Recherche fondamentale

Toutes mises à mort sous anesthésie pour que leurs organes soient prélevés, 65 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est mise à jeun six heures, reçoit une injection d'analgésique puis d'anesthésique, subit une laparotomie, une ligature de l'œsophage, un cathétérisme du canal biliaire et un prélèvement sanguin intracardiaque. L'objet du projet est de mesurer les sécrétions digestives de souris privées du récepteur des lipides dans les papilles gustatives, pour préciser le rôle de la langue dans le goût du gras. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à l'animal vivant, décrit sa lignée comme "indispensable", et annonce une étude pilote sur cinq mâles reproducteurs pour vérifier que la chirurgie est faisable à quatre mois.

Objectifs

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. C’est plus précisément les récepteurs gustatifs, exprimés par les cellules des bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) qui permettent la détection des saveurs. Les récepteurs de lipides exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Le signal gustatif est transmis au cerveau par les nerfs gustatifs, conduisant à une augmentation des sécrétions digestives préparant le corps à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue – cerveau – intestin. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas le récepteur principal des lipides ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras, due à une altération de l’axe langue – cerveau – intestin, avec notamment une diminution des sécrétions digestives déclenchées lors d’une application linguale de lipides. Comme ce récepteur est exprimé dans plusieurs tissus et organes, il a été difficile de déterminer chez ces souris, le rôle oral dans les effets observés. Ainsi, des souris génétiquement modifiées qui n’expriment pas le récepteur principal des lipides uniquement dans les papilles gustatives ont été générées. Le but de ce projet est de continuer d’étudier le rôle du récepteur principal aux lipidessur la langue dans l’activation des sécrétions digestives chez les souris qui n’expriment pas ce récepteur dans les papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description d’une nouvelle souche de souris génétiquement modifiées qui n’exprime pas le récepteur principal des lipides dans les papilles gustatives et qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard et sera pesé de façon hebdomadaire. Six heures avant la manipulation, les souris seront mises à jeun (de nourriture seulement). Lors de la manipulation, une injection sous-cutanée d’analgésiant puis une injection intrapéritonéale d’anesthésiant seront effectuées. Un anesthésique local sera également appliqué. Les souris endormies seront tondues au niveau de l’abdomen. Une laparotomie, une ligature de l’œsophage et cathétérisation du canal biliaire seront réalisés sous anesthésie générale. Un prélèvement sanguin intracardiaque (sous anesthésie toujours) sera réalisé puis les souris seront mises à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale sous anesthésie, ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Ils auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie d’où l’utilisation d’analgésiques (buprénorphine + carprofene) en amont de l’anesthésie. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaire pour les injections sous-cutanées (analgésiques) et intrapéritonéales (anesthésiques). Une douleur est également à prévoir lors de cette injection sous-cutanée et lors de cette injection intrapéritonéale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

La sécrétion pancréato-biliaire est une étude faisant intervenir une communication inter-organes ainsi qu’une sécrétion pancréatique in vivo. C’est un paramètre métabolique qui ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable . Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur, la désinfection des surfaces, l’utilisation d'un champ stérile, la stérilisation des outils de dissection, la tonte de la zone d’incision et la désinfection de la peau.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la phase post-ingestive et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 4 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie. Dans le DAP précédent, l’âge minimum était 2 mois. Cela concorde avec les expériences précédemment réalisées (avec l’utilisation de ces animaux et avec les différents articles qui mentionnent cette chirurgie) mais les souris étaient toujours trop petites. Pour maximiser les chances de succès des chirurgies, nous choisissons des souris de 4 mois minimum. Tout de même, une étude pilote sera réalisée en amont sur 5 males reproducteurs pour s’assurer de la faisabilité de la chirurgie sur des animaux de 4 mois.

Deux à dix-sept séances de course sur tapis de vingt à soixante minutes, avec un critère d'arrêt fixé à cinq stimulations électriques ou plus en une minute : 74 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués vingt-quatre heures après la dernière séance pour prélever leurs organes. Ils subissent aussi quatre à dix-huit gavages d'une molécule ou d'eau, et des prises de sang à la queue. Le porteur attend des blessures musculaires ou tendineuses liées à la répétition de l'exercice et des irritations de l'œsophage dues aux gavages. Il indique avoir demandé un financement pour développer en parallèle un modèle de contraction de cellules musculaires in vitro, les données obtenues sur les rats devant servir à valider ce modèle cellulaire.

Objectifs

Le tissu musculaire est essentiel pour la santé et est même lié à la longévité. Cependant, les effets de l’exercice physique varient beaucoup d’une personne à l’autre, notamment à cause de différences dans l’expression des gènes influencés par l’environnement. Des travaux récents ont montré que le lactate, qui est produit en grande quantité par le muscle lors de l’exercice intense, est capable d'influencer l'expression des gènes en se fixant sur des protéines associées à l’ADN. Ce marquage par le lactate est activement étudié dans le cancer, mais son rôle dans l’adaptation musculaire à un protocole d’entrainement reste inconnue. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de l’exercice intermittent intense, connu pour induire une forte augmentation de la concentration en lactate, sur le marquage des protéines de l'ADN pour comprendre ses conséquences sur l’adaptation musculaire à l’entrainement.

Bénéfices attendus

Ce travail pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'expression des gènes impliqués dans l'amélioration des performances musculaires, afin de développer des approches personnalisées — comme des conseils en nutrition ou une approche pharmacologique — dans le but d’améliorer les effets de l’entraînement physique chez chacun, y compris pour les patients ayant des difficultés à répondre à l’exercice.

Procédures

Voici les interventions qui seront réalisées sur les animaux: i) course sur tapis (2 à 17 séances de course de 20-60min) ; ii) prise de sang à la queue; iii) administration d'une molécule ou d'eau de boisson par gavage oral (4-18 gavages, 1min par gavage).

Impact sur les animaux

En fonction des phases du projet, différents effets indésirables ou nuisances sont attendus : 1) un test d'évaluation de la vitesse maximale aérobie des animaux est nécessaire pour pouvoir ajuster l'intensité des séances d'exercices sous maximaux des animaux en fonction de leur capacité individuelle. Ce test peut être une source de stress pour l'animal du fait de l'environnement (e.g. bruits, odeurs) et de l'effort en lui-meme 2) Comme cela est le cas chez l'homme, les séances d'exercice répétés pouvant être à l'origine de blessures musculaires et/ou tendineuses pour les animaux. 3) L'administration du traitement par gavage oral répété peut induire des irritations bégnines au niveau de l'œsophage des animaux.

Devenir

Vingt-quatre heures après la fin de la dernière séance d’exercice, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

A l’heure actuelle seul le modèle animal permet d’étudier de manière intégrée les effets de l'exercice sur le muscle en prenant en compte la signalisation systémique, l’irrigation sanguine et les interactions tissulaires. En effet, les modèles cellulaires actuels, comme les cultures de cellules musculaires, ne reproduisent pas fidèlement l'organisation complexe du muscle in vivo, incluant l’interaction entre les fibres musculaires, les nerfs et les vaisseaux sanguins. De plus, ils ne permettent pas de simuler les contraintes mécaniques réelles de l'exercice, comme la charge, l’étirement et la contraction dynamique, qui sont essentielles aux adaptations musculaires. En parallèle de ce projet, une demande de financement a été faite afin de développer au laboratoire un modèle de contraction de cellules musculaires in vitro, dans le but, à terme, de réduire l'utilisation du modèle animal. Les données qui seront récoltées durant ce projet seront donc d'un intérêt majeur pour nous permettre de comparer les résultats obtenus in vivo avec nos résultats in vitro, validant ainsi la pertinence de notre modèle cellulaire dans l'étude des voies de régulation du muscle.

Réduction

Pour ce projet, nous prévoyons d'utiliser 2 fois (i.e. aigu et chronique) 4 groupes de 8 rats pour nos différentes conditions expérimentales : contrôle non-traité; contrôle traité, exercice non-traité; exercice traité. Nous voulons 8 animaux par groupe car d'après nos précédents protocoles d'étude des effets de l'entrainement, la taille d'effet observé sera suffisante pour obtenir une amélioration significative des performances de course des animaux à l'issue des 5 semaines d'entrainement.

Raffinement

Dans un objectif de raffinement, plusieurs mesures seront mises en place tel que l'observation régulière (pesée, prise alimentaire, comportement, aspect, détection de toute souffrance et blessure), ce qui nous permettra d'évaluer le bien-être des animaux selon une grille précise et adaptée et de déterminer si les animaux atteignent l'un des critères d'arrêt. De plus, pour réduire le stress lié à la course sur tapis, un soin particulier sera apporté au protocole d'habituation à l'exercice sur tapis de course, qui sera effectué au début de l'étude. L’expérimentateur en charge des séances de course sur tapis sera également attentif à bien respecter le critère d’arrêt des animaux (5 stimulations électriques ou plus sur 1 minute) pour éviter toute fatigue excessive des animaux. La motricité des animaux sera également observée attentivement avant et pendant toute la durée des séances d'entraînement pour détecter toute blessure qui pourrait induire de la douleur au repos comme à l’exercice. Afin de réduire le risque de blessure, toutes les séances de course sur tapis débuteront par une phase d'échauffement des animaux de 2 paliers à de 5min à 10 et 20 m/min. Si malgré ces précautions un animal développe une blessure ne lui permettant plus de suivre le protocole de course sans douleur, celui-ci sera mis à mort. Afin d’éviter tout problème qui pourrait découler du gavage, l'olive des canules de gavage sera lubrifié avec de l'huile de paraffine (vaseline liquide) et la procédure d'administration sera supervisée par l'animalière du laboratoire, qui possède une solide expérience dans la réalisation de ce geste. La prise alimentaire des animaux sera effectuée de manière hebdomadaire pour détecter toute modification du comportement qui pourrait être lié à une irritation due l'œsophage des animaux. Enfin, pour éviter toute douleur, la mise à mort terminale sera effectuée après anésthésie des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser un modèle de rats car celui-ci est classiquement utilisé dans les études sur les effets de l'exercice physique aigu et chronique. L'utilisation de ce modèle nous permettra donc de comparer nos résultats aux données de la littérature ainsi qu'à de précédents résultats du laboratoire. Cette espèce permet l'obtention de quantités de tissu musculaire nécessaires pour toutes les études à réaliser, limitant la nécessité de cumuler plusieurs animaux d'espèces plus petites (souris par ex.). Les animaux utilisés seront âgés de 4 mois au début de l'étude, car cela permet de limiter les effets liés à la croissance d'animaux plus jeunes et d'éviter les défauts de réponse à l'entraînement qui peuvent être observés chez des rats plus âgés.

Seize semaines d'un régime riche en sucres, en graisses et en cholestérol rendent des souris diabétiques, avant qu'un régime cétogène, un régime sans glucides ou un supplément de bêta-hydroxybutyrate ne leur soit imposé pendant trois à neuf jours. 1 010 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur répète qu'aucun effet dommageable majeur n'est attendu, tout en indiquant une perte de poids de 10 à 15 % dans les trois premiers jours du régime cétogène et une prise de poids allant jusqu'à 45 grammes sous régime riche en graisses. La mise à mort sert à prélever des cellules rares du foie pour trois techniques d'analyse qu'il juge "indispensables", dont le séquençage de l'ARN cellule par cellule.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une sensibilité à l'insuline altérée, dont la prévalence augmente à l'échelle mondiale, constituant ainsi une nouvelle forme de pandémie. De nombreuses interventions alimentaires ont été proposées pour améliorer le contrôle glycémique, le régime cétogène émergeant comme l'une des approches les plus répandues. Cependant, malgré les preuves solides soutenant l'efficacité du régime cétogène dans l'atténuation du diabète, son impact sur l'immunité innée, en particulier sur les macrophages hépatiques, reste mal compris. Ce projet vise à étudier l'effet du régime cétogène chez les souris rendues diabétiques sur une période de 16 semaines de régime occidental riche en sucres et en graisses. Dans une première phase de l'étude, nous chercherons à comprendre l'effet de la cétogenèse précoce sur les populations de macrophages hépatiques. Nous utiliserons ensuite ces informations pour explorer comment cette vague de cétogenèse peut remodeler le profil des macrophages hépatiques afin de les rendre plus résilients face au diabète.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira de nouvelles perspectives sur les cellules et/ou les voies métaboliques que nous devons activer pour déclencher la cétogenèse et inverser le diabète. Les résultats auront donc potentiellement des conséquences pour le traitement du diabète de type II.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux pourront avoir 9 jours de régime alimentaire standard (groupe contrôle), 3 jours de régime cétogène, 6 jours de régime cétogène, 9 jours de régime cétogène, 6 jours de régime riche en matières grasses (66 % de graisses, 30 % de glucides), 6 jours de régime sans glucides (30 % de graisses, 0 % de glucides), 6 jours de régime alimentaire standard avec supplément de beta-hydroxybutyrate, 16 semaines de régime alimentaire standard, 16 semaines de régime alimentaire standard suivies de 6 jours de régime cétogène, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose, 16 semaines de régime riche en glucides/lipides/cholestérol avec saccharose/fructose suivies de 6 jours de régime cétogène. Certains animaux auront un prélèvement de sang (sous anesthésie locale (ponction rapide (durée 5 secondes d'une veine de la queue).

Impact sur les animaux

Régime cétogène : Aucun effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent perdre un peu de poids corporel (jusqu’à 10-15% de perte de poids au cours des 3 premiers jours du régime). Il est à noter que des effets modérés sur l'activité physique peuvent être observés en raison de la transition métabolique vers la cétose. Régime riche en graisses : Pas d’effet dommageable majeur pour les animaux. Les souris peuvent prendre du poids progressivement (jusqu'à 45 g) au fur et à mesure des semaines, mais restent globalement en bonne santé. Régime sans glucides : Aucun effet indésirable significatif. Aucune perte de poids. Régime standard avec supplément de BHB : Pas d’effet dommageable notable. Aucune différence significative par rapport aux souris du groupe contrôle. Prélèvement sanguin: Aucune conséquence grave, mais les souris peuvent ressentir un léger stress ou inconfort dû à la contrainte et au prélèvement. La perte de 50 μL de sang ne devrait pas entraîner d'effets indésirables graves, mais un suivi des signes de stress ou d’inconfort sera réalisé. Les souris seront surveillées de près tout au long de l’étude pour s’assurer qu’elles ne subissent pas de souffrances sévères ou prolongées.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques (cytométrie en flux, imagerie, transcriptomique) qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donx indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous utilisons le moins de souris possible pour cette étude. Après leur euthanasie, nous collecterons différents types de tissus et cellules, y compris des cellules rares comme les macrophages du foie, pour des analyses approfondies (par exemple, single-cell RNA-seq). Chaque souris nous permettra d'obtenir une grande quantité d'informations. Le nombre de souris nécessaires a été soigneusement déterminé pour chaque groupe, soit à partir des données disponibles dans la littérature, soit à l’aide d’outils statistiques (calcul de puissance) pour garantir un effectif juste et nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, de nombreuses publications mettent en avant le rôle essentiel des modèles murins dans les études précliniques de la cétogenèse, du diabète de type 2 et de la résistance à l'insuline. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales seront adultes / sexuellement matures (âgées de 8 à 10 semaines) au début de la procédure.

Jusqu'à quarante séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie générale et quarante injections par animal : 500 souris et 100 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré tient à la mise au point de protocoles d'imagerie par bioluminescence et par fluorescence, et à la formation de nouveaux utilisateurs de ces machines, en amont des projets scientifiques des équipes. Le porteur signale des phénotypes dommageables possibles, perte de motricité empêchant l'animal de s'alimenter, crises convulsives, amaigrissement, tumeur de plus d'un centimètre cube gênant l'alimentation ou provoquant une douleur permanente. Il présente ce projet de plateforme comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés ailleurs, en évitant de lancer de grandes études dont les résultats ne seraient pas satisfaisants.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence du petit animal sont des techniques non invasives qui permettent de suivre des cellules spécifiques en temps réel et au cours de plusieurs sessions (suivi longitudinal). Ce suivi longitudinal est notamment utilisé pour le suivi de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs, l’étude du trafic cellulaire, la surveillance des cellules transplantées et les modèles d’expression génique. L’objectif de ce projet consistera d’une part à mettre au point différents protocoles d’imagerie pour répondre par la suite aux besoins des équipes de recherche, et d’autre part à la formation des nouveaux utilisateurs à cette technique. Pour atteindre cet objectif, des expériences en conditions réelles sur animaux anesthésiés doivent être menées.

Bénéfices attendus

Du point de vue scientifique, ce projet permettra de proposer des techniques à la pointe de la technologie pour répondre à des questions scientifiques diverses (suivi au cours du temps de la progression d'une maladie ou d'un traitement, la validation de nouveaux marqueurs, la surveillance des cellules transplantées). Ce projet permettra de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence sur des lots d’animaux pilotes. A la fin de chaque étude, nous pourrons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permettra de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne seront pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes pourraient être utilisées pour justifier les futures demandes d’autorisation de projets à portée scientifique.

Procédures

Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Nous réaliserons 40 séances maximum par animal (2h maximum par séance) avec minimum 48h entre chaque imagerie. Les injections de molécule pour détecter la bioluminescence seront réalisées sur animal éveillé ou endormi en fonction des nécessités : 40 injections maximum (durée inférieure à 1 minute), avec minimum 48h entre chaque injection. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale nécessaire pour les examens d’imagerie sera associée à une hypothermie, un risque de difficultés cardiorespiratoires, et un risque rare de non-récupération de la vigilance suite à l’anesthésie. Les injections seront associées à une brève et légère douleur au point d’injection, avec un risque d’hématome possible très localement. En ce qui concerne les phénotypes dommageables, nous pourrons observer une perte de motricité empêchant l'alimentation, des crises convulsives, un amaigrissement, un développement d'une tumeur supérieur à1cm3 gênant l'alimentation et/ou l'hydratation et/ou entraînant une douleur permanente.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever puis analyser des tissus d’intérêt

Remplacement

Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles existants seront réalisés dans un premier temps sur des échantillons de tissu ou de cellule. Seules les études nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées sur l'animal. En effet, les premières étapes permettent de valider des cibles d’intérêt puis l’utilisation d’un organisme vivant dans sa globalité permet d'étudier la complexité des échanges que ce soit au niveau cellulaire, structurel ou entres organes.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé (600) est réduit au maximum. Selon les études, entre 5 et 10 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Cinq animaux est le minimum nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant et plus représentatif. L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi au cours du temps, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. De plus afin de limiter le nombre d’animaux, les équipes seront formés avec les animaux utilisés pour les études pilotes quand cela sera possible. Ce projet permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés à une échelle plus globale en réalisant des études pilotes pour des projets scientifiques, ce qui permettra de n’engager qu’un faible effectif d’animaux pour la mise au point des imageries. Ainsi si les résultats ne s’avéraient pas concluants un plus nombre d’animaux ne seraient pas engagés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie et éclairage. Les cages sont enrichies (nids, bâtonnets de bois à ronger). Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée. Ils sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle d’expérimentation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Lors de l’anesthésie générale nécessaire pour réaliser l’imagerie, du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter tout dessèchement oculaire. De plus, leur température corporelle sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un plateau chauffant intégré au système d’imagerie. Les animaux seront remis dans leur cage d’origine une fois qu’ils seront parfaitement réveillés. Ils seront à nouveau examinés sous 24 heures pour vérifier leur récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Nous limiterons le nombre d’imagerie dans la vie de l’animal et nous assurerons d’un délai de récupération de 48h minimum entre chaque session tout en vérifiant au préalable son bon état de récupération. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris et rat) sont les seules espèces utilisées dans ce type de machine pour acquérir des images capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Dans notre contexte, les projets de recherche porteront sur l’étude des maladies neurodégénératives, les cancers ou les maladies du foie ou du poumon, pathologies pour lesquelles il existe de nombreux modèles de rongeurs déjà développés. Les animaux pourront être imagés entre 3 semaines et 18 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation au cours du temps des animaux. Nous essaierons donc de nous placer dans un stade physiologique similaire aux pathologies étudiées afin d’obtenir les meilleures chances de réussite de la transposition de nos résultats à l’Homme. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles pour nos tests.

Pour décrire la maturation des mitochondries des astrocytes qui bordent les vaisseaux sanguins du cerveau, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections intrapéritonéales consécutives leur sont administrées dès le premier jour après la naissance, sans anesthésie, le porteur les décrivant comme sans douleur tout en signalant une irritation possible au point d'injection. Toutes sont ensuite tuées sous anesthésie générale à cinq, quinze, trente et soixante jours de vie pour prélever leur cerveau. L'effectif ne repose sur aucun calcul de puissance, le porteur reconnaissant ne pas disposer d'assez de données et retenant cinq animaux par expérimentation d'après ses résultats antérieurs et la littérature.

Objectifs

Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiels à la physiologie cérébrale. Ces cellules possèdent deux interfaces, une communicante avec les neurones et une autre avec les vaisseaux sanguins. Des études récentes ont montré que les mitochondries astrocytaires sont importantes pour la mise en place des synapses au cours du développement post-natal. Cependant aucune étude ne s'est intéressée à l'interface avec les vaisseaux sanguins. Dans ce projet nous souhaitons caractériser la maturation de ces mitochondries dans les astrocytes bordant les vaisseaux. Toutes nos analyses seront réalisées à plusieurs stades de la naissance jusque chez l'adulte.

Bénéfices attendus

Aucune étude à ce jour n'a étudié l'importance des mitochondries astrocytaires sur le développement du réseau vasculaire. Or les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme des cellules et permettent leur bon développement. Cette étude permettra d'identifier de nouvelles cibles spécifiques de ces mitochondries astrocytaires et ainsi apporter de nouvelles connaissances sur le développement cérébral et vasculaire.

Procédures

Deux interventions seront utilisés dans ce projet. 1) Trois injections intrapéritonéale consécutives chez des nouveau-nés à partir du 1er jour post-natal, ce geste dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Il est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. 2) Les animaux inclus dans la procédure 1 seront ensuite mis à mort sous anesthésie générale à des stades de développpements différents. Le temps de procédure comprend à la fois l'induction (analgésie/anesthésie) et la perfusion, cette procédure n'excède pas 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront trois injections intra-péritonéales pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. La manipulation des animaux sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère.

Devenir

Les animaux utilisés pour les différentes études (histologiques, biochimiques, biomléculaires) seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus de l'anesthésie, une analgésie sera mise en place. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie). Les animaux subiront trois injections intrapéritonéale pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. Une observation particulière des animaux les jours suivants sera réalisée. La manipulation des animaux sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère. Pour vérifier la bonne tolérance des animaux à l'injection répétée du produit chimique, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place adaptée à l'âge étudié (Annexe 1). Elle est bassée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostataion), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux évitant la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement post-nataux à 5, 15, 30 et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moments clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.

400 souris génétiquement modifiées pour développer une néphropathie à IgA vont être utilisées, toutes tuées à seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant douze semaines des croquettes enrichies en algues ou dépourvues de vitamine A, des antibiotiques dans l'eau de boisson trois fois par semaine pendant huit semaines, puis un gavage de bactéries trois fois par semaine pendant quatre semaines. Chaque semaine elles sont isolées cinq minutes dans une cage sans litière pour récupérer leurs urines et leurs fèces, l'opération étant répétée dans la journée si la quantité recueillie ne suffit pas. Le porteur écrit que la maladie ne leur cause aucune nuisance et que l'utilisation de la souris est "indispensable" pour apporter la preuve du concept avant des essais chez les patients.

Objectifs

La néphropathie à IgA (NIgA), une maladie rénale inflammatoire, est la plus courante en France et dans le monde. Elle a été décrite en 1968 par le professeur Berger. À ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir cette maladie, qui est devenue l’une des principales causes de perte de fonction rénale. Cela nécessite des traitements comme la dialyse (qui remplace la fonction des reins en filtrant le sang pour éliminer les déchets et l'excès de liquide) ou la transplantation de rein. La NIgA se produit lorsque le système immunitaire ne fonctionne pas correctement et attaque par erreur certaines protéines du corps. Cela entraîne une accumulation anormale d’une protéine (l'IgA) dans les reins. Avec le temps, cette accumulation provoque une inflammation qui peut endommager les reins et les empêcher de filtrer correctement le sang. Des modèles des souris génétiquement modifiées ont montré qu’elles développent une forme de la NIgA similaire à celle des humains. L'absence d’une protéine spécifique favorise l’accumulation de ces protéines dans les reins, ce qui accélère la progression de la maladie. Les causes exactes de la NIgA ne sont pas encore totalement comprises, mais des facteurs comme l’alimentation et la flore intestinale (l'ensemble des micro-organismes vivant dans notre corps, comme les bactéries) semblent jouer un rôle important. Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre l’impact des régimes alimentaires et de la flore intestinale sur l’évolution de la NIgA. Par exemple, il étudie l’effet d’un régime riche en algues, qui modifie la flore intestinale et favorise des bactéries spécifiques. Ces bactéries sont retrouvées en plus grande quantité chez les patients atteints de NIgA. D’autres recherches montrent que l’élimination de la vitamine A de l’alimentation des souris améliore les symptômes de la maladie, en réduisant l’accumulation de protéines du système immunitaire dans les reins. L’objectif global de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’alimentation et la flore intestinale. Ces résultats, encore en phase préclinique, pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir la progression de la NIgA, ouvrant ainsi la voie à de futurs essais cliniques chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués, tels que l’effet de l’alimentation (riche en algues et déficiente en vitamine A) et de la flore intestinale dans une maladie inflammatoire rénale, la NIgA, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de la NIgA.

Procédures

Pour étudier l'effet de l'alimentation (riche en algues ou carencée en vitamine A) sur la maladie de la NIgA, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec des croquettes contenant des algues ou des croquettes dépourvues de vitamine A, disponibles en libre accès. Le poids des souris sera mesuré une fois par semaine pendant 16 semaines. Des prélèvements seront réalisés toutes les deux semaines pour les urines et chaque semaine pour les fèces pendant 16 semaines. Afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et les bactéries de la flore intestinale dans la maladie de la NIgA, les souris recevront des antibiotiques dans leur eau, trois fois par semaine pendant 8 semaines. A l’âge de 8 semaines, elles seront gavées avec des bactéries, trois fois par semaine pendant 4 semaines. Le poids des souris sera également mesuré chaque semaine dès le début de l'étude pendant 16 semaines. Les prélèvements seront effectués toutes les deux semaines pour les urines et toutes les quatre semaines pour les fèces pendant 16 semaines. Dans les deux cas, les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés sur des souris vigiles. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans litière pour effectuer le prélèvement. Les échantillons d'urine seront collectés à l'aide d'une pipette dans la cage, après que les souris aient uriné d'elles-mêmes. Les échantillons de fèces seront également prélevés dans la cage après que les souris aient fait leurs besoins. Si les échantillons sont insuffisants, l'opération sera répétée au cours de la journée. Les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés le même jour. A l’âge de 16 semaines, les animaux seront euthanasiés conformément aux réglementations en vigueur. Un prélèvement sanguin sera effectué directement au niveau du cœur après la mort des animaux, et les reins, le foie, la rate et l’intestin seront récupérés pour analyse.

Impact sur les animaux

Toutes les souris utilisées ne présentent pas de problème de santé lié à la maladie. La NIgA ne cause pas de nuisances pour elles. Les bactéries ne sont pas des bactéries infectieuses. L’administration des antibiotiques n’a pas d’effet négatif sur les souris. Celles-ci ont bien toléré l’alimentation riche en algues. Les seules nuisances possibles pourraient être liées aux gestes du gavage, comme un stress temporaire ou un léger inconfort dû à l’introduction de la sonde gastrique.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes de remplacement compte-tenu de la complexité de l’interaction entre le microbiote intestinale et la réponse inflammatoire (L’organisme fabrique des substances chimiques qui produisent une réponse immunitaire pour lutter contre l'infection ou guérir les tissus endommagés), et les effets rénaux qui nécessitent de travailler à l'échelle d'un organisme entier vivant. L'utilisation de modèle murin est donc indispensable pour montrer le rôle du microbiote apportant ainsi la preuve du concept et permettrait d'envisager des essais cliniques chez des patients.

Réduction

Les souris utilisées présentent un faible taux de mortalité. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Le nombre de souris par groupe a été fixé en tenant compte des différences possibles dans les effets de la NIgA. Ce calcul a été basé sur des résultats préliminaires et sur un calcul statistique.

Raffinement

Dans le respect de la loi des 3R et dans un souci de bien-être animal, des matériaux comme du coton et du kraft seront ajoutés dans les cages pour permettre aux animaux de faire des nids et éviter les comportements stéréotypés. Nous nous assurerons qu'aucun animal ne soit isolé durant l'expérience afin de préserver leurs groupes sociaux. Des seuils de sécurité, définis de manière précoce, ont été établis pour éviter toute douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux. Ces seuils, basés sur des critères comme la variation du poids, l’apparence extérieure et les changements de comportement, permettront d’adapter les mesures prises : augmentation des observations, administration d'antalgiques renouvelables toutes les 12 heures, ou euthanasie anticipée si nécessaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel responsable, et les seuils de sécurité seront vérifiés une fois par semaine (état général et pesée). Lorsqu'un geste comme le gavage est effectué, les souris seront surveillées le lendemain pour vérifier leur état général. À la fin de l’expérience, tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle murin est le meilleur choix pour développer le modèle de néphropathie à IgA, similaire à celle de la NIgA chez l'homme. Cela nous permettra d'analyser et d'étudier les effets de la maladie avec des interactions entre le régime alimentaire et le rôle du microbiote. Cette espèce présente l'avantage d'être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d'utiliser un modèle génétiquement modifié bien établi. Pour ce faire, nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines, car l'alimentation a un impact sur la composition de la flore intestinale comme montré chez l'homme, dès le plus jeune âge.