Recherche fondamentale

Toutes tuées pour analyse de leurs organes, 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie sous anesthésie générale leur implante des cellules tumorales dans le pancréas, suivie d'échographies hebdomadaires sous anesthésie, d'un à deux traitements par champ électrique pulsé par semaine et d'injections intratumorales ou intrapéritonéales répétées. Le porteur indique que la croissance des tumeurs pancréatiques peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance, et que la chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste. Les essais chez des patients atteints de cancer du pancréas restent une perspective, et le porteur écarte les cultures cellulaires en affirmant qu'elles ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.

Pour vérifier qu'éliminer un type de lymphocyte rend une immunothérapie plus efficace, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur ouvre l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour implanter des cellules tumorales dans le foie ou le cæcum, puis elles reçoivent des injections dans le ventre trois fois par semaine pendant trois semaines et passent deux séances d'imagerie hebdomadaires. Celles dont la tumeur régresse complètement sont gardées deux mois de plus avant d'être tuées. Le porteur annonce une grille d'évaluation des points limites sans en donner les seuils, tout en décrivant le développement de grosses tumeurs et de métastases comme un effet indésirable possible.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des points de contrôle a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le foie ou le caecum. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables. L’injection des traitements peut générer des désagréments au moment de l’injection. Les traitements seront injectés par voie péritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. Le groupe qui aura les deux traitements n’aura qu’une seule injection IP à chaque fois. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont rares : les immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale de l’agent d’imagerie, 2X par semaine pendant 3 semaines puis 1X par semaine pendant 2 mois. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Quatre groupes (Controle, les deux traitements seuls et la combinaison de traitement) de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance statistique pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées à l’expérimentation animale et à la chirurgie afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Avant la chirurgie, les souris recevront une antibiothérapie préventive et une analgésie. Les procédures d’imagerie et de chirurgie abdominale seront réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée en permanence et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge analgésique adaptée en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et un analgésique sera injecté en sous-cutanée 2 fois par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée et dans l’organe d’origine de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Opérés sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif médical dans l'œil, lors d'une chirurgie pouvant durer jusqu'à deux ou trois heures, 300 lapins et 150 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur indique que l'hématome ou l'œdème au niveau du site opératoire peut entraîner une diminution ou une perte importante de la vision. Ces implantations servent à constituer les dossiers d'autorisation de mise sur le marché de produits d'ophtalmologie, testés pour le compte de donneurs d'ordre. L'effectif est arbitré à partir de l'estimation du nombre d'études signées avec ces clients sur les cinq ans du projet.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en ophtalmologie (exemple : produit ou matériel utilisés pour les chirurgies de la cataracte ou du glaucome...).). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité et tolérance lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux de données de performance et de tolérance des produits de santé en ophtalmologie. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer de quelques minutes à jusqu’à 2h à 3h). Cette intervention peut avoir lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - stress liés à la réalisation d’une anesthésie générale et d’une chirurgie (stress de la contention, , stress lors du réveil). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -hématome ou œdème au niveau du site opératoire pouvant entrainer une diminution ou une perte importante de la vision. - retrait de la nourriture chez le porc qui est de 12 à 24h, pour la mise à jeun per opératoire en vue de l’anesthésie.

Devenir

Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induits par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en ophtalmologie.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" des produits à tester différents. Les études de screening et les études pilotes peuvent être menées en amont pour permettre de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, ou pour déterminer le meilleur modèle pour le dispositif à tester, réduisant de réduisant le nombre d’animaux utilisés pour les études réglementaires à plus grande échelle, quidoivent répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir de l’estimation du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : en phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et complétés par des scores de suivi de la douleur. La présence d’un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter la souffrance.

Choix des espèces

Le lapin et le porc sont des modèles reconnus dans la littérature scientifique en ophtalmologie, en raison des grandes similitudes anatomiques avec l’œil humain. Le choix de l’espèce se fera selon le type de dispositif et les contraintes normatives associées, afin de répondre à ce que demande la réglementation pour la mise sur le marché des dispositifs médicaux. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l’utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.

Deux gavages, jusqu'à onze injections et quatre séries de huit à neuf prélèvements de sang à la queue, après douze semaines de régime enrichi en lipides. 1 080 souris vont être utilisées dans ce second établissement du même projet, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène pourtant l'ensemble à "des inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées". Toutes seront tuées puis nécropsiées pour analyser leur sang et plusieurs de leurs organes.

Objectifs

L’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux et s’accompagne de complications métaboliques. L’excès de tissu adipeux est corrélé au degré d’insulino-résistance qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit au développement d’un diabète de type 2. Le tissu adipeux est un organe central du métabolisme par sa fonction de stockage des lipides. Il produit également de nombreux facteurs, dont des adipokines bénéfiques ou délétères vis-à-vis de l’action de l’insuline ; ces adipokines peuvent agir au sein même du tissu ou à distance dans l’organisme. Une meilleure connaissance des adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l’obésité. Nous avons mis en évidence chez l’Homme une nouvelle adipokine dont le niveau d’expression dans le tissu adipeux est faible chez des personnes atteintes de syndrome métabolique ou de diabète de type 2. Son taux sanguin est un déterminant négatif de la résistance à l’action de l’insuline. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de cette adipokine par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une insulino-résistance. Nous voulons tester si sa surexpression dans le tissu adipeux peut permettre de retarder, voire d’empêcher, le développement d’une résistance à l’action de l’insuline induite par l’obésité. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances sur les acteurs de la sensibilité à l’insuline, dans un contexte de prise de poids et de dégradation de la signalisation insulinique. La compréhension du rôle de certaines adipokines dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline au cours de l’obésité, permettra de cibler de nouveaux mécanismes cellulaires. L’apport de l’expérimentation animale est majeur dans l’étude de la dérégulation de ces voies, en offrant un point de vue à corps entier de la physiopathologie de l’obésité et du diabète.

Procédures

Dans l’EU1, les animaux auront une alimentation enrichie en lipides durant 12 semaines et un hébergement à thermoneutralité. Tous les animaux seront soumis à 2 gavages, 3 à 11 injections et 4 séries de 8 à 9 prélèvements de sang à la queue au cours de leur vie ; chaque acte sur animaux vigiles n’excédant pas 15 secondes consécutives. Tous les animaux pourront subir une intervention chirurgicale (de 10 à 15 minutes maximum) sous anesthésie générale avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire. Dans l’EU2, les animaux seront soumis à 1 gavage, 1 série de 5 prélèvements de sang à la queue n’excédant pas 15 secondes consécutives, puis nécropsiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourraient survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min), lors des 12 semaines de régime enrichi en lipides, lors des gavages (environ 15 sec) ou encore lors des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 5 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors de prises de sang ou encore lors d’injections. Dans l’éventualité où l’option chirurgicale serait retenue pour induire la surexpression de l'adipokine étudiée, les souris pourraient ressentir une douleur légère pendant 1 à 2 jours malgré l’utilisation d’antalgique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et nécropsiés en vue de l'analyse de leur sang et de plusieurs organes.

Remplacement

Les modèles in vitro d’adipocytes humains et murins existent et l’équipe en cultive couramment. Cependant, en raison de la capacité de prolifération quasi-inexistante des adipocytes, ces lignées sont cultivées sous forme de préadipocytes puis différenciées en adipocytes matures grâce à un milieu de culture spécifique. Ces conditions de culture rendent les cellules artificiellement résistantes à l’action de l’insuline et il est impossible d’étudier l’effet de certaines molécules sur la sensibilité à l’insuline. De plus, les tissus adipeux sont constitués d’une grande diversité de cellules, outre les adipocytes, qui participent à la dysrégulation de la sensibilité à l’insuline. C’est le cas des cellules immunitaires qui, selon leurs sécrétions de cytokines et chimiokines, influencent le signal insulinique à l’échelle du tissu. Ainsi, le modèle in vivo sur l’animal, utilisé à des fins expérimentales, est indispensable à l’étude de ces dialogues intercellulaires au niveau du tissu, puis à l’étude des dialogues inter-organes au niveau systémique.

Réduction

Grâce à nos études préliminaires, nous savons qu’un minimum de 10 animaux nourris avec un régime enrichi en graisses par condition testée est nécessaire pour observer un effet sur la sensibilité à l’insuline. Ces travaux n’avaient cependant été réalisés que sur des mâles de fond génétique sauvage. A cause d’une hétérogénéité interindividuelle significative dans les paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront dans ce projet d’utiliser 15 animaux contrôles par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard) et 15 animaux génétiquement déficient pour une adipokine par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard), pour chaque condition expérimentale et température d’hébergement. Ce nombre minimal permettra d’obtenir des résultats robustes et basés sur une puissance statistique suffisante, en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Nous estimons que pour établir une différence éventuelle entre les groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus par groupe : soit 15 mâles non déficients, 15 mâles déficients, 15 femelles non déficientes et 15 femelles déficientes par condition expérimentale et température d’hébergement. L'utilisation de 3 cohortes au maximum, manipulées à des temps « indépendants », est justifiée par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Pour le bien-être animal, les souris seront en groupes sociaux de 4 à 5 individus constitués dès le sevrage de fratries, dans la majorité des cas. Les souris ne seront jamais isolées lors des protocoles. Un contrôle quotidien de l'alimentation, la boisson et l'état physique des animaux sera effectué. Des enrichissements (feuille d’essuie-tout, bâtonnet de bois, papier kraft « sizzle-nest ») seront placés dans les cages et remplacés lors du change hebdomadaire ou en cas de souillure excessive. Si les animaux montrent des signes d’agitation/nervosité lors des manipulations, des abris seront ajoutés aux cages (igloos, tubes…) afin de satisfaire leur besoin naturel de se cacher. Selon le développement technique et la disponibilité commerciale de certains produits à administrer, ces options moins invasives seront privilégiées à la chirurgie. Dans le cas contraire, les injections ou chirurgies se feront sous anesthésie avec antalgique et tapis chauffants. Dès l’apparition d’un comportement normal de réveil (étirements, ébrouement, toilettage…), il sera replacé avec ses congénères. Dans les jours suivants, la litière de copeaux de bois standard sera remplacée par une litière de cellulose ne produisant pas de poussière, évitant l’irritation des plaies chirurgicales. La cicatrisation de l’abdomen et l’absence de signes de douleurs (évaluée par la grille de scoring) sera un point essentiel de la surveillance quotidienne. Après mise sous régime riche en graisses, un suivi du poids hebdomadaire sera réalisé. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris) est le modèle animal expérimental le plus étudié notamment pour les études physiologiques et métaboliques. La lignée animale déficitaire pour le gène d’une adipokine a été développée chez la Souris et est utilisée par plusieurs équipes de recherche, ce qui permet une comparaison avec les données de la littérature. La transposition du modèle à l’Homme est améliorée par l’humanisation du modèle murin, par l’utilisation de vecteurs viraux permettant l’expression du gène humain de notre adipokine dans le tissu adipeux des animaux. Les animaux utilisés seront adultes et âgés de 8 semaines au début du protocole, 22 semaines à la fin du protocole.

Vingt-trois heures seules en cage métabolique pour récolter séparément leur urine et leurs excréments : 672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant quatre semaines, elles mangent une nourriture contaminée par une mycotoxine et reçoivent chaque semaine de l'alcool par gavage, avec des prélèvements de sang à la queue, à la joue et à la veine saphène. Le porteur indique que la mycotoxine peut réduire leur prise de poids, que le gavage peut irriter leur œsophage et que l'isolement en cage peut les stresser. Il retient une lignée de souris connue pour développer des maladies du foie, alors que l'étude porte précisément sur les atteintes hépatiques.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l'Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines, produites par certaines moisissures, sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50% des céréales, les concentrations augmentent avec le changement climatique et aujourd'hui environ 80% des individus y sont exposés. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Elle ne provoque pas de dommages sur l'ADN mais exacerbe ceux qui sont provoqués par des contaminants alimentaires connus pour endommager l’ADN dits génotoxiques. L'alcool est l'une des substances qui affecte le système nerveux (psychoactive) les plus fréquemment consommées en France et est responsable d'environ 3 millions de décès par an. La consommation d'alcool affecte principalement l’intestin et le foie et est associée à diverses maladies inflammatoires. L'alcool provoque des dommages à l'ADN qui, s'ils sont mal réparés peuvent devenir le point de départ des cancers. L’effet de l’alcool et de la mycotoxine étudiée en mélange pourrait ainsi être à l'origine d'effets encore plus importants. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l'intestin. Comme par ailleurs il est connu que les capacités de détoxification sont différentes entre les hommes et les femmes, nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes de multi-exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc.. Ils consomment aussi de l’alcool de manière occasionnelle. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à cette mycotoxine augmente les effets néfastes dus à une exposition aiguë à l’alcool, mimant une consommation occasionnelle. Les données expérimentales permettront d’évaluer comment une exposition combinée impacte notamment la santé digestive et hépatique. Nous mesurerons des marqueurs de génotoxicité et d’inflammation et des lésions de l’intestin et du foie. Les résultats attendus de ce projet sont importants en termes de santé publique, car les consommateurs sont chroniquement exposés à ces contaminants en mélange. Si l’hypothèse d’une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu’elles sont combinées est confirmée, les données produites seront valorisées dans des publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’homme.

Procédures

Les souris hébergées en groupe seront exposées à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines. Une fois par semaine elles recevront le traitement à l’alcool par gavage, durée du geste 30 secondes et un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux vigiles dont la durée est inférieure à 1 minute. Lors de la dernière semaine du protocole, les animaux seront soumis également à un jeûne de 4 heures, à un gavage avec un marqueur fluorescent (durée du geste 30 secondes) ainsi qu'au prélèvement de deux gouttes de sang à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale, ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour 23h au maximum pour récolter séparément les urines et les fèces pour analyses. A la fin de chaque procédure, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la joue puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’administration de l’alcool par gavage peut entrainer une modification transitoire du comportement. Le gavage oral peut induire une irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins à la veine maxillaire, à la veine caudale et à la veine saphène peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une douleur liée à la piqure de l’aiguille. L’isolement de l’hébergement individuel en cage à métabolisme peut être stressant pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée en mélange avec l’alcool exacerbe la réponse inflammatoire de cellules d’intestin ou de foie en culture. Cependant lorsqu’ils sont ingérés par un organisme vivant, leur devenir puis leurs effets vont dépendre notamment de leur absorption dans l’intestin et de la façon dont ils sont détoxifiés dans le foie. Ce projet nécessite donc l'utilisation d'animaux de laboratoire car nous souhaitons étudier les conséquences d’une co-exposition alimentaire à la mycotoxine et à l’alcool sur un organisme entier, ce qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives comme la culture de cellules.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Le gavage sera réalisé par une personne expérimentée, l’observation des animaux sera renforcée après l’administration afin de s’assurer du bien-être des animaux. Une crème anesthésiante sera appliquée avant les prélèvements de sang. Les cages individuelles utilisées durant 23h maximum sont transparentes, incluent l’abri en inox et les animaux sont à proximité de leurs congénères afin de permettre le contact visuel. Durant ce séjour, le suivi du bien-être est renforcé avec plusieurs visites par jour.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. C’est d’autre part le modèle le plus utilisé pour étudier et reproduire les effets de la consommation d’alcool ou de l’exposition à des mycotoxines comme en atteste la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une injection de cytomégalovirus murin dans chaque poche amniotique au treizième jour de gestation, et leurs petits, nés infectés, subissent la section d'un bout de queue à la naissance, cinq jours d'injections dans l'abdomen et des mesures d'audition à trois, six et neuf semaines. Parmi les effets attendus, le porteur liste la difficulté de prise de poids, l'ouverture des cicatrices chez les mères et la surdité des souriceaux. Il affirme que l'étude ne peut être réalisée que chez l'animal, la complexité de l'oreille interne rendant selon lui impossible tout recours à des "méthodes alternatives".

Objectifs

L’infection pendant la grossese à cytomégalovirus (un virus transmissible par voie respiratoire chez l'Homme et qui peut infecter le bébé pendant la grossesse) est la principale cause infectieuse de surdité acquise avant la naissance. Cette infection représente 0,5 à 1% des naissances vivantes et elle est le plus souvent sans symptomes à la naissance. La surdité est la séquelle la plus fréquente même chez les nouveau-nés sans symptomes à la naissance, et peut se révéler plusieurs années après. L’équivalent murin du virus, le MCMV, peut entraîner chez la souris, les mêmes anomalies que celles retrouvées chez l’humain. La surdité chez les souriceaux infectés est mise en évidence par une mesure de l'audition (potentiels évoqués auditifs (PEA)) à 3, 6 et 9 semaines. Trois nouvelles molécules semblent avoir une efficacité antivirale sans toxicité. Le but de cette étude est de comparer l'efficacité de ces molécules par rapport au traitement de référence sur un modèle murin dans le contexte d'une infection à CMV.

Bénéfices attendus

Il n’existe actuellement pas de traitement permettant de prévenir ou guérir la surdité dans le cadre de l’infection à cytomégalovirus (CMV) pendant la grossesse. La prescription de traitement antiviral à la naissance semble limiter ou ralentir la surdité. Les antiviraux commercialisé sont efficaces sur l’infection mais ils ont des effets secondaires (toxicité sanguine, toxicité rénale) et n’ont pas l’autorisation d'utilisation pour l’infection congénitale par le CMV. Les traitements que nous voulons tester ont été développés récemment et n’ont pas encore été testés dans les infections congénitales à CMV. Il s’agit donc de la première étude d’évaluation d’efficacité de ces antiviraux dans cette indication.

Procédures

Les souris seront infectées par le cytomégalovirus murin (MCMV) puis traitées par différents antiviraux pour observer l'efficacité de ces traitements sur la surdité provoquée par le MCMV. L'infection au MCMV sera faite une fois par souris gestante, par une injection dans chaque poche amniotique (poche contenant les bébés souriceaux) de MCMV. Les traitements à l'étude seront administrés chez les souriceaux nés infectés, par une injection intrapéritonéale (cavité abdominale) une fois par jour pendant 5 jours. Les prélèvements de sang lors de la section d’un bout de queue à la naissance des souriceaux sera réaliser une fois par souriceau. Ainsi que le prélèvement de salive à la naissance (au niveau de la face interne de la joue à l'aide d'un petit écouvillon adapté).

Impact sur les animaux

Douleur en post opératoire des injections de MCMV (douleurs de cicatrice). Douleur lors des injections des traitements antiviraux dans la cavité abdominale. Risque d'nfections du site opératoire ou ouverture de la cicatrice après injection du virus aux mères gestantes. Difficulté de prise de poids due à l'infection. Surdité des souris infectées.

Devenir

Euthanasie des animaux en fin de procédure pour pouvoir faire les analyses sur les tissus (recherche du virus et de signes d'inflammation, recherche d'effets secondaires des traitements).

Remplacement

L'objectif de l'étude étant d'évaluer la préservation de l'audition, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal. Compte-tenu de la complexité de structure de l’oreille interne, il n’est pas possible de remplacer ce modèle animal par d’autres modèles ni par des méthodes alternatives ni substitutives.

Réduction

Les calculs du nombre d'animaux nécessaire à été fait pour avoir une puissance statistique suffisante compte tenu des variations d'audition entre les groupes. Dans des études précédentes sur ce même virus mais avec des traitements différents , le nombre de souriceaux par femelle gestante était divisé par deux lorsque les souris étaient infectées par le virus, justifiant un nombre important de femelles gestantes (5 par groupe d'étude).

Raffinement

Le suivi clinique quotidien permettra d'évaluer la douleur à l'aide d'une grille de score prenant en compte des paramètres suffisamment précoces et prédictifs (comportement de l'animal, blessures éventuelles) permetant de proposer une action pour réduire la douleur (désinfection d'une blessure par exemple) ou qui aboutira à l’euthanasie de l’animal. Les souris seront hébergées dans une animalerie calme, avec enrichissement dans les cages et seront surveillées quotidiennement. Lors des procédures douloureuses ou tests auditifs, ils seront endormis et un traitement anti douleur sera administré.

Choix des espèces

La souris constitue l’espèce de choix dans cette infection virale car le MCMV est génétiquement proche du virus humain et les atteintes induite par ce virus sont similaires à celles observées chez l’homme. Les femelles gestantes seront injectées à E13 (13ème jour de gestation). Il s’agit de la période de développement neurologique. Ce stade correspond également à l’apparition et au développement des organes de l'audition, qui se forment entre le 13ème et 18 ème jour de gestation chez la souris. Pour l'étude de la vie des molécules dans la corps de la souris, les souriceaux auront 1 jour de vie et les souris seront adultes afin de pouvoir observer d'éventuelles différences entre l'adulte et le nouveau-né.

Génétiquement modifiées pour ne plus répondre aux corticostéroïdes, 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une compression du nerf sciatique de vingt minutes sous anesthésie, pratiquée sur les deux pattes arrière, l'une comprimée et l'autre opérée à blanc, puis trois tests moteurs mesurant la force, la coordination et l'équilibre. Le porteur qualifie la douleur induite de légère et affirme que la patte témoin ne gêne pas l'animal, tout en prévoyant une quantification quotidienne de cette douleur et des points limites. Toutes seront tuées à deux ou six mois pour prélever leurs nerfs sciatiques.

Objectifs

Le but de cette étude est d'utiliser un modèle de compression du nerf sciatique chez la souris pour mieux comprendre l'effet d'hormones sur la régénération du nerfs périphérique en utilisant des animaux ayant une réponse modifiée à ces hormones dans le nerfs.

Bénéfices attendus

Bien que très efficaces, les traitements hormonaux peuvent être accompagnés d'effets secondaires sévères. Des hormones sont impliquées dans la réponse au stress, l'immunité, l'inflamation, les rythmes biologiques, la mémoire et le métabolisme. De façon étonnante, leur rôle dans la biologie des nerfs a été peu étudié à ce jour. Mieux comprendre les rôles des hormones dans leur régénération pourrait avoir des applications dans le traitement des maladies des nerfs liés au diabéte, ou dans les atteintes nerveuses auto-immunes comme le syndrôme de Guillain-Barré.

Procédures

Pour étudier la réparation de la gaine de myéline les animaux subiront une compression du nerf sciatique pour induire une altération de la gaine de myéline et ensuite sa régénération. La procédure ne dure que 20 minutes et sera effectuée sous anesthésie générale après traitement analgésique pour limiter la douleur liée à l'opération. Après l'opération, nous suivrons au cours des semaines suivantes la récupération des fonctions du nerf sciatique en utilsant trois tests moteurs mesurant la force, la coordination et l'équilibre. Chacun des tests ne dure que quelques secondes par animal et sera répéter un autre jour, le premier test servant à habituer l'animal.

Impact sur les animaux

Chez la souris, la compression du nerf sciatique altère légèrement la locomotion et peut entraîner une douleur que nous avons caractérisée comme légère. Nous quantifierons les jours suivants cette douleur chez les souris en utilisant des critères spécifique d'évaluation de la douleur que nous avons mis en place afin de prendre en charge par un analgésique si nécessaire les nuisances induites par cette procédures. Les tests comportementaux peuvent aussi induire une légère douleur localisée. De base, l'état des animaux insensibles aux hormones n'est pas dommageable : on observe une baisse de performance sur des tests moteurs spécifiques mais sans gène au déplacement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les tests moteurs permettant de mesurer la régénération du nerf, qui aura lieu à 2 mois (jeunes adultes) ou à 6 mois (adultes matures) afin de prélever les nerfs sciatiques pour étudier la cinétique moléculaire et cellulaire de la remyélination.

Remplacement

La remyélinisation est un processus complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires qui ne peuvent être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la gaine de myéline et de son maintien a des conséquences fonctionnelles qui nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.

Réduction

Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données aux tests satistiques adaptés et comparerons les groupes de 10 animaux deux à deux (contrôles vs réponse aux corticostéroïdes inactivée / lésés vs non lésés). De plus, l’analyse de cohorte d'un autre projet du laboratoire et l’optimisation du protocole de compression du nerf sciatique nous permet de réduire par deux le nombre d’animaux opérés en s’affranchissant du groupe contrôle. Vue l’innocuité du geste chirurgical sur les tissus environnants le nerf et l’atteinte locomotrice très limitée, nous avons décidé d’opérer les animaux au niveau des deux pattes arrières (une subit la compression, l’autre seulement le geste chirurgical à blanc). Aucune gène n’a été constatée du côté de la patte contrôle et cela ne compromet pas la capacité de l’animal à se nourrir ou se déplacer, ni n’affecte significativement son bien-être.

Raffinement

Les manipulations se font dans une pièce dédiée au comportement dans la zone expérimentale de l'animalerie. Les animaux issus d'une même portée sont hébergés dans les mêmes cages contenant du matériel de nidification. L'enrichissement est renforcé des dômes et des batonnets à ronger. Au minimum 4 heures s'écoulent entre chaque test de nature différente, et au maximum 2 tests seront effectués dans la même journée. La compression des nerfs s'effectue sous anesthésie et analgésie. Des analgésiques sont également administrés après l'opération. Si des animaux se déplacent avec difficulté, du gel alimentaire sera mis à disposition. La compression du nerfs ne provoque pas de dommage majeur pour l'animal et la récupération s'effectue rapidement, mais par précaution des points limites ont été définis pouvant aller jusqu'à l'arrêt de l'expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères suffisamment proche de l’Homme pour servir à l’évaluation de l’implication des voies de signalisation des corticostéroïdes sur le développement et le maintien de la gaine de myéline périphérique. Par ailleurs, la génération de modèles de souris transgéniques est une stratégie largement utilisée dans ce domaine de recherche. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces voies ont été principalement développés pour la souris. Les animaux seront utilisés au stade 2 mois, jeune adulte, et 6 mois, adulte mature pour voir si l'âge influe sur la capacité de régénération de la gaine de myéline lorsque la réponse aux glucocorticoïdes est inactivée.