Recherche fondamentale

Pour étudier le rôle du cil primaire des cellules rénales dans les maladies rénales chroniques, 17 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson pendant vingt-quatre heures ou deux semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein ou son obstruction permanente sous anesthésie, parfois suivie d'une réversion chirurgicale quatre jours plus tard, et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que la maladie peut entraîner à un stade avancé une baisse de l'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité, et que les souris atteignant les points limites sans possibilité de soulagement sont tuées. Ce chiffre de 17 320 n'est adossé qu'à la mention d'un test statistique comparant les groupes deux à deux.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques sont des pathologies génétiques ou acquises caractérisées par une détérioration de la fonction et de la structure du rein avec l’apparition de multiples kystes rénaux ou l’accumulation de cellules immunitaires et cicatricielles. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Ce projet a pour objectif d’étudier le rôle du cil primaire, une extension filiforme de la membrane des cellules rénales dans les maladies rénales. Le cil primaire joue un rôle important dans ces maladies en régulant la forme et les propriétés mécaniques du rein ainsi que le recrutement de cellules qui participent à la destruction du rein. En permettant une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de la destruction du rein, ce projet va servir de base à l’élaboration de nouveaux traitements à destination des patients atteints de maladies rénales chroniques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but une meilleure compréhension des maladies rénales chroniques kystique et fibrosante pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement actuellement, afin d’améliorer les traitements et la prise en charge des patients.

Procédures

-Induction d’une maladie rénale chronique par administration d’antibiotique dans l’eau de boisson en continu sur animaux vigiles. Cette intervention dure 24 heures ou 2 semaines et est réalisée une seule fois. -Ablation chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction permanente chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes) suivi d’une réversion chirurgicale de cette obstruction 4 jours plus tard également sous anesthésie générale et analgésie (20 minutes). Ces interventions sont réalisées une seule fois. - Injections intrapéritonéales de molécule induisant la perte des cellules mutantes dans le rein sur animal vigile : les injections durent 10 à 20 secondes. 1 à 5 injections sont réalisées à 24 heures d’intervalle. -Prélèvement de sang sous anesthésie générale. Cette intervention dure 2 minutes et est réalisée une seule fois.

Impact sur les animaux

La contention peut provoquer un stress chez l’animal. L’ajout d’antibiotique dans l’eau de boisson peut induire un goût amer. La maladie rénale chronique peut entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité́. La chirurgie induit une douleur modérée et passagère. Le prélèvement sanguin sous anesthésie peut occasionner une douleur passagère. Les injections intra-péritonéales induisent une douleur légère et passagère.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l'étude pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoïdes rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, et l’ensemble des populations cellulaires observées in vivo. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.

Réduction

Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. De plus, lors des chirurgies, un seul rein sera manipulé, permettant de conserver le rein controlatéral comme contrôle interne.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Pour diminuer l’amertume liée à la prise d’antibiotique, du sucre est ajouté dans l’eau de boisson. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Dans l’attente de leur réveil, les souris opérées sont placées sur une table chauffante jusqu’aux premiers signes de réveil puis transférées dans une cage propre avec de la nourriture à disposition. Le prélèvement sanguin est réalisé à l’aide d’un mini-capillaire sous anesthésie générale. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin du développement rénal. Les maladies rénales chroniques étudiées dans ce projet affectent majoritairement les patients adultes. L’induction de la maladie sera effectuée sur des souris âgées de 4 semaines afin que la maladie se développe progressivement à l’âge adulte entre 12 et 18 semaines.

84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 72 recevront chacune cent stimulations ultrasonores d'une milliseconde, chaque tir visant une zone de peau différente. Les douze autres reçoivent une injection intrapéritonéale et une injection intradermique, qui peut enflammer le site de piqûre. Le porteur indique que la stimulation peut provoquer une sensation de douleur au réveil de l'anesthésie, l'objectif étant d'activer sélectivement des neurones sensoriels pour préparer de futurs dispositifs contre la douleur chronique. Entre dix minutes et deux heures après la neurostimulation, chaque souris est tuée pour le prélèvement de ses ganglions rachidiens et de sa moelle épinière.

Objectifs

La neurostimulation par ultrasons focalisés est une technique alternative prometteuse pour le traitement de la douleur chronique. Comparé à la stimulation électrique standard nécessitant l’implantation d’électrodes par chirurgie, les ultrasons ont l’avantage d’être non-invasifs, de pouvoir pénétrer jusqu’à plusieurs centimètres dans le corps et de permettre une grande précision spatio-temporelle. Nous avons récemment démontré grâce à des expériences in vitro sur les neurones des ganglions de la racine dorsale (DRG) de souris qu’il était possible d’activer les neurones sensoriels de différents sous-types. En particulier, il a été montré que les neurones nociceptifs jouant le rôle de senseurs de la douleur ainsi qu’une sous-population de neurones sensoriels du toucher identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion, sont particulièrement sensibles aux stimulations ultrasonores. L’activation sélective de ces neurones sensoriels du toucher est susceptible de constituer une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement des douleurs chroniques pathologiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’activation sélective de neurones sensoriels induite par les ultrasons chez la souris in vivo et d'identifier les voies spinales et cérébrales activées par les stimuli ultrasonores. Ce projet devrait permettre d’ouvrir la voie à une nouvelle génération de dispositifs thérapeutiques à ultrasons pour le traitement de la douleur chronique.

Bénéfices attendus

Les douleurs chroniques touchent jusqu'à 20% de la population mondiale, et sont de fait un problème majeur de santé publique. Une sous-population de neurones sensoriels spécialisés dans le toucher ont été identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion tissulaire et représentent par conséquent une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement de la douleur chronique pathologique. Comprendre les conditions de stimulation par ultrasons in vivo pourra à long terme ouvrir la voie à de nouvelles modalités de thérapies pour les douleurs chroniques, à la fois non invasives et plus efficaces que les traitements par stimulation électrique. D’autre part, le chemin pris par le signal nerveux lors de la stimulation de ces neurones sensoriels du toucher n’a jamais été identifié.

Procédures

Dans une première procédure, 12 souris recevront une injection intrapéritonéale et une injection intradermique de quelques secondes chacune. Dans une deuxième procédure, 72 autres souris recevront une série de 100 stimulations ultrasonores d’une milliseconde maximum chacune, chaque stimulation ciblant une zone de peau distincte des précédentes. Au total, cette procédure durera au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’injection intradermique peut causer une légère inflammation au niveau du site d'injection. La stimulation ultrasonore peut provoquer une sensation de douleur lors de la phase de réveil de l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car le prélèvement des tissus (ganglions rachidiens et la moelle épinière) est indispensable pour réaliser des études histologiques permettant de confirmer l’activation des neurones sensoriels après la stimulation par ultrasons.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour appréhender l’étude du système nerveux sensoriel dans sa globalité, de la stimulation en périphérie au niveau de la peau jusqu’à l’intégration du signal nerveux dans le cerveau.

Réduction

Des études préliminaires in vitro ont permis d’identifier une gamme de paramètres ultrasonores pour la stimulation des neurones sensoriels, réduisant le nombre paramètres à utiliser pour l’étude in vivo et donc le nombre d'animaux. Nous mettons en place une première procédure qui est une étude pilote et qui va permettre de localiser la zone à stimuler par ultrasons lors d'une deuxième procédure, permettant une réduction significative du nombre de souris à tester. Lors de la deuxième procédure, nous réaliserons le plus de marquages possibles sur des mêmes tissus afin de minimiser le nombre de souris nécessaires. Nous ne stimulerons par ultrasons qu’un seul côté de la souris afin que l’autre côté serve de contrôle et qu’il n’y ait pas besoin de souris contrôle supplémentaires. Après application de ces stratégies, les effectifs ont été calculés avec un outil informatique de calcul statistique pour être ramenés au minimum tout en permettant d'avoir un effet significatif.

Raffinement

Pour la première procédure, les souris seront anesthésiées avant l'injection pour éviter le stress et leur température sera maintenue constante avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Le protocole prévoit une surveillance quotidienne de leur état de santé par le personnel compétent. Des points limites sont définis pour encadrer la surveillance, s’assurant que toute souffrance excessive est rapidement détectée et prise en compte. En cas de détection d’un signe de détresse, une concertation est menée avec la Structure chargée du Bien-Être des Animaux de l’établissement pour décider de la conduite à tenir (par exemple administration d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien). Si un animal atteint un état de souffrance non compatible avec une amélioration rapide, la procédure sera interrompue et l’euthanasie envisagée. Pour la seconde procédure, les expérimentations seront menées intégralement sous anesthésie générale gazeuse pour éviter le stress de l'animal et pour que la stimulation possible de neurones de la douleur ne provoque pas de sensation douloureuse pendant la stimulation ultrasonore. La température corporelle des souris sera maintenue constante avec un tapis chauffant. Après la neurostimulation, les souris seront replacées dans leur cage et leur état de santé sera surveillé par le personnel compétent de la phase de réveil de l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie qui aura lieu entre 10 minutes et 2 heures plus tard. D’autres points limites sont définis pour encadrer cette surveillance. En cas de détection d’un état de souffrance non compatible avec la poursuite de la procédure, celle-ci sera interrompue et l’euthanasie envisagée.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive sont parfaitement décrits chez la souris : la peau, les neurones sensoriels et la moelle épinière. Nous utiliserons des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences.

Jusqu'à vingt et une injections par animal et une opération de quinze minutes : 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des analyses post-mortem. L'objet est d'ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique pour faire entrer davantage de médicaments dans les glioblastomes, décrits comme les tumeurs cérébrales les plus agressives. Sur ce que subissent les souris, le porteur s'en tient à des "douleurs légères et de courte durée" liées aux injections et à des "nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales". Ni le mode d'implantation des tumeurs ni la répartition des 880 souris entre les procédures ne sont précisés.

Objectifs

Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales les plus agressives. La faible diffusion des médicaments au travers de la barrière hémato-encéphalique limite fortement leurs efficacités. Ainsi, le développement de stratégies thérapeutiques sur-mesure conçues pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique constitue un besoin clinique majeur. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Une molécule ciblant ces protéines a été développée et induit une ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule peut être utilisée pour augmenter la diffusion et l’efficacité des médicaments contre les tumeurs cérébrales.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales, ainsi que d’augmenter leurs efficacités

Procédures

Maximum de 21 injections (< 1 minute par injection) par souris, avec un intervalle entre deux injections allant de 24h à 72h en fonction des traitements. Maximum de 1 procédure chirurgicale par souris (15minutes).

Impact sur les animaux

Douleurs légères et de courte durées liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro de perméabilité sur cellules endothéliales cérébrales ont été réalisées. Cependant, la complexité de la barrière hémato-encéphalique ne peut pas être entièrement répliquée in vitro. Cette complexité se retrouve conservée entre humains et souris, faisant de la souris un modèle nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Pour éviter le stress et la douleur, les injections seront réalisées sous anesthésie générale associée en amont à une analgésie. Nous avons mis en place des points limites adaptés à chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière hémato-encéphalique qui ne peut pas être entièrement répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris génétiquement modifiées avec une barrière hémato-encéphalique perméable ou imperméable. Des souris adultes entre 2 et 8 mois seront utilisées pour l’étude des effets de la barrière hémato-encéphalique sur la diffusion et l’efficacité́ des molécules thérapeutiques visant les tumeurs cérébrales.

Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".

Objectifs

La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.

Procédures

Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).

Impact sur les animaux

- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.

Remplacement

Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.

Réduction

Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.

Raffinement

À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.

Choix des espèces

Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.

Opérées au crâne pour quarante-quatre d'entre elles afin d'y retirer localement une protéine, puis placées seules quatre fois vingt-quatre heures dans une cage instrumentée, 176 souris porteuses de mutations liées à l'autisme voient ensuite leur sommeil enregistré pendant quarante-huit heures. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur n'annonce aucun effet indésirable attendu hormis d'éventuels signes de stress ou de grattage, et prévoit de demander une dérogation aux conditions d'hébergement si l'isolement de quarante-huit heures est jugé trop long. Toutes sont tuées à la fin, le porteur écrivant n'avoir "rien d'autre à étudier avec eux" et ne pas souhaiter garder ces lignées dans son animalerie.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique sont fréquemment accompagnés de perturbations du sommeil, comme des insomnies, une fragmentation des cycles veille-sommeil ou des difficultés à maintenir un sommeil réparateur. Ces problèmes ont un impact significatif sur la qualité de vie et peuvent aggraver les symptômes comportementaux associés à l’autisme. Dans ce projet, nous utilisons des souris porteuses de mutations génétiques similaires à celles retrouvées chez les individus autistes, ce qui permet de modéliser ces troubles de manière précise. Nous allons analyser leurs comportements de sommeil en mesurant des paramètres tels que la durée totale du sommeil, la fréquence des réveils et les transitions entre les différentes phases du cycle veille-sommeil. L’objectif est d’identifier, parmi ces souris, celles dont les troubles de sommeil sont les plus marqués. Une attention particulière sera portée au rôle du cervelet, une structure clé dans la coordination des fonctions motrices et cognitives, mais également impliquée dans la régulation des rythmes veille-sommeil. Cette identification est cruciale pour mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents et guider nos recherches futures vers des stratégies thérapeutiques ciblées.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce travail permettra de mieux comprendre les troubles du sommeil dans des modèles de souris porteurs de mutations liées à l’autisme, apportant des informations précieuses sur les mécanismes biologiques impliqués. Ces connaissances pourront éclairer comment les anomalies génétiques affectent les circuits cérébraux qui régulent le sommeil, et comment ces perturbations contribuent aux symptômes comportementaux associés à l’autisme. En identifiant les liens spécifiques entre mutations, troubles du sommeil et fonctionnement neuronal, cette recherche ouvre la voie à une compréhension plus intégrée des interactions complexes entre sommeil et développement neurocognitif.

Procédures

Nous utiliserons quatre lignées de souris différentes, toutes modèles du spectre autistique, les 44 souris Shank3 fl/fl recevront une injection stéréotaxique (de 20 minutes) comprenant également trois injections sous-cutanées de xylovet (20 s) 3 min avant l’incision pour l’injection stéréotaxique et en fin de chirurgie (20 s) et 24h après la chirurgie (20 s). Cette intervention permettra de retirer localement une protéine. Tous les animaux de l’étude (10 jours après leur chirurgie pour les Shank3 fl/fl) seront placés individuellement dans une cage spécialement conçue pour enregistrer les mouvements de la souris, grâce à un tapis de sol. Ce dispositif permet d’enregistrer leur sommeil, tout en préservant un cadre de vie confortable et le plus proche possible de leurs conditions naturelles. Ainsi les souris seront placées 4 fois 24h pour habituation dans ces cages, puis 1 fois pendant 48 h pour l’enregistrement de sommeil.

Impact sur les animaux

Si des signes de stress ou de grattage survenaient, une attention particulière sera apportée à ces animaux pour limiter leur souffrance et leur douleur.

Devenir

À la fin de ces expérimentations, les animaux seront euthanasiés, car ils n’entrent dans aucune autre procédure, nous n’avons rien d’autre à étudier avec eux et nous ne souhaitons pas garder ces lignées dans notre animalerie.

Remplacement

L’habituation plusieurs fois 24h avant l’enregistrement est un raffinement qui vise à diminuer le stress des animaux du au changement d’environnement. Cette étape permet de réduire l’impact des facteurs émotionnels sur les paramètres physiologiques étudiés et vise à améliorer la fiabilité et la reproductibilité des données. Par ailleurs, les objectifs scientifiques de cette étude nécessitent des enregistrements des comportements de sommeil, qui ne peuvent être réalisé sur des modèles alternatifs (in silico, in vitro, ou sur tissu isolé). Le recours à l’animal vivant est donc indispensable à la compréhension des mécanismes sous-tendant la régulation du sommeil.

Réduction

Nous avons choisi un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire. Ce nombre d’animaux choisi correspond également à ce que l’on retrouve dans d’autres études similaires, où la variabilité liée au sommeil est déjà bien documentée.

Raffinement

Tout au long de la procédure, les souris seront régulièrement surveillées afin de détecter Pour les souris subissant une chirurgie, une anesthésie sera réalisée. Tout au long des procédures, les souris seront régulièrement surveillées afin de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Des points limites strictes et spécifiques à ce protocole ont été définis (perte de poids, prostration, automutilation, anomalies comportementales persistantes, etc.). L’expérimentation sera immédiatement interrompue si ces critères sont atteints, avec administration de soins appropriés et d’une analgésie, et le cas échéant, euthanasie sans délai, afin de prévenir toute souffrance inutile. Une demande de dérogation aux conditions standards d’hébergement prévues à l’article R. 214-95 du Code rural et de la pêche maritime sera formulée si l’isolement en cage individuelles pendant 48h est perçu comme trop long.

Choix des espèces

Les animaux génétiquement modifiées n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes que les souris, tout du moins concernant les mutations que nous souhaitons étudier. Elles nous permettent par conséquent d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveau-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes entre 2 et 4 mois.

3 648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections abdominales sur animal vigile pour déclencher la modification génétique, puis des glucocorticoïdes ou des régimes obésogènes pendant quatre jours à vingt semaines, avec des jeûnes de cinq à quinze heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures. Elles passent aussi deux minutes immobilisées dans un tube pour la mesure de leur masse grasse et dix minutes dans un test d'anxiété dont le protocole n'est pas nommé. L'objet est de décrire les effets d'un excès de glucocorticoïdes sur la graisse, le foie et le comportement, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit "la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les glucocorticoïdes sont des outils thérapeutiques amplement utilisés dans un large panel de maladies chroniques inflammatoires. Néanmoins chez certains patients, l’utilisation à long terme et à fortes doses peut entrainer des maladies telles que le diabète, des maladies du foie et des anomalies de répartition des dépôts adipeux, présentant des altérations fonctionnelles. Ces altérations peuvent également impacter le comportement des animaux et favoriser des troubles de l’anxiété à différents âges. Ce projet de recherche vise à décrire l’impact d’un excès de glucocorticoïdes sur la physiologie des tissus adipeux et les conséquences métaboliques sur d’autres tissus sensibles à l’action de l’insuline tels que le foie et le muscle squelettique ainsi que les conséquences sur l’activité cognitive. De plus, les expériences décrites dans ce projet permettront d’étudier le rôle des glucocorticoïdes dans un contexte d’obésité induite par des régimes obésogènes, sur les maladies hépatiques, la fonctionnalité des organes sensibles à l’insuline et dans l’équilibre glycémique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement et la morphologie des tissus graisseux, notamment lors de traitements de longue durée. Plus largement, nous examinerons aussi les conséquences de leur action des glucocorticoïdes sur les maladies du foie (par exemple, l'accumulation de graisse dans le foie, l'inflammation, la fibrose ou la cirrhose), induites par des régimes riches en graisses. À terme, ces recherches pourraient montrer que bloquer l'action de ces hormones au niveau des tissus graisseux pourrait devenir une solution pour réduire les effets négatifs de ces traitements ou de ces régimes sur le métabolisme.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours soit un total de 5 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à différents traitements via des régimes alimentaires spécifiques et/ou l’eau de boisson durant 4 jours à 20 semaines selon les groupes. Les animaux seront impliqués dans une mesure de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests pour évaluer soit la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun (entre 5h et 15h selon les actes), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen ou par voie orale et 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Des souris adultes et âgées seront également soumises à des tests de comportement pour mesurer l’anxiété des souris traitées ou non (1 fois, 10 minutes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses. Une seconde partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin (2-3 minutes) ou une chirurgie (8-10 minutes) immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.

Impact sur les animaux

Les modèles transgéniques inductibles subiront des injections pour induire l’invalidation du gène d’intérêt. Les administrations entrainent une contrainte/stress liée à la contention, à la piqure qui sont légers et de courte durée. Une partie des animaux subiront des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés pendant plusieurs semaines à des régimes obésogènes pouvant induire une obésité associée à une insulino-résistance et le développement des pathologies hépatiques qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Les animaux soumis à une mesure de la composition corporelle subiront un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention durant la mesure (1 fois, environ 2 minutes). Les souris seront inclues dans plusieurs tests de phénotypages métaboliques. Ces phénotypages seront réalisés sur des souris à jeun, pour lesquels l’alimentation aura été supprimée auparavant (entre 5h et 15h en fonction des tests mis en œuvre). Cela pourrait induire une sensation de faim au cours de ces périodes. Elles seront également amenées à suivre des challenges métaboliques. Ces manipulations pourront entrainer un stress et une douleur de courte durée (contention, administration par orale et/ou injection, prélèvement sanguin de faible volume) ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, avant l’euthanasie en vue des différentes analyses, une partie des animaux subira une unique injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les animaux seront ensuite euthanasiés après quelques minutes par une méthode réglementaire. Une autre partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés afin d’effectuer un prélèvement sanguin terminal qui sera suivi d’une euthanasie sans réveil des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux.

Remplacement

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement des tissus graisseux, ainsi que d’autres organes sensibles à l’insuline tels que le foie. D’un point de vue évolutif le GR apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Ce travail de physiologie intégrée permettra de comprendre d’une part, l’activité sensori-motrice et le degré d’anxiété des animaux et d’autre part, les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre les différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire le comportement des animaux et les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 3648 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié. Les administrations de traitement via l’eau de boisson seront surveillées et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Les régimes seront placés en faible quantité afin de garantir une qualité optimale de l’aliment et son appétence. Les différentes explorations métaboliques et comportementales mises en œuvre seront effectuées par du personnel formé au geste et selon des protocoles maitrisés et les mises à jeun seront réduites au maximum pour réduire la contrainte sans compromettre l’obtention des résultats scientifiques De plus, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Les souris transgéniques seront utilisées à l’âge adulte et/ou âgées car nous étudions l’impact des glucocorticoïdes sur des tissus et organes matures, totalement différenciés.