Recherche fondamentale

Un fragment de nageoire coupé sous anesthésie, puis un prélèvement de sperme pour les mâles : 1 050 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet crée une lignée mutante pour un gène exprimé dans l'intestin, absent chez la souris, afin d'observer les effets de son inactivation sur le microbiote. Le porteur indique que 48 poissons seulement seront analysés après leur mise à mort, répartis entre individus mutants et non modifiés. Il ne dit rien du sort des mille autres, au-delà du fait qu'il faut selon lui "un grand nombre d'œufs" pour obtenir la mutation recherchée.

Objectifs

Un nouveau type de cellules a récemment été découvert dans l’intestin chez plusieurs espèces dont l’humain et le poisson-zèbre. Ces cellules pourraient jouer un rôle important dans le fonctionnement de l’intestin en régulant la composition du mucus, le pH et la production de substances antimicrobiennes. Elles pourraient donc avoir un impact sur le microbiote, qui est essentiel à la digestion et à la santé. Cependant, la fonction exacte de ces cellules reste inconnue, car elles ne sont pas présentes chez la souris, un modèle couramment utilisé en recherche. Pour mieux comprendre leur rôle, ce projet vise à étudier le rôle d’un gène (BEST4) spécifiquement exprimé par ces cellules chez le poisson-zèbre. Après modification génétique, l’intestin des poissons sera analysé afin d’observer les éventuels changements dans sa structure et son fonctionnement, ainsi que sur le microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Aucun modèle animal n’a encore été développé pour étudier l’inactivation de ce gène. Ce projet permettra donc de mieux comprendre le rôle de ces cellules récemment découvertes dans l’intestin de nombreuses espèces. Ces nouvelles connaissances sur le fonctionnement de l'intestin pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies digestives, tant chez l’humain que chez l’animal.

Procédures

Les animaux sont des animaux mutants qui seront prélevés pour organes post-mortem. Il s'agit donc de créér une lignée génétiquement modifiée dont les animaux subiront un génotypage et prélèvement de sperme pour les mâles concernés.

Impact sur les animaux

Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système digestif, car ce gène est surtout exprimé dans l’intestin. Des modifications pourraient affecter la sécrétion d’ions, l’hydratation du mucus, la régulation du pH et la production de substances antimicrobiennes, ce qui pourrait influencer l’équilibre du microbiote intestinal et, par conséquent, la santé intestinale. Cependant, comme ce gène n’est pas fonctionnel chez la souris sans provoquer de troubles majeurs, il est probable que l’intestin du poisson-zèbre puisse s’adapter en compensant l’absence de ces cellules. Le genotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction de l'activité de nage. La récolte de gamètes est bien maîtrisée et ne génère pas d’inconfort ou de nuisance pour les animaux.

Devenir

Ce projet vise à étudier le fonctionnement de l’intestin après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes.

Remplacement

Les cellules intestinales peuvent être étudiées à l’aide de modèles in vitro. Toutefois, ces modèles ne reproduisent pas encore toute la complexité de l’intestin, notamment la présence d’un microbiote diversifié. Il n’existe donc pas d’alternative aux études sur l’animal pour comprendre le rôle de ces cellules dans l'intestin.

Réduction

Au total, 48 poissons seront étudiés après euthanasie, répartis équitablement entre deux groupes : des individus mutants et des individus non modifiés. Pour obtenir ces poissons, un grand nombre d'œufs doit être produit, car seuls quelques-uns porteront la mutation recherchée. Le nombre strictement nécessaire de poisson sera produit afin de garantir l'obtention des 48 poissons nécessaires aux analyses.

Raffinement

Les poissons seront élevés dans des conditions optimales, adaptées à leur espèce, en veillant à la température, à l’éclairage, à la qualité de l’eau et à la densité des aquariums (30 individus maximum par bac dans un volume de 9.5 litres). Des plantes seront ajoutées pour enrichir leur environnement. Toutes les manipulations, comme la mise en ponte ou l’anesthésie, seront effectuées rapidement afin de minimiser le stress. Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’apparition de symptômes, qu’ils soient liés ou non à la modification génétique, le poisson sera pris en charge par le vétérinaire du laboratoire, qui décidera des mesures à adopter pour préserver son bien-être.

Choix des espèces

Les études sur la physiologie digestive utilisant des techniques de modification génétique sont souvent réalisées chez la souris. Cependant, ce modèle n’est pas adapté ici, car les cellules spécifiquement étudiées sont absentes dans son intestin. Le poisson-zèbre a été choisi car ces cellules sont bien présentes dans son intestin et partagent des caractéristiques similaires avec celles des mammifères. De plus, cette espèce est idéale pour la recherche génétique en raison de sa reproduction très efficace (plus de 200 œufs par femelle), du développement rapide des embryons, et du fait qu’un individu atteint sa maturité en seulement trois mois. Enfin, le poisson-zèbre est déjà largement utilisé pour mieux comprendre le fonctionnement de l’intestin des mammifères. Dans ce projet, les analyses seront réalisées sur des animaux adultes, afin d’étudier l’intestin à un stade de développement mature.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées puis nécropsiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent douze semaines de régime enrichi en lipides, subissent deux gavages, trois à onze injections et quatre séries de huit à neuf prélèvements de sang à la queue, certaines une chirurgie sous anesthésie générale. Le projet teste si la surexpression d'une adipokine dans le tissu adipeux retarde la résistance à l'insuline liée à l'obésité. Le porteur écrit que le modèle in vivo est "indispensable" pour étudier ces dialogues entre cellules, après avoir précisé que son équipe cultive couramment des adipocytes humains et murins.

Objectifs

L’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux et s’accompagne de complications métaboliques. L’excès de tissu adipeux est corrélé au degré d’insulino-résistance qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit au développement d’un diabète de type 2. Le tissu adipeux est un organe central du métabolisme par sa fonction de stockage des lipides. Il produit également de nombreux facteurs, dont des adipokines bénéfiques ou délétères vis-à-vis de l’action de l’insuline ; ces adipokines peuvent agir au sein même du tissu ou à distance dans l’organisme. Une meilleure connaissance des adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l’obésité. Nous avons mis en évidence chez l’Homme une nouvelle adipokine dont le niveau d’expression dans le tissu adipeux est faible chez des personnes atteintes de syndrome métabolique ou de diabète de type 2. Son taux sanguin est un déterminant négatif de la résistance à l’action de l’insuline. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de cette adipokine par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une insulino-résistance. Nous voulons tester si sa surexpression dans le tissu adipeux peut permettre de retarder, voire d’empêcher, le développement d’une résistance à l’action de l’insuline induite par l’obésité. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances sur les acteurs de la sensibilité à l’insuline, dans un contexte de prise de poids et de dégradation de la signalisation insulinique. La compréhension du rôle de certaines adipokines dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline au cours de l’obésité, permettra de cibler de nouveaux mécanismes cellulaires. L’apport de l’expérimentation animale est majeur dans l’étude de la dérégulation de ces voies, en offrant un point de vue à corps entier de la physiopathologie de l’obésité et du diabète.

Procédures

Dans l’EU1, les animaux auront une alimentation enrichie en lipides durant 12 semaines et un hébergement à thermoneutralité. Tous les animaux seront soumis à 2 gavages, 3 à 11 injections et 4 séries de 8 à 9 prélèvements de sang à la queue au cours de leur vie ; chaque acte sur animaux vigiles n’excédant pas 15 secondes consécutives. Tous les animaux pourront subir une intervention chirurgicale (de 10 à 15 minutes maximum) sous anesthésie générale avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire. Dans l’EU2, les animaux seront soumis à 1 gavage, 1 série de 5 prélèvements de sang à la queue n’excédant pas 15 secondes consécutives, puis nécropsiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourraient survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min), lors des 12 semaines de régime enrichi en lipides, lors des gavages (environ 15 sec) ou encore lors des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 5 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors de prises de sang ou encore lors d’injections. Dans l’éventualité où l’option chirurgicale serait retenue pour induire la surexpression de l'adipokine étudiée, les souris pourraient ressentir une douleur légère pendant 1 à 2 jours malgré l’utilisation d’antalgique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et nécropsiés en vue de l'analyse de leur sang et de plusieurs organes.

Remplacement

Les modèles in vitro d’adipocytes humains et murins existent et l’équipe en cultive couramment. Cependant, en raison de la capacité de prolifération quasi-inexistante des adipocytes, ces lignées sont cultivées sous forme de préadipocytes puis différenciées en adipocytes matures grâce à un milieu de culture spécifique. Ces conditions de culture rendent les cellules artificiellement résistantes à l’action de l’insuline et il est impossible d’étudier l’effet de certaines molécules sur la sensibilité à l’insuline. De plus, les tissus adipeux sont constitués d’une grande diversité de cellules, outre les adipocytes, qui participent à la dysrégulation de la sensibilité à l’insuline. C’est le cas des cellules immunitaires qui, selon leurs sécrétions de cytokines et chimiokines, influencent le signal insulinique à l’échelle du tissu. Ainsi, le modèle in vivo sur l’animal, utilisé à des fins expérimentales, est indispensable à l’étude de ces dialogues intercellulaires au niveau du tissu, puis à l’étude des dialogues inter-organes au niveau systémique.

Réduction

Grâce à nos études préliminaires, nous savons qu’un minimum de 10 animaux nourris avec un régime enrichi en graisses par condition testée est nécessaire pour observer un effet sur la sensibilité à l’insuline. Ces travaux n’avaient cependant été réalisés que sur des mâles de fond génétique sauvage. A cause d’une hétérogénéité interindividuelle significative dans les paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront dans ce projet d’utiliser 15 animaux contrôles par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard) et 15 animaux génétiquement déficient pour une adipokine par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard), pour chaque condition expérimentale et température d’hébergement. Ce nombre minimal permettra d’obtenir des résultats robustes et basés sur une puissance statistique suffisante, en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Nous estimons que pour établir une différence éventuelle entre les groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus par groupe : soit 15 mâles non déficients, 15 mâles déficients, 15 femelles non déficientes et 15 femelles déficientes par condition expérimentale et température d’hébergement. L'utilisation de 3 cohortes au maximum, manipulées à des temps « indépendants », est justifiée par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Pour le bien-être animal, les souris seront en groupes sociaux de 4 à 5 individus constitués dès le sevrage de fratries, dans la majorité des cas. Les souris ne seront jamais isolées lors des protocoles. Un contrôle quotidien de l'alimentation, la boisson et l'état physique des animaux sera effectué. Des enrichissements (feuille d’essuie-tout, bâtonnet de bois, papier kraft « sizzle-nest ») seront placés dans les cages et remplacés lors du change hebdomadaire ou en cas de souillure excessive. Si les animaux montrent des signes d’agitation/nervosité lors des manipulations, des abris seront ajoutés aux cages (igloos, tubes…) afin de satisfaire leur besoin naturel de se cacher. Selon le développement technique et la disponibilité commerciale de certains produits à administrer, ces options moins invasives seront privilégiées à la chirurgie. Dans le cas contraire, les injections ou chirurgies se feront sous anesthésie avec antalgique et tapis chauffants. Dès l’apparition d’un comportement normal de réveil (étirements, ébrouement, toilettage…), il sera replacé avec ses congénères. Dans les jours suivants, la litière de copeaux de bois standard sera remplacée par une litière de cellulose ne produisant pas de poussière, évitant l’irritation des plaies chirurgicales. La cicatrisation de l’abdomen et l’absence de signes de douleurs (évaluée par la grille de scoring) sera un point essentiel de la surveillance quotidienne. Après mise sous régime riche en graisses, un suivi du poids hebdomadaire sera réalisé. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris) est le modèle animal expérimental le plus étudié notamment pour les études physiologiques et métaboliques. La lignée animale déficitaire pour le gène d’une adipokine a été développée chez la Souris et est utilisée par plusieurs équipes de recherche, ce qui permet une comparaison avec les données de la littérature. La transposition du modèle à l’Homme est améliorée par l’humanisation du modèle murin, par l’utilisation de vecteurs viraux permettant l’expression du gène humain de notre adipokine dans le tissu adipeux des animaux. Les animaux utilisés seront adultes et âgés de 8 semaines au début du protocole, 22 semaines à la fin du protocole.

Injectées sous anesthésie de cellules tumorales humaines dans la glande mammaire, gavées une fois par jour pendant quatre jours d'une molécule qui active les récepteurs aux œstrogènes, des souris femelles immunodéprimées passent aux neuvième et onzième jours deux examens d'imagerie TEP sous anesthésie, le second après une nuit de jeûne et une prise de sang. 30 souris vont être utilisées sur deux établissements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour vérifier si un traceur radioactif qui imite les œstrogènes peut repérer sans biopsie des mutations rendant inefficaces les traitements hormonaux du cancer du sein. Le porteur cite la douleur de l'injection mammaire et du développement tumoral, une irritation de l'œsophage, une hypoglycémie liée au jeûne et une vulnérabilité accrue aux infections. Toutes sont tuées après les examens, pour l'analyse de leurs tumeurs.

Objectifs

Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.

Procédures

Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.

Quarante-cinq minutes de chirurgie du cerveau, puis deux heures d'enregistrement de l'activité neuronale : 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en huit groupes de douze, ils reçoivent d'une à quatre injections de kétamine avant l'enregistrement. L'objet déclaré est de comprendre comment la kétamine module l'activité du cortex préfrontal, dans l'espoir d'ouvrir des pistes contre la dépression résistante aux traitements. Le porteur retient le rat parce que son usage est "généralisé" en neurosciences et que les résultats pourront être comparés à la littérature existante.

Objectifs

La découverte des effets antidépresseurs rapides de la kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et éveillé l’espoir de nouveaux traitements à efficacité accélérée. En effet, alors que les antidépresseurs classiques mettent plusieurs semaines à agir et sont inefficaces chez plus de 30% des patients, l’injection d’une seule dose de kétamine provoque des effets antidépresseurs rapides et robustes chez les patients atteints de dépression pharmaco-résistante. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine du pouvoir antidépresseur de la kétamine est donc une étape clé pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles dépressifs majeurs. En effet, la kétamine pourrait soulager les symptômes de la dépression en modulant l'activité cérébrale contrôlant l’humeur. Les objectifs du projet sont donc de tester l'effet d'une dose unique ou de doses multiples de ketamine sur la modulation de l'activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Ces expérience permettront de mieux comprendre le rôle modulateur exercée par la kétamine sur l'activité du cerveau contrôlant l'humeur et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitements des troubles dépressifs.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau qui dure 45 minutes. Deux groupes de 12 rats sont soumis à une injection du composé (5 min) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à deux injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à trois injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à quatre injections du composé (5 min per injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Tous les animaux sont hébergés en cage collective ée (2 rats par cage) pour une dureé maximum de 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à une chirurgie et traitements successifs dont le degré de gravité va de léger à modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie , en effet l'animal est anesthésié puis opéré. Bien que toutes les mesures soient prisent pour réduire douleur et risque d’infections, cette procédure représente la plus importante nuisance pour l'animal. Les autres types de nuisances envisagées sont l'euthanasie même si l'animal est sédaté au préalable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer des analyses imunohistochimiques sur ce dernier.

Remplacement

La procédures décrite a recours exclusivement à des rats de laboratoire (Sprague Dawley) pour les raisons suivantes : 1. Il est interdit de mettre en œuvre chez l’homme des techniques neurobiologiques invasives telles que celles décrites ici et qui permettent d’établir des liens de causalité tels que ceux que nous cherchons à tester, 2. Il n ’existe pas encore de modélisation mathématique (pharmacologiques) des effets que nous cherchons à comprendre. Pour comprendre les mécanismes de la plasticité in vivo, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Des outils statistiques sont utilisés pour calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires à la validation de l'expérience. Ce nombre s'élève à 12 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Le confort de l’animal est pris en compte tout au long de sa vie au moyen d’une grille d’évaluation et la définition de points limites et critères d’arrêt de l'expérience. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour qu'ils sachent détecter tout signe de mal-être et ne soient pas eux-mêmes source de mal-être par une manipulation inadaptée. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par ou sont eux-mêmes des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les expériences se déroulent quand les animaux sont actifs et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont pris en main de façon appropriée [jamais par la queue, les pattes reposant sur un support (bras, main...) pour éviter la sensation du vide]. L’anesthésie pour les chirurgies et la douleur post -opératoire sont gérées avec des molécules adaptées comme des antidouleurs. Une pommade cicatrisante est appliquée sur les sutures. Pour prévenir l’hypothermie, les chirurgies sont pratiquées sur couverture chauffante puis l’animal est placé dans une chambre post-opératoire jusqu’à ce qu’il se redresse sur ses pattes. Les animaux sont hébergés collectivement tout au long de l'expérience. Pour enrichir l’environnement, des nids végétaux sont placés dans chaque cage et renouvelés systématiquement lors du change.

Choix des espèces

Cette espèce est un bon modèle pour les études pharmacoloqiques. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences. Nous utiliserons des rats jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi afin de correspondre aux données de la littérature afin de pouvoir comparer nos données.

Tuées à l'issue pour prélever leur sang et leur foie, 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent l'injection d'une molécule choisie pour sa toxicité hépatique, qui peut provoquer des douleurs abdominales. Quatre cents d'entre elles subissent en plus l'ablation des ovaires, dont la moitié avec la pose d'une capsule hormonale sous la peau, pour modéliser la ménopause et les traitements hormonaux. Le porteur reconnaît que le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisé, et affirme dans le même temps qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement".

Objectifs

De nombreuses études ont montré que la toxicité de nombreux médicaments dépends des rythmes circadiens c'est-à-dire que leur toxicité est dépendante de l'heure de la journée. Cette approche de la pharmocologie, appellée chronothérapie, permet de diminuer la toxicité et/ou augmenter l'efficacité des médicaments. Cependant, l'effet du sexe sur différentes chronothérapies n'a été étudié que très brièvement dans la littérature alors qu'on sait que de nombreux paramètres pharmacologiques (absorption, métabolisation, excrétion) sont régulés de manière sexe-dépendante et circadienne. L'objectif de ce projet est donc de tester la chronotoxicité de 5 molécules utilisées en clinique et connues pour présenter une pharmacocinétique circadienne et dont nous avons identifié que les voies de métabolisation hépatique dépendent du sexe et du statut oestrogénique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer et comparer la chronotoxicité de ces 5 molécules entre les femelles et les mâles ainsi qu'entre des femelles intactes modélisant des femmes en période reproductive et des femelles ovariectomisées modélisant des femmes ménopausées. Ces résultats seront déterminants pour optimiser la chronothérapie de ces 5 molécules chez les femmes en période reproductive, les femmes ménopausées et les hommes sachant que ces molécules sont fréquement utilisées en clinique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 200 animaux seront soumis à une chirurgie de classe modérée (ovariectomie) et 200 animaux seront soumis aux deux chirurgie de classe légère (pose de pellet sous-cutanné) et modérée (ovariectomie). Tous les animaux de ce projet (800 animaux au total) seront soumis à l'injection de molécule induisant une toxicité hépatique pouvant induire des douleurs abdominales et est donc considérée comme une procédure de classe modérée.

Impact sur les animaux

L'étude de la toxicité hépatique nécessite par définition d'utiliser des doses toxiques des différents composés testés pouvant induire des douleurs (douleurs abdominales). Si le type de douleur induite par ces molécules n'a jamais été formellement caractérisée, la toxicité hépatique aigue est généralement considérée comme une procédure de classe légère ou modérée. Ce protocole peut donc engendrer chez les animaux des douleurs abdominales et un stress lié à la manipulation.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélevements (sang, foie) et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Les effets de sexe et circadiens font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du sexe et des rythmes circadiens sur la métabolisation et la toxicité hépatique. De même, l'étude de la toxicité hépatique ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet. Cependant, une veille bibliographique régulière sera réalisée afin d’identifier de nouvelles méthodes alternatives pertinentes pour remplacer ce protocole.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages. L'étude de l’horloge biologique nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur propre horloge car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, les animaux utilisés dans ce projet seront manipulés dans la phase de nuit. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie et d’analgésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce s'est orienté vers la souris car c'est le modèle utilisé dans les études précedentes qui ont généré les résultats préliminaires aboutissant à ce projet. De plus, afin de pouvoir appliquer les conclusions de ce projet à l'humain, le modèle murin est le modèle expérimental qui permet de modéliser au mieux la pharmacocinétique des molécules testées. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.

Injectées de toxines bactériennes qui font chuter leur pression artérielle puis les plongent dans le coma, 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi une IRM de trente minutes sous anesthésie générale. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre la fuite capillaire du choc septique, à partir de protéines repérées chez dix-neuf patients. Le porteur présente le coma comme une limitation de l'inconfort, tout en indiquant que les doses plus importantes retenues ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant qu'il ne survienne.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.

Une partie des souris est génétiquement prédisposée à développer des tumeurs du côlon, l'autre privée du gène de la tétraspanine 8. 1 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont marquées par section d'une phalange, gavées avec des bactéries choisies pour leur rôle pro-cancéreux, puis saignées par ponction derrière l'œil sous anesthésie, la progression tumorale étant suivie deux fois par semaine par l'aspect du pelage, celui de l'anus et la présence de sang dans les selles. Toutes sont tuées à la fin de leur procédure pour prélèvements, sauf celles retenues pour entretenir la lignée.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle de la tétraspanine 8 (Tspan8) dans le côlon en termes physiologique et physiopathologique. Cette protéine est majoritairement localisée dans la membrane des épithéliums notamment dans le tube digestif et est connue pour être associée à des processus métastatiques dans le cancer colorectal. Pour ce projet, nous utiliserons des souris invalidées pour Tspan8 et des souris prédisposées à dévolopper un cancer colorectal. L’objectif principal sera de générer un modèle d'étude prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8 afin d’établir l’implication éventuelle de cette protéine sur la carcinogénèse colique. Le second objectif consistera à définir l’importance de cette dernière dans la perméabilité intestinale et son rôle sur le microbiote intestinal dans les deux contextes. En effet, ce dernier est un acteur majeur des (dis-) fonctions intestinales et il a été montré que les tétraspanines peuvent interagir avec des souches bactériennes. De ce fait, nous évaluerons également si TSPAN8 peut être partenaire pour des bactéries commensales ayant acquis des facteurs de virulence et connues pour jouer un rôle procarcinogène dans le cancer du côlon (Escherichia coli productrice de colibactine). Enfin, nous testerons la même hypothèse avec une entérobactérie murine Citrobacter Rodentium mimant une infection par entérobactérie chez homme.

Bénéfices attendus

Cette étude est partie intégrante d’un projet plus large visant à caractériser l’effet du microbiote intestinal sur la survenue de cancers colorectaux. En effet, l’étude des modifications de la structure de la barrière intestinale et de la colonisation bactérienne, en contexte sain ou pathologique sur des souris invalidées pour le gène de la TSPAN8, nous permettra de définir le rôle pro tumoral de cette protéine et de débuter les études mécanistiques visant à établir le lien entre cette protéine et les bactéries intestinales. A terme, ces études permettraient de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer colorectal.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage intragastrique (douleur légère, faible durée quelques secondes) et des prélèvements de sang par technique rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse en pré-mortem (douleur légère, faible durée quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour les souris ne produisant pas la protéine d'intérêt TSPAN8, il n’est pas attendu de phénotype dommageable au vu des précédentes observations. Pour les souris prédisposées à développer un cancer colorectal, la croissance tumorale sera appréhendée par une observation bi-hebdomadaire des souris. Une fiche de score sera réalisée pour chaque souris et permettra de déterminer si l’animal est en souffrance. Les animaux seront génotypés/marqués par phallangectomie. Cette technique entraîne une douleur légère et de faible durée. Plusieurs paramètres généraux, comportementaux et d’autres liés au modèle seront observés : suivi du poids, aspect du pelage et de l’orifice anal, consistance et présence de sang dans les selles, locomotion, comportement innée et induit. Un suivi renforcé (quotidien) sera également mis en place dès l’apparition des premiers signes de douleur (noté sur la fiche de score) afin d’intervenir la plus rapidement. Les animaux pourront également subir un gavage intragastrique (douleur légère, très courte durée) ou un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital en prémortum sous anesthésie gazeuse (douleur légère, très courte durée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour des prélèvements post-mortem sauf ceux nécessaires à l'entretient de la lignée.

Remplacement

La caractérisation des propriétés de la Tspan8 sur l’architecture de l’épithélium intestinal en contexte sain sera complétée par des études in vitro sur cellules coliques polarisées. Cependant, l’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il est impossible d’étudier le rôle de la Tspan8 lors d’une infection chronique en modèle in vitro. De même, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'étudier la perméabilité intestinale à l'échelle systémique en présence de microbiote intestinal sain ou pathologique. Enfin, l'étude du rôle de la TSPAN8 sur la modulation du microbiote intestinal en contexte sain ou pathologique doit obligatoirement être réalisé sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire sur modèle sain (Tspan-/-) ou pathologique (APCmin/+) ont mis en évidence une forte variabilité des modèles (variabilité inter individuel), de la colonisation bactérienne post gavage, de son maintien au cours du temps, de la progression tumorale en fonction du temps et de l'étude de le perméabilité intestinale. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance des modèles et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Lors de la création de la lignée le nombre d'animaux est également réduit à son minimum afin d'obtenir à terme un minimum de 7 souris femelles et mâles présentant le génotype d'intérêt pour l'étude du bien être animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un suivi qui permettra de détecter toute apparition de souffrance ou de mal-être quel que soit le modèle (sain ou pathologique). Le cas échéant, l’animal sera isolé et traité à l’aide d’antidouleurs de manière graduelle à la souffrance observée. Les animaux seront hébergés avec un milieu enrichi renforcé (cabane plastique, tube carton, pad-fibre). L’eau et l’alimentation seront fournis à volonté et disposé dans le fond de cage pour faciliter son accès. La litière sera changée en fonction des besoins de chaque cage. Durant la phase de création de la lignée, les animaux bénéficieront du même raffinement.

Choix des espèces

L’étude des processus de progression tumorale ne peut s’effectuer que dans un organisme vivant proche de l’homme, en l’occurrence, le modèle souris. Celui-ci est aussi particulièrement adapté aux expériences d’infection bactérienne et d’étude de la perméabilité intestinale. Dans le modèle prédisposé à développer un cancer colorectal et invalidé pour la Tspan8, nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois correspondant respectivement à la période d’apparition des premières lésions et d’un stade avancé de développement tumoral. Pour le modèle uniquement invalidé pour la synthèse de la Tspan8, nous regarderons aux temps 2,3 et 4 mois les modifications de perméabilité de l’épithélium intestinal. La colonisation bactérienne sera suivi en temps réel 1fois/semaine.