Recherche fondamentale

182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune privée d'eau en dehors d'une heure trente par jour pendant trois semaines, et cela à trois reprises au cours de sa vie, à cinq, douze et dix-huit mois. Un second groupe subit en plus une chirurgie stéréotaxique de trois heures sous anesthésie générale, à quatre mois, pour implanter un dispositif d'enregistrement, puis reçoit une heure de stimulation visuelle par jour pendant trente jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les souris s'adaptent bien à la restriction et stabilisent leur poids autour de 92 % du poids initial, et qu'il a retenu cette privation d'eau parce qu'elle stresse moins qu'une privation de nourriture. La stimulation lumineuse est annoncée comme totalement non invasive et transposable rapidement aux personnes âgées, quand l'usage immédiat consiste à ouvrir le crâne de souris pour enregistrer leur activité cérébrale.

Objectifs

Le vieillissement normal s'accompagne souvent de troubles de la mémoire qui affectent la qualité de vie des personnes âgées. Ces troubles touchent particulièrement la mémoire de travail, qui nous permet de maintenir temporairement des informations en mémoire pour guider nos actions. Cette fonction repose sur la communication entre deux régions cérébrales principales : l'hippocampe, impliqué dans la mémoire, et le cortex préfrontal, essentiel à la prise de décision. Des études récentes suggèrent que les troubles de la mémoire liés à l'âge pourraient résulter d'une perturbation de la communication entre ces régions cérébrales. Notre projet vise à comprendre précisément comment cette communication évolue au cours du vieillissement normal et comment ses altérations conduisent aux troubles de la mémoire. De manière innovante, nous testerons si une stimulation visuelle à une fréquence spécifique, dont nous avons démontré qu'elle augmente significativement la dynamique cérébrale, pourrait restaurer une communication normale entre ces régions cérébrales et ainsi améliorer la mémoire. Ce projet est rigoureusement conçu en conformité avec les principes des 3 R (Réduction, Raffinement, Remplacement). Les animaux seront soumis à une surveillance quotidienne et bénéficieront de soins méticuleux dans des conditions expérimentales strictement contrôlées. Une analyse statistique robuste justifie l'utilisation de 182 souris sur une période de 5 ans pour l'exécution complète de l'étude. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques non-invasives pour maintenir les capacités cognitives au cours du vieillissement normal.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux responsables du déclin cognitif lié à l'âge, tout en ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques facilement transposables chez l'humain. En effet, la stimulation visuelle rythmique étant totalement non-invasive, elle pourrait rapidement être adaptée en une intervention thérapeutique pour maintenir les capacités cognitives des personnes âgées. Les résultats de ce projet pourraient donc ouvrir la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques non-invasives pour maintenir les capacités cognitives au cours du vieillissement normal.

Procédures

Le premier groupe sera soumis à des tests comportementaux à trois âges différents (5, 12 et 18 mois). Chaque période de test comprend une restriction hydrique (accès à l'eau 1h30 par jour pendant environ 3 semaines), deux jours d'habituation au dispositif (10 minutes par jour) suivis des sessions d'apprentissage et de test (16 essais par jour). Le second groupe sera soumis à une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (environ 3h) à l'âge de 4 mois, suivie du même protocole comportemental. À 12 mois pour un premier sous-groupe ou 18 mois pour un second sous-groupe, les animaux recevront une stimulation visuelle quotidienne pendant 30 jours (1h de stimulation encadrée par 1h avant et 1h après dans une pièce calme). Les animaux subissent également une injection pour l’anesthésie

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire de la douleur et une altération temporaire de l'état de santé des animaux. La restriction hydrique nécessaire aux tests comportementaux peut causer un inconfort modéré. Cependant, nos données montrent que les souris s'adaptent bien à ce protocole avec une stabilisation du poids à environ 92% du poids initial. Cette approche a été choisie car elle est moins stressante qu'une restriction alimentaire. L’injection ip d’anesthésique peut induire une douleur aigüe de courte durée

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever le tissu cérébral fixé

Remplacement

Notre projet vise à étudier l'évolution des interactions hippocampo-corticales au cours du vieillissement normal et leur impact sur la mémoire de travail spatiale. Ces processus reposent sur des interactions dynamiques complexes entre structures cérébrales qui ne peuvent être reproduites in vitro ou par des simulations informatiques. De plus, l'étude du vieillissement normal nécessite un suivi longitudinal qui ne peut être réalisé que chez l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux dans chaque groupe représente le minimum nécessaire, déterminé grâce à une analyse statistique rigoureuse. Cette analyse prend en compte plusieurs facteurs importants incluant la variation naturelle du comportement chez la souris ou la mortalité naturelle due au vieillissement. Le nombre d'animaux choisi nous permet donc d'obtenir des résultats scientifiquement valables malgré ces contraintes.

Raffinement

La chirurgie sera opérée sous anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale par injection sous-cutanée au niveau de la zone d’incision chirurgicale. Une pommade d’anesthésique local limitera les douleurs aux oreilles dues aux barres d’oreilles, l’ajout de pommade à base de vitamine A limitera le dessèchement oculaire. Pendant la chirurgie une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien assurera l’analgésie et il sera ajouté au biberon pendant 1 à 3 jours pour assurer l’analgésie post-opératoire. Enfin, la température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté. La lutte contre l’hypothermie se poursuit jusqu’au réveil complet de l’animal en plaçant sa cage sous une lampe chauffante. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, plus particulièrement avec une observation détaillée la semaine suivant la chirurgie. En amont des expériences, les animaux seront familiarisés à la manipulation par l’expérimentateur afin de diminuer le stress. Ils seront également habitués à l’utilisation d’une boite (plutôt qu’un tunnel qui abimerait le dispositif électrophysiologique) pour le transport de l’animal depuis sa cage d’hébergement au dispositif expérimental et viceversa.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle car son cerveau présente des similarités importantes avec celui de l'humain, particulièrement pour les régions impliquées dans la mémoire. Nous avons choisi une lignée de souris (CD1) qui, comme les humains, présente une diversité génétique naturelle. Ceci est particulièrement important pour étudier le vieillissement, qui varie d'un individu à l'autre. L'étude suivra les souris de l'âge adulte (4-5 mois) jusqu'à un âge avancé (18 mois). Cette période nous permet d'observer l'évolution complète des capacités cognitives : depuis l'état optimal chez le jeune adulte, en passant par l'apparition des premiers changements (12 mois), jusqu'au vieillissement plus marqué (18 mois).

Une injection de cardiotoxine dans chacun des deux tibias détruit le muscle de souris endormies à l'isoflurane, après cinq jours d'injections quotidiennes de tamoxifène et avant jusqu'à sept jours d'injections de glucocorticoïdes. 3 400 souris mâles vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme n'attendre aucun effet secondaire majeur et décrit des procédures qui n'entraînent généralement pas de souffrance, alors que le protocole repose sur la destruction chimique des muscles des pattes et sur un prélèvement sanguin qu'il chiffre à 25 % du volume corporel juste avant la mise à mort. Celle-ci consiste en une perfusion de paraformaldéhyde dans le cœur sous anesthésie à la kétamine, pour fixer d'un coup tous les organes.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous le animaux expérimetaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 30 semaines. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3, 5 , 7, 14, 28 et 60 jours après injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée LysM-Cre, cette Recombinase Cre étant constitutive elle ne nécessite pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible LysM-CreERT2. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée LysM-Cre. Amendement Nous voulons ajouter trois modèles. Deux modèles dans lesquels GR est invalidé dans la fibre musculaire de manière constitutive (HSA-Cre) ou inductible (HSA-CreERT2). Le second modèle proviendra d’un fournisseur agrée de souris ayants subies une surrénalectomie. Nos résultats préliminaires montrent la nécessité d'étudier des stades intermédiaires, à savoir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 28, 40, 60 et 80 jours après l’injection de cardiotoxine, sans se limiter aux précédemment stades mentionnés.

Dix à quinze minutes d'anesthésie pour mesurer une force musculaire puis provoquer une fatigue du muscle, une seule fois par animal : 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles absorbent pendant cinq jours une substance mélangée à un gel alimentaire qui supprime une protéine dans leurs cellules souches musculaires, l'objectif étant de comprendre la régulation de ces cellules dans la dystrophie musculaire de Duchenne. Le porteur attend un vieillissement accéléré des muscles, une perte de masse musculaire et une réduction de la mobilité, conséquences qu'il dit non encore caractérisées. Il précise que ces souris ne présentent pas les symptômes des patients, se déplacent, se reproduisent et vivent normalement, et retient malgré cela ce modèle parce que leurs muscles ressemblent à ceux de l'être humain.

Objectifs

Le muscle se régénère complètement après une lésion grâce aux cellules souches musculaires. A la détection d’une blessure, elles produisent de nouvelles fibres musculaires en s’activant, s’expandant, se différenciant puis en fusionnant entre elles. Les cellules souches musculaires s’adaptent aux différents changements au cours de ces étapes, grâce à leur métabolisme. Cependant, l’activité de ces cellules souches musculaires est défectueuse chez des patients atteints de Dystrophie musculaire de Duchenne. Cette maladie est dégénérative. Elle est causée par l’absence d’une protéine dans le muscle, ce qui le rend extrêmement sensible aux blessures à la moindre contraction. Cela entraîne le recrutement constant des cellules souches musculaires, qui n’arrivent pas à réparer le muscle correctement. En conséquence, les patients atteints de cette maladie perdent la capacité de marcher après une dizaine d’années de vie et meurent par insuffisance cardiaque ou respiratoire. Aucun traitement n’existe actuellement, les thérapies actuelles réduisent les symptômes, mais ont de lourds effets indésirables. Il y a donc une nécessité d’étudier plus profondément cette maladie, pour pouvoir développer d’autres approches thérapeutiques dans le futur. Notre projet consiste donc à étudier le rôle d’une protéine dans la régulation métabolique des cellules souches musculaires dans un modèle de souris mimant la Dystrophie musculaire de Duchenne. Ce modèle de souris est cependant moins impacté que les patients atteints de la maladie. En effet, ces souris se déplacent, se reproduisent et vivent normalement. Cependant, leurs muscles ont une fonction altérée et des signes de lésions. Nous pouvons donc nous servir de ce modèle pour étudier la régulation métabolique des cellules souches musculaires. En enlevant une protéine d’intérêt dans les cellules souches musculaires de ce modèle, nous déterminerons son rôle dans la régulation des cellules souches musculaires dans la Dystrophie musculaire de Duchenne. Ce projet permettra ainsi de mieux comprendre comment sont régulées les cellules souches musculaires dans cette maladie. Ce travail supportera le développement de stratégies thérapeutiques ciblant les cellules souches musculaires, pour améliorer durablement la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Le projet vise à améliorer les connaissances sur les régulations métaboliques des cellules souches musculaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne. Étant donné qu’il n’existe actuellement pas de traitement pour soigner cette pathologie, apporter de nouvelles connaissances est primordial afin d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de cette pathologie. Nous déterminerons pour la première fois comment les cellules souches musculaires sont métaboliquement altérées dans la DMD. Notre étude permettra ainsi le développement de futures stratégies thérapeutiques ciblant les cellules souches musculaires pour améliorer durablement la qualité de vie des patients.

Procédures

Un groupe de souris sera soumis à une mesure de force et à une stimulation musculaire au cours de leur vie, sous anesthésie générale. L’intervention ne dure que 10 min maximum et la potentielle douleur ressentie lors de la stimulation musculaire sera prise en charge par l’administration d’un anti-douleur en amont.

Impact sur les animaux

Le fait d’enlever une protéine dans les cellules souches musculaires de modèle de souris de la dystrophie musculaire de Duchenne peut avoir des conséquences, qui ne sont pas encore caractérisées. Nous nous attendons à un vieillissement accéléré des muscles, se traduisant par une perte de la masse musculaire et une réduction de la mobilité de l’animal. Nous souhaitons analyser la force musculaire de ces souris. Pour cela, les animaux doivent être anesthésiés pour une durée totale de 10-15min, le temps de mesurer la force musculaire et de réaliser un test de fatigue musculaire. Le test de fatigue musculaire peut entraîner une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire, qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Ce projet découle de précédents résultats montrant l’implication d’une protéine dans l’activité déréglée des CSM dystrophiques. Cependant, l’étude des cellules souches musculaires est complexe, elles interagissent avec d’autres cellules et des molécules au sein du muscle. Ainsi, étudier la régulation métabolique de ces cellules en culture devient vite limité, puisque nous ne pouvons mimer correctement toutes les interactions et signaux présents dans le muscle. Ainsi, l’expérimentation animale est indispensable pour déterminer les fonctions de cette protéine en analysant les tissus, cellules et molécules.

Réduction

L’utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire au projet. Plusieurs échantillons seront prélevés post-mortem sur le même animal pour optimiser le nombre d’animaux utilisés. Certains échantillons post-mortem peuvent être analysés dans différentes procédures, ils seront donc réutilisés pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Des analyses statistiques ont été faites pour estimer le nombre d’animaux nécessaires à différentes expériences. Le nombre d’animaux a également été calculé sur la base de précédents résultats et selon le nombre d’expériences planifiées.

Raffinement

Les souris absorberont pendant 5 jours une substance permettant la suppression de notre protéine d’intérêt au sein des cellules souches musculaires. Cette substance sera mélangée à un gel alimentaire qui remplacera les croquettes habituelles des souris. Cela permet d’éviter les injections de cette substance, cause de stress et d’inflammation chez l’animal. Les souris seront acclimatées à ce changement de nourriture une semaine à l’avance. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement lors de la durée du traitement et hebdomadairement après traitement. Cette surveillance s’effectue grâce à l’établissement de différents critères, se basant sur l’aspect et le comportement de l’animal. Cela permettra de prendre en compte et minimiser le moindre signe de douleur ou de mal-être de l’animal, en adaptant les conditions d’hébergement. Pour suivre les cellules souches musculaires en activité dans le muscle en analyse post-mortem, nous administrerons une autre substance aux souris, qui se fixera sur les cellules en activité. Pour éviter les injections, cette substance sera mélangée à l’eau de boisson des souris, qui contiendra 1% de glucose, pour donner un léger goût sucré. Les souris seront acclimatées à ce changement d’eau de boisson (1% de glucose) une semaine avant traitement. Cette substance n’est pas connue pour entraîner des effets indésirables chez les animaux après un mois d’administration. Lors de l’analyse de la force musculaire, les animaux seront anesthésiés puisque cette procédure nécessite l’immobilisation de l’animal. La mesure de force et le test de fatigue seront réalisés consécutivement sur le même animal, sous une seule anesthésie, grâce à un dispositif permettant de réaliser ces deux mesures, de façon concomitante. Cela réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés, et la qualité des résultats en est améliorée. La procédure dure environ 10-15 min et ne sera effectuée qu’une seule fois par animal. Un anti-douleur sera administré lors de l’anesthésie, pour éviter toute légère douleur pouvant être causée par le test de fatigue.

Choix des espèces

Le modèle de souris de la Dystrophie musculaire de Duchenne ne présente pas de symptômes contrairement aux patients atteints de DMD. Toutefois, les muscles de ces souris présentent des signes de régénération et de lésions, plus ou moins importants au cours de leur vie. Cela n’empêche cependant pas les animaux de se déplacer, de se reproduire et de vivre normalement. Nous utilisons un modèle de souris puisque les muscles, par leur structure et leur fonctionnement, ressemblent aux muscles de l’Homme. Pour mieux caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt, nous analyserons les conséquences de son absence dans les cellules souches musculaires, à différents âges des souris, correspondant aux différents stades de progression de la maladie. A 3 semaines d’âge, les muscles des souris ne présentent aucun signe de lésion ou de régénération. Enlever notre protéine d’intérêt à ce moment-là, nous permettrait ensuite d’observer comment les cellules souches musculaires se comportent à 8-12 semaines d’âge, période où ces cellules sont normalement fortement sollicitées pour réparer/régénérer le muscle. Une autre stratégie de ce projet consiste à enlever notre protéine d’intérêt à la fin de la période où les cellules souches musculaires sont fortement sollicitées, entre 10 et 12 semaines d’âge. Nous observerons ensuite les conséquences de l’absence de cette protéine sur le long terme, de 5-6 mois à 15-17 mois d’âge, correspondant au début et à la fin de la phase dite de « faible intensité » de la maladie chez ces souris.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, 1 515 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin d'établir un modèle d'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, chez des souris au système immunitaire intact. Une partie subit une chirurgie abdominale ou lombaire pour une injection dans le foie ou la rate, ou la greffe d'un fragment tumoral dans le foie. Toutes subissent jusqu'à dix prélèvements sanguins, vingt échographies sous anesthésie et deux séances d'IRM qui imposent un transport vers un autre établissement, et des vecteurs viraux sont injectés à des souriceaux avant la naissance puis à deux, cinq et quinze jours de vie. Le porteur écrit que le développement des tumeurs hépatiques n'entraîne pas de nuisances en soi, parce que les souris seront tuées avant que ces tumeurs ne dégradent leur état général.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Jusqu'à 40 ml de sang prélevés chaque mois sur animal conscient, ou une heure de contention sous des cages de moustiques qui se gorgent directement sur leurs oreilles, jusqu'à trois fois par semaine : 44 lapins vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur sang entretient des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques, et alimente les tests d'insecticides et de répulsifs menés en santé publique. Le porteur indique que la contention peut mettre les lapins en état de stress, avec yeux exorbités, râle et souffle court, et que des lésions aux oreilles apparaissent quand les tentatives de prélèvement échouent. Ceux qui atteignent quatre ans sont proposés à l'adoption, soit la moitié de l'effectif, les autres restant en vie pour la reconduction du même projet. L'espèce a été retenue notamment parce que les lapins cessent vite de réagir aux piqûres de moustiques, à la différence de l'être humain.

Objectifs

Nos travaux portent sur les insectes et arachnides responsables de la transmission de maladies infectieuses. De ce fait, nous avons des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques. Nous avons besoin d'avoir accès à une source de sang pour maintenir ces élevages car cela permet à ces animaux de produire leurs œufs ou de croître. De plus, les moustiques, phlébotomes et tiques sont également utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines. Ainsi, les prélèvements sanguins peuvent également servir pour infecter ces insectes et archnides avec des virus ou des parasites et ainsi simuler la transmission de maladies. Egalement, dans le cadre des évaluations d’insecticides et/ou répulsifs utilisés en santé publique, l'efficacité de ces produits peut être démontré parce qu’ils empêchent la piqûre ou permettent de contrôler la population de vecteurs. L’objectif global de ce projet est le gorgement des moustiques, pblébotomes, tiques : - à des fins de production - à des fins d’expérimentations

Bénéfices attendus

La reproduction des insectes et archnides effectuée en laboratoire permet de maintenir les souches et ainsi de les utiliser dans les différents projets. Les élevages sont utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines : 1. évaluation des insecticides utilisés en santé publique dans le cadre d’expertise ou de recherche. 2. évaluation de nouvelles formules d’insecticides pouvant donner lieu à des dépôts de brevets 3. recherche sur les maladies infectieuses transmises par ces insectes et arachnides 4. études sur le comportement de ces insectes et arachnides 5. autre objectif : fournir d'autres laboratoires et instituts pour des expérimentations et/ou des modules d'enseignement. Ces axes de recherche sont des voies importantes pour mettre en œuvre des moyens de protection efficaces contre les maladies transmissibles via ces insectes et archnides, tel le paludisme, transmis par les moustiques, qui fait chaque année de 1 à 3 millions de morts.

Procédures

Un prélèvement sanguin régulier sur animal conscient sera effectué sur une partie des lapins. Ils seront prélevés entre 1 à 2 fois par mois selon les demandes. Généralement, les lapins seront prélèvés mensuellement de maximum 40 ml de sang puis mis en repos pour 4 semaines. La durée du prélèvement en lui-même est d’une dizaine de minutes. L’autre partie des lapins sera mis régulièrement en contention pendant 60 min maximum afin que les moustiques (disposés en cages) puissent se gorger directement sur les oreilles des lapins. La fréquence sera entre 0 et 1 fois/semaine pour les gorgements simples (annuel) et entre 1 à 3 fois/semaine pour les gorgements liés aux évaluations insecticides utilisés en santé publique (entre 3 à 6 mois d’évaluation/an maximum). Il n’y a pas de gorgement direct pour les phlébotomes et tiques.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de gorgement direct sur lapin, celui-ci peut être en situation de stress (yeux exorbités, râle, souffle court…). De plus, la piqûre par des moustiques en direct représente également une nuisance, même sans effet visible d’inflammation ou de grattage. Les lapins prélevés, quant à eux, peuvent présenter des lésions au niveau des oreilles si les tentatives de prélèvements sont infructueuses.

Devenir

les animaux ayant atteint environ 4 ans seront mis à la retraite et proposés à l’adoption soit la moitié de l'effectif prévu. Les animaux ayant moins de 4 ans seront maintenue en vie en vue d'un nouveau dépôt du même projet scientifique (utilisation continue).

Remplacement

Les élevages de moustiques, phlébotomes et tiques nécessitent du sang pour produire des œufs ou leur croissance. À ce jour, il n’existe pas d’alternative totalement sans sang ou utilisant un sang artificiel, bien que des projets soient en cours pour explorer d’autres options, notamment pour les moustiques. Gorgement sur lapin : Les signaux émis par un animal permettent de reproduire les conditions naturelles et d’assurer un gorgement efficace. Les systèmes de gorgement artificiel (sang prélevé) ne conviennent pas toujours, notamment pour des études comportementales ou des tests de répulsifs/insecticides, car ils ne reproduisent pas tous les facteurs naturels nécessaires (comme le CO₂ ou l’acide lactique). Gorgement artificiel : Le sang acheté auprès de fournisseurs externes comporte un faible risque de contamination par des pathogènes ou des molécules (médicaments, vermifuges), ce qui peut nuire aux élevages. En revanche, le sang prélevé sur des lapins dans l’animalerie est contrôlé, exempt de pathogènes et sécurisé. Lors de traitements, les lapins concernés sont temporairement exclus. De plus, le sang prélevé destiné aux infections expérimentales doit être prélevé dans les 24 heures avant l’expérimentation.

Réduction

Pour les gorgements direct de moustiques avec lapin en contention, nous avons optimisé l'utilisation des lapins en limitant à deux lots de trois lapins, chaque lot utilisé une seule fois par semaine (lundi et vendredi). Nous n'utilisons qu'un lapin par insectarium (souches sensibles et résistantes), soit deux lapins, avec un troisième en réserve en cas d'agitation. Cela minimise le nombre de lapins. Nous avons également adopté des pratiques pour réduire le nombre de prélèvements. Pour les moustiques sains, le sang est réutilisé une seconde fois, diminuant les prélèvements. Bien que cela ne soit pas applicable aux repas infectieux, cela réduit la fréquence d’utilisation des lapins. Nous privilégions le gorgement artificiel sur membrane lorsque possible, réduisant ainsi le besoin de lapins en contention chaque semaine. Nous jugeons que le stress hebdomadaire de la contention est plus important que celui d’un prélèvement mensuel, d’où notre effort de réduction. Trois lapins par semaine suffisent pour obtenir 120 ml de sang, avec un roulement de 12 lapins pour leur repos et un lapin en cas de prélèvement infructueux, soit un lot total de 13 lapins. Pour l’évaluation des insecticides sur moustiques, trois lapins sont utilisés par lot : un pour les moustiques témoins, un pour les moustiques traités, et un troisième en réserve. Chaque lapin peut être utilisé une à trois fois par semaine, réduisant ainsi la nécessité d'en introduire de nouveaux. De plus, après deux jours, la majorité des résidus absorbés est excrétée, permettant de réutiliser les mêmes lapins sans risque de contamination. Enfin, l'expérience montre que les lapins peuvent être utilisés pour les prélèvements et les piqûres de moustiques jusqu'à un âge avancé (mais nous procéderons à une mise à la retraite aux alentours des 4 ans). Cela prolonge leur utilisation et évite le renouvellement fréquent des lots, participant ainsi à la réduction globale du nombre de lapins utilisés pour nos élevages et études.

Raffinement

Cliquez ou appuyez ici pour entrer du texte. Bien-être des lapines en animalerie : Des enrichissements comme des rondins de bois et blocs de sel (moins appréciés) ont été introduits pour permettre aux lapines de jouer ou ronger. Deux parcs ont été installés, offrant à chaque lapine une sortie hebdomadaire d'une demi-journée en rotation. Les lapines, hébergées par deux, sont regroupées dès leur arrivée, mais en cas d’agressivité, elles sont logées individuellement tout en pouvant se voir et se sentir à travers des parois en plexiglas. Dans ce cas, des enrichissements variés et des sorties fréquentes au parc favorisent leur sociabilisation. Gorgement direct : Les lapines destinées au gorgement direct sont installées dans une pièce calme, éloignée des bruits et du passage du personnel. Des panneaux signalent leur présence pour limiter les perturbations. Les gorgements se déroulent dans une pièce sombre afin de maintenir leur calme, et des friandises leur sont offertes après la contention. Prélèvements sanguins : Les prélèvements se font sur des animaux conscients, évitant l'anesthésie générale. Un délai de récupération de 2 à 4 semaines est respecté entre chaque prélèvement, selon la quantité de sang prélevée. Une crème anesthésiante (lidocaïne) est appliquée sur leurs oreilles 15 à 30 minutes avant le prélèvement. Après l’intervention, les oreilles sont nettoyées avec un antiseptique, puis une crème cicatrisante est appliquée avant de replacer les lapins dans leur hébergement. Retraite et adoption : Une mesure de raffinement envisagée est de fixer une mise à la retraite des lapines à l’âge de 4 ans, avec une proposition pour leur adoption

Choix des espèces

Cette espèce a été choisie pour sa taille et facilité de manipulation. Les lapins sont suffisamment gros pour supporter la prise de sang par les femelles moustiques contrairement aux petits rongeurs et sont plus faciles à manipuler et élever que des gros mammifères. De plus, ils permettent des prélèvements sanguins d'un volume plus important par rapport aux rongeurs. Leur facilité de mise en contention évite également le recours à l'anesthésie. Il est également à noter que les lapins ne présentent rapidement plus de réaction inflammatoire suite aux piqûres de moustiques (désensibilisation rapide), contrairement à l'Homme. Les lapins arrivent généralement à l'animalerie lorsqu’ils sont agés de 19 semaines. Ils ne sont utilisés que lorsqu'ils atteignent le poids de 3,5kg.

Chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente sous anesthésie générale, pose d'une microlentille et d'une fibre sur l'implant, dix séances d'observation au microscope sous anesthésie, puis dix séances supplémentaires sur animal éveillé. 900 souris vont être utilisées ainsi sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de mettre au point des microscopes capables de contrôler des neurones par la lumière et de les imager en profondeur, dans les circuits visuels et moteurs. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur cerveau et vérifier les données anatomiques.

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant simultanément de contrôler l’activité des neurones avec des protéines sensibles à la lumière et de les imager dans des régions du cerveau en profondeur en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques pour détecter l’activité des neurones. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes combinant imagerie et activation des neurones du cerveau avec la lumière en combinaison avec des fibres optiques et des microlentilles. Ces outils constituent des techniques sans précédent pour l’étude du cerveau, permettant de contrôler l’activation de cellules choisies dans des circuits neuronaux, selon des schémas mimant des processus physiologiques. L’objectif est d’utiliser ces nouveaux outils pour l’étude des circuits visuels, sensoriels et moteurs localisés en surface et en profondeur dans le cerveau. . Le projet nous permettra d’obtenir la cartographie des connexion neuronales des régions profondes du cerveau et de pouvoir démontrer le lien entre circuits neuronaux spécifiques de la vision et du comportement moteur.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de développer de nouvelles techniques d’optiques pour la manipulation des neurones avec la lumière et l’imagerie en simultanée à travers de microlentilles. Les circuits neuronaux moteurs et visuels en profondeur pourront être étudiés avec ces nouvelles techniques, plus précises par rapport aux méthodes actuellement utilisées. Cette étude nous permettra aussi de comprendre la structure et l’intégration de circuits moteurs et sensoriels, afin de cibler au mieux les thérapies géniques en cas de pathologie (par exemple visuelle).

Procédures

Chirurgie au niveau cérébrale sous analgésie et anesthésie générale (durée de la chirurgie : 1h-1h30). Tous les animaux. Observation des animaux en microscopie sous anesthésie générale (durée : 1-2h). Les observations seront répétées 10 fois. Une partie des animaux. Pose d'un microlentille et fibre sur l'implant sous microscope et sous anesthésie générale (durée : 1-2h) en préparation des observations sur animal éveillé. Une fois. Une partie des animaux. Observation des animaux éveillés en microscopie (durée : 1-2h). Les observations seront répétées 10 fois. Une partie des animaux.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants permanents, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire (1 à 3 jours après l’opération). Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Des rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie ou légèrs saignements. Des rares effets pourront se produire après les chirurgies : perte de l’implant en post-opératoire ou inflammation. La contention légère de l'animal pour les injections et pour les expériences peut entrainer un léger stress des animaux. Les injections peuvent causer de la douleur légère de courte durée au niveau du site d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet pour prélever le cerveau et vérifier les données anatomiques.

Remplacement

Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle et motrice ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.

Réduction

L’utilisation d’animaux avec implants permanents nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience. Cela nous permettra de travailler sur un plus petit nombre d’échantillons sur lesquels nous répéterons les stimulations avec la lumière tout en respectant leur bien-être. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique. Pour chacune des mesures à réaliser, nous utiliserons des tests statistiques pour l’interprétation des résultats. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 900 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 5 congénères dans des cages ventilées. Ils seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant expérimentation. Une signalétique particulière sera utilisée pour les animaux en expérimentation. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis pour chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation. Les procédures sont affinées à chaque instant pour garantir le bien-être des animaux (par exemple la mise à disposition dans la cage de gel pour l’alimentation en cas de perte de poids en post-opératoire). L’utilisation d’une grille d’évaluation permettra de définir les points limites précoces et prédictifs à chaque acte expérimental, afin d’éviter toute souffrance de l'animal et permettre l’euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge. Les animaux observés éveillés seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.

Choix des espèces

Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 28 jours et 1 an avec circuits neuronaux matures.

Greffées d'une tumeur sous anesthésie locale, les souris de ce projet reçoivent ensuite 17 à 24 injections sur quatre à six semaines, cinq à sept gavages et cinq prélèvements sanguins sous anesthésie générale. Elles sont 3 888 à être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. L'objet déclaré est de tester si des médicaments antidiabétiques déjà commercialisés modifient la relation entre microbiote intestinal et efficacité des traitements anticancéreux. Le porteur décrit les atteintes en quelques lignes, mentionnant une gêne et une douleur locale modérée liées à la tumeur, et justifie l'effectif de 3 888 souris par un test statistique dont il ne dit rien.

Objectifs

Dans la littérature, le rôle joué par l’ensemble des micro-organismes vivant au sein de l’intestin (microbiote intestinal) a été démontré dans l’efficacité des traitements immunothérapeutiques contre certains type de cancers. De même, il a été démontré que le cancer avait un impact sur le microbiote intestinal et sa composition, favorisant un déséquilibre intestinal entre les les bactéries dites « bonnes » et « mauvaises ». Ce déséquilibre est appelé dysbiose. Cette dysbiose peut également être due à la prise d’antibiotiques. Il a été montré que le cancer induit un stress au niveau de l’intestin, entrainant une cascade d’évènements dont la diminution de cellules sécrétrices d’hormones. Des études ont montré que des médicaments commercialisés contre le diabète, ayant le même effet qu'une de ces hormones sécrétées par ces cellules inhibées, influencent le système immunitaire, dont des cellules connues pour être impliquées dans la réponse immunitaire contre le cancer. Le but de ce projet est d’étudier l’impact potentiel de ces médicaments dans la relation microbiote intestinal-cancer-traitements contre le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’explorer le potentiel de médicaments, déjà connus et commercialisés comme traitement contre le diabète, dans un contexte cancéreux. Cela permetrait d’identifier le rôle qu’ils pourraient jouer dans les interactions microbiote intestinal-traitements contre le cancer et ainsi, sur le plus long terme, permettre leur utilisation dans le cadre d’une maladie autre que celui pour lequel ils ont été mis sur le marché.

Procédures

Les animaux auront des greffes de tumeurs, réalisés sous anesthésie locale (durée 2 minutes, une par souris). Les injections des traitements sous anesthésie locale, seront au nombre de 17 à 24 sur 4 à 6 semaines, durée 2 minutes. Nous réaliserons également des gavages, entre 5 et 7, durée 2 minutes. Des prélèvements sanguins seront également effectués sur les animaux, sous anesthésie générale (n=5, durée 5 minutes au maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lié à la manipulation. Les gavages peuvent provoquer une contrainte transitoire et légère lors du geste en lui-même. La croissance d’une tumeur peut entrainer une gêne locale et une douleur locale modérée. Les traitements et la tumeur peut entraîner une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des analyses sur divers organes et tissus, ce qui nous permettra de répondre aux hypothèses du projet.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, les différents micro-organismes présent dans l'intestin (bactéries, archées etc...), les différentes cellules du système immunitaire et l’effet des traitements immunothérapeutiques contre le canccer sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Nous mènerons cette étude de façon séquentielle pour que chaque procédure fasse suite à la validation de l’hypothèse précédente. Dans le cas où la procédure s’avère non concluante, l’expérimentation ne sera pas répétée et la procédure sera arrêtée, ce qui diminuera le nombre de souris. Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé grâce à un test statistique. Les résultats feront également l'objet d'une analyse statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un espace respectant leur bien-être : régime alimentaire normal et une eau stérile correspondant à leurs besoins, ainsi qu’un enrichissement adapté à l’espèce utilisée. A leur arrivée, ils seront mis en quarantaine pendant une semaine avant le début des expérimentations, afin de leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Dès le début des procédures, les souris auront un examen clinique quotidien afin de s’assurer de leur bien-être tout au long des procédures, suivant des critères pré-définis (poids, aspect du pelage et de la dentition, comportement social, taille et aspect de la tumeur). Si l’un de ces critères, définis comme point limite, est défaillant, suivant une grille d’évaluation pré-définie, l’animal sera euthanasié. Les injections et prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. Lors des gavages, nous utiliserons des sondes de gavages en polypropylène, en s’assurant de l’insérer et la retirer le plus délicatement possible.

Choix des espèces

La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite dans la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeurs entre l’Homme et la souris. Les modèles de tumeur que nous utiliseront sont issus de lignées cellulaires de souris. Les animaux utilisés seront à maturité sexuelle, entre 7 et 8 semaines, ce qui nous permettra d’étudier le système immunitaire à un stade de développement optimal et fonctionnel.

20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour contrôle histologique. Une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes leur implante un plot d'enregistrement dans le crâne, dispositif de cinq grammes qui impose un hébergement individuel pendant toute l'étude, soit jusqu'à six mois sans contact avec des congénères. Dix d'entre elles reçoivent trois stimulations électriques aux pattes lors d'un test de conditionnement contextuel, répété jusqu'à trois fois, pour mesurer comment l'activité des cellules de direction de la tête se modifie avec la mémoire à long terme. Le porteur écarte le remplacement en indiquant que ces procédures ne pourraient pas non plus être conduites chez l'humain, du fait de leur caractère invasif.

Objectifs

L’objectif principal est de mieux comprendre comment les circuits neuronaux se réorganisent au cours de la formation de la mémoire déclarative (la mémoire pour des faits et des événements). Un grand nombre d’études chez l’humain et chez l’animal a montré que cette mémoire est initialement dépendante de l’activité d'une structure cérébrale, l’hippocampe. Au cours du temps on assiste à son désengagement progressif et en parallèle à une augmentation de l’activité corticale. Ce processus de réorganisation des circuits neuronaux est appelé consolidation systémique. Cette réorganisation est possible grâce à la communication entre l’hippocampe et le cortex, à travers une troisième structure, le thalamus, dont l’activité augmente au cours de la formation de la mémoire. Toutefois, une étude récente a montré qu’un noyau spécifique du thalamus, le noyau antérodorsal, montre un patron d’activité très différent. Ce noyau présente une très faible activation durant la formation de la mémoire, alors que le reste du thalamus est fortement activé. Ceci a été montré en utilisant des techniques d’imagerie cellulaire permettant d’extraire une photographie de l’état d’activation d’un réseaux neuronale à un instant bien précis, mais ne fournissant aucune information sur la fonctionnalité de ce même réseau. L’objectif de l’étude présent est donc d’obtenir un corrélat fonctionnel de l’inhibition de ce noyau durant la mémoire à long-terme. Pour cela nous proposons d’étudier comment l’activité des neurones du noyau antérodorsal se modifie durant la mémoire à long-terme, chez la souris. En particulier, nous allons nous intéresser à un corrélat bien caractérisé, qui est l’activité directionnelle. En effet, une proportion importante des neurones de ce noyau s’active lorsque la tête de la souris pointe vers une direction précise. Ces cellules, nommées cellules de direction de la tête, permettent à l’animal de s’orienter dans tout environnement en fournissant une information très générale relative à l’orientation de la tête et du corps dans l’espace. Nous nous attendons à une diminution significative de l'activité de ces cellules lorsque les souris durant la mémoire à long-terme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les substrats neuronaux de la formation d’une mémoire contextuelle, similaire à la mémoire déclarative chez l’humain. La compréhension fine des processus de modification des circuits neuronaux sous-tendant la formation de cette mémoire est essentielle pour comprendre non seulement son fonctionnement, mais aussi son dysfonctionnement dans le cadre de différentes pathologies neurodégénératives, telles que la Maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux (N=20) sont soumis à deux interventions principales: une procédure chirurgicale et une procédure comportementale couplée à l'enregistrement neuronal. La procédure chirurgicale, d’une durée comprise entre 30 et 45 minutes environ, prévoit d'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l’expérimentateur pour permettre le branchement du câble d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette légère contention avant et après la chirurgie, au cours de séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduit dans le dispositif comportemental. Le premier dispositif est une arène circulaire de 80-100cm de diamètre; les animaux sont laissés libre d'explorer cet environnement pour une session de 10-15 minutes effectuée une fois par jour pour toute la durée de l’étude. L'ensemble des souris sera également soumis au test de conditionnement contextuel 3 fois au maximum pendant toute la durée de l’étude. Cette tâche comprends 3 sessions d’exploration de 5 minutes dans une arène rectangulaire (31cm * 24cm) ; durant la deuxième de ces sessions, la moitié des animaux (N=10) subira 3 stimulations au niveau des pattes, ce qui entraîne une légère douleur; l'autre moitié des souris (N=10) sera simplement insérée dans le même dispositif en l'absence des stimulations. La durée totale de l'étude est de 6 mois au maximum.

Impact sur les animaux

Nuisance attendues : - la chirurgie, sous anesthésie générale profonde, d'une durée comprise entre 30 et 45 minutes, entraîne une lésion au niveau du crâne et du stress. Cette chirurgie permet d’implanter les électrodes dans le thalamus antérieur (N=20 souris). Toutes les souris seront soumises à l’enregistrement de l’activité neuronale au cours de deux tests comportementaux. - le plot d'enregistrement implanté en chronique entraîne une gêne modérée de par son encombrement et son poids (5 g environs), et impose un hébergement individuel pour préserver sa fonctionnalité. Il y a donc une restriction des interactions sociales durant la totalité de l’étude; un enrichissement supplémentaire dans la cage d'hébergement est mis en place. - la manipulation pour le branchement du câble d'enregistrement nécessite une légère contention de l'animal pendant quelques secondes uniquement. - en fin d'expérimentation, les animaux sont mis à mort par injection d'un agent euthanasiant, sous anesthésie.

Devenir

A la fin des expériences tous les animaux seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la réalisation des contrôles histologiques.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur l'étude du comportement des souris, ce qui ne peut pas être realisé à partir de modèles in vitro ou des modèles artificiels (basés sur des simulations sur ordinateur). Du fait du caractère invasif des procédures (implantation d'électrodes) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations pour obtenir des résultats statistiquement valables (les phénomènes étudiés pouvant présenter une variabilité interindividuelle importante, notamment dans l’étude du comportement) et celle de réduire la taille des effectifs. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieurs à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. Nous mettrons en place deux stratégies pour réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés. D'une part, nous allons tout d’abord caractériser l’activité neuronale des souris dans une tâche d’exploration libre, et seulement lorsque un nombre significatif de neurones sera isolé (au moins 10 neurones) les animaux seront soumis à la tâche de conditionnement. De l'autre part, nous essayerons de répéter la tâche de conditionnement contextuel 3 fois pour chaque animal (avec un délai d'un mois au moins), en modifiant le plus possible l’apparence du contexte (en changeant la couleur des murs et les repères visuels). Ces deux stratégies permettront de maximiser le nombre de neurones caractérisés, et ainsi reduire le nombre des animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole afin de diminuer leur stress. La chirurgie est optimisée pour réduire la durée de l’opération (30-45 min). La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré en préopératoire, permettant ainsi de couvrir la phase post-opératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire et de la solution physiologique sont administrés en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Des points limites spécifiques ont été définis et seront appliqués tout le long de l'expérience.

Choix des espèces

Il s’agit d’un étude pilote dont l’hypothèse est basée sur des résultats précédents, chez la souris. Il est donc impératif de maintenir les mêmes conditions expérimentales, ce qui inclus l’utilisation de la même espèce. De plus, un grand nombre d’articles publiés ont étudié les bases neurales de la formation de la mémoire chez la souris. On pourra donc se baser sur des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte (8-12 semaines, 18-28g). Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.

Dix-huit injections en neuf semaines, une vingtaine de mesures de l'épaisseur des articulations, neuf tests de répartition du poids sur les pattes et neuf tests de force de préhension : voilà le programme de chacune des 2 700 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite par deux injections, avec douleurs articulaires, gonflements et raideurs apparaissant entre 21 et 28 jours, une mobilité réduite et des difficultés à s'alimenter. Le projet cherche à savoir si moduler un mécanisme de recyclage cellulaire ralentit la polyarthrite rhumatoïde, toutes les souris étant tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur justifie l'espèce par l'expertise disponible en élevage et manipulation, et conclut qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit cette complexité.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire chronique qui touche les articulations. Elle concerne environ une personne sur cent, avec une fréquence plus élevée chez les femmes. Cette maladie provoque des douleurs persistantes, une raideur articulaire et des déformations progressives des articulations. À long terme, elle peut aussi entraîner des complications touchant d’autres organes et réduire l’espérance de vie. La maladie apparaît généralement autour de l’âge de 45 ans et sa fréquence augmente avec l’âge. En plus de ses effets sur la qualité de vie, elle a un fort impact professionnel, puisqu’environ la moitié des personnes touchées arrêtent de travailler dans les cinq ans suivant le diagnostic. L’objectif de ce projet est d’étudier si la modulation d’un processus naturel de recyclage des composants cellulaires, impliqué dans la régulation de l’inflammation, pourrait aider à prévenir ou à traiter cette maladie. En agissant sur ce mécanisme, nous espérons diminuer l’inflammation au niveau des articulations, limiter les dommages causés aux os et améliorer les symptômes ressentis par les patients. À terme, ce projet pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour mieux prendre en charge cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’explorer l’effet d’un modulateur de l’autophagie dans des modèles murins de polyarthrite rhumatoïde (PR), avec des bénéfices attendus à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour développer de nouveaux traitements. Sur le plan fondamental, cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l’autophagie dans l’évolution de l’inflammation et des lésions articulaires caractéristiques de la PR. Elle analysera comment un déséquilibre de ce processus peut favoriser la survie des cellules inflammatoires et aggraver la maladie. Cette recherche vise à identifier les étapes clés du développement de la PR et à repérer de nouvelles cibles pour de futurs traitements. D’un point de vue thérapeutique, si l’inhibition ciblée de l’autophagie s’avère efficace pour ralentir la progression de la PR, cette approche pourrait déboucher sur de nouvelles solutions médicamenteuses. Ces traitements seraient particulièrement utiles pour les patients qui ne répondent pas bien aux thérapies actuelles ou qui ne les supportent pas, en offrant un meilleur contrôle de la maladie avec moins d’effets secondaires liés à l’immunosuppression. Les retombées de ce projet sont donc doubles : il contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes en jeu dans la PR et ouvrira la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes. À terme, ces avancées pourraient améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant l’impact économique et social de la maladie.

Procédures

Certaines souris possédant un fond génétique particulier recevront, en plus des autres actes, 5 injections successives d’un agent chimique destiné à réduire la quantité d’une protéine spécifique. Ces injections seront administrées sur animaux vigiles une fois par jour pendant 5 jours et dureront quelques secondes chacune. Pour induire l’arthrite, les souris recevront deux injections également sur animal vigile, chacune durant environ 15 secondes. Les traitements expérimentaux comprendront un total de 18 injections, d’une durée d’environ 10 secondes chacune (2 injections par semaine) sur une durée de 9 semaines sur animaux vigiles. Afin de surveiller l’évolution de l’inflammation articulaire, des mesures de l’épaisseur des articulations seront réalisées sur animaux vigiles tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un instrument de précision. Cette procédure prendra environ une minute par animal, avec un total d’environ 20 mesures par souris. L’état de l’arthrite sera évalué chaque semaine selon une grille d’observation spécifique, une évaluation prenant environ 2 minutes par animal et réalisée 9 fois par souris sur toute la durée de l’étude sur animaux vigiles. Des échographies des articulations seront effectuées toutes les deux semaines sous anesthésie légère. Chaque session durera environ 20 minutes et chaque souris passera 4 séances au total. Un test permettant d’évaluer la répartition du poids entre les pattes avant et arrière sera réalisé une fois par semaine sur animaux vigiles. Cette analyse, qui dure environ 5 minutes par animal, permettra de mesurer l’impact de l’arthrite sur l’appui des pattes. Chaque souris passera ce test 9 fois. Enfin, un test mesurant la force de préhension des pattes sera effectué une fois par semaine sur animaux vigiles, afin d’évaluer d’éventuelles faiblesses musculaires liées à la maladie. Ce test, d’une durée d’environ 5 minutes par animal, sera répété 9 fois par souris.

Impact sur les animaux

Les souris impliquées dans ce projet recevront des injections de molécules. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et temporaire ainsi qu'une irritation à l'endroit de l'injection. Une inflammation cutanée temporaire peut également apparaître en raison des molécules injectées. Des symptômes d'arthrite, tels que des douleurs articulaires, gonflements et raideurs, surviennent généralement entre 21 et 28 jours après l'injection. Dans certains cas, des changements comportementaux, comme une réduction de l'activité ou un isolement, ainsi qu'une perte de mobilité, peuvent être observés. Certaines souris recevront des injections d'anticorps. Cette procédure peut entraîner une irritation locale temporaire et un stress dû à la manipulation. Dans les 24 à 48 heures suivant l'injection, une inflammation aiguë des articulations peut se développer, accompagnée de douleurs, de gonflements et de raideurs. Ces symptômes peuvent réduire la mobilité, entraîner des difficultés à s'alimenter et causer un inconfort général. Une perte de poids modérée peut également être observée. Les injections administrées au cours du traitement peuvent causer une douleur passagère au site d'injection et un stress lié à la contention. Une manipulation incorrecte pourrait entraîner des effets indésirables, tels qu'une irritation ou une hémorragie mineure. Effets secondaires généraux : La progression de l’arthrite peut entraîner des douleurs chroniques persistantes, provoquant des comportements de retrait, une diminution de la mobilité et un état général altéré. Des troubles alimentaires et un pelage abîmé peuvent également apparaître.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d'animaux dans les études sur l'arthrite induite est indispensable en raison de l'absence de méthodes alternatives capables de reproduire la complexité du développement et de la progression de ces maladies auto-immunes. Ces études permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre les cellules immunitaires, le collagène et les composants du cartilage, ainsi que les réponses inflammatoires spécifiques à l'arthrite rhumatoïde. Les réponses immunitaires, impliquant des interactions entre les cellules T, les cellules B, les anticorps et le collagène de type II, ne peuvent être pleinement explorées que dans un organisme vivant. Actuellement, les alternatives in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire l'ensemble des paramètres biologiques observés in vivo, notamment la réponse systémique à l'inflammation auto-immune.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2700 souris, un nombre déterminé à l’aide d’une analyse statistique rigoureuse pour s’assurer qu’il est suffisant pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront organisées de manière à optimiser le nombre d’animaux impliqués, en réduisant au maximum le recours à des groupes témoins tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Si les premières expériences montrent que l’hypothèse de départ est invalide, l’étude sera immédiatement arrêtée afin d’éviter l’utilisation inutile d’animaux. Lors des prélèvements, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur les tissus collectés (études immunologiques, observation des cellules et des tissus, analyses moléculaires), ce qui permettra d’exploiter au maximum les données obtenues à partir de chaque animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres chercheurs pour éviter de multiplier les expériences et ainsi réduire encore l’utilisation d’animaux. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin d’en tirer des conclusions solides et fiables.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires en vigueur, en collaboration étroite avec le personnel de l’animalerie. Les souris auront un accès libre à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’à un environnement enrichi (matériaux de nidification, tunnels) afin de favoriser leur bien-être et de limiter le stress. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour détecter précocement tout signe d’altération de l’état de santé. Une stratégie progressive de prise en charge de la douleur sera mise en place pour chaque modèle. Ce protocole permettra d'adapter l'analgésie à l'état clinique de l'animal. Le recours à des méthodes d'administration non invasives (eau de boisson enrichie en analgésique) sera privilégié chaque fois que possible. En cas de complication (plaie, réaction locale, difficulté alimentaire), des soins de support seront prodigués : application d’antiseptiques locaux, ajout de gel nutritionnel, et adaptation de l’enrichissement. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres (blessures qui seront immédiatement soignées). Le personnel impliqué dans les procédures est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale et veillera à limiter le stress lors des manipulations. Les injections seront réalisées avec des aiguilles fines afin de réduire les traumatismes. Les animaux anesthésiés seront installés sur des tapis chauffants pour prévenir l’hypothermie, et leurs yeux seront protégés par l’application de gel ophtalmique. Les conditions d’hébergement, les soins et les protocoles pourront être ajustés en temps réel en fonction de l’état des animaux, dans une démarche continue de raffinement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal repose sur des raisons scientifiques solides. Les souris sont les plus utilisées en recherche grâce à une expertise confirmée en élevage, manipulation et suivi vétérinaire. Elles garantissent des résultats fiables et reproductibles, essentiels au développement de nouveaux traitements. Les lignées sélectionnées pour ce projet ont été choisies pour leurs caractéristiques adaptées à l’étude de l’arthrite rhumatoïde : Les souris seront utilisées dès 7 à 8 semaines, âge correspondant à un développement physiologique complet, garantissant des résultats fiables. L’utilisation de ces modèles est indispensable pour comprendre l’arthrite et tester des traitements innovants. Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet aujourd’hui de reproduire cette complexité.