Recherche fondamentale

Valider chez la brebis un gel contraceptif destiné aux femmes : 229 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées dans l'élevage à l'issue du projet. Chacune reçoit une injection de synchronisation, deux injections intramusculaires d'une hormone abortive et trois prises de sang à la jugulaire, le cycle étant répété quatre à cinq fois dans l'année. Le porteur reconnaît que l'avortement provoqué peut déclencher des contractions utérines douloureuses, une accélération cardiaque et respiratoire, voire une rétention placentaire avec fièvre et abattement. Il présente ce gel, déjà efficace de 90 à 100 % in vitro, comme une "alternative révolutionnaire" aux contraceptifs existants.

Objectifs

L'objectif du projet est de valider in vivo un gel contraceptif non-hormonal humain chez la brebis. Les méthodes contraceptives hormonales existantes provoquent des effets secondaires et/ou de l'inconfort, tels que prise de poids, diminution de la libido, augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de dépression. Malheureusement, les contraceptifs non hormonaux existants sont souvent peu pratiques. Ce projet propose donc de valider in vivo chez la brebis, un gel à déposer au niveau de l'orifice du col de l’utérus, qui en interagissant avec le mucus, formerait un bouchon empéchant le passage des spermatozoïdes. Déjà validé in vitro avec une efficacité de 90 à 100%, l'objectif est maintenant de tester son efficacité in vivo, en se basant sur l'évaluation du passage ou non des spermatozoïdes dans le col de l’utérus de la brebis, dont la preuve effective est la fécondation.

Bénéfices attendus

Le gel contraceptif développé dans le projet est présenté comme une alternative révolutionnaire aux méthodes actuellement existantes : hormonales (avec tous les effets secondaires connus), non hormonales (qui présentent elles aussi des inconvénients), et les méthodes dites non-techniques (qui ont une efficacité relative). Ce gel est en effet très efficace (entre 90% et 100% d’efficacité in vitro), sans hormones, peu invasif et très pratique d’utilisation. Il représente donc une solution de choix pour les millions de femmes qui ne peuvent et ne veulent pas utiliser d’hormones.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection lors du traitement de synchronisation, deux injections de l'hormone abortive par voie intra-musculaire, ainsi que trois prises de sang à la veine jugulaire. Ceci répété 4 à 5 fois. Chaque intervention dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : douleur et hématome possible après les prises de sang, douleur causée par les injections par voie intramusculaire, répétées 4 à 5 fois dans l’année. Un stress peut être également occasionné par la contention nécessaire lors des injections et prises de sang. L’induction de l’avortement peut déclencher des contractions utérines douloureuses. Le cloprosténol peut provoquer des effets liés à l'activité de la prostaglandine dans les muscles lisses, tels qu'une augmentation de la fréquence cardiaque et respiratoire et une gêne abdominale. Si malgré toutes nos précautions une rétention placentaire devait arriver, les animaux pourraient souffrir de fièvre, abattement, respiration plus rapide.

Devenir

Les 229 animaux restants retourneront dans l'élevage

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’un produit destiné à l’usage chez l’Homme doit d’abord se faire sur animaux, lorsque cela est éthiquement admissible. Dans notre cas, l’efficacité du gel a été évaluée in vitro. Elle doit maintenant être confirmée in vivo, avant de pouvoir démarrer une phase d’essai chez la femme. L’étude du passage des spermatozoïdes à travers le col de l’utérus n’est pas permise par des modèles in vitro et requiert des animaux pour l’étudier dans toute sa complexité.

Réduction

Sur la base statistique de puissance, nous avons défini qu'un nombre minimum de 209 animaux au total était suffisant pour valider in vivo l'efficacité du contraceptif non hormonal. De plus, le traitement évite de mener des gestations non nécessaires à terme et donc la procréation d’animaux non nécessaire.

Raffinement

Les brebis resteront dans leur troupeau tout au long du projet, et seront traitées sur le site d’élevage, par des opérateurs expérimentés. Un renforcement positif alimentaire sera mis en place après chaque manipulation. Les animaux seront habituées aux manipulations avant le démarrage de l'expérimentation. Les cous des brebis seront tondus afin que la veine jugulaire soit plus accessible, et éviter les hématomes. Une crème décongestionnante sera appliquée après le prélèvement. Si une infection utérine devait advenir, des antibiotiques et antiinflammatoires seraient administrés. De même, si l’avortement induit devait déclencher des contractions utérines douloureuses, un antiinflammatoire non stéroïdien serait administré.

Choix des espèces

La brebis est un bon modèle pour etudier l'efficacité d'un contraceptif humain, notamment pour le site de depôt du sperme (vagin) qui est le même que pour l'espèce humaine, mais également pour étudier la viscosité du mucus cervical et le passage des spermatozoides à travers le col utérin. Il est donc nécessaire d'utiliser des brebis adultes matures sexuellement, dans un état physiologique permettant une fécondation.

Deux injections dans le cerveau, une heure d'opération chacune, puis une chirurgie terminale deux mois plus tard : 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cerveau. Seize d'entre elles subissent en plus trois prélèvements sanguins alors qu'elles sont éveillées. Le projet teste un vecteur viral censé apporter une copie fonctionnelle d'un gène défectueux, première étape déclarée vers une thérapie génique de certaines formes d'autisme. Toute souris dépassant un score de 15 sur la grille de surveillance est tuée, ce que le porteur présente comme la garantie qu'aucun animal ne subira de "souffrance prolongée".

Objectifs

Certaines maladies du spectre autistique sont des troubles graves qui affectent le développement et le fonctionnement du cerveau. Ces troubles comprennent des problèmes sociaux, des comportements répétitifs et des crises d'épilepsie, qui apparaissent dès l'enfance et affectent grandement la qualité de vie des individus et de leur famille. Aujourd’hui, les traitements ne font que réduire ces symptômes, mais ne réparent pas la cause du problème. Ce projet cherche une nouvelle solution appelée thérapie génique. L’idée est d’ajouter une “bonne copie” d’un gène défectueux pour aider le cerveau à mieux fonctionner. L’étude a trois objectifs : 1.Vérifier que le traitement atteint les bonnes cellules : Nous allons observer quelles cellules du cerveau peuvent recevoir cette nouvelle copie du gène. 2.Tester si le gène fonctionne bien : Nous vérifierons si les neurones traités produisent correctement la protéine dont ils ont besoin. 3.S’assurer que le traitement est sûr : Nous nous assurerons qu’il n’y a pas d’effets secondaires graves ou de dommages au cerveau, pour qu’un jour ce traitement puisse être utilisé chez l’homme. Ce projet pourrait constituer une étape majeure vers un traitement innovant et personnalisé pour les personnes atteintes de ces troubles.

Bénéfices attendus

1. Un nouveau traitement pour l’autisme : ce projet cherche une nouvelle façon de soigner certaines formes d’autisme causées par un problème dans un gène. Il vise à réparer ce dysfonctionnement dans le cerveau pour aider les neurones à mieux fonctionner. Ce traitement pourrait aussi servir pour d’autres maladies du cerveau. 2. Mieux comprendre l’autisme : en étudiant comment un gène défectueux affecte le cerveau, les chercheurs pourront mieux comprendre pourquoi certaines personnes développent de l’autisme ou de l’épilepsie. Ces découvertes aideront à améliorer les traitements et à mieux soigner d’autres troubles du développement cérébral. 3. Un pas vers un véritable remède : si les résultats sont positifs, ce projet pourrait mener à des tests sur l’homme et, à terme, à des traitements personnalisés. En résumé, cette recherche pourrait changer la vie des personnes atteintes d’autisme d’origine génétique et ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour d’autres maladies du cerveau.

Procédures

Toutes les souris recevront deux injections intracérébrales (l'opération dure une heure), et après deux mois, pour le prélèvement du cerveau, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée. Une partie des souris, (16 animaux au total), feront l'objet d'une procédure de prélèvement sanguin (avec les animaux éveillés, cette manœuvre dure 30 secondes par animal), trois fois pendant la durée du projet.

Impact sur les animaux

Douleur et inconfort après l'opération. Les animaux peuvent ressentir une légère douleur au niveau de la tête ou de la mâchoire pendant environ 12 heures après l'opération. Stress associé à la manipulation, risque d'infection. Réactions locales à la plaie. La petite plaie à la tête pourrait s'infecter ou s'enflammer. Risque pour les connexions neuronales. Il existe un très faible risque que l'injection perturbe d'importantes connexions cérébrales, ce qui pourrait affecter certains mouvements.

Devenir

Dans cette étude, tous les animaux seront euthanasiés avec un chirugie terminale sous anesthésie à la fin de la procédure. Cette étape est nécessaire pour permettre l’analyse approfondie de leurs organes, notamment du cerveau, afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques étudiés. Ces analyses, réalisées selon des techniques histologiques précises, sont indispensables pour obtenir des résultats fiables et avancés, contribuant ainsi à la recherche scientifique et médicale. Cette approche garantit également que les animaux ne subissent aucune souffrance prolongée, en accord avec les principes de bien-être animal et les réglementations en place.

Remplacement

Malgré les efforts continus pour développer des modèles alternatifs, l'utilisation de souris reste indispensable dans les études sur les maladies neurologiques, en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d'examiner ces mécanismes au sein d'un organisme vivant. Bien que les cultures de cellules souches neurales et les organoïdes cérébraux fournissent des informations précieuses sur les réseaux neuronaux, ils ne reproduisent pas entièrement le microenvironnement cérébral complexe, en particulier les interactions cruciales entre les différents types de cellules. Ces interactions sont essentielles pour comprendre les altérations des réseaux neuronaux dans des conditions telles que l'épilepsie ou certains comportements associés aux troubles du spectre autistique. Les progrès de la modélisation informatique permettent des simulations utiles de certains aspects des réseaux neuronaux, mais ces modèles sont limités par des données restreintes et la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris, bien qu'elles ne reproduisent que partiellement les comportements et les altérations des réseaux humains, sont particulièrement utiles dans leurs versions génétiquement modifiées pour des gènes spécifiques. Ces modèles constituent une base précieuse pour l'étude du rôle de certaines protéines, permettant aux chercheurs de tester comment moduler ou restaurer l'expression des gènes dans le cadre de pathologies telles que l'épilepsie ou l'autisme, et ainsi de mieux comprendre des mécanismes similaires chez l'homme et de développer des traitements potentiellement plus efficaces. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons d'abord chaque vecteur viral en culture cellulaire pour nous assurer qu'il exprime correctement les protéines. Seuls les vecteurs qui passent ce contrôle de qualité en culture seront ensuite utilisés sur des animaux vivants, ce qui réduira la nécessité d'utiliser des modèles animaux uniquement lors des étapes cruciales de validation.

Réduction

Nous avons analysé les données antérieures de notre laboratoire et examiné la littérature existante afin de déterminer le nombre minimum d'échantillons nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Étant donné que nous incluons des animaux mâles et femelles et que nous comparons trois conditions différentes en utilisant des techniques d'histologie, nous avons soigneusement calculé la taille de l'échantillon nécessaire. Plutôt que de commencer avec un nombre fixe, par exemple 10 par groupe, nous optimisons le nombre d'animaux sur la base de notre expérience antérieure et des études publiées. Cette approche nous permet d'utiliser le moins d'animaux possible tout en maintenant la validité scientifique de nos résultats.

Raffinement

Tout au long du projet, toutes les mesures nécessaires seront mises en œuvre pour éviter tout impact négatif sur le bien-être des animaux. L'expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d'hébergement appropriées, l'enrichissement de l'environnement et la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse des animaux. Ils sont placés dans des avec une maison en carton, de la laine de coton et une roue d'exercice, afin de répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera vérifié une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures pour réduire la douleur. Après les procédures, de la nourriture gélifiée et de l'eau seront placées sur le sol pour faciliter l'alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour suivre de près les effets des interventions. Les animaux présentant l'un des points limites ou un score supérieur à 15 dans ce tableau seront systématiquement euthanasiés.

Choix des espèces

L’objectif principal de ce projet est de développer un nouveau traitement. Avant d’y parvenir, nous devons d’abord tester la sécurité et l’efficacité de notre vecteur viral chez des souris. Nous utilisons de jeunes souris adultes âgées de 2 à 3 mois, car elles offrent plusieurs avantages. À cet âge, leur cerveau est complètement formé et elles sont en bonne santé, ce qui garantit des résultats fiables. Leur crâne est également suffisamment stable pour permettre des injections précises dans les régions spécifiques du cerveau. Cela nous aide à analyser où le vecteur se distribue et quels neurones il cible, ce qui est crucial pour améliorer la précision et la validité des résultats. Ce travail est une étape essentielle pour développer des solutions thérapeutiques innovantes pour des maladies complexes.

Deux séjours de quarante-huit heures seule en cage d'enregistrement pour 292 souris, une chirurgie d'injection intracérébrale de trente minutes pour 242 d'entre elles, puis une chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever le cerveau : 350 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à relier un gène de l'hypothalamus antérieur au sommeil et à la thermorégulation, en s'appuyant sur les troubles du sommeil observés chez les personnes diabétiques. Les atteintes annoncées restent vagues, avec des "perturbations du rythme de sommeil" envisagées et une sensibilité après chirurgie dont les animaux "récupèrent habituellement en quelques heures". Le régime riche en graisses qui rend ces souris obèses et diabétiques figure dans la liste des effets néfastes, sans apparaître parmi les procédures décrites.

Objectifs

Les variations de glycémie liées à un diabète mal contrôlé sont fréquemment associées à des troubles du sommeil (sommeil fragmenté, cauchemars, apnées du sommeil, fatigue diurne) et à des défauts de thermorégulation (sueurs, hypothermie). L’hypothalamus antérieur contrôle plusieurs fonctions telles que le sommeil et la thermorégulation. Nous avons observé qu’un gène connu pour contrôler la synthèse de l’insuline en réponse au glucose dans le pancréas est également présent dans l’hypothalamus antérieur. Ce projet expérimental a pour but : (1) de caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones exprimant ce gène dans l’hypothalamus ; (2) d’étudier le rôle de ce gène dans l’hypothalamus antérieur et sa régulation par le glucose; (3) d’établir dans quelle mesure la régulation de ce gène pourrait être responsable des troubles du sommeil et de la thermorégulation.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce travail apportera une meilleure connaissance des réseaux neuronaux contrôlant le sommeil et la thermorégulation ainsi qu’un éclairage moléculaire nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles pour le traitement des troubles du sommeil associés au diabète, en ciblant par exemple les modifications post-traductionnelles de ce facteur de transcription.

Procédures

enregistrement de l'activite veille/sommeil en cage individuelle ( 2x 48h, n=292 souris ) procédure chirurgicale injection intracerebrale ( n= 242 animaux , durée de l'intervention : 30 minutes + 1h de reveil) chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau (n=242 animaux durée analgesie 30 minutes avant +15 minutes)

Impact sur les animaux

En l’absence de stimulation, aucun phénotype dommageable n’a été rapporté les lignées murines utilisées dans ce projet. L’effet de la stimulation de ces quelques neurones de l'hypothalamus antérieur est transitoire (1h) et son effet sur les animaux sera suivi en continu. Des perturbations du rythme de sommeil sont envisagées. Les chirurgies sont susceptibles d’entrainer une sensibilité post chirurgie. Les animaux récupèrent habituellement en quelques heures. Le sommeil des animaux est enregistré en en cages individuelles. Le régime alimentaire riche en graisse induit une obésité et un diabète.

Devenir

les animaux sont mis a mort pour permettre l'analyse post-mortem de leur cerveau (expression de gènes et de protéines d'interêt)

Remplacement

Il n’est pas possible d’étudier une fonction physiologique complexe comme la régulation du sommeil hors d’un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est optimisé pour permettre de mettre en évidence le résultat de façon statistiquement significative (puissance du test 80% risque alpha 5%) tout en minimisant le nombre d’animaux requis . La taille des groupes est donc calculée dans chacune des procédures en fonction des effets attendus. Dans le cas de l'étude anatomique, uniquement descriptive, le nombre retenu (n=10) est celui généralement mentionné dans les publication anatomiques comparables. La séquence expérimentale est optimisée (ex : étude anatomique suivant les test de sommeil) de façon a minimiser le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.

Raffinement

Les modèles conditionnels dans lesquels les modifications génétiques sont restreintes à quelques neurones de l’hypothalamus antérieur permettront d’éviter des phénotypes plus dommageables. Pour les enregistrements (48h), les animaux sont placés avec les memes elements d'enrichissement en cages individuelles où ils gardent un contact visuel entre eux. Les approches non invasives sont systématiquement privilégiées. L’administration par voie orale se fera, après habituation, en proposant le principe actif dans un petit volume de gélatine aromatisé aux fruits rouges. Lorsqu’une expérimentation nécessite une intervention chirurgicale, en plus de l’anesthésie générale, des anesthésiques locaux et des analgésiques seront systématiquement administrés en péri-opératoire.

Choix des espèces

L’existence et la disponibilité de souris génétiquement modifiées qui n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes (dont la température est régulée) nous permet d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveaux-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes, mais pas âgées, entre 2 et 6 mois.

Les souris dont la prise de poids finit par gêner la locomotion sont retirées du projet et mises à mort. 88 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes, la moitié après un transfert vers un second établissement. Chacune est pesée quinze ou seize fois, mise à jeun quatre ou quinze heures, gavée deux à trois fois, saignée à la queue trois ou quatre fois, injectée dans l'abdomen puis dans le sinus derrière l'œil, et passe quarante-huit heures seule en cage de mesure. Le porteur décrit ses lignées génétiquement modifiées comme des souris qui "se portent bien", et retient l'espèce pour la ressemblance de son métabolisme oro-intestinal avec celui de l'être humain.

Objectifs

L’excès de lipides alimentaires est associé à l’obésité via un apport énergétique et une inflammation élevés. CD36 est un récepteur présent notamment au niveau des membranes des cellules intestinales qui contrôle la formation des lipoprotéines synthétisées par l’intestin au cours de la digestion. Ces lipoprotéines véhiculent les lipides alimentaires mais aussi des molécules pro-inflammatoires issues du microbiote intestinal. Le premier objectif de ce projet sera donc d’évaluer la contribution du CD36 intestinal sur la régulation de la dépense énergétique de souris rendues obèses par un régime de type occidental (riche en graisses et en sucres). Nos précédents travaux de recherche laissent envisager que le CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique dans le traitement des pathologies telles que l’obésité. Pour ce faire nous utiliserons des souris déficientes en CD36 spécifiquement au niveau des cellules intestinales comparées à des souris contrôles. 32 souris contrôles et 32 souris déficientes en CD36 seront nourries soit avec un régime standard, soit avec un régime occidental durant 15 semaines (temps nécessaire pour observer des effets). Le deuxième objectif de ce projet consiste à évaluer les conséquences d’une sur-activation de CD36 intestinal dans la mise en place de l’obésité. De précédents travaux ont permis de montrer que des leurres lipidiques, c’est-à-dire des molécules mimant les lipides mais n’apportant pas de calorie, diminuaient la consommation de lipides chez la souris obèse, en activant CD36 au niveau des papilles gustatives. Dans ce projet, nous étudierons à présent l’effet d’un leurre lipidique au niveau intestinal sur la mise en place de l’obésité induite par une régime occidental chez la souris. Pour cela, 24 souris contrôles seront nourries avec ce régime durant 8 semaines (temps nécessaire pour observer des effets dans ce cas). 12 souris recevront chaque jour le leurre lipidique en complément de leur alimentation et seront comparées à 12 souris recevant un placebo. Au total, 88 souris seront utilisées dans ce projet, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le CD36 intestinal modifie-t-il la dépense énergétique en régimes standard et de type Western Diet (riche en acides gras saturés et en sucres) ? 2. Le CD36 intestinal modifie-t-il les capacités d’absorption intestinale des lipides alimentaires et la perméabilité intestinale lors d’un régime riche en acides gras saturés ? 3. La suractivation de CD36 intestinal par des leurres lipidiques affecte t-elle la mise en place de l’obésité ? En fonction des résultats obtenus dans ce projet, CD36 intestinal pourrait constituer une cible thérapeutique en cas de surconsommation de lipides alimentaires.

Procédures

L’ensemble de l’effectif du projet recevra un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) et sera soumis à un suivi de masse corporelle hebdomadaire pour la procédure 1 (15 pesées sur 15 semaines de régime) et bi-hebdomadaire pour la procédure 2 (16 pesées sur 8 semaines de régime), ainsi qu’un suivi de masse grasse et masse maigre par une technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 3 minutes) en semaines 0, 2, 4 , 9 ou 10, et 15 pour la procédure 1(5 mesures par souris au cours du régime), et en semaines 0, 2, 4, et 8 (4 mesures par souris au cours du régime) Dans la procédure 1, 2 gavages seront réalisés : en S12 avec de l’huile et une molécule fluorescente en solution aqueuse, et en S14 avec une solution aqueuse contenant la molécule fluorescente. Dans la procédure 2, 3 gavages seront réalisés (durée de moins de 10 secondes à chaque fois) : en S5 avec du glucose, en S7 avec une solution aqueuse contenant une molécule fluorescente et en S8 avec de l’huile. Dans la procédure 2 uniquement, une injection intrapéritonale sera réalisée en S4 avec de l’insuline. L’injection intrapéritonéale est un geste rapide (moins de 10 secondes) et effectué par du personnel formé et habitué à le réaliser. Une injection intraveineuse au sinus retro-orbital sous anesthésie générale sera réalisée avec une molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme (en S14 dans la procédure 1 et en S8 dans la procédure 2). Cette injection rapide (moins de 10 secondes) est effectuée sous anesthésie par du personnel formé. Des prélèvements sanguins au niveau caudal par simple pression après une légère incision du bout de la queue (0,5mm) et sous anesthésie locale seront également réalisés en semaines 11, 12, et 14 pour la procédure 1 et en semaines 5, 6, 7 et 8(environ 1min par souris par prélèvement). Dans la procédure 1, une mesure de la dépense énergétique est réalisée en semaine 9 ou 10. Cette mesure indolore et non invasive s’effectue dans des cages spécifiques. Elle nécessite 2 jours d’isolement dans cette cage. Dans la procédure 1, toutes les interventions se dérouleront dans l’EU1 jusqu’à la semaine 15. En semaine 16, la moitié de l’effectif (32 souris) sera transféré dans l’EU2 dans des boites de transports adaptées et y restera 48H. Les animaux seront alors soumis à un jeûne court de 4H avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale. La procédure 2 se déroulera exclusivement dans l’EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux en régime WD peuvent avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’est jamais observé après 3 mois de régime. Le projet requiert d’individualiser les souris lors des mesures de dépense énergétique pendant 48h, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les tests de tolérance orale au glucose et à l’insuline, et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent des mises à jeun de 4 ou 15h. Les mises à jeun de 4h se font sur la matinée en dehors de leur phase de nourriture nocturne et n’a donc que peu d’impact. La mise à jeun nécessaire de 15h se fait sur la nuit lors de leur phase de nourriture nocturne et s’avère donc plus stressante pour les animaux qui auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Le test de tolérance orale au glucose et l’étude de l’hypertriglycéridémie nécessitent une préhension des animaux afin de les gaver ce qui peut être stressant pour les souris. Le test de tolérance à l’insuline nécessite une préhension des souris et une injection intrapéritonéale qui peut également être invasive. L’analyse de la composition corporelle nécessite de faire entrer les souris dans un tube plastique dans lequel elles doivent rester 3 minutes, ce qui peut être anxiogène. L’injection de la molécule bloquant temporairement l’action d’une enzyme sera réalisée par voie intra-veineuse sous anesthésie à l’isoflurane par un personnel formé maitrisant ce geste.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, la moitié de l’effectif (32 souris) sera mis à mort dans l’EU1 sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. L’autre moitié (32 souris) sera transféré dans l’EU2 puis mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale pour prélèvements d’organes afin de réaliser des études post mortem.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides.

Raffinement

Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale (application au bout de la queue pour les prélèvements sanguins à la queue), soit sous anesthésie générale (pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids, prise de poids pouvant gêner la locomotion). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet (mise à mort sous anesthésie générale). Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet. Le transport des animaux dans l’EU2 sera effectué au moyen de boites opaques spécifiquement prévues pour les rongeurs, dans lesquelles seront disposées de la nourriture et de l’eau gélifiée, ainsi qu’un enrichissement supplémentaire afin de limiter le stress lié au transport. De plus, les 2 EU étant très proches, le temps de transport sera très court (environ 15minutes).

Choix des espèces

La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent bien, se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.

Pêchés à l'épuisette sans anesthésie, transportés dans un seau opaque, isolés vingt-quatre heures dans un bassin où la température de l'eau descend à 7 °C puis monte jusqu'à 32 °C, 100 bars juvéniles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération se répète jusqu'à cinq fois par poisson, et chaque individu est pesé sous anesthésie toutes les six semaines, jusqu'à douze fois. Le porteur qualifie de "légère" la nuisance aux températures intermédiaires et de "modérée" celle des températures extrêmes chaudes, maintenues moins de deux heures. Après sept jours de retour dans leur bac d'origine, tous les bars sont tués pour prélever leur cœur, leur foie, leur cerveau et leur muscle rouge.

Objectifs

Dans ce projet, nous évaluerons l’impact d’un réchauffement de l’environnement sur la capacité du bar européen à tolérer ou fuir une augmentation de la température de l’eau de son milieu naturel. L’objectif du projet est de déterminer à quelle température il préfère résider ; ainsi qu’à partir de quelle température il fuit, et si ces températures préférées de l’animal sont corrélées aux températures optimales de la centrale énergétique de leur cellule. Le modèle bar est choisi car au stade juvénile, le bar réside dans les estuaires, qui sont extrêmement sujets aux variations thermiques spatiales et temporelles. L’efficacité de la centrale énergétique de la cellule à convertir l’énergie des nutriments en énergie utilisable par les cellules sera aussi mesurée à différentes températures. La corrélation entre la température optimale d’efficacité de la centrale énergétique de la cellule et la température préférée de l’animal sera évaluée. Nous prédisons que la préférence thermique des bars juvéniles s’explique par l’optimum thermique du fonctionnement de leur centrale énergétique cellulaire. Les individus qui passent plus de temps dans une eau relativement chaude ont des centrales énergétiques cellulaires qui ont une efficacité maximale à des températures plus élevées que les individus qui préfèrent les eaux moins chaudes. Les données de ce projet nous fourniront des prédictions quant au comportement et à la physiologie des bars juvéniles dans les nourriceries lors d’évènements de chaleur aigus.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur le comportement et la physiologie du bar sauvage face aux variations temporelles et spatiales de son environnement thermique. A court terme, ce projet nous permettra de mesurer la préférence thermique du poisson sans le contraindre à rester dans un environnement qu’il aurait naturellement fui. Ce projet permettra de savoir si la température préférée de l’animal est corrélée à la température optimale du fonctionnement des centrales énergétiques cellulaires. Ce projet permettra aussi d’évaluer l’effet du conditionnement thermique (15°C et 20°C) sur la température préférée de l’animal et l’optimum thermique des centrales énergétiques cellulaires. A long terme, la réalisation de ce projet nous aidera à mieux mettre en place la surveillance des poissons in situ dans le but d’évaluer leur utilisation de l’espace en fonction de leur environnement thermique. Des connaissances manquent sur les réponses des poissons face aux vagues de chaud. On ne sait pas où se déplacent les animaux dans la journée, en fonction des changements de température réguliers et extrêmes. L’étude de la préférence thermique des poissons nous aidera à prédire leur déplacement sur la côte. Les données de ce projet nous fourniront aussi des prédictions quant à la mise en place des récepteurs dans les nourriceries de bars afin d’évaluer les déplacements des poissons marqués.

Procédures

Chaque poisson aura au maximum 5 pêches et transferts sans anesthésie (4 aller-retours du bac d’élevage au dispositif de mesure de la préférence thermique et l’aller pour la mise à mort) de moins de 3 minutes par transfert. Chaque poisson sera isolé pendant 24h avec une variation de température (par rapport à la température de conditionnement : refroidissement de 8°C et réchauffement de 12°C) qu’il pourra fuir pour retourner à une température préférée. Cette étape sera répétée au maximum 2 fois. Une seule pesée sans anesthésie dans une bassine avec de l’eau sera réalisée suite à la mesure de la préférence thermique, avant le retour vers le bac d’origine. Au préalable de la mesure de la préférence thermique, les poissons seront pesés toutes les 6 semaines sous anesthésie, et au minimum 3 semaines avant la mise à mort pour mesurer le fonctionnement des centrales énergétiques. Cette procédure sera répétée au maximum 12 fois.

Impact sur les animaux

Pour transférer les poissons de leur bac d’origine aux bacs de test et inversement, chaque poisson sera pêché individuellement sans anesthésiant avec une épuisette pour être déposé dans un seau de transport à couvercle opaque. L’animal sera transporté dans le seau sur une courte durée du bac d’élevage au bassin expérimental (3 min, < 100m). L’animal sera ensuite maintenu individuellement dans le bassin expérimental pendant 24h. Après 12h d’habituation dans le bassin expérimental, la température de l’eau d’une des 2 piscines va être diminuée puis augmentée par tranche de 2h (1h de transition + 1h de pallier). Pour les poissons conditionnés à 15°C, la température sera diminuée à 7°C et 11°C, puis augmentée à 19°C, 23°C et 27°C. Pour les poissons conditionnés à 20°C, la température sera diminuée à 12°C et 16°C, puis augmentée à 24°C, 28°C et 32°C. La nuisance générée est estimée légère pour les températures intermédiaires (

Devenir

Les animaux retourneront dans leur bac d’origine pour 7 jours. Puis leur mise à mort sera nécessaire pour prélever les tissus (cœur, foie, cerveau et muscle rouge) pour mesurer les performances mitochondriales.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation animale permet de réaliser une étude qui englobe l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions cellulaires, offrant ainsi la possibilité d’avoir un suivi complet des réponses des centrales énergétiques cellulaires face à l’environnement de l’animal.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et basé sur nos études précédentes qui montrent une relation statistique significative entre les performances animales et le fonctionnement des centrales énergétiques cellulaires à partir de n = 40 par conditions expérimentales.

Raffinement

- Le transfert de chaque poisson entre les bacs d’origine et le bac de test (< 100 m) se fera dans un seau avec un couvercle opaque afin de limiter l’émersion du poisson et diminuer le stress généré par cette manipulation. - Une fois le poisson déposé dans le dispositif expérimental, il sera surveillé (via une caméra) par un expérimentateur pendant 10 minutes. Si le poisson est toujours extrêmement agité, au bout de 10 min, il retournera à son bac d’origine. - Le poisson s’acclimatera dans le dispositif expérimental pendant 14h (une nuit) sans subir de changement de température. - Lors de la mesure de la préférence thermique, l’animal choisira toujours sa température préférée, sans contrainte. - Il sera transféré du dispositif expérimental à son bac d’origine (et inversement) sans changement de température afin qu’il ne soit exposé à aucun choc thermique. Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état des poissons sera réalisée. Des points limites suffisamment stricts et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le bar européen est une espèce largement distribuée en Europe et une ressource économique et nutritive pour de nombreux pays. Il est donc important de prédire les réponses du bar face au réchauffement climatique. Juvénile – entre 0 et 1 an, car au stade juvénile, le bar réside dans les estuaires, qui sont extrêmement sujets aux variations thermiques spatiales et temporelles. En novembre 2024, les animaux avaient un poids de 28 g et une longueur totale de leur corps de 13.4 cm.

Une pompe diffusant un agent hypertenseur est implantée sous la peau et des constricteurs sont posés pour réduire le flux sanguin cérébral. 45 souris vont être utilisées de cette façon dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des examens IRM sous anesthésie répétés toutes les deux semaines pendant trois mois, puis une ponction de liquide céphalorachidien avant leur mise à mort. Parmi les complications possibles, le porteur énumère des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus, un globe oculaire percé, une hémorragie non contrôlée et des lésions du cerveau ou de la moelle épinière. Il rappelle par ailleurs que l'IRM "ne génère aucun signe de souffrance visible".

Objectifs

La maladie des petits vaisseaux (SVD en anglais) est particulièrement fréquente chez les personnes âgées, même sans accident vasculaire cérébral ni démence, et peut représenter les stades précoces de ces affections. L’objectif du projet est de mettre au point un protocole d’imagerie non-invasive, par Imagerie par Résonance Magnétique, similaire à celui appliqué chez l’homme pour détecter les anomalies cérébrales induites par la SVD chez le petit animal, et ainsi pouvoir évaluer l’efficacité de traitements.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. L’utilisation de modèles murins pathologiques permet de valider le protocole IRM similaire à celui appliqué chez l’homme pour détecter les anomalies cérébrales. Ce projet permettra d’évaluer la sensibilité de détection de ces anomalies pour tester ensuite des traitements innovants contre les troubles neurologiques associés à la SVD.

Procédures

Pour créer une hypertension, une pompe diffusant un agent hypertenseur sera posé en sous-cutané des souris (durée 10 min). Pour créer une hypoperfusion cérébrale, les animaux auront une implan-tation de constricteurs sous anesthésie générale gazeuse (durée 10 min). Trois semaines après, tous les animaux subiront des examens IRM sous anesthésie générale. Ces examens seront répétés 2 semaines plus tard, jusqu’à 3 mois d’observation. Après le dernier examen IRM, un traceur fluorescent sera injecté dans la circulation sanguine (geste réalisé en 1 min), puis du liquide céphalo rachidien sera prélevé (5 minutes) avant leur euthanasie. Toutes les actes seront effectués sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'hypertension artérielle générée et la baisse de flux sanguin (hypoperfusion ) sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigues seront des accidents cérébro-vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent un déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les injections peuvent entrainer les événements suivants: globe oculaire percé, hémorragie importante non contrôlée. Le prélèvement du liquide céphalorachidien peut provoquer des saignements au niveau du site de ponction, en particulier si les vaisseaux sanguins sont endommagés pendant l'intervention. Un prélèvement excessif peut perturber l'équilibre du liquide, pouvant affecter la fonction cérébrale ou induire une pression intracrânienne anormale. Le prélèvement peut potentiellement provoquer des dommages aux structures cérébrales sous-jacentes ou à la moelle épinière, pouvant entraîner des troubles neurologiques transitoires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, pour vérifier que les anomalies détectées par IRM sont réellement présentes sur les coupes histologiques.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neurologiques du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que des signes cliniques associés à ces maladies. Il est nécessaire de visualiser par imagerie non-invasive les altérations du cerveau de l’animal vivant, afin de limiter les analyses post-mortem qui nécessitent l’emploi de nombreux animaux. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles pathologioques.

Réduction

Il y aura 2 groupes de souris : hypertendues ou avec une perfusion sanguine cérébrale diminuée. Nous pensons que les anomalies crérébrales induites vont être détectées facilement sur les images IRM. L’avantage de l’IRM est son caractère non-invasif, permettant de suivre les animaux de façon longitudinale. Ainsi, chaque animal est son propre contrôle, ce qui réduit le nombre d’animaux à utiliser. Ceci devrait permettre d’avoir un nombre suffisant par groupe pour déterminer la sensibilité de détection des différentes anomalies par IRM et obtenir des résultats statistiques.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe dans des cages avec libre accès à l’eau et à la nourriture. De l’enrichissement sera placé dans la cage : maisonnette, coton, batônnets de bois à ronger. Tous les actes sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté. L’administration de l’hypertenseur sera réalisée grâce à l’implantation de pompes en sous-cutané, permettant de limiter au maximum les injections répétées. L'utilisation d'anesthésies gazeuse, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux, et un ballonnet pour le contrôle de la respiration lors des examens IRM permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. De plus, une réhydratation des animaux après les sessions d’imagerie sera réalisée. Du gel ophtalmologique sera appliqué à chaque anesthésie pour compenser la sécheresse oculaire. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible et est classée légère en degré de gravité. Une grille de scorage a été établie pour permettre de suivre l’état des animaux tant au niveau de l’apparence physique, du comportement, du poids de corps et de signes cliniques généraux.

Choix des espèces

La souris est est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire à de forte ressemblance avec celui décrit chez l'homme. Les modèles d'hypertension artérielle et de modification de flux sanguin cérébral ont été développés et validés pour cet espèce. Nous utiliserons des souris adultes (10 semaines minimum) c'est à dire, lorsque la maturation du réseau vasculaire cérébral est atteinte.

Vérifier que des molécules injectées dans le sang atteignent bien le cerveau : c'est le seul objet de ce projet, pour lequel 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intraveineuse alors qu'elle est éveillée, maintenue à la main quinze à trente secondes, avec un risque de lésion et d'hématome au point d'injection. Trente à cent vingt minutes plus tard, elles sont anesthésiées puis tuées pour que leur cerveau soit analysé. Le porteur indique que la complexité d'un "organisme entier" ne se reproduit pas in vitro, après avoir pourtant sélectionné ces molécules sur des cultures de neurones.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie génétique neurodégénérative. Les principales manifestations cliniques de cette maladie sont les mouvements choréiques, un déficit cognitif et des troubles psychiatriques. La neuropathologie de la MH affecte préférentiellement une région du cerveau impliqué dans le contrôle des mouvements volontaires. Il n’existe aucun traitement curatif de la MH si bien que la maladie progresse inexorablement vers la mort. Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués à la fois dans les symptômes moteurs et psychiatriques afin de proposer des cibles thérapeutiques que nous testons chez la souris. Nous avons plusieurs cibles thérapeutiques associées à des stratégies thérapeutiques que nous avons déjà étudiées dans un précédent projet et qui montrent des effets bénéfiques sur le comportement cognitif et moteur. L'objectif du projet proposé ici est de confirmer le passage des molécules thérapeutiques dans le cerveau suite à une administration intra-veineuse.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par cette étude permettront de compléter et de publier une étude prometteuse sur de nouvelles cibles thérapeutiques dans la maladie de Huntington (MH). La stratégie adoptée au cours de ce projet est un point de départ important dans l’optique d’une thérapie efficace et durable chez les patients atteints de la MH qui concerne 18 000 cas répertoriés en France.

Procédures

Au cours du projet, les animaux seront soumis à une injection unique en intra-veineuse sur animal vigile, immobilisé par contention manuelle (15-30 secondes maximum). Après un temps de maintien compris entre 30 et 120 minutes, une anesthésie est effectuée suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’administration intraveineuse pourra entrainer un stress lors de la contention nécessaire à l’administration ainsi qu’une douleur de courte durée au site d’injection. Une lésion au site d’injection est possible ainsi que la formation d’un hématome. En fin de période de maintien (30 à 120 minutes après l’injection des molécules), les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. L’anesthésie peut induire un stress thermique et dans de rare cas une détresse respiratoire.

Devenir

Les souris utilisées dans cette procédure seront toutes euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue, en vue des analyses biochimiques nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier le passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par nos petites molécules. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Les molécules testées ont été au préalable sélectionné pour leurs effets bénéfiques sur des cultures primaires de neurones modélisant la pathologie cellulaire de la Maladie de Huntington. Ces tests concernaient la régulation des gènes et aussi la formation d’agrégats et la survie neuronale

Réduction

Le projet impliquera 20 animaux au maximum. Ce projet sera réalisé uniquement sur des souris commerciales de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Les résultats observés chez les souris disposant d’une barrière hémato-encéphalique intègre et fonctionnelle devrait permettre de démontrer le passage de nos petites molécules de la circulation sanguine jusqu’au cerveau. Nous limitons également au maximum le nombre d’animaux par groupe avec seulement 2 animaux/groupe soit 10 animaux par expérience. Nous incluons toutefois la possibilité de réaliser une seconde expérience pour pallier aux éventuels problèmes méthodologiques et/ou pour confirmer les résultats obtenus soit un total maximal de 20 animaux pour l’ensemble du projet. Les molécules seront quantifiées dans les cerveaux des souris contrôles et traitées. Il s’agira de détecter ou non la présence de ces molécules (pas de test statistique).

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress tout en permettant d’atteindre les objectifs scientifiques. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie local/générale, analgésie). Les animaux seront habitués à être manipulés afin de limite le stress lors de l’administration intra-veineuse du composé. L’injection sera effectuée après anesthésie locale par un personnel très expérimenté et ne devrait pas prendre plus de quelques instants. Les animaux seront étroitement surveillés durant les minutes suivants l’injection.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le projet sera mené sur un modèle de rongeur mus musculus reconnu comme modèle animal idéal pour la translation vers les thérapies. La structure de la barrière hémato-encéphalique, les régions cérébrales, les types de neurones et les circuits neuronaux sont largement conservés entre le rongeur et l'être humain. Justification des stades de développement : Les animaux seront utilisés à l’âge de 10 semaines, après une période d’acclimatation d’une semaine minimum. Cet âge permet d’avoir une barrière hémato-encéphalique parfaitement intègre et fonctionnelle de manière à optimiser nos résultats.

L'abdomen de chaque souris est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules tumorales dans la paroi du cæcum ou dans le foie, en quinze minutes. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des traitements injectés trois fois par semaine pendant trois semaines et deux séances d'imagerie hebdomadaires. Toutes sont tuées à la fin, y compris celles dont la tumeur régresse totalement et qui sont alors gardées deux mois de plus sous surveillance par imagerie. Le porteur range ces injections répétées et les anesthésies parmi les nuisances "fugaces" et "passagères", tout en reconnaissant que la croissance des tumeurs et l'apparition des métastases sont elles-mêmes sources de souffrance.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des « immune checkpoints » a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum et dans le foie sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes. Les injections intrapéritonéales de traitements, de luciférase et d’antibiotiques, ainsi que les injections sous-cutanées de buprénoprhines sont une source de nuisances fugaces La manipulation des souris lors des injections des traitements et lors des imageries est une nuisance. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Pour chaque traitement à tester Control, a-CD4, a-PD1 et a-CD4+ a-PD1 (4), 4 groupes de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Toutes les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Les souris recevant une chirurgie nécessitant l’ouverture de la cavité abdominale, recevront une antibiothérapie préventive avant chaque chirurgie. Les procédures telles que l’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie à l’isoflurane suivie d’un réveil sous lampe chauffante (EU2) ou couveuse (EU1), réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être en permanence contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée : 0.1 mg/kg de buprénorphine en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et 0.1 mg/kg de buprénorphine seront injectées en sous-cutanée 2X par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes C57Bl/6, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).