Recherche fondamentale

Brûlés en quatre points du dos sous anesthésie générale, 8 mini-porcs subissent ensuite huit renouvellements de pansement et seize biopsies cutanées de 8 mm. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur neuf jours de manipulation, et tous tués à l'issue pour prélever la peau brûlée. L'objet est de tester un pansement régénératif censé éviter les autogreffes chez les grands brûlés, avant tout essai clinique. Le porteur décrit un programme hebdomadaire de jeux, des fruits et légumes quotidiens et un pansement gastrique préventif, dans le même document qui prévoit quatre brûlures profondes par animal.

Objectifs

Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical innovant à 2 composantes : une composante physique et une composante biologique. Celui-ci est destiné au traitement des brûlures chez l'homme. Les 2 composantes physique et biologique ont par ailleurs été testées séparément en laboratoire et sur des brûlures cutanées de mini-pigs. Les objectifs de ce projet sont de tester le pansement dans sa forme finale (composantes combinées) sur les brûlures du mini-pig, en évaluant plusieurs critères : - La tolérance du pansement. - Sa protection contre les contaminations bactériennes. - Le maintien de son intégrité au cours du temps. - La réduction de l’inflammation locale et systémique. - L’impact sur la vitesse et la qualité de cicatrisation. La pertinence de cette étude repose sur la forte ressemblance entre le mini-pig et l’homme à l’échelle de la peau, ce qui est rend les données générées robustes pour une translation vers des études cliniques.

Bénéfices attendus

Les brûlures constituent un problème de santé publique majeur, avec près de 11 millions de personnes dans le monde subissant annuellement des brûlures suffisamment graves pour nécessiter des soins médicaux. Ce problème touche particulièrement les enfants qui représentent près de 50 % des brûlés, et pour lesquels la stratégie thérapeutique la plus souvent choisie est d'effectuer une autogreffe de peau. Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical régénératif innovant, destiné au traitement des brûlures du second degré profond chez l’homme, dans le but d'éviter, lorsque c'est possible, les autogreffes, et de restaurer rapidement l'intégrité du tissu tout en minimisant les infections, la douleur et la cicatrice résiduelle. Son intérêt est aussi d'améliorer la vitesse et la qualité de cicatrisation par rapport aux pansements traditionnels.

Procédures

Les interventions réalisées comprennent 9 jours de manipulation au total (20 à 30 minutes par animal et par jour), sous anesthésie générale : -4 brûlures au total par animal, réalisés en une seule fois (10 minutes). -8 renouvellements de traitement et pansements des brûlures (15-20 minutes). -2 prises de sang (6mL) au total par animal (1 minute). -4 biopsies de peau rondes de 8mm au total par plaie et par animal (5-10 minutes).

Impact sur les animaux

-Douleur due aux brûlures et aux biopsies. -Stress et gêne dus à la présence de plusieurs pansements sur le dos de l’animal. -Stress dû à la manipulation fréquente et à l’hébergement individuel. -Risque d’effets secondaires liés à l’anesthésie fréquente (mais de courte durée) et/ou à l’administration fréquente d’analgésiques. -Risque d’infection des plaies.

Devenir

Le sort des 8 animaux inclus dans cette étude est la mise à mort à la fin du protocole, pour cause de prélèvement d'organes post-mortem, notamment la peau au niveau des différentes brûlures pour analyses des tissus cutanés.

Remplacement

Les études de tolérance et d’efficacité d’un dispositif médical doivent être réglementairement réalisées sur des modèles animaux avant tout essai clinique chez l’homme. Les tests cutanés qu’il est possible de faire en laboratoire ont été appliqués avant d’envisager le modèle animal mais ceux-ci génèrent peu de données ; la peau est en effet un tissu complexe et la cicatrisation un mécanisme auquel participent une multitude de cellules et de facteurs, qui ne peut être reproduit dans un laboratoire.

Réduction

Après une étude pilote, le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été validé par une méthodologiste statisticienne et assure un nombre optimal d’individus pour générer des résultats robustes et exploitables.

Raffinement

Dans la conception de ce projet, l’ensemble des procédures ont été bien étudiées afin de générer des données robustes et exploitables tout en respectant les critères du bien-être animal et en limitant sa douleur et son stress. Les animaux disposent de nourriture adaptée, diversifiée et enrichie quotidiennement (fruits et/ou légumes), d’eau en accès libre et d’un programme hebdomadaire de jeux et activités. De plus une attention particulière sera apportée au confort digestif des animaux 1- par continuité de l’alimentation entre élevage et animalerie et 2-par apport d’un pansement gastrique avant alimentation une fois par jour aux porcs pour diminuer le risque d’ulcère gastrique. Pendant toutes les manipulations, les animaux seront installés sur un tapis chauffant, et les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, suivies d’un traitement approprié contre la douleur. Les animaux seront surveillés 3 à 6 fois par jour pour noter le moindre signe clinique apparent et lancer une prise en charge adaptée ; un suivi des points limites stricts et spécifiques au projet est donc réalisé tout au long de la procédure. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront séparés pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase à cause des risques d’arrachement des pansements avec des comportements de grignotage des pansements entre congénères. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif.

Choix des espèces

Les nombreuses similitudes entre l’homme et le porc en termes d’anatomie et de physiologie cutanée en font un excellent modèle animal pour l’étude de l’efficacité du pansement sur la cicatrisation des brûlures cutanées. Les animaux sont adultes. La croissance d’un jeune animal pourrait affecter et probablement améliorer la cicatrisation, ce qui introduirait un biais dans l’analyse.

Venus des États-Unis, dix macaques rhésus séparés de leur mère à la naissance et élevés en nursery, et dix élevés par leur mère, forment la cohorte que ce projet suit jusqu'à l'âge adulte. 21 macaques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué, tous étant réintroduits dans leur groupe social. Ils reçoivent une puce sous la peau de chaque avant-bras, sont capturés la veille de chaque IRM, transportés une heure et demie à l'aller comme au retour, puis anesthésiés et intubés pour trois sessions de scanner d'environ trois heures. Le porteur signale l'irritation de la trachée liée à l'intubation, l'accumulation d'agent de contraste dans le cerveau qui impose une injection de chélateur du fer, les conflits et blessures possibles au retour dans le groupe, et présente le suivi de cette cohorte déjà constituée comme un élément de réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.

Objectifs

Les effets de l'adversité sociale précoce ont un impact sur plusieurs domaines des fonctions sociales et cognitives, générant un certain nombre de déficits de régulation émotionnelle et d'attention qui peuvent perdurer tout au long de la vie de l'individu. Les troubles du développement humain, tels que l'anxiété et le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité, comptent parmi les formes les plus répandues de troubles psychiatriques et sont connus pour avoir un impact extrêmement négatif sur la vie sociale. Ce projet à pour but de mieux comprendre ces pathologies, d'un point de vue mécanistique et comportemental afin de mieux les détecter et de les traiter. Le projet proposé utilisera un modèle de primate non humain pour mieux comprendre l'impact de l'adversité sociale précoce sur l'émergence de déficits sociaux et cognitifs, de la préadolescence à l'âge adulte. Pour ce faire nous allons profiter de l’existence d’un groupe de macaques rhésus unique sur le territoire français composé d’individus avec des histoires de vie très différentes. Ce groupe en provenance des USA est composé de 10 individus élevés avec leur mère et de 10 individus séparés de leur mère à la naissance et élevés en nursery avec d’autres bébés macaques. Le premier objectif du projet est de mieux comprendre comment la privation sociale précoce module le comportement dans trois dimensions principales de la cognition sociale : les fonctions de régulation émotionnelle, la perception sociale et l'attention. Afin de répondre a cet objectif nous utiliserons des tests comportementaux automatiques en accès libre (sans contrainte pour l’animal). Le deuxième objectif est de mieux comprendre comment l'altération des fonctions sociales associée à l'adversité précoce affecte l'activité des régions cérébrales impliquées dans le traitement sensoriel de la voix et des visages. Le troisième objectif est de mieux comprendre comment deux neurotransmetteurs naturellement présents dans le cerveau interviennent dans les déficits sociaux et d'attention associés à l'adversité précoce. Afin de répondre à ces deux derniers objectifs, l’activité cérébrale des macaques sera étudiée grâce à la réalisation des IRMs, une technique non invasive utilisé aussi chez l’humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs désignés EU1/2 et EU2/2.

Bénéfices attendus

Les effets de l'adversité sociale précoce chez l’humain ont un impact sur plusieurs domaines des fonctions sociales et cognitives, générant un certain nombre de déficits de régulation émotionnelle et d'attention qui peuvent perdurer tout au long de la vie de l'individu. Les troubles du développement, tels que l'anxiété et le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité, comptent parmi les formes les plus répandues de troubles psychiatriques et sont connus pour avoir un impact extrêmement négatif sur la vie sociale. Ce projet à pour but de mieux comprendre ces pathologies, d'un point de vue mécanistique et comportemental afin de mieux les détecter et de les traiter. Spécifiquement, nous prédisons des différences entre les individus exposés à une adversité précoce et les individus élevés avec leur mère au sein de leur groupe social, en ce qui concerne (i) leur performance à des tâches comportementales de type social impliquant des stimuli affectifs (vocalisations, visages) et (ii) dans les réponses cérébrales à des modulations sensorielles impliquant des stimuli sociaux (vocalisations, visages) ou des modulations neuropharmacologiques. Nous testerons l’impact de l’ocytocine, neuromodulateur impliqué dans les comportements sociaux, ainsi que l’impact de la noradrénaline, neuromodulateur impliqué dans le contrôle de l’attention et de l’impulsivité. Ces résultats permettront de mieux comprendre comment l’adversité sociale précoce affecte l’émergence de déficits sociaux et cognitifs à l’âge adulte, avec des applications potentielles pour la détection et le traitement de ces déficits chez l’humain.

Procédures

Pose d’une puce RFID en position sous-cutanée dans chaque avant bras : celle-ci se réalise dans l’EU2/2 lors du contrôle sanitaire des animaux qui dure en moyenne 20 minutes, la pose de puces en elle-même ne dure pas plus de 10 minutes. La capture des animaux se réalise la veille de l’IRM à l’EU2/2 et dure en moyenne une heure (avec ou sans anesthésie). Le transport des animaux jusqu’au centre IRM de l’EU1/2 se décompose en deux trajets (aller et retour) d’une heure et demie chacun. Chacune des trois sessions de scanning à l’EU1/2 dure environ 3 heures incluant la sédation et l’anesthésie de l’animal, son positionnement dans le scanner, l’acquisition des séquences anatomiques et fonctionnelles, puis sa sortie et son réveil. Les sorties, absences et réintroductions auront un impact sur le ou les groupes et sur les individus de ces groupes pouvant engendrer des conflits avec blessures pendant l'absence de certains animaux et aux retours d'autres.

Impact sur les animaux

1) Pose des puces RFID : Stress lié à la capture pouvant nécessiter (rarement) une télé-anesthésie; mise à jeûn 12h avant l’anesthésie ; douleur liée à la piqûre pour l’anesthésie. 2) Transport à l’EU1/2: Stress lié à la capture pouvant nécessiter (rarement) une télé-anesthésie si la méthode standard (cage au bout du tunnel) ne fonctionne pas ; stress lié au transport. 3) Scans IRMf : Stress lié à la capture en cage de contention dans un environnement peu familier; douleur liée à la piqûre pour l’anesthésie; irritation de la trachée liée à l’intubation pour l’anesthésie gazeuse; accumulation d’agent de contraste dans les tissus cérébraux nécessitant une injection d’un chélateur du fer après la 3e session. 4) Hébergement à l’EU1/2: stress lié à la séparation du groupe social pendant une semaine, affectant potentiellement les groupes de manière répétée; stress lié à l’hébergement dans un environnement non familier; stress et blessures potentielles liées à la réintroduction dans le groupe social à l’EU2/2.

Devenir

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduits dans leur groupe social.

Remplacement

La recherche scientifique actuelle montre que l’adversité sociale a des effets complexes sur le développement physiologique et cognitif, touchant le système immunitaire, la croissance, le métabolisme et des fonctions allant de la perception sensorielle à des capacités plus élaborées comme la socialisation et la régulation émotionnelle. Cependant, ces impacts ne peuvent être reproduits ni sur des modèles biologiques in vitro, ni sur des modèles computationnels in silico, nécessitant des études sur des organismes en interaction sociale. Ainsi, le recours à l’animal est essentiel. Pour modéliser les effets de l’adversité sociale en lien avec les comportements et les mécanismes cérébraux, les primates constituent des modèles privilégiés. Bien que diverses espèces sociales soient étudiées, seules les espèces partageant des structures cérébrales et des fonctions cognitives comparables à celles des humains offrent une pertinence suffisante. Parmi les primates, les macaques se distinguent par leurs comportements sociaux sophistiqués (hiérarchie, reconnaissance, coopération) et leurs similarités cérébrales avec l’humain, notamment au niveau du cortex préfrontal et de l’amygdale. Ces caractéristiques les rendent particulièrement adaptés à l’étude des effets de l’adversité sociale sur le cerveau et le comportement. Enfin, les études sur l’humain sont limitées par l’impossibilité de contrôler précisément les environnements précoces et leurs évolutions. L’expérimentation chez les macaques permet un contrôle rigoureux des conditions de vie, rendant les résultats plus fiables et transférables à l’humain. Ce projet s’appuie sur un groupe unique de macaques rhésus, dont une moitié a été séparée de leur mère à la naissance, offrant une opportunité unique pour explorer les liens entre adversité sociale, cerveau et comportement.

Réduction

Nous souhaitons profiter de la totalité de ce groupe de macaques unique composéde 10 individus contrôles et 10 individus avec adversité précoce. Ce nombre procurera la puissance statistique nécessaire pour détecter des différences même subtiles entre les deux groupes comme indiqué par des travaux publiés ayant comparé ces deux groupes plus jeunes. La taille de 20 individus correspond à la taille standard de groupes humains étudiés en IRMf et permettant des analyses avec les sujets en variable aléatoire (test T de Student) pouvant être généralisées au-delà de l’échantillon . Des analyses similaires réalisées lorsque ces mêmes animaux étaient plus jeunes ont permis d’observer de claires distinctions fonctionnelles sur des réseaux spécifiques. Les animaux correspondent à une cohorte suivie depuis le plus jeune âge. Le fait de suivre cette cohorte longitudinalement permet d'adresser les effets de l'adversité précoce chez les jeunes puis les adultes sans recours à de nouveaux animaux et correspond à un élément de réduction. Nous utiliserons un seul singe supplémentaire, non relié au groupe de 20 animaux, pour la mise au point du protocole d'IRM.

Raffinement

Les animaleries des deux EU font l’objet d’un planning d’enrichissements soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). La pose des puces de radio-identification se fera lors du contrôle vétérinaire annuel, afin de limiter les interventions. Pour la capture pour le transport à l’EU1/2 nous amènerons le singe à se rendre volontairement dans une boite de transport accolée au tunnel de son hébergement dans laquelle il sera transféré puis dans une zone d’isolement temporaire en attendant son transport. En cas d’échec de cette méthode, il sera capturé par anesthésie par fléchage. Le fait de grouper les trois sessions d’acquisition sur une semaine consécutive permettra de n’effectuer qu’une seule capture, transport et réintroduction par animal au lieu de trois. Transport : les animaux seront placés dans des cages de transport adaptées et maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache inox positionné sur la cage. Le compartiment du véhicule agréé est chauffé lors du transport. Séparation : Les individus ne seront séparés que temporairement (une semaine) de leur groupe social le temps du protocole d’anesthésie et d’acquisition IRM. Après la session IRM à l’EU1/2, au retour à l’EU2/2 les sujets sont surveillés en infirmerie puis réintégrés à leur groupe social le matin suivant. Les réintroductions sont faites selon les procédures validées par le responsable du BEA. Elles sont toutes supervisées par le responsable BEA et réalisées et suivies par l'assistante spécialisée. Sessions IRM au sein de l’EU1/2 : L’injection d’un agent de contraste permet d’augmenter le rapport signal/bruit et donc de diminuer le nombre de scans nécessaires par individu. Si un problème survient lors de l’anesthésie pendant l’IRM (par exemple arythmie, problème respiratoire, hypoxie, arrêt cardiaque, hypothermie etc.), alors le scan est stoppé immédiatement et l’animal est réveillé et surveillé. Les sessions de scans seront séparées par au moins une journée sans scanning permettant aux animaux une journée complète avec alimentation et hydratation normale avant la mise à jeun et anesthésie suivante. Les procédures ne prévoient pas d’infliger une douleur qui nécessiterait une analgésie; cependant des points limites adaptés ont été mis en place en cas de problèmes.

Choix des espèces

Les effets de l’adversité sociale sur le développement physiologique et cognitif touchent le système immunitaire, la croissance, le métabolisme, ainsi que des fonctions comme la socialisation et la régulation émotionnelle. Étudier ces impacts nécessite des organismes en interaction sociale, rendant l’expérimentation animale indispensable. Les macaques, par leur proximité cognitive et cérébrale avec l’humain, sont des modèles idéaux pour explorer ces effets. Leurs comportements sociaux complexes et leurs structures cérébrales, notamment au niveau du cortex préfrontal et de l’amygdale, permettent d’étudier des mécanismes comparables à ceux des humains. En raison des limites des études humaines, l’expérimentation chez les macaques, avec un contrôle strict des conditions de vie, offre des résultats fiables et transposables. Ce projet s’appuie sur un groupe unique de macaques rhésus pour approfondir ces liens: ce groupe en provenance des USA est composé de 10 individus élevés avec leur mère et de 10 individus séparés de leur mère à la naissance et élevés en nursery avec d’autres bébés macaques. Le groupe principal est constitué d'adultes ayant soit subi une adversité précoce dans l'enfance ou non. La phase d'étude des animaux est justifiée par les objectifs du projet, à savoir l'étude de l'impact des conditions sociales de développement sur le comportement et l'activité cérébrale à l'âge adulte.

Jusqu'à vingt et une administrations de composés espacées de huit heures, et jusqu'à dix prélèvements de sang obtenus en sectionnant la pointe de la queue. 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour recueillir les échantillons. Une dermatite est provoquée par des agents sensibilisants, avec rougeur, gonflement et démangeaisons que les animaux grattent, pour cribler des candidats médicaments anti-inflammatoires. Les anesthésies répétées qu'imposent les applications sur la peau créent une résistance progressive au produit, et le porteur les décrit comme une source importante de stress liée à l'odeur de l'anesthésiant et à la perte de repères au réveil. Il écrit renoncer à toute grille de score parce qu'elle obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit de tuer les souris dès qu'un écart de poids de 2 à 5 % apparaît.

Objectifs

La prévalence (nombre de patients atteints dans la population générale) de la dermatite atopique (eczéma) a triplé en 30 ans dans les pays industrialisés. En France, près de 15% des enfants seraient affectés. La dermatite atopique est une affection de la peau chronique, prurigineuse et inflammatoire, alternant périodes de poussées et périodes d’accalmie. La dermatite atopique se manifeste par une altération de la barrière épidermique qui rend la peau sèche et anormalement sensible à toutes les agressions et est accompagnée d’une sensibilisation aux allergènes, avec une réaction immunitaire excessive. Il n’existe pas actuellement de traitement curatif contre la DA. Les traitements sont exclusivement préventifs (prévention des poussées) et symptomatiques (anti-inflammatoire et antihistaminique + antibiotique et antiviraux en cas de complications). Les anti-inflammatoires utilisés actuellement, les corticoïdes, présentent de nombreux effets indésirables. Il apparaît donc nécessaire de mettre au point de nouveaux traitements ciblant la dermatite atopique. Notre objectif est d’évaluer l’activité anti-inflammatoire de produits pharmacologiques, candidats-médicaments, dans un modèle de dermatite atopique chez la souris. Le développement de candidats-médicaments à partir de modèles moléculaires et cellulaires disponibles requiert une transposition dans des modèles intégrés et complexes. C’est pour cette raison qu’une approche chez la souris est nécessaire pour s’assurer de l’activité anti-inflammatoire des nouveaux candidats-médicaments préalablement sélectionné sur les tests alternatifs disponibles.

Bénéfices attendus

La mesure de l’activité anti-inflammatoire des composés dans un modèle de dermatite permettra de sélectionner les plus efficaces, capables de contrôler l’inflammation locale et promouvoir une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires sans perturber l’immunité spécifique. Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients atteint de dermatite.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les composés étudiés. Les composés étudiés seront administrés aux animaux vigils (quelques secondes) 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations intradermiques et les applications topiques. Afin de suivre la concentration sanguine du composé et/ou contrôler les constantes biologiques et les biomarqueurs de l’inflammation au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue sur animaux vigils et sur une période minimale de 72h.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre des prélèvements sanguins de qualité, rapidement et sans contention. Les anesthésies répétées pour les applications topiques entrainent une résistance progressive à l’anesthésique et sont une source importante de stress des animaux en raison de la forte odeur de l'anesthésiant et de la perte des repères au réveil. L’administration des agents sensibilisants entraine une inflammation locale (rougeur, gonflement) et des démangeaisons suivies de « grattages » de la zone inflammatoire par l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments et les produits pharmacologiques auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire l’innocuité d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les composés les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 (groupes contrôles) à 8 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats pour la mise en évidence d’un effet anti-inflammatoire ≥30% sur le recrutement des cellules inflammatoires dans la peau ou la production d’anticorps circulant, avec une incertitude inférieure à 5%. Pour les études qui requiert la mesure de la formule sanguine (NFS) pour le suivi des populations leucocytaires dans le sang 8 animaux pour chaque groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des variations généralement plus faible. Les tests statistiques utilisés pour les analyses sont dépendant des paramètres analysés. Le choix du test adapté est dicté par la structure des échantillons. D’après notre expérience antérieure et l’évolution des pratiques, nous estimons que 5 composés seront testés chaque année sur une période de 5 ans pour un maximum de 1100 souris dans le cas le plus défavorable.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification », d’un igloo, d’une roue, d’une balançoire et de bâtonnets à ronger. Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre les administrations intradermiques et les applications topiques. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Un renforcement positif est mis en place après chaque administration par l’ajout de récompenses alimentaires dans la cage (« Mini-gâteries »,). Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des composés, pour mettre en évidence tous signes de toxicité qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de l’activité anti-inflammatoire est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments et des produits pharmacologiques. Enfin, ce choix permet aussi de bénéficier des nombreux outils disponibles pour cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires et inflammatoires, mais également le recourt à des animaux génétiquement modifiés dont la disponible est bien plus élevée chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal. La grande majorité des études seront conduites sur des animaux adulte (> 8 semaines) mais certaine études requiert des animaux plus jeune, à l'épiderme plus fin, perméable et sensible afin de mimer au mieux les développements ayant pour cible les enfants.

Une injection intraveineuse unique de vecteur viral, sept à dix prélèvements de sang sous anesthésie selon la durée du suivi, et deux à trois gavages par sonde rigide à bille. 200 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des analyses post-mortem. Il s'agit de savoir si un vecteur de thérapie génique atteint les neurones et les cellules gliales de l'intestin, et si le microbiote intestinal modifie l'efficacité du transfert de gènes. Le porteur écrit que l'injection intraveineuse d'un tel vecteur chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable, alors qu'il fonde le projet sur une lignée de rats dont 30 % développent une réponse immunitaire contre le vecteur, et conclut que le modèle animal demeure "incontournable".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Malheureusement, l’utilisation de fortes concentrations d’AAVr chez l’Homme peut parfois induire une réponse immunitaire importante entrainant une perte d’efficacité du traitement et dans certains cas des effets secondaires graves voire létaux. Le microbiote intestinal exerce une influence sur plusieurs fonctions physiologiques de l’hôte et en particulier sur les fonctions digestives (immune, barrière épithéliale, système nerveux entérique (SNE)). L’ensemble de ces fonctions/composantes cellulaires contribue à l’efficacité ou représente une cible des thérapies géniques. De plus des études récentes suggèrent une modification de la réponse de la thérapie génique par le microbiote intestinal. Dans ce contexte, la capacité de la thérapie génique à cibler les constituants cellulaires du SNE (neurones ou cellules gliales) ainsi que le rôle joué par le microbiote intestinal en tant qu’acteur de l’efficacité de ce ciblage reste à définir. Dans ce projet nous proposons d’étudier la relation entre le microbiote/SNE et les vecteurs AAV chez le rat pour : - Evaluer la capacité de l’AAV à transduire le système nerveux entérique et notamment les cellules gliales et les neurones entériques. Ceci permettrait d’ouvrir des perspectives thérapeutiques ciblant les atteintes du SNE observées dans de nombreuses pathologies chroniques digestives ou extradigestives ou dans des maladies rares altérant les fonctions digestives (Crohn, désordres intestinaux liés à la myopathie de Duchenne). - Déterminer si la composition du microbiote intestinal peut prédire l’efficacité du transfert de gènes ou contribuer à sa réponse thérapeutique. Un AAVr de sérotype 9 sera utilisé dans un premier temps car il présente un tropisme neuronal susceptible de transduire le SNE. Ce sérotype est actuellement utilisé en clinique et autorisé sur le marché pour le traitement de pathologies neuromusculaires. D’autres sérotypes tels que l’AAV6 ou l’AAVrh10 décrits pour la transduction de cellules gliales et neuronales pourront également être testés. Ce choix sera fait à partir de résultats obtenus in vitro sur des cellules gliales entériques de rats.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de documenter les interactions entre les vecteurs AAV, le système nerveux entérique et le microbiote.

Procédures

Dans ce projet et selon les groupes, les animaux seront suivis soit sur 1 mois, soit sur 3 mois. Les rats recevront une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral en Intraveineuse. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit 7 pour les suivis 1 mois et 10 pour les suivis 3 mois. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour l’exploration fonctionnelle digestive, un gavage sera réalisé. Le temps d’intervention est d’une dizaine de secondes et sera réalisé 3 fois en tout, avant injection du vecteur puis à + 1mois et + 3 mois et 2 fois pour les animaux suivis 1 mois.

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins et les injections de vecteur AAV en intraveineuse, les animaux seront sous anesthésie gazeuse. Les animaux ressentiront, au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin et au point d’injection de l’intraveineuse due à la pénétration de l’aiguille. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur AAV chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Le gavage nécessite une contention de l’animal qui n’a donc plus de liberté de mouvement pendant la procédure qui va durer 10 secondes. De plus l’introduction de la sonde (rigide avec bille) génère également un inconfort pour lui. Néanmoins afin de générer un minimum d’inconfort et de stress, le geste sera pratiqué par un expérimentateur qui maitrise cette technique. Pour le prélèvement de sang, la toute petite incision pratiquée à l’extrémité de la queue avec l’aiguille 22G doit induire une douleur à l’animal. Cependant, l’application d'un anesthésique local avant le prélèvement va limiter cette douleur. Pour l'euthanasie, le prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave n’engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

Lorsque les stratégies de transfert de gène à l’aide d’AAV ont été transférées en clinique, des effets indésirables liés à une réponse immune ont été rapportés pouvant prévenir l’efficacité du transfert de gène. Ces effets n’avaient pas été documentés dans les modèles animaux. Depuis, nous avons développé au laboratoire un modèle de rat Sprague-Dawley, qui présente une réponse immunitaire anti-AAV pouvant prévenir l’efficacité du transfert de gène comme observée chez l’Homme. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire ces réponses immunitaires in vitro avec un système immunitaire combiné à des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable.

Réduction

Chez l’Homme, l’efficacité du transfert de gène varie d’un individu à l’autre et peut être liée au déclenchement d'une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 30% des rats injectés avec l’AAV9 perdent l’expression du transgène et présentent une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. Pour les analyses qui seront réalisées ici (biodistribution du vecteur, analyses biochimiques et analyses histologiques, analyse du microbiote intestinal), le nombre d’animaux par groupe (n=20) est donc basé sur nos expériences précédentes lors desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille.. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 20 .

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Chez l’Homme, l’efficacité du transfert de gène varie d’un individu à l’autre et peut être liée au déclenchement d'une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. A l’heure actuelle, cette variabilité et la réponse immunitaire associée ne peut pas être reproduite in vitro dans les modèles organoïdes. Toutefois, elle a été constatée dans 2 études précédentes réalisées au laboratoire dans un modèle de rats SD. Après injection systémique d’AAV9, 30% des rats SD perdent l’expression du transgène et présentent une réponse immunitaire cellulaire et humorale dirigée contre le vecteur et contre le produit du transgène. A notre connaissance, le rat SD est le seul model de rongeur qui reproduit les observations faites chez l’Homme. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

Douze rats vont être utilisés pour mettre au point au laboratoire une méthode d'isolement et d'analyse des microparticules sanguines, sans question scientifique posée sur l'accident de décompression lui-même. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous tués à l'issue, pour prélever leur sang et leurs tissus. Chacun subit une contention et un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis, un mois plus tard, 135 minutes en caisson hyperbare qui simulent une plongée. Le porteur range parmi les effets attendus la douleur provoquée par les symptômes d'accident de décompression, et indique que l'effectif de douze repose sur des expériences précédentes sans qu'aucun test statistique ait été réalisé.

Objectifs

Il est communément admis que le facteur déclencheur de l’Accident de Décompression est la formation de bulles subséquente à la réduction de la pression ambiante. Les microparticules sont des vésicules extracellulaires circulantes libérées par les cellules sanguines (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales). Par les protéines qu’elles arborent à leur surface mais aussi par les molécules (protéines, microARN, …) qu’elles renferment, les microparticules jouent un rôle important dans la transmission d’information et, notamment, l’inflammation. Ainsi, par exemple, leur nombre et leurs caractéristiques sont modifiés dans les pathologies vasculaires. Il a été montré (i) : que leur nombre augmente après la décompression et (ii) : qu’elles sont capables d’induire certains symptômes de l’accident de décompression. De plus, certaines d’entre elles contiennent du gaz et pourraient constituer un site de formation des bulles circulantes pendant la décompression. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place, dans notre laboratoire, une méthode d’isolement, d’analyse et de caractérisation des microparticules dans le cadre d’études sur l’accident de décompression. Pour ce faire, nous avons besoin dans un premier temps, de récupérer chez des rats, des échantillons sanguins afin de valider le protocole d’isolement des microparticules à l’état de base et après l’exposition hyperbare. Dans un deuxième temps, la méthode d’analyse de ces microparticules nécessite de déterminer la concentration d’anticorps optimale pour le marquage des cibles d’intérêt, indispensable à leur détection et à leur analyse.

Bénéfices attendus

A court terme, le bon fonctionnement du protocole d’isolement des microparticules et de leur analyse permettra la mise en place d’une nouvelle expertise au laboratoire. A moyen terme, cette méthode sera utilisée pour la réalisation de projets nécessitant l’analyse de microparticules circulantes chez le rat. A plus long terme, cette méthode pourra être utilisée dans d’autres projets relatifs à l’accident de décompression dans notre laboratoire mais également dans des projets liés à l’inflammation ou à la dysfonction vasculaire.

Procédures

Les rats seront contentionnés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Un mois après, ils seront placés dans le caisson hyperbare pendant 135 min (30 min d’acclimatation + 105 min de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée) ; (2) : le stress lié à la contention et à l’anesthésie (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 5 minutes, et réalisé 1 fois) pour la réalisation des prélèvements sanguins ; (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée (acte de gravité modérée, d’une durée totale de 2h30) ; (4) : La douleur induite par l’apparition de symptômes d’accident de décompression lors de la période d’observation (ces nuisances seront modérées, d’une durée moins de 1 minute).

Devenir

Les 12 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des mécanismes à l’origine de l’accident de décompression. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé sur la base des expériences précédentes et aucun test statistique n’a été réalisé. Les effectifs demandés vont nous permettre de réaliser toutes les mises au point nécessaires à la mise en place de cette nouvelle méthode d’analyse. Les animaux seront intégrés progressivement par lot de 4. Nous commencerons par un premier lot de 4 animaux, puis, si besoin, nous passerons à un deuxième lot, puis à un troisième. Si les mises au point sont terminées avant d'utiliser tous les lots, le projet peut être arrêté, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport aux estimations initiales. Nous estimons à 12 le nombre d’animaux nécessaire au vu de la faible quantité de sang que nous pouvons prélever pour réaliser ces mises au point.

Raffinement

Une habituation au dispositif expérimentale (caisson hyperbare) sera réalisée avant l’entrée dans l’étude afin d’habituer les rats à l’environnement et de réduire le stress. Tout au long du projet, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De fait, nous disposons d’un important corpus de données pour ce type d’étude. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.

80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée en cage individuelle jusqu'à vingt-quatre jours, toutes tuées à l'issue pour prélèvement. Une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ouvre le protocole, suivie de quatre séances d'imagerie, de quatre prélèvements de sang à la queue et de deux périodes de quatre jours en cage de mesure de la dépense énergétique. L'objet est de relier la croissance d'une tumeur à l'hypermétabolisme observé chez les patients, et de tester une molécule qui réduit la dépense énergétique. Le poids et la prise alimentaire sont surveillés chaque jour pour que la perte de poids n'excède pas 20 % du poids initial, le protocole devant être arrêté dès qu'une dégradation apparaît.

Objectifs

La perte de masse est une cause majeure de décès en cancérologie et aggrave la toxicité des traitements. Elle résulte de la fonte des graisses et des muscles, d’une augmentation de la dépense énergétique au repos et d’une plus grande fatigabilité, entraînant un déficit énergétique appelé hypermétabolisme. Ce phénomène apparaît avant les premiers signes visibles de perte de masse chez les patients atteints de tumeurs. L’étude de la dépense énergétique et des marqueurs cliniques et biologiques des patients montre un impact négatif et une moindre réponse aux traitements. Pourtant, le lien entre le développement tumoral et l’hypermétabolisme reste inexploré. Cette étude chez l’animal vise à : -caractériser les paramètres métaboliques liés à l’hypermétabolisme à différents stades du développement tumoral grâce à des cages d'enregistrement de la dépense énergétique ; -évaluer ces paramètres chez des souris atteintes de tumeurs en présence d’une molécule réduisant la dépense énergétique. L’objectif est de mieux comprendre le lien entre hypermétabolisme et cancer et d’explorer une nouvelle piste thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes responsables de l’hypermétabolisme, c’est-à-dire l’augmentation de la dépense énergétique au repos, chez les animaux porteurs d’une tumeur. L’objectif est d’identifier les principaux facteurs impliqués, comme la dépense d'énergie au repos et ou issue de l’activité physique afin de mieux expliquer ce phénomène chez les patients. En analysant le métabolisme des animaux atteints de tumeurs et en testant un médicament qui réduit la dépense énergétique, nous pourrons évaluer le lien entre l’hypermétabolisme et la progression du cancer observée chez les patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée dans la veine caudale (moins d'une minute). Les mesures par imagerie se feront 4 fois, chaque mesure ne dépassant pas 10 minutes, cela inclut également un prélèvement sanguin (donc 4 prélèvements de 50 microlitres) chaque prélèvement prenant 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique sera effectuée 2 fois, sur une période de 4 jours à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée maximum de l'isolement des animaux est de 24 jours. Les prélèvements à la queue induisent une douleur légére. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux seront surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. La croissance tumorale peut induire un dysconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire, car il est impossible de reproduire sans animaux les interactions entre la croissance d’une tumeur, le système immunitaire et l’équilibre énergétique de l’organisme. L’étude de la dépense énergétique et des comportements associés doit se faire sur un organisme entier, car les tissus impliqués fonctionnent ensemble. La souris est un modèle adapté, car ses mécanismes de régulation énergétique sont similaires à ceux de l’Homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats.

Réduction

Dans les procédures 1 et 2, nous utiliserons 10 souris par groupe, un nombre suffisant pour détecter des différences significatives de perte de poids liée à la tumeur. Le suivi du poids, de la composition corporelle et de la croissance tumorale par imagerie permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires aux analyses de l’équilibre énergétique. Pour réduire encore leur utilisation, nous étudierons l’alimentation, la dépense énergétique et la composition corporelle sur les mêmes animaux. Les données issues d’études précédentes indiquent que 10 souris par groupe sont suffisantes malgré la variabilité des mesures. L’évaluation métabolique sur 4 jours aidera à réduire cette variabilité, optimisant ainsi le nombre d’animaux requis. Enfin, des outils statistiques adaptés permettront d’analyser l’impact de la tumeur, du traitement et du sexe sur ces paramètres.

Raffinement

Les interventions (imagerie, injections et échocardiographies) seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur. Une technique d’imagerie non invasive sera utilisée pour suivre l’évolution de la tumeur au fil du temps et la mettre en relation avec la balance énergétique, le poids et la composition corporelle. Pendant la phase d’individualisation, le poids et la consommation alimentaire seront enregistrés. Les analyses de la balance énergétique et de la composition corporelle, totalement non invasives, se dérouleront dans des cages classiques équipées de capteurs intégrés, sans perturber les animaux. L’hébergement inclura un enrichissement avec un abri en plastique rouge, du coton et une nacelle pour favoriser le bien-être des souris. Les mesures de la dépense énergétique seront automatisées, effectuées en continu de jour comme de nuit, sans intervention humaine. Une surveillance quotidienne permettra de détecter tout changement de comportement ou de santé (observation, suivi du poids et de la prise alimentaire et hydrique). Des points limites stricts ont été définis : en cas de signe de souffrance ou de dégradation de l’état des souris, le protocole sera immédiatement arrêté.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Elle est particulièrement adaptée à l'étude des dysfonctionnements métaboliques, car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la souris est le modèle de référence pour l'étude du développement tumoral, de la réponse immunitaire et du métabolisme énergétique. Pour les deux procédures, les souris seront utilisées à l’âge adulte (12 semaines). Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (1) l’âge adulte garantit que toutes les structures cérébrales sont stabilisées, ce qui évite d'impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au fil du temps; (2) le poids de l’animal est plus stable à cet âge, permettant une analyse fiable et robuste durant toute la durée de l’expérimentation.

Un virus est inoculé par inhalation, trente secondes par narine, sur des souris placées sous anesthésie profonde. 325 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un quart d'entre elles subit jusqu'à quinze prélèvements sanguins, à raison d'un par mois, certaines étant gardées jusqu'à quinze mois après l'infection. Le virus utilisé n'est jamais nommé, et le porteur range parmi les effets attendus les blessures de bagarre qui cicatrisent mal chez les animaux âgés.

Objectifs

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la vaccination permet, en moyenne, d’éviter chaque année 3,5 à 5 millions de décès par an. La vaccination est basée sur la persistance d’une protection immunitaire contre un pathogène donné mais les mécanismes qui assurent le maintien d’une telle protection sur le long terme ne sont pas encore totalement compris. De même, la persistance d'une protection immunitaire est à la base de la réussite, sur le long terme, des immunothérapies anti-cancéreuses actuelles. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui assurent la préservation d’une protection immunitaire, en fonction du temps.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant la persistance de l'immunité après une infection virale, et d’identifier potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques pour la favoriser et améliorer les vaccins. Ces résultats serviront également à l’amélioration des immunothérapies anti-cancéreuses, afin d’éviter les rechutes chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par animal – durée 30 secondes ; - Injection (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes; - Infection par inhalation (sous anesthésie profonde) - 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine; Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par mois pendant toute la durée de la procédure (jusqu’à 15 prélèvements pour ¼ des animaux) - durée 30 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: i) une douleur modérée et un stress généré par les prélèvements sanguins; ii) une légère douleur générée par les injections (pour l’anesthésie profonde); iii) le stress généré par la procédure d’inoculation du virus par inhalation; iv) une perte de poids transitoire générée par l'infection virale qui sera contrôlée; v) un léger délai de cicatrisation en cas de blessure sur des animaux agés, qui pourrait survenir suite à une bagarre; vi) des signes cliniques liés à l’âge tel que une perte de poids et/ou une diminution de la température corporelle

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes et effectuer des analyses cellulaires et moléculaires dans le but de comprendre les mécanismes qui assurent le maintien d’une protection immunitaire sur le long terme.

Remplacement

La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, le maintien d’une protection immunitaire sur le long terme dépend de signaux reçus dans différents endroits de l’organismes qui ne peuvent être récapitulés in vitro.

Réduction

Nous avons calculé par des approches statistiques, le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans toutefois compromettre une analyse robuste des résultats. De plus, une optimisation des protocoles a été réalisée in vitro en amont, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour les analyses moléculaires (qui demandent beaucoup de matériel cellulaire).

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue jusqu’au réveil de l’animal; ii) les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse après application d’un anestésique local; iv) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux; v) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. En cas d'apparition de signes de douleur modérée, les animaux recevront un traitement anti-douleur pour les soulager (par exemple le doliprane).

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur le maintien d’une protection immunitaire à long terme. De plus, la souris est une espèce dans laquelle un grand nombre d'outils sont disponibles, permettant des analyses précises. Les animaux utilisés dans le projet sont des adultes de 6 semaines à 18 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (entre 6 et 12 semaines, le système immunitaire des souris est stable, selon nos expériences antérieures) et certains animaux seront gardés jusque 15 mois après infection.