souris jusqu’à l’âge de 4 mois. Cela permet d’étudier l’impact de l’obésité dans le développement de ces lésions précancéreuses.

1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus articulaires. À dix semaines, chacune subit une chirurgie du genou droit d'environ quinze minutes qui déstabilise un ménisque et déclenche une arthrose, après des injections intrapéritonéales quotidiennes ou un régime alimentaire médicamenteux de deux à quatre semaines. Le porteur décrit une possible prostration dans les trois jours suivant l'opération, l'isolement de l'animal et l'arrêt du toilettage social, ainsi qu'un risque d'infection des sutures. Les retombées annoncées pour les 500 millions de personnes touchées par l'arthrose restent au conditionnel, et le porteur compte parmi les bénéfices du projet le fait d'y tester un mode d'administration moins invasif.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation semble correspondre à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). Dans le contexte de l’arthrose, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés via un mécanisme nommé « angiogenèse » se met en place. Cette invasion vasculaire favorise la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a rapporté, de manière précise, la phase de la maladie à laquelle les chondrocytes deviennent hypertrophiques, ainsi que le devenir de ces cellules au cours du temps. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le mécanisme de l’hypertrophie des chondrocytes qui survient lors de l’arthrose. Pour ce faire, nous souhaitons générer et utiliser une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant de visualiser les chondrocytes hypertrophiques grâce à une protéine fluorescente spécifique. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’apparition des chondrocytes hypertrophiques sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement les chondrocytes hypertrophiques.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Dans un second temps, les résultats obtenus, nous permettront d’évaluer l’intérêt de cibler l’étape d’invasion vasculaire du cartilage pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’arthrose. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représente des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongé et aux intervention) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

Les animaux âgés de 8,10,12 ou 14 semaines recevront des injections intrapéritonéales du composé d’intérêt quotidienne de quelques secondes sur une période de 3/5 jours ou seront soumis à un régime contenant le composé d’intérêt pendant 2/4 semaines. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal. A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Cette opération sera effectuée dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Une injection sous-cutanée de solution saline physiologique sera également effectuée afin de prévenir la déshydratation des animaux.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si des douleurs sont ressenties par l’animal, celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux de la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait notamment être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Comme indiqué dans la littérature, la présence du composé d’intérêt dans la nourriture peut provoquer une aversion chez les animaux et donc entraîner une perte de poids significative. Une acclimatation des souris à ce régime spécifique sera réalisée, de même, la prise de nourriture et le poids des animaux feront l’objet d’une évaluation régulière. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué...) seront attentivement surveillés.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem de tissus articulaires. Ces prélèvements sont indispensables pour évaluer la fiabilité et la reproductibilité d’induction de l’arthrose post-traumatique au sein de notre lignée de souris génétiquement modifiée, ainsi que pour mieux caractériser la progression de la maladie (notamment l’apparition de cellules hypertrophiques pathologiques) chez ces animaux.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communication cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Le nombre de 9 animaux de chaque sexe par groupe a été calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvement multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Cette étude prend en considération la règle des 3R en intégrant une optimisation du raffinement des protocoles par l’évaluation de l’efficacité de mode de délivrance alternatifs d’un composé actif, afin de réduire le recours à des gestes invasifs sur les animaux. Premièrement, nous déterminerons si l’utilisation d’un régime alimentaire contenant le composé actif peut se substituer aux injections intrapéritonéales, plus invasives et stressantes pour l’animal. Dans un second temps et uniquement si le premier protocole de raffinement ne donne pas de résultats satisfaisants, nous évaluerons l’intérêt d’un mode de délivrance qui associe un nombre réduit d’injections intrapéritonéales et un régime alimentaire à base de composé actif. Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée en avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur suceptible d'être ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 8-14 semaines, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial.

2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à trente injections espacées de huit heures et subir dix micro-prélèvements de sang après section de la pointe de la queue. Toutes sont tuées en fin de procédure pour le recueil des échantillons. L'objet est de vérifier l'innocuité de composés en développement, le porteur estimant que 200 composés seront testés en cinq ans sur ces 2 500 souris. Il indique que ces candidats-médicaments peuvent induire une mort cellulaire, la défaillance d'un ou plusieurs organes et des douleurs locales ou systémiques, tout en présentant l'opération comme un moyen de définir une posologie ne portant pas atteinte au bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments ou de nouveaux outils pharmacologiques, il est nécessaire d’étudier l’activité pharmacologique de la substance active chez l’animal. Avant ces études pharmacologiques, il est indispensable d’évaluer l’innocuité des produits pharmacologiques (sondes…) et candidats-médicaments en cours de développement dans le but d’identifier les effets indésirables liés à l’administration de ces composés. Cette étape clé doit permettre de mettre en évidence toutes atteintes au bien-être animal et de définir les conditions d’utilisation optimale des composés avant leur utilisation future dans des modèles complexes chez la souris. Cette étape permet aussi d’éliminer les composés présentant une toxicité incompatible avec l’utilisation souhaitée.

Bénéfices attendus

La mesure de l’innocuité des composés permettra d’éliminer les plus toxiques et de définir les conditions d’utilisation les plus adaptées et notamment une posologie (voie, dose et fréquence d’administration) ne portant pas atteint au bien-être des animaux. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament ou un outil pharmacologique efficace et sûr.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections (quelques secondes) pour l'administrer les composés étudiés. Les composés étudiés seront administrés 1 à 30 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et certaines administrations. Afin de suivre la concentration sanguine du composé et/ou contrôler les constantes biologiques et les biomarqueurs au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une période minimale de 72h. Un prelèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée et peuvent être répétée durant 30 jours consécutifs. La section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre des prélèvements sanguins de qualité, rapidement et sans contention entraine également une douleur légère de courte durée. Les candidats médicaments testés sont susceptibles d’exprimer leur activité biologique et tout autre effets indésirables. Ils sont susceptibles de perturber les fonctions biologiques, d’induire une mort cellulaire, d’entrainer la défaillance d’un ou plusieurs organes, de provoquer des douleurs locales ou systémiques se traduisant par une modification du comportement des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments et les produits pharmacologiques auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire l’innocuité d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire les fonctions mécaniques vitales et l’ensemble des phénomènes biologiques nécessaire à la vie et impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les composés les plus prometteurs et éliminer les plus dangereux avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure permet la mise en évidence des effets indésirables dès 2 animaux par condition testée en l’absence d’analyses biologiques. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de suivre l’évolution des constantes biologiques. Pour ces analyses, 5 à 8 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats . D’après notre expérience antérieure et l’évolution des pratiques, nous estimons que l’innocuité de 200 composés sera mesurée sur une période de 5 ans pour un maximum de 2500 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification », d’un igloo, d’une roue, d’une balançoire et de bâtonnets à ronger. Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations et seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Un renforcement positif est mis en place après chaque administration par l’ajout de récompenses alimentaires dans la cage (« Mini-gâteries »). Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des composés. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort et/ou une perte ou absence de prise de poids significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de l’innocuité est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments et des produits pharmacologiques. De plus, certains composés sont très difficiles à synthétiser et la petite taille de la souris requiert beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’innocuité d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.