Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude du rôle du lactate dans le couplage neuro-métabolique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour mesurer les échanges de lactate entre cellules du cerveau. Chacune subit environ une heure de chirurgie sous anesthésie, le temps d'implanter une fenêtre crânienne au-dessus du cerveau et de fixer une barre de contention sur sa tête. Suivent jusqu'à quinze séances d'imagerie de deux heures, des perfusions, des injections de colorants et d'insuline, un prélèvement de sang toutes les quinze minutes, et pour une partie des souris des observations éveillées après deux semaines d'habituation au poste. Le cerveau est prélevé sur 52 animaux, les 188 autres étant tués au motif qu'ils portent une fenêtre crânienne et ont reçu des injections, ce qui les rend impossibles à replacer.
Objectifs
L’objectif général du projet est d’approfondir notre connaissance du métabolisme cérébral et de sa régulation, pour mieux comprendre son altération dans les maladies neurodégénératives liées au vieillissement. L’activité électrique des neurones est la principale source de dépense énergétique du cerveau. Ainsi, le cerveau qui ne représente que deux pour cent de la masse corporelle, contribue à vingt pour cent des dépenses énergétiques du corps. Une série d’études ont montré que le glucose était le principal substrat énergétique du cerveau en condition physiologique. Cependant, d’autres travaux ont également démontré que le lactate, produit final de la fermentation du glucose et traditionnellement considéré comme un déchet métabolique, pouvait être substitué au glucose et permettre le maintien de l’activité neuronale de tranches de cerveaux maintenues en culture. En effet, bien qu’issue de la dégradation du glucose, la molécule de lactate reste relativement riche en énergie. Par ailleurs, il a été découvert que les astrocytes, un autre type de cellules cérébrales, pouvaient produire et libérer du lactate, conduisant ainsi à l’hypothèse d’un transfert de lactate des astrocytes vers les neurones. D’autre part, certaines études récentes suggèrent qu’une altération de la voie d’utilisation du glucose dans les astrocytes et donc de la libération de lactate par ces astrocytes, pourrait participer aux déficits cognitifs observés dans des modèles murins de la maladie d’Alzheimer. Comprendre quelle part de l’énergie utilisée par les neurones dérive de leur utilisation directe du glucose et-ou du lactate produit par les astrocytes est donc d’une importance fondamentale pour toute approche thérapeutique visant à restaurer le métabolisme cérébral dans différentes formes de démence. Notre projet vise donc à établir si la dynamique de production de lactate dans les astrocytes et de ses fluctuations dans l’espace extracellulaire et dans les neurones est compatible avec l’hypothèse d’un transfert de lactate des astrocytes vers les neurones. Par ailleurs, ce projet nous permettra également de déterminer si ce processus est impliqué dans le couplage neuro-vasculaire, c’est-à-dire l’ensemble de processus qui conduisent à une augmentation localisée du flux sanguin à la suite d’une activation neuronale, celui-ci étant dysfonctionnel dans différentes formes de démence.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du métabolisme cérébral et notamment de l’utilisation du lactate astrocytaire par les neurones devrait contribuer à mieux comprendre les processus par lesquels ce métabolisme devient dysfonctionnel au cours de certaines maladies (comme les dégénérescences liées au vieillissement). Par ailleurs, savoir si les neurones utilisent de manière substantielle du lactate dans des conditions physiologiques devrait également permettre d’orienter certaines thérapies visant à compenser un métabolisme neuronal défectueux, mais aussi de mieux comprendre l’impact de certains facteurs environnementaux sur le métabolisme cérébrale (l’activité physique élève le taux plasmatique de lactate, certaines bactéries du microbiote intestinal produisent du lactate, certains aliments sont riches en lactate…).
Procédures
Les animaux sont tous soumis à une intervention chirurgicale d’environ une heure sous anesthésie et analgésie permettant d'implanter une fenêtre crânienne au-dessus du cerveau ainsi qu’une barre de contention sur la tête pour nos observations. Une partie des animaux recevront un agent sous anesthésie (intervention de 3 minutes maximum, une seule fois). Tous les animaux seront observés sous anesthésie durant des sessions d’imagerie n’excédant pas 2 heures et 15 fois maximum durant le projet (espacement de 3 jours minimum entre les observations). Durant les expériences d’imagerie, les animaux recevront une perfusion de solutions ainsi qu’une injection de colorants. Ils recevront également une injection d’insuline (maximum une fois par mois) et un prélèvement de sang sera effectué toutes les 15min pour suveiller leur glycémie durant le temps de l'imagerie. Les animaux seront également observés éveillé, après une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur. Les animaux sont exposés à un léger risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie. La chirurgie peut provoquer une douleur transitoire et une perte de poids durant les 3 jours suivants l’opération. Certains animaux recevront une perfusion intraveineuse lente de solution durant les expériences sous anesthésie qui peut provoquer une légère douleur, un stress, ainsi qu’un très faible risque d’hémorragie au réveil à la fin de l’expérience. Certains animaux seront observés éveillés sous le microscope, après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage.
Devenir
Les 240 animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 52 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires. Le reste des animaux (188), étant déjà injectés par des agents et porteurs d’une fenêtre crânienne sont euthanasiés car il n’est pas possible de les replacer.
Remplacement
Toutes les études métaboliques et celles s’intéressant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal vivant. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées non utilisables en recherche clinique. Nos recherches portent sur le métabolisme cérébral et plus particulièrement sur les fluctuations du lactate dans le cerveau or il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico satisfaisant, capable de reproduire la complexité des mécanismes cellulaires impliqués dans la régulation du lactate dans le cerveau.
Réduction
Ce projet nécessitera l’utilisation d’au maximum 240 souris. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles. Ce nombre a été déterminé à partir d’une analyse de puissance à l’aide d’un logiciel adapté prenant en compte la valeur moyenne de nos réponses en condition basale pour chacune des 3 lignées transgéniques utilisées et des 13 molécules injectés.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois et igloo et roue), et nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par la structure du bien-être animal pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie générale et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie, un apport d’air oxygéné et un suivi de température sera réalisé. Après la chirurgie et l’imagerie les animaux recevront un antidote à l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Après la chirurgie, ils recevront une gelée nutritive et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours, avec pesée quotidienne sera mis en place. Durant ce temps, les cages seront signalées grâce à une étiquette de soins postopératoires. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents, nous permettant ainsi de suivre l’activité de différents types cellulaires. Dans ce projet les souris seront utilisées entre 2 mois et 15 mois. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.
Développement d’un biocapteur pour la détection des ovulations et le monitoring en temps réel du statut reproductif chez la vache
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Jusqu'à un prélèvement de sang par heure pendant quarante-huit heures, pour un total annoncé de 4 104 ml sur quatorze jours de protocole. Huit génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues à l'attache, porteuses d'un cathéter posé dans la jugulaire gauche, avec un contrôle de l'hématocrite prévu pour vérifier qu'elles supportent la saignée, et toutes gardées vivantes à l'issue. L'objet déclaré est un biocapteur qui suivrait en continu les hormones de la reproduction pour repérer les ovulations et fiabiliser l'insémination artificielle. Le porteur annonce des gains de performances de reproduction et de résultats économiques pour les élevages, la longévité des vaches découlant de la baisse des réformes pour échec de reproduction.
Objectifs
Les résultats économiques d’un élevage bovin sont fortement tributaires des performances de reproduction du troupeau. Ces dernières décennies, l’utilisation de l’insémination artificielle (IA) s’est très largement répandue en particulier dans les élevages laitiers. L’utilisation de l’IA nécessite de détecter de façon fiable le moment des ovulations chez les femelles, quelle que soit leur conduite et leur environnement d’élevage. Traditionnellement, la détection des ovulations repose sur l’observation de l’œstrus que les vaches expriment dans les heures qui précèdent l’ovulation. La détection des œstrus se heurte toutefois à deux problèmes majeurs : 1/ l’agrandissement de la taille des troupeaux qui rend cette activité particulièrement chronophage et 2/ la dégradation de l’expression de l’œstrus observée chez les animaux à fort potentiel laitier. Ces problèmes remettent en question les outils d’aide à la détection des ovulations basés sur l’enregistrement des signes comportementaux exprimés durant l’oestrus et orientent les réflexions vers le développement d’outils s’appuyant sur le suivi des dynamiques hormonales annonciatrices de l’ovulation et indicatrices du statut reproducteur de la femelle. Le projet a pour objectif de développer un dispositif microfluidique porté par l’animal permettant le prélèvement sous-cutané de fluides interstitiels et le dosage à haute fréquence des hormones impliquées dans la régulation du cycle ovarien et le déclenchement de l’ovulation. Le dispositif doit, à terme, associer 1/ des microaiguilles creuses pour le prélèvement des fluides interstitiels, 2/ des biocapteurs électrochimiques permettant le dosage des hormones, 3/un circuit et une pompe microfluidiques pour assurer la circulation des fluides interstitiels au sein du dispositif et 4/ une électronique de mesure et de transfert des données permettant d’informer l’éleveur sur le statut hormonal de ses vaches via une interface dédiée. Les trois premières briques constituent les principaux verrous technologiques identifiés en amont du projet. La stratégie de travail consiste à robustifier le dosage des hormones par les biocapteurs électrochimiques retenus.
Bénéfices attendus
Le projet doit permettre la mise au point d’un dispositif de monitoring des hormones de la reproduction à partir du prélèvement de fluides interstitiel. Un tel dispositif permettra chez les bovins laitiers et allaitants d’améliorer les performances de reproduction dans les systèmes utilisant l’insémination artificielle (80% des vaches laitières et 12% des vaches allaitantes). L’amélioration des performances de reproduction contribuera à améliorer les performances économiques des élevages mais aussi la longévité des animaux puisqu’il permettra de réduire les réformes pour cause d’échec de la reproduction. A terme, un tel dispositif devrait également profiter à d’autres filières animales et notamment la filière brebis laitière qui fait face à une mise en cause de l’utilisation des traitements hormonaux pour réaliser l’IA. Pour ces filières, le bénéfice du projet sera économique et environnemental.
Procédures
Les 8 animaux seront soumis à la pose d'un cathéter au niveau de la jugulaire gauche sous anesthésie locale, puis à la réalisation de prélèvements sanguins durant la phase expérimentale. - Suivi de la cinétique des hormones durant la phase folliculaire : De J4 à J17, 4 prélèvements seront réalisés par jour à 7h, 11h, 16h et 21h, chacun correspondant à 5 tubes de 9 ml. Soit un total de 5 x9= 45 ml/prélèvement. Le temps de récupération associé à ce volume de sang prélevé est de 14 minutes, de sorte que la récupération sera totale entre chaque prélèvement. Le volume total de sang prélevé par jour sera de 4 x 45 = 180 ml. - Captation du pic d'hormone : J9 à J11. Sur cette fenêtre de 48h, les prélèvements passeront à une fréquence de 1 prélèvement par heure. Les 4 prélèvements par jour seront maintenus aux mêmes horaires que décrits précédemment (7h, 11h, 16h et 21h). Pour le suivi du pic, 3 tubes de 9 ml seront prélevés à chaque point de mesure, soit un total de 27 ml de sang prélevé / h (soit un temps de récupération de 6 minutes). Le volume total de sang prélevé par jour pour la captation du pic sera de 648 ml/j. Sur cette période se rajouteront les 4 prélèvements /j (7h, 11h, 16h et 21h) soit un total de 4 prélèvements/j x 4 tubes /prélèvement x 9ml/tube = 144 ml/j. Le volume total de sang prélevé sur cette fenêtre de 48h sera de (648+144) x 2j= 1584 ml. Sur l’ensemble de l’essai (14 jours de prélèvements), le volume total de sang prélevé sur les animaux sera de 180 x 14 + 1584 = 4104 ml.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont associés aux prélèvements sanguins. La pose du cathéter permettra de garantir moins de douleur et de traumatismes (hématomes) que dans le cas de prises de sang ponctuelles et répétées au niveau de la veine caudale. Cela permettra également de garantir un meilleur confort aux animaux en limitant le stress du fait d’une moindre contention comparativement aux prises de sang. La contrepartie est que les animaux doivent être conduits à l’attache durant l’expérimentation mais nous limitons au maximum la durée de celle-ci par rapport à nos objectifs scientifiques et nous avons prévu une phase d’habituation. Par ailleurs les génisses seront en contact visuel et auditif durant toute la durée de l’essai.
Devenir
A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront gardés en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement ou son délégataire.
Remplacement
La mise au point d’un biocapteur capable de détecter l’occurrence d’ovulations à partir du monitoring, in situ, de la cinétique des hormones de la reproduction, implique, par principe, de tester sa capacité à doser les hormones dans un fluide biologique complexe tel que le plasma. De façon à limiter le recours aux échantillons de plasma issus d’animaux, cette étape interviendra lorsque tous les tests préliminaires visant à démontrer la capacité du biocapteur à doser différents niveaux de concentrations en hormone dans des fluides artificiels de complexité croissante aura été réalisée : solutions tampons enrichies de molécules ioniques puis de molécules organiques (acides gras, protéines) de structure et de charge connues et enfin plasma artificiel.
Réduction
Deux éléments ont été pris en compte pour évaluer le nombre d’animaux à utiliser et prendre en compte le principe de réduction : 1/ d ‘une part, la nécessité de disposer d’une gamme de concentrations hormonales qui reflète une certaine variabilité interindividuelle. Pour cela nous avons considéré qu’un effectif de 5 animaux serait suffisant pour explorer cette variabilité dans la mesure où la variabilité des niveaux de concentrations hormonales que l’on peut observer chez des génisses est moindre que celle attendue chez des vaches en lactation. 2/ d’autre part, le taux de réponse des animaux au traitement hormonal. Celui-ci a été apprécié en se basant sur les connaissances rapportées dans la littérature, et qui indiquent des taux de réponse variant de 50 à 66% pour des femelles cyclées. Ainsi pour espérer atteindre un effectif minimal de 5 animaux présentant des cinétiques hormonales de phase folliculaire suite au retrait de l’implant, nous avons choisi d’inclure 8 génisses dans l’étude.
Raffinement
Une phase d’habituation de 7 jours aux conditions de vie à l’attache sera réalisée pour tous les animaux avant le début des prélèvements de façon à identifier ceux qui ne supporteraient pas d’être maintenues à l’attache (agitation, baisse d’ingestion, comportements ou attitude anormale). La pose des cathéters sera réalisée par une personne habilitée et en conditions d’asepsie. Un système de maintien et de protection du cathéter (bandage) sera mis en place de façon à éviter que celui-ci ne se déloge ou soit arraché par frottement contre les parois de la logette. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la distribution de l'alimentation par un animalier responsable de la mise en œuvre et du suivi du protocole. L'évaluation de la gêne et d’éventuelles lésions générées par le cathéter ou les conditions de vie à l’attache sera faite par observation de l’état physique et du comportement des animaux. Une évaluation du niveau d’anémie sera également réalisée via la mesure de l’hématocrite des animaux avant le début de l’essai, avant la phase de prélèvements intenses (1/h) à J7 et 3 jours après (J14) afin de vérifier si les animaux peuvent être maintenus dans l’essai. En cas d'observation de signes inhabituels, de lésion ou d’anémie sévère (taux d'hématocrite entre 10 et 13 %), le vétérinaire référent de l'installation expérimentale sera contacté immédiatement et un traitement approprié sera administré, pouvant aller jusqu'au retrait de l'animal de l'essai.
Choix des espèces
Le premier élément de pertinence associé au choix de l’espèce bovine est qu’il s’agit de l’espèce cible pour l’utilisation du biocapteur. Sa mise au point nécessite donc de s’assurer qu’il sera en mesure de fonctionner sur des fluides complexes de composition similaire à celle des fluides interstitiels qui seront prélevés par les microaiguilles. Le deuxième élément de pertinence est associé à la taille de la vache qui permet de prélever les quantités de sang nécessaires à l’étude en restant bien en deçà des seuils maximum à ne pas dépasser. Les animaux utilisés seront des génisses plutôt que des vaches laitières car les installations expérimentales disponibles ne nous permettent pas de conduire des vaches laitières à l’attache. Par ailleurs du fait de la nécessité d’amener les animaux deux fois par jour en salle de traite, les risques de déplacement ou d’arrachage du cathéter auraient été trop importants. Nous avons donc choisi de travailler sur des génisses qui devront être pubères (>13 mois) pour pouvoir suivre leur cyclicité. Ces génisses n’excèderont pas l’âge de 27 mois qui correspond à leur mise à reproduction pour un premier vêlage visé à 36 mois.
Comprendre les maladies de l’aorte à l’aide de modèles de souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une mini-pompe est implantée sous la peau du dos pour diffuser pendant vingt-huit jours une molécule qui provoque un anévrysme de l'aorte. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent des séances d'imagerie cardiaque et un transport à pied entre deux établissements, et l'un des gènes étudiés tue l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent. Les effets déclarés se limitent à un léger stress et à une suture qui peut être irritée légèrement, alors que le même texte reconnaît qu'une dissection aortique et une mort subite peuvent survenir en fin de traitement.
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Les anévrysmes de l’aorte thoracique (AAT) sont un gonflement d'une region spécifique de l'aorte qui relie le coeur au reste du corps humain. Ce gonflement à pour conséquence une fragilsation importante du reste du réseau cardiaque. La rupture de l’aorte qui consiste en un dechirement de celle-ci est alors favorisée et mortelle. Aucun traitement n’est pour le moment disponible pour ralentir la progression de la pathologie en raison de connaissances insuffisantes sur les mécanismes impliqués. Le but de notre recherche est d’identifier les gènes impliqués dans les AAT (anévrysme aortique thoracique) car a ce jour, seuls 30 % des patients ont une cause génétique connue. Il a été identifié 4 gènes qui sont potentiellement impliqués dans les anévrysmes mais leur rôle exact reste à établir. Pour mieux comprendre leur implication dans les anévrysmes de l'aorte thoracique, des modèles murins ont été générés afin de pouvoir etudier leur mécanismes. Un modèle de souris par gène identifié sera mis en place pour lequel nous induirons par la suite un anévrysme de l'aorte à l'aide d'une molécule déjà connue de la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider des gènes impliquées dans les AAT et ainsi réduire le nombre de patient dont la cause génétique n'est à ce jour pas connue. L'identification du rôle de ces gènes nous amenera a mieux comprendre leur mécanisme et ainsi offrir un meilleur suivi de l'anévrysme aux patients. La connaissance approfondie des potentiels acteurs impliqués dans les anévrysmes nous permettra de prévenir les conséquences fatales de la progression de cette pathologie et potentiellement de développer des solutions thérapeutiques.
Procédures
Dans l'EU1, une incision sous la peau au niveau du dos sera réalisée sur animal anesthésié pour implanter une mini-pompe qui délivrera une molécule pendant 28 jours pour induire un anévrysme. La durée de l’acte est de 10 min. Au préalable, sur un groupe d’animaux, il sera administré pendant une semaine dans l’eau de boisson une molécule connue de la littérature pour augmenter l’apparition de l’anévrysme. Pour suivre l'évolution du développement des anévrysmes, une imagerie cardiaque sera effectuée dans l'EU2 soit 10 min par souris.
Impact sur les animaux
La mise en place des pompes à AngII (pompes avec Angiotensine II qui est un hypertenseur) peut induire un léger stress à la souris. La suture peut être irritée légèrement. En fin de traitement, une possible dissection aortique peut survenir et donc une mort subite. Les échographies sont rapides et bien supportées par les animaux. L'un des gènes étudiés entraine la mort de l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés et des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour analyses.
Remplacement
Les prélèvements chez l'humain après opérations sont limités en nombre et en nature (seulement des petites parties de la paroi anévrysmale sont retirées par les chirurgiens). Cette pathologie est complexe et fait intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bein sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, le modèle murin nous permet d'être en mesure de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler un gène en particulier. Des expériences ont été menées sur des cellules humaines isolées afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux. Cependant, la complexité des mécanismes à l'origine des anévrysmes requiert l'utilisation d'un organisme complet.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Un lot expérimental nécessite 10 souris pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif est déduit de nos expériences précédentes. Toutefois, si nous constatons une différence statistiquement significative à un effectif plus faible, nous conclurons l'étude. La production d'animaux nécessaire sera réduite au minimum des besoins expérimentaux.
Raffinement
Nous raffinerons l'environnement des animaux par enrichissement de leur milieu de vie. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture ainsi que de la boisson. Nous veillerons à ce que les animaux ne soient pas laissé isoler dans les cages durant toutes les expériences afin de ne pas perturber les groupes souciaux. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés lors du projet pour couvrir les douleurs opératoires. De plus, les yeux seront couverts d'ocrygel pour eviter la déshydratation des yeux. Une surveillance quotidienne sera efféctué par l'expérimentateur ainsi que le personnel de l'animalerie, cette surveillance pourra être augmentée en cas de nécéssité. Le suivi sera quotidien. Nous établirons une grille d'évaluation des effets/nuisances susceptibles de toucher les animaux. Les critères observés seront l’apparence, le comportement, la mobilité et la perte poids. Les animaux recevront une injection d'un anti-douleur toutes les 8 heures pendant 2 jours en cas de besoin. En cas de déshydratation, les animaux recevront une injection de sérum physiologique au niveau de l’abdomen. Lors du transport des animaux de l'EU1 à l'EU2, nus ferons ce transport à pied (5min), à l'abri des regards, avec des hydrogels dans les cages et un peu de nourriture et des igloos en carton pour éviter le stress.
Choix des espèces
Les lignées murines impliquant les 4 gènes étudiés ont déjà été générées et nous y avons accès. De nombreux modèles murins ont déjà été décrits et développés pour les AAT nous permettant ainsi de comparer les modèles entre eux afin de mieux comprendre les mécanismes sous jacents. Les animaux seront utilisés au stade adulte (12 semaines), car les anévrismes de l’aorte thoracique se déclarent majoritairement chez l’Homme adulte et chez la souris à 12 semaines.
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres nerveuses sensorielles de type C dans la modulation de la douleur neuropathique périphérique chimio-induite
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris utilisées ont été génétiquement modifiées pour qu'une classe de leurs neurones sensoriels soit détruite, afin d'observer ce qu'il reste de la douleur quand ces fibres manquent. 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent cinq gavages successifs, puis six injections intrapéritonéales de deux molécules anticancéreuses réparties sur plusieurs semaines, avant des tests répétés de sensibilité de la patte arrière au toucher, au froid et à un gradient de température. Le porteur indique que ces injections provoquent une hypersensibilité mécanique, une hyperalgésie thermique et une allodynie au froid, et que tous les animaux sont tués pour prélever les tissus destinés aux analyses.
Objectifs
Plusieurs études dont certaines réalisées au sein de notre équipe, montrent qu’une classe particulière de fibres somato-sensorielles est impliquée dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. Environ 30% des patients atteints de cancer et traités par des agents anti-cancéreux développent des douleurs chroniques notamment des douleurs neuropathiques périphériques. Chez les rongeurs, l’apparition de neuropathie périphérique induite par l’administration d’agents anti-cancéreux est réversible au bout de vingt jours. Afin de pouvoir démontrer directement la fonction de ces fibres somato-sensorielles in vivo, dans la modulation de la douleur neuropathique périphérique, nous avons créé des souris génétiquement modifiées dans lesquelles ces neurones sensoriels sont supprimés sélectivement. Ces souris seront exposées à 2 molécules anti-cancéreuses différentes afin d’évaluer l’impact de la suppression de ces neurones sensoriels dans la mise en place de la douleur neuropathique périphérique chimio-induite. Afin d’inclure le sexe en tant que variable biologique, comme requis depuis 2005 dans le domaine de la recherche sur la douleur, notre étude portera sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important. En particulier, les patients traités par des molécules anti-cancéreuses peuvent développer des douleurs chroniques plusieurs années après l’arrêt du traitement, détériorant grandement leur qualité de vie. Ainsi comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mise en place de la neuropathie périphérique chimio-induite reste un enjeu majeur pour permettre le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Dans ce projet, nous chercherons à caractériser le rôle d'une classe de neurones sensoriels dans la douleur neuropathique périphérique induite par chimiothérapie. Nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par l’administration de molécules anti-cancéreuses.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 gavages de 2 min toutes les 24h puis de 2 injections à 2 jours d'intervalle. 4 semaines après, 4 nouvelles injections seront administrées, espacées de 2 jours. 3 tests comportementaux alternativement seront réalisés sur ces animaux durant une semaine puis une à 2 fois par semaine pendant 5 semaines. Ces tests consistent à évaluer la sensibilité de la patte arrière de la souris à des stimulis mécaniques ou thermiques (au froid et à un gradient de température). Chaque stimulation varie de 3 à 20 sec en fonction des tests. La durée totale de ces tests est d'environ 1 min maximum par souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir des administrations de composés par gavage et par injection intrapéritonéale. La contention pour gavage et les injections intrapéritonéales sont susceptibles de générer du stress mais le personnel est formé à la réalisation de ces actes. Sur la base des données bibliographiques, nous savons que l’injection par voie intrapéritonéale des composés chimio-thérapeutiques va générer chez une souris sauvage une hypersensibilité mécanique, une hyperalgésie thermique et une allodynie au froid.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans chaque procédure sont euthanasiés afin de prélever les tissus nécessaires aux besoins de l'analyse.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Sur la base d’études pilotes, nous avons réduit au minimum nos effectifs permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. L’optimisation de notre plan expérimental (enchaînement de différents tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, partage de tissus) permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. L’utilisation d’outils informatiques prenant en compte la variabilité liée au traitement, aux tests comportementaux ainsi que le nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable, nous permettent de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement, ainsi que dans les analyses moléculaires prévues dans ce projet. Le nombre indiqué tient compte de toutes ces variables.
Raffinement
Les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire au mieux voir supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité de locaux d'expérimentation, de matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) limitant le stress des animaux et favorisant la validité des expériences ; b) recours à l'anesthésie/analgésie ; c) établissement d’une grille de score et des points limites les plus précoces possibles. Les expérimentateurs ont été formés et maitrisent les méthodes notamment l’administration par « voie orale ». Une surveillance accrue des souris sera réalisée durant la première semaine d’administration des molécules anti-cancéreuses et précédant chaque test de comportement. Si une anomalie est constatée, les zootechniciens en charge de la surveillance quotidienne contacteront le porteur de projet et les membres du bien-être animal et des mesures seront prises, si nécessaire (y compris les points limites adaptés) afin de minimiser la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrits chez la souris. Nos tests comportementaux et nos analyses cellulaires et moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car à ce stade du développement, le système somato-sensoriel primaire arrive à maturation. Néanmoins, l'expérimentation sera débutée chez ces souris âgées de 3 et 3.5 semaines afin de supprimer de façon optimale la population de neurones sensoriels d’intérêt.
Comorbidités des rhumatismes inflammatoires chroniques : physiopathologie et traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1750
1 750 rats et 750 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 650 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite leur est provoquée, avec érythème et gonflement des pattes, perte de poids, écoulements des yeux et du nez, mobilité réduite et vocalises que le porteur lit comme les signes d'un état de souffrance plus marqué. S'y ajoutent, selon les groupes, une marche rapide de trente minutes par jour sur tapis roulant pendant plusieurs semaines, des séances de rotarod, un spray froid appliqué sur les pattes, des gavages et un cathétérisme de la carotide sous anesthésie suivi de la mise à mort. Le projet porte sur les maladies concomitantes de la polyarthrite rhumatoïde, et le porteur justifie l'usage de deux espèces par le fait que les cultures cellulaires, les organoïdes et les approches in silico ne permettraient pas d'évaluer l'influence du sexe biologique, qu'il juge "indispensable" à la valeur prédictive des résultats.
Objectifs
Notre projet est un projet de recherche fondamentale, préclinique, qui vise à identifier des nouveaux traitements pour les patients atteints de rhumatismes inflammatoires chroniques (RIC). Ces maladies, dont les plus fréquentes sont la polyarthrite rhumatoïde et les spondyloarthrites, sont des maladies inflammatoires causées par un dérèglement du système immunitaire. Les patients souffrent de douleurs et de déformations de leurs articulations qui entraînent un handicap et a des conséquences socio-professionnelles importantes. Il est moins connu que ces patients développent également des pathologies concomitantes à leur maladie rhumatismale (comorbidités), qui réduisent l’espérance de vie, telles les comorbidités cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral, insuffisance cardiaque) ou altèrent encore plus leur qualité de vie, comme les comorbidités cognitives (troubles de la mémoire, dépression) et les comorbidités intestinales (inflammation intestinale). Alors que beaucoup de données scientifiques sont disponibles sur les mécanismes et traitements du problème articulaire de ces patients, très peu d’études ont été consacrées à la prise en charge spécifique de ces comorbidités. Les effets des traitements antirhumatismaux sur ces comorbidités sont inconnus ou controversés, et aucun traitement spécifique de ces comorbidités n’a été pour l’instant identifié. Pour ces raisons, ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes impliqués dans les comorbidités associées aux RIC et d’identifier d’autres options thérapeutiques innovantes. Il mettra en œuvre plusieurs modèles animaux d’arthrite, chez le Rat ou la Souris, qui sont complémentaires les uns des autres vis-à-vis des comorbidités à étudier. Sur la base des données de la littérature, et selon les mécanismes que nous aurons identifiés, différentes approches thérapeutiques seront évaluées chez les animaux souffrant d’arthrite : approches médicamenteuses (voie orale ou voie injectable) et approches non médicamenteuses (cryothérapie appliquée sur les pattes, ou activité physique à un temps de l’arthrite compatible avec cette pratique). Il est attendu que toutes les approches qui seront testées n’aient soit pas d’effet aggravant de l’arthrite, soit réduisent l’intensité de l’inflammation articulaire.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints de rhumatismes inflammatoires chroniques, de réduire la surmortalité associée à leur maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Interventions non-invasives. Cette catégorie d’intervention est réalisée soit sur un animal vigile, soit sur un animal anesthésié. Elle n’engendre pas de douleur, mais uniquement une gêne à la nouveauté de l’expérience. La durée varie selon l’intervention, voir le tableau suivant. En cas d’intervention qui demande une contention des animaux, une phase d’habituation est programmée au préalable. Par exemple : - Mesure de pression artérielle à la base de la queue : habituation, en condition vigile, quelques minutes à chaque mesure. - Marche rapide sur tapis roulant : habituation, en condition vigile, 30 minutes /jour, pendant plusieurs semaines - Rotarod (coordination sur tige tournante) : habituation, en condition vigile, 5 à 10 minutes /jour, pendant plusieurs jours - ECG : sous anesthésie gazeuse, pendant quelques minutes, le réveil s’effectue 2 à 3 minutes après l’arrêt de l’exposition à l’anesthésique Application ou administration de traitements Si le traitement est administré par voie parentérale, une douleur similaire à la douleur d’une piqûre d’une aiguille est engendrée. Autrement, les conditions d'applications dépendent du type de traitement. Par exemple : -Cryothérapie par spray froid sur les pattes après contention manuelle en condition vigile pendant quelques minutes. - Injection sous-cutanée, intra-péritonéale, intradermique après contention manuelle vigile en moins d’une minute, - Gavage après contention manuelle en condition vigile en moins d’une minute - Administration orale par eau de boisson : dans la cage, en condition vigile avec accès à volonté au biberon -Administration orale dans la nourriture : dans la cage vigile avec ccès à volonté à la mangeoire. Pour les modèles d’arthrite générant une douleur et une atteinte articulaire, un soin particulier sera apporté aux animaux lors de la manipulation. Un système de points limites définit au préalable le seuil de souffrance à ne pas dépasser. Sa détermination quotidienne permet de suivre le bien-être de l’animal et d’envisager sa mise à mort, le cas échéant. Procédures chirurgicales : cathétérisation carotidienne, mesure de la courbe pression-volume cardiaque. Ces procédures doivent respecter les aspects réglementaires définis : sous anesthésie générale, après analgésie, avec température contrôlée, et respiration vérifiée, par un expérimentateur habilité à la chirurgie expérimentale. L’animal est mis à mort à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1 de gravité sévère, une perte de poids et des écoulements nasaux sont observés au moment du développement d’arthrite et associés à l’apparition d’érythème et de gonflements des pattes antérieures et postérieures. Une douleur est associée à l’arthrite, et la mobilité des animaux est réduite lors de la phase inflammatoire de la maladie. Des écoulements au niveau des yeux et l’expression de vocalises peuvent apparaitre traduisant un état de stress et de souffrance plus marqué. A une phase plus tardive, des croutes cutanées peuvent apparaitre au point d’injection au niveau de la queue. Cette procédure étant considérée « sévère » au cours des phases inflammatoires des modèles d’arthrite, un suivi journalier de points limites est appliqué pendant ces phases inflammatoires. Dans les procédures 2 et 3 de classe légère, les administrations multiples par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent aussi engendrer un inconfort pour les animaux. Ainsi, les injections doivent se faire à différents points afin de ne pas sursolliciter une seule région. L'état des points d'injection doit être vérifié le lendemain de chaque administration.
Devenir
Notre démarche de recherche inclut des explorations fonctionnelles chez l’animal vigile ou anesthésié. Mais elle implique aussi des explorations biomoléculaires sur les tissus d’intérêt. Ainsi, à l’issue de chaque procédure nous avons besoin de collecter les organes/tissus afin de réaliser des analyses. Tous les animaux de ce projet sont donc mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est nécessaire car la compréhension de nouveaux mécanismes tissulaires/moléculaires et l’étude de nouvelles approches thérapeutiques ne peuvent pas être d’emblée réalisées chez les patients, et nécessite des explorations à des stades précliniques de la maladie, irréalisables chez le patient. Les méthodes d’analyses in vitro sur cellules ou organoïdes en culture, ou in silico, ne reproduisent pas intégralement les communications complexes inter-organes (nerveuses, endocrines, immunologiques) impliqués dans les RIC et ne permettent pas d’évaluer l’influence du sexe biologique, indispensable pour garantir la valeur prédictive des résultats chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux se base sur le nombre de modalités thérapeutiques qui seront testées, avec notamment la notion d’effet-dose pour les études pharmacologiques, le nombre requis d’animaux selon la procédure réalisée (qui tient compte de la variabilité de la technique de mesure et du test statistique utilisé), et la nécessité d’étudier la variabilité liée au sexe pour des paramètres qui n’ont jamais fait l’objet d’études antérieures de l’influence du sexe biologique en cas d’arthrite. Des effectifs plus réduits seront utilisés pour les expériences préliminaires de recherche de doses efficaces des nouveaux médicaments, ou pour l’apprentissage de techniques d’exploration fonctionnelles complexes. Dans la mesure du possible, les techniques non invasives d’évaluation de la comorbidité d’intérêt seront toujours privilégiées aux mesures invasives. Pour chaque expérience, une banque de tissus sera réalisée afin de ne pas répéter ultérieurement des expériences.
Raffinement
Un raffinement sera apporté à chaque procédure afin de limiter le stress des animaux. Les effets de l’arthrite et des traitements sur les différentes comorbidités seront évalués à l’aide de différents tests, dont certains seront réalisés chez l’animal anesthésié et analgésié. Les modèles d’arthrite pouvant générer une douleur, un soin particulier sera apporté aux animaux lors de leur manipulation, un suivi clinique sera effectué, l’accès à la nourriture sera facilité. Quotidiennement, la détermination de points limites est réalisée afin de limiter la souffrance animale, en procédant à la mise à mort de l’animal selon le niveau de souffrance atteint. Cette évaluation sera réalisée conjointement avec la structure du bien-être animal, et éventuellement après sollicitation du Vétérinaire, le cas échéant. Pour les procédures nécessitant une anesthésie de l’animal, un tapis chauffant sera utilisé pour prévenir l’hypothermie.
Choix des espèces
Nos travaux s’intéressent à deux types de maladies inflammatoires chroniques : polyarthrite rhumatoïde et spondylarthropathie. Le Rat et la Souris sont les espèces de référence pour modéliser ces pathologies et ses comorbidités. La Souris offre en plus l’avantage de créer des lignées transgéniques permettant d’étudier l’effet de l’altération ou de rajout partiel ou total d’un gène codant une protéine d’intérêt. Dans tous nos modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte. Dans tous nos modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 5 mois.
Rôle des neurones du cœur dans les troubles cardiaques de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant jusqu'à douze séances hebdomadaires d'enregistrement cardiaque d'une heure, deux chirurgies et jusqu'à six séries d'injections. La première opération, de soixante minutes, sert à administrer un produit qui provoque l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cœur, et les injections répétées détruisent la fonction des nerfs vagues, ce dont le porteur affirme que cela reste sans impact sur l'état général des animaux dans les conditions de l'étude. La seconde chirurgie, de quatre-vingt-dix minutes, est menée sans réveil, tous les rats étant tués pour l'analyse histologique des cœurs et des cerveaux. L'effectif repose sur des groupes de 15 animaux, le porteur reconnaissant que la moitié pourrait suffire si aucune différence n'apparaît entre mâles et femelles à mi-parcours.
Objectifs
La maladie de Parkinson est liée à la dégénérescence de certains neurones dans le cerveau, associée à l’accumulation de la protéine alpha-synucléine. En plus des symptômes moteurs caractéristiques de la maladie, il existe de nombreux symptômes non-moteurs qui sont très invalidants. Parmi ces symptômes non-moteurs, l’hypotension orthostatique (baisse soudaine de la pression artérielle lors du passage d’une position couchée ou assise à une position debout) est fréquente chez les patients, provoquant des étourdissements et vertiges qui augmentent le risque de chute. On observe également une diminution de la variabilité de la fréquence cardiaque et d’autres troubles de la régulation du rythme cardiaque dont la fréquence et l’intensité varient d’un patient à l’autre. Cependant, il existe des preuves que l’accumulation d’alpha-synucléine ne se restreint pas au cerveau et touche également des organes périphériques dont le cœur. En effet, il existe des neurones situés dans le cœur qui constituent le système nerveux intracardiaque et qui jouent un rôle important dans la régulation de la fonction cardiaque. Les neurones cardiaques intègrent les informations en provenance des systèmes nerveux sympathique et parasympathique, permettant ainsi d’assurer le contrôle de l’activité du cœur. Ils pourraient être affectés dans la maladie de Parkinson et ainsi contribuer directement aux troubles cardiaques. Le rôle potentiel de ces neurones cardiaques dans la maladie de Parkinson reste inconnu à ce jour et c'est ce que nous cherchons à mettre en évidence dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques retrouvés dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alphasynucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent. L'évaluation des troubles cardiaques permettrait de mettre en évidence l'intérêt probable de modifier la prise en charge thérapeutique des patients en incluant de nouvelles molécules permettant de limiter ces dysfonctionnement.
Procédures
Tous les animaux (n=480) seront soumis à deux tests comportementaux moteurs (un spontané et un nécessitant une légère contention de quelques secondes) puis à une anesthésie gazeuse de moins de 10 minutes permettant de raser l'animal et de poser des électrodes au niveau du thorax pour mesurer pendant 1 heure l'activité cardiaque sur l'animal vigile. La mesure se fait par télémétrie ; l'animal est libre de ses mouvements pendant la mesure. Cette mesure est répétée une fois par semaine soit 6 fois pour la moitié des animaux et 12 fois pour les animaux restants. Une chirurgie d'une durée de 60 minutes sera réalisée sous anesthésie et couverture médicamenteuses anti-douleurs. Cette chirurgie permet d'administrer un produit qui provoque une accumulation d'alpha synucleine aun niveau cardiaque. Les animaux vigiles recevront une injection 1 fois par jour pendant 3 jours, à deux semaines d'intervalle (3 fois pour la moitié des animaux (n=240) et six fois pour la seconde moitié (n=240)) permettant la perte de fonction des nerfs vagues. Puis après six et/ou douze semaines, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux. 240 animaux seront soumis à une seconde chirurgie de 90 minutes permettant de faire des mesures de l'activité cardiaque et de la pression artérielle. Les animaux seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable (pour prélèvements). 240 animaux auront une seconde chirurgie sans réveil et sous couverture anesthésique et analgésique (pour d'autres prélèvements).
Impact sur les animaux
Léger stress transitoire lors des pesées, injections, inductions et réveil d'anesthésie, et tests comportementaux. Légère douleur transitoire lors des injections. Légère gêne pendant l'heure de port des électrodes. Léger inconfort transitoire lors du réveil après anesthésie. Pendant les jours suivant la chirurgie, douleur et inconfort minimisés par les antalgiques et légère perte de poids transitoire. Dans les conditions de vie des animaux dans ce projet, la perte de fonction des nerfs vagues n'a pas d'impact sur l'état général des animaux.
Devenir
Tous les animaux (n=480) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de plusieurs paramètres physiologiques tels que l'activité électrique du coeur et la pression artérielle, ainsi que la réalisation des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.
Remplacement
Des approches in silico ou in vitro ou des données obtenues chez les patients existent et donnent de l'information mais ces approches ont des limites et à ce stade d'avancée des connaissances, il est nécessaire de passer au modèle in vivo pour avoir un système entier et intégré.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque lot expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance statistique. Ces critères prenent en compte le risque de possibles décès expérimentaux ou d'origine non contrôlée et impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par lot soit 480 rats mâles et femelles. Des analyses statistiques à plusieurs variables seront effectuées. Les deux sexes seront étudiés en parallèle. Après avoir expérimenté la moitié des animaux mâles et femelles, si une différence est mise en évidence, l'intégralité des animaux du projet seront nécessaires, en revanche si aucune différence n'apparait, nous pourrons grouper les résultats sur les deux sexes et ainsi n'utiliser que la moitié de l'effectif total des animaux de ce projet.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec contrôle de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale et sans délai de ceux-ci. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.
Choix des espèces
L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson puisque les réseaux neuronaux sont similaires à ceux de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment de la première chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.
Étude et caractérisation de l’effet de CLEC-1 dans l’immunosuppression liée au sepsis dans un modèle de pneumonie de souris. 2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une sonde de gavage enduite de lidocaïne descend dans la trachée de souris anesthésiées pour y déposer des bactéries et déclencher une pneumonie septique. 3 118 souris vont être utilisées de cette manière, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que ces interventions "n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire", tout en prévoyant une ou plusieurs injections de morphinique sur animal vigile selon le score de douleur relevé chaque jour. La rubrique consacrée au choix de l'espèce ne justifie rien : elle reprend mot pour mot le texte sur l'hébergement et le transport, et l'effectif de 3 118 souris tient en une ligne, réduit "au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable".
Objectifs
Pour ce projet nous allons déterminer le rôle d’un récepteur cellulaire dans la réponse immunitaire suite à une infection pulmonaire aigüe (sepsis). Ensuite nous allons tester si l’utilisation d’une molécule thérapeutique ciblant ce récepteur peut apporter un bénéfice dans le traitement de ces infection pulmonaires. Finalement, nous allons étudier les interactions de ce récepteur immunitaire avec d’autres mécanismes immunitaires.
Bénéfices attendus
Le sepsis et une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Ce projet vise à déterminer le lien entre l’activité d’un récepteur immunitaire et l’établissement de l’immunosuppression induite par le sepsis. Mieux comprendre les mécanismes biologiques responsables de ce phénomène pourrait mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques utiles dans le traitement du sepsis.
Procédures
Afin d’induire une pneumonie et après anesthésie générale, les animaux seront placés sur le dos. Une injection de bactéries sera réalisée directement dans la trachée à l’aide d’une sonde de gavage, enduite d’analgésique. Cette injection intratrachéale dure moins d’une minute et sera réalisée sur une majorité des animaux (EU1). Afin de s’assurer du bien-être des animaux et de l’absence de douleur, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles expérimentaux a été mis en place. En fonction de l’évaluation, si un animal présentait des signes de douleur, une ou plusieurs injections de morphiniques pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Ce geste dure moins d’une minute (EU1). Certains animaux auront des administrations intraveineuses (IV) en caudale et en vigile (EU1). Le geste d’IV est très rapide et ne dure au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours), sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre les différents compartiments immunitaires et non immunitaires du poumon pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (Annexe 9). En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) pour d’anesthésier localement la trachée. Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Concernant le transport des animaux, ceux-ci seront transporté dans des cages contenant un maximum de 5 animaux par compartiment, avec accès à de la nourriture et de l’eau, par un transporteur agrée.
Choix des espèces
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (Annexe 9). En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) pour d’anesthésier localement la trachée. Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Concernant le transport des animaux, ceux-ci seront transporté dans des cages contenant un maximum de 5 animaux par compartiment, avec accès à de la nourriture et de l’eau, par un transporteur agrée.
Effets des polluants sur les poissons hôtes et leurs parasites : une étude expérimentale sur le modèle chevesne-acanthocéphales
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés en rivière sous autorisation préfectorale, 480 chevesnes sauvages vont être maintenus jusqu'à six mois dans des bassins extérieurs, puis tués. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger. Deux fois par semaine pendant deux semaines, chaque poisson est anesthésié pour ingérer un mélange d'herbicide, d'antidépresseur, d'antipyrétique et d'anti-inflammatoire, avant des relevés comportementaux, une prise de sang et une mise à mort permettant de compter les parasites intestinaux et de doser les polluants dans le foie, les muscles, le rein et le tube digestif. Le porteur annonce des connaissances utiles pour orienter les politiques de protection de la biodiversité, et signale que les bassins ne sont pas régulés en température, exposant les poissons à un stress thermique qui s'ajoute à celui de la capture et de la captivité.
Objectifs
La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites intestinaux sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalius cephalus infesté par des acanthocéphales. Des premières manipulations ont été d’ors et déjà réalisées. Ces manipulations ont permis de montrer que l’allocation énergétique et le comportement des poissons sont corrélés à de la charge en parasites. Ce projet vise à tester 1) les effets cocktails de l’exposition à plusieurs polluants (résidus de médicaments et pesticides), 2) les possibles effets d’acclimatation suite à une pré-exposition aux polluants et de résilience lorsque l’exposition cesse, et 3) des conséquences sur le paramètres neurotoxiques influençant potentiellement le comportement et notamment les comportements de groupe. Les composés testés sont des molécules très présentes dans l’environnement, à savoir un herbicide, un antidépresseur, un antipyrétique, et un anti-inflammatoire non-stéroïdien. Des manipulations expérimentales seront menées chez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, et exposés à des polluants dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques.
Bénéfices attendus
Nos recherches explorent une question originale : les parasites intestinaux, en capturant certains polluants, peuvent-ils apporter un bénéfice aux poissons en milieux pollués, malgré les effets négatifs du parasitisme ? Ce point est souvent ignoré en écotoxicologie, une discipline qui étudie les effets des polluants sur les organismes vivants, mais qui se limite souvent à des expériences en laboratoire sans prendre en compte les interactions entre les espèces. Contrairement aux tests classiques, nos études reproduiront les conditions réelles d’exposition aux polluants, en tenant compte des mélanges de substances et de leur accumulation au fil du temps. Nous nous intéresserons aussi aux effets sur le cerveau et le comportement des poissons, qui restent peu étudiés. Pour cela, nous utiliserons des marqueurs innovants permettant de mesurer l’impact des polluants sur l’activité cérébrale et les dommages neuronaux. Ces outils pourront être utilisés en écotoxicologie et en écophysiologie, notamment pour évaluer le stress des poissons, y compris ceux retrouvés morts dans la nature. Nos résultats aideront à mieux comprendre les risques liés aux résidus de médicaments et aux pesticides dans les milieux aquatiques. Ces connaissances seront précieuses pour orienter les politiques de protection de la biodiversité. Enfin, notre projet est mené en collaboration avec des acteurs de terrain (syndicats de rivière, agences de l’eau, fédérations de pêche), favorisant des échanges sur l’état des cours d’eau et des populations de poissons.
Procédures
Les individus seront capturés en milieu naturel (autorisation préfectorale), hébergés pour une durée de 6 mois maximum, dans des très grands bassins extérieurs avec enrichissement du milieu. Chaque acte durera moins de deux minutes, sur des poissons anesthésiés (selon la méthode réglementaire). Les interventions consisteront à manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion sur individus anesthésiés (durée pour obtenir l'anesthésie inférieure à 3 minutes), à raison de deux fois par semaine pendant 2 semaines (temps de manipulations inférieurs à 2 minutes). Des paramètres comportementaux seront mesurés (durée de relevé des paramètres comportementaux inférieure à 15 minutes), et une prise de sang sera réalisée (sous anesthésie) afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés par une méthode réglementaire et différents prélèvements réalisés pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont : le stress de la capture et de la captivité, le stress de l’administration aux agents polluants, le stress thermique (les mésocosmes extérieurs sont influencés par les températures atmosphériques). L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. L'exposition expérimentale à l’herbicide, à l’antidépresseur, à l’antipyrétique et à l’anti-inflammatoire peut engendrer des altérations physiologiques et comportementales, telles que des réponses immunitaires altérées, ou des comportements répétitifs.
Devenir
L'euthanasie, réalisée par une méthode réglementaire, se justifie par la nécessité de relever le nombre de parasites chez les poissons, et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.
Remplacement
Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.
Réduction
480 animaux seront utilisés en tout, soit 30 animaux par lot pour l’ensemble des études (30X16 lots soit 480 individus). Cet effectif a été retenu à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes, en augmentant le N pour les études comportementales où la variabilité interindividuelle est beaucoup plus élevée. L’analyse statistique des données sera réalisée afin de comparer les groupes et donc les effets de la charge en parasites et de la charge en polluants sur les poissons, avec un suivi temporel des individus.
Raffinement
Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de 12m3, entièrement tapissés de filets, pour une protection vis-à-vis des prédateurs, et la récupération rapide des poissons, réduisant ainsi le stress et les risques de blessure. Les mésocosmes disposeront de radeaux végétalisés flottants de dimension 1x1 m permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Les mesocosmes ne sont pas régulés en température, et les poissons seront donc soumis aux variations de la température extérieure, qui sera toutefois atténuée par l’ombre assurée par les radeaux végétalisés. Lors de chaque acte, les poissons seront dans des bacs oxygénés, puis transférés dans un bac avec l'anesthésiant (durée pour obtenir l'anesthésie inférieure à 3 minutes). Chaque acte réalisé sous anesthésie durera moins de deux minutes. Après manipulation, ils seront placés dans un bac de réveil (eau fraiche, oxygénée, réveil rapide de moins de 5 minutes, avec surveillance des battements operculaires), puis rejoindront le reste du groupe dans le mésocosme, une fois un état de conscience, une réactivité au stress retrouvé, une récupération totale de l’équilibre et des activités de nage. Un suivi journalier des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement [nage erratique, position au sommet de la colonne d’eau, absence d’interaction sociale, isolement, hyper ou hypo-activité], hyper ventilation, hypersécrétion de mucus, présence de lésions) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance en aquarium dédié. La fréquence d’observation sera augmentée, un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie. Une forte mortalité constatée sur l’ensemble du groupe présentera un point limite pour l’ensemble de l’expérience.
Choix des espèces
L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, rendant le couple chevesnes-acanthocéphales idéal pour cette étude, 2. cette espèce ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. des précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm, taille nécessaire pour que les poissons présentent des parasites acanthocéphales.
Caractérisation et étude d’un nouvel agent de contraste à potentialité multimodale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un cathéter posé dans la veine de la queue, une heure d'IRM sous anesthésie, puis deux nouvelles séances d'imagerie à quatre et vingt-quatre heures : 62 souris suivent ce protocole, dont une partie après avoir reçu sous la peau une injection de cellules tumorales. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger pour 42 souris et modéré pour 20. L'objet du projet est de tester si trois enrobages polymères rendent des nanoparticules assez discrètes vis-à-vis du foie et du système immunitaire pour circuler plusieurs heures dans le sang et atteindre une tumeur. Toutes les souris sont tuées pour le prélèvement des organes et de la tumeur, celles dont la tumeur dépasse 10 % du poids corporel ou qui perdent plus de 20 % de leur poids étant sorties de l'étude et mises à mort avant terme.
Objectifs
Après une étude préalable réalisée in vitro sur des cellules en culture, l’objectif de ce projet est l’évaluation in vivo de nouveaux composés issues des nanotechnologies comme agents de contraste pour l’imagerie médicale. Ces composés sont prometteurs pour l'amélioration du diagnostic et la thérapie du cancer. Ils permettent notamment une augmentation de contraste des images obtenues par résonance magnétique nucléaire (IRM). La difficulté majeure rencontrée pour l'utilisation de ces composés est qu'ils sont très rapidement captés en quelques minutes par les systèmes de défense de l'organisme comme le foie et les cellules du système immunitaire. Si les composés ne restent pas suffisamment longtemps dans la circulation sanguine, ils n'ont pas le temps de passer dans le tissu tumoral. Des modifications de la surface de ces composés par greffage de polymères particuliers permet de les rendre relativement invisibles du système de défense. Ainsi, leur temps de présence dans le sang s'allonge, augmentant la probabilité de passage du composé dans le tissu tumoral. Pour ce projet nous allons tout d'abord évaluer avec pour critère principal de sélection, l’invisibilité biologique pour 3 types de polymères à 3 concentrations différentes. Le temps de présence dans la circulation attendu est de plusieurs heures avec nos composés Puis sur un modèle de souris porteuse d'une tumeur, nous testerons les 2 meilleurs agents à 2 concentrations différentes. L’imagerie sera réalisée avec un IRM dédié au petit animal sous anesthésie pour éviter les mouvements durant les acquisitions.
Bénéfices attendus
Ces nouveaux agents de contraste sont développés dans le but de limiter les doses à injecter chez les patients, et pour pallier le fait qu’une seule technique d’imagerie se révèle souvent insuffisante pour poser un diagnostic précis. La mise au point d’agents de contraste bimodaux (combinant deux types d’imagerie complémentaires) et vectorisés (aptes à cibler sélectivement la zone d’intérêt), devient une nécessité en matière de santé. Leur utilisation permettrait d’accéder rapidement à un diagnostic plus précis et de définir le traitement le plus approprié, limitant ainsi les effets secondaires, améliorant la prise en charge des patients, et réduisant les coûts de santé. Des études menées auprès de professionnels du secteur montrent qu’un intérêt particulier se dégage pour une sonde associant la précision spatiale de l’IRM à la grande sensibilité de l’imagerie nucléaire, du fait de leur complémentarité et du développement d’appareils combinant IRM et imagerie nucléaire. Pour autant, et même si de nombreuses publications rapportent la synthèse de sondes associant IRM et imagerie nucléaire, aucune sonde duale adaptée n’est actuellement disponible sur le marché. Les nanomatériaux sont de bons candidats pour le développement de tels outils bimodaux, notamment par les possibilités de vectorisation/modification qu’ils apportent.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions dans ce projet : (1) une imagerie par IRM sous anesthésie in vivo non invasive et non traumatique, 3 sessions : la première dure 1 h, la seconde dure 10 min et est réalisée après 4h suivant l’injection de l’agent de contraste, enfin la dernière est réalisée 24h après la première. (2) pose d’un cathéter réalisé en moins de 10 minutes pour injection par voie intraveineuse à la première session d’imagerie, le cathéter est enlevé à la fin de la première session d’imagerie, l’animal étant toujours sous l’effet de l’anesthésie gazeuse. (3) pour certains animaux, une injection sous-cutanée de cellules tumorales, durée incluant la préparation 10 min.
Impact sur les animaux
- La pose d’un cathéter : le cathéter est posé dans la veine caudale , il peut induire un hématome et une altération temporelle de la veine. -Induction tumorale : la génération d'une tumeur peut entrainer une perte de poids de l’animal, des souffrances et éventuellement des troubles fonctionnels.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux sont mis à mort car les organes sont prélevés pour analyse. A l'issue de la procédure 2 sur les animaux porteurs d’une tumeur solide, tous les animaux sont mis à mort car les organes et la tumeur sont prélevés pour analyse.
Remplacement
Certaines phases d'optimisation des nano-particules (vérification de la stabilité, toxicité cellulaire) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité à intégrer la tumeur.
Réduction
L'imagerie, par opposition aux bio-distributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en œuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session après 4h et après 24h suivant l’injection de l’agent de contraste). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique paramétrique ou non paramétrique selon la distribution des données. Pour la première phase de caractérisation de nos nano-sondes, des animaux non inclus dans un protocole dont la mise à mort était programmée pourront être utilisés.
Raffinement
La première phase de caractérisation in vivo des nano-sondes sera menées sur des souris saines pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de tumeur sous-cutanée. Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur dépassant 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une injection sous-cutanée de cellule tumorales, l'anesthésie sera réalisée classiquement par induction à l'isoflurane. Les animaux sont maintenus dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une dose d’analgésique sera administrée, si l’état général de l’animal ne s’améliore pas dans les 48h et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de la souris est reconnu comme pertinent pour l'évaluation préclinique des caractéristiques des agents de contraste en imagerie. La souris possède comme l’homme une vésicule biliaire ce qui permet de visualiser la voie d’élimination hépatique. Le modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris est bien maitrisé. Les animaux pour la phase d’évaluation de la furtivité seront utilisés au stade de jeunes adultes à adulte (de 7 à 16 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Des animaux jeunes de 4 à 6 semaines seront utilisés pour la génération d’une tumeur sous-cutanée. Ce stade est optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses. Ces animaux seront explorés par IRM (entre 7 et 10 semaines).
Etude des facteurs protecteurs contre l’inflammation du cerveau à l’aide d’un modèle animal de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont l'état se dégrade nettement sont tuées immédiatement, puis analysées. 405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 pour l'élevage, mises à mort à un an. Chacune subit un prélèvement de 2 mm au bout de la queue, quatre injections abdominales consécutives, puis deux injections sous la peau et dans l'abdomen d'un mélange qui déclenche une inflammation du système nerveux reproduisant la sclérose en plaques. Le porteur affirme avoir choisi des conditions d'induction produisant des symptômes "modérés", sans douleur ni perte de poids significative, et annonce que les retombées "devraient sans nul doute" ouvrir des pistes thérapeutiques chez l'humain.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du cerveau et de la moelle épinière qui conduit à une destruction progressive de la gaine de protéines qui entoure les neurones. Elle est dévastatrice et conduit à la paralysie du patient. Une partie des cellules immunitaires, les macrophages du cerveau appelés microglies (MG), protègent normalement le système nerveux central du développement de la SEP. Il a été récemment découvert que les MG contiennent une substance nommée la protéine P, qui contrôle la fonction des MG et leur capacité de protection contre les maladies du cerveau. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo le rôle de la protéine P dans la progression de la SEP chez des souris transgéniques, en induisant la maladie par un traitement chimique. Nous étudierons également comment la protéine P modifie l'activité des MG. Nous espérons que notre projet permettra d'identifier de nouveaux outils diagnostics et thérapeutiques dans le contexte de la SEP.
Bénéfices attendus
Le rôle de la protéine P dans un modèle murin de SEP n'a jamais été testé et permettra de confirmer des résultats préliminaires in vitro sur son rôle dans la progression de la SEP. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics, et peut-être thérapeutiques, en découvrant les gènes contrôlés par la protéine P dans les MG, qui seront des cibles thérapeutiques potentielles. Les retombées de ce travail seront utiles pour la compréhension des mécanismes pathologiques de la SEP et devraient sans nul doute faire découvrir de nouveaux outils de prévention et des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.
Procédures
Les souris auront une biopsie de la queue, qui consiste à prélever 2 mm de l'extrémité de la queue. Elles recevront pendant quatre jours consécutifs une injection dans le ventre d'un produit permettant de supprimer la protéine P chez les souris ayant une modification génétique spécifique. Cette injection dure moins de deux minutes. Quatorze jours plus tard, les souris recevront deux injections sous la peau et dans le ventre d'une combinaison de substances produisant le modèle de sclérose plaques chez l'animal. Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour éviter tout stress chez l'animal. Toutes les souris seront observées quotidiennement pour évaluer l'évolution de la pathologie. Celles présentant une dégradation importante de leur état seront immédiatement euthanasiées et analysées.
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue peut causer une brève douleur et un léger saignement qui seront arrêtés par une légère pression exercée localement.Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Clorhexidine). Des injections répétées pendant quatre jours consécutifs peuvent être une source de stress pour les animaux.
Devenir
Les 45 souris utilisées pour l’élevage seront euthanasiées à l’âge d’un an. Les 360 souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude (10 à 15 semaines pour les souris euthanasiées au pic de la maladie et 12 à 17 semaines pour les souris euthanasiées 30 jours après induction de la maladie). Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées dans le cerveau de ces souris.
Remplacement
Toutes les données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages (MG) du cerveau et contrôle leur fonction. La lignée de souris qui n’exprime plus P dans les MG nous permettra de mimer au mieux la sclérose en plaques, une maladie très sévère qui conduit à la paralysie des patients et à leur mort. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues par d’autres méthodes, étant donné la complexité physiologique du développement de la sclérose en plaques. Nous sommes donc obligés de travailler à l'échelle de l'organisme. L'inactivation de la protéine P ne peut être réalisée que sur l'animal et la complexité du cerveau ainsi que les interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués dans la maladie ne peuvent pas être reproduites in vitro par des cultures cellulaires.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir des résultats robustes qui pourront ensuite être transposés chez l’homme. L’induction de la maladie sera réalisée en trois séries d'expériences : 1). - pour suivre l’état clinique des animaux pendant un mois ; 2) - pour isoler les macrophages du cerveau (MG) au pic de la maladie et les analyser ; 3)- pour isoler les macrophages du cerveau des souris avec ou sans la protéine P, en absence de la maladie. Cette dernière étape nous indiquera des marqueurs qui pourront être utilisés pour prédire la progression de la maladie. Le nombre total de souris est de 360. 45 souris seront utilisées comme géniteurs dans l'élevage. Pour réduire le nombre total de croisements et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, parce que la maladie SEP ne montre pas de différence due au genre.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées par groupe de cinq dans des cages ventilées. La température, l'humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec un bâtonnet en bois, des cotons et du kraft, pour permettre aux souris de jouer et avoir une activité diversifiée. Avant les injections sous-cutanées, les souris seront anesthésiées pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. D’ailleurs, nous avons choisi des conditions d’induction de la maladie qui permettent un développement modéré des symptômes de la maladie sans induction de douleur et sans perte significative de poids des aliments spécifiques qui permettront aux souris de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Le suivi des souris malades deux fois par jour permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance. Enfin, nous nous attendons à ce que le blocage de la protéine Pax6 induise la maladie plus tôt et avec un phénotype plus marqué. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris, car c'est le meilleur modèle pour créer des animaux transgéniques et comparer le développment des maladies chez ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des maladies humaines. Toutes nos données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages du cerveau et régule l'état inflammatoire de ces cellules. La lignée de souris qui permet d'inactiver la protéine P chez l’animal adulte, exclusivement dans les microglies (les macrophages du cerveau), est un modèle idéal pour étudier le rôle de la protéine P dans le développement de la sclérose en plaques (SEP). Ce modèle de SEP chez la souris est de loin le meilleur moyen de mimer la SEP humaine, l'une des maladies les plus sévères et dévastatrices, liée à une activation aberrante des microglies, qui sont les macrophages du cerveau, et qui jouent un rôle protecteur contre l'inflammation du cerveau. Toutes les souris devront être adultes, âgées de 6 à 8 semaines, parce que la maladie SEP se développe chez l'être humain adulte.
Gestion de la production de 2 lignées de souris transgéniques utilisées comme modèles de l’hypophosphatémie liée à l’X
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Sur les 1 100 souris que cet élevage fera naître, 710 seront tuées parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, 150 gardées vivantes pour la reproduction et 240 intégrées à des projets de thérapie génique. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au titre de la gestion de deux lignées modèles de l'hypophosphatémie liée à l'X. L'unique acte déclaré est une biopsie de moins de 2 mm à l'oreille, pratiquée aux ciseaux sur animal vigile pour le génotypage, décrite comme une douleur "légère et passagère". Seuls les mâles porteurs de la mutation serviront de modèle, les femelles hétérozygotes n'exprimant que peu ou pas d'anomalie, ce qui explique le nombre de souris tuées sans avoir été utilisées.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de produire des souris utilisées comme modèles de l'hypophospahtémie liée à l'X appartenant à deux lignées très proches l'une de l'autre qui différent par leur fond génétique : HypDuk-BALB/c et HypDuk-B6. On parle de lignées congéniques. Chez les patients, l' hypophosphatémie liée à l'X est une maladie génétique héréditaire qui se manifeste par du rachitisme pendant la croissance et des atteintes musculo-squlettiques chez l'adulte. Elle est due à une mutation sur un gène dit "phex" qui fait que lorsque cette anomalie génétique et présente, elle se traduit par un défaut de minéralisation elle-même liée à une perte de phosphate au niveau des reins et une baisse de phosphate dans le sang. Les hommes et les femmes sont tous deux affectés par cette maladie car l'anomalie génétique est dominante. Les souris prises comme modèles de cette maladie dans ce projet ont un taux de phosphate dans le sang faible mais qui ne se traduit pas par des atteintes osseuses comme chez les patients. Ainsi, bien que le gène altéré est dominant chez les patients et affecte les hommes et les femmes, les femelles souris dites hétérozygotes qui possèdent un exemplaire du gène muté et un exemplaire du gène sain expriment peu ou pas d'anomalie . De fait, seuls les mâles portant la mutation sur le chromosome sexuel seront utilisés comme modèle d'étude et de thérapie génique de la maladie.
Bénéfices attendus
Cette demande s'inscrit dans le projet de développement d'une thérapie génique pour l'hypophosphatémie liée à l'X. Ces procédures justifient la production des colonies HypDuk-Balb/c et HypDuk-B6 et leur gestion.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de moins de 2 mm de diamètre à l'oreille pour le génotypage. Une paire de ciseaux fins sera utilisée à cet effet qui sera désinfectée à l'alcool et rincée à l'eau stérile entre chaque prélèvement. Cet acte est exécuté par du personnel zootechnique entraîné et ne nécessite que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement à l'oreille réalisé à des fins de génotypage est le seul effet indésirable du projet. Il induit une douleur légère et passagère.
Devenir
- 240 animaux seront inclus dans des projets scientifiques de thérapie génique pour traiter l'hypophosphatémie - 150 animaux seront gardés en vie pour les besoins de la reproduction et la gestion des élevages - 710 animaux seront euthanasiés car ne présentant pas un génotype d'intérêt pour l'expérimentation ou la reproduction.
Remplacement
Dans le cadre du projet de développement d'une thérapie génique pour le traitement de l'hypophosphatémie liée au chromosome sexuel X, nous avons nécessairement besoin d'utiliser le modèle animal car: i) Nous mesurons des paramètres biochimiques dans les fluides biologiques tels que le taux de phosphate dans le sang ; ii) Nos vecteurs de thérapie génique agissent simultanément dans différents compartiments sur le foie, les reins, et les os ; iii) Nous avons besoin d'un organisme corps entier pour évaluer les réponses de l'organisme à notre traitement comme les réponses immunitaires dirigées contre nos vecteurs et qui peuvent en affecter l'efficacité. Il n'existe donc pas de remplacement possible aux prélèvements de tissus et de sang à partir desquels nous procéderons à des explorations fonctionnelles dans le cadre de projets de thérapie génique pour le traitement de l'hypophosphatémie liée à l'X.
Réduction
La production des 2 lignées de souris objet de ce projet repose sur des croisements spécifiques et des stratégies d'accouplement en sorte d'adapter au plus juste la production aux besoins expérimentaux des projets de thérapie génique. Notre équipe dispose d'un historique lui permettant d'ajuster le nombre d'accouplement en tant que de besoin. A l'origine de cet historique, le nombre de couples avait été mis en place à l'aide d'un outil qui relie le nombre de reproducteurs nécessaires aux objectifs de production.
Raffinement
Pour la biopsie de l'oreille à des fins de génotypage, les souris vigiles seront maintenues en contention (manuelle) par du personnel zootechnique entrainé qui possède une parfaite maitrise du geste de manière à prélever moins de 2 mm de tissu sans saignement. Lorsque l'animal est remis dans sa cage, il est surveillé pendant au moins 5 minutes pour détecter un éventuel comportement qui traduirait une gêne occasionnée par l'acte.
Choix des espèces
A notre connaissance, les seuls modèles animaux mimant l'hypophosphatémie liée à l'X sont les deux modèles murins objets de cette demande. Les animaux sont prélevés à 7 jours.
Rôles du facteur de transcription hypothalamique Mafa dans la régulation physiologique du sommeil chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois heures de chirurgie pour poser des électrodes crâniennes, puis six semaines d'isolement dont trois passées seule dans un baril de plexiglas : 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. L'objet du projet est d'établir si le dysfonctionnement d'un groupe de neurones de l'hypothalamus explique les troubles du sommeil qui accompagnent le diabète. Le porteur reconnaît que cet isolement peut induire un stress, qu'il qualifie de léger et rapidement estompé, et met en avant les contacts visuels et olfactifs conservés entre quatre barils voisins. Il écarte la mouche et le poisson zèbre, dépourvus de sommeil paradoxal, et juge que les organoïdes, les cultures sur puces et l'intelligence artificielle "ne constituent pas encore d'alternatives crédibles".
Objectifs
Le diabète est fréquemment associé à des troubles du sommeil (fragmentation, cauchemars, apnées, fatigue diurne) et de la température corporelle (sueur, hypothermie). Notre équipe a récemment observé chez la souris qu’un gène contrôlant la fabrication de l’insuline par le pancréas jouerait également un rôle dans une région du cerveau impliquée dans des fonctions vitales comme le sommeil et la thermorégulation. Conduit chez la souris, ce projet expérimental vise donc à (1) caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones de cette région du cerveau ; (2) étudier leur lien avec le glucose ; et (3) établir dans quelle mesure leur disfonctionnement pourrait être responsable des troubles du sommeil liés au diabète. Seul le troisième axe de ce projet plus large fait l’objet de cette présente DAP.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à renforcer nos connaissances sur le sommeil physiologique mais aussi pathologique accompagnant le diabète et des troubles de la température corporelle. Nos travaux et ceux de nos collaborateurs apporteront un éclairage nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir sur le long terme des pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles du sommeil chez les patients diabétiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale (3h) sous anesthésie et analgésie générales requises pour la pose des électrodes permettant d’enregistrer le sommeil. A l’issue de la chirurgie, les souris seront placées à l’isolement partiel pendant 6 semaines dont 3 en cage double avec séparateur pendant la récupération post-opératoire et 3 en baril individuel pendant les enregistrements. Ce baril sera placé dans une enceinte contenant 3 autres barils. Quelques interactions sociales sont ainsi maintenues sans contact tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure est classée de sévérité modérée. Les lignées de souris transgéniques mises en œuvre dans ce projet sont normales et viables. L’anesthésie chirurgicale entraîne une légère baisse de la température corporelle rapidement compensée par l’utilisation d’une couverture chauffante. Chirurgie : possible douleur au réveil, contrôlée par des médicaments appropriés. Récupération post-opératoire en quelques heures en cage double avec grillage facilitant des interactions sociales sans contact. Lors de l’enregistrement du sommeil, chaque souris sera hébergée dans un baril individuel placé dans un caisson contenant 3 autres barils, facilitant ainsi quelques interactions sociales. Cet isolement peut induit un léger stress qui s’estompe rapidement au cours de la période d’habituation à ce nouvel environnement. Les expérimentations induisent une perturbation réversible transitoire du rythme veille-sommeil (3h) qui fait l’objet de la présente étude.
Devenir
Toutes les souris pour ce projet de recherche seront mises à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement des cerveaux.
Remplacement
Il est impossible d’étudier une fonction vitale comme le sommeil hors d’un organisme vivant. Aussi, les modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire, comprendre et modéliser des mécanismes neurobiologiques complexes. La souris est particulièrement bien adaptée aux études neurophysiologiques (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge, lignées génétiquement modifiées). Par ailleurs, ses mécanismes nerveux du cycle veille-sommeil sont communs à tous les mammifères, incluant l’homme. Des animaux moins évolués comme la mouche ou le poisson zèbre sont parfois utilisés (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal et leur cerveau ne présente pas la même complexité anatomique et fonctionnelle. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation et l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces ou les organoïdes mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles et pertinentes aborder des processus aussi complexes que le sommeil et comprendre des pathologies qui l’affectent comme le diabète, les apnées du sommeil ou la narcolepsie.
Réduction
Notre estimation porte sur un besoin de 80 souris réparties en 8 lots expérimentaux. Les expériences proposées ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux tout en maximisant les effets statistiques. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos études chez la souris publiées récemment. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes de la procédure expérimentale, la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des conditions d’enregistrement du sommeil au cours du temps pouvant rendre les interprétations fonctionnelles aléatoires, mais aussi la nécessité́ de ne pas compromettre la reproductibilité́ et la significativité́ des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques adaptés aux petits échantillons).
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès la phase post-opératoire pour optimiser leur récupération (médicaments adaptés si nécessaire, suivis du poids, de la mobilité et du comportement). Notre préoccupation est de détecter rapidement si certains paramètres physiologiques et comportementaux se dégradent pendant la procédure, constituant des points limites avec mise à mort pour prévenir une quelconque souffrance. Pour la durée de la procédure, chaque animal est hébergé dans un baril individuel en plexiglas transparent. Quatre barils sont placés dans le caisson d’enregistrement pour que les animaux gardent des contacts visuels, auditifs, olfactifs, limitant les effets possiblement angoissants liés à l’isolement social. Des enrichissements conventionnels (roue, coton, bâtonnet de bois, lanière de carton) sont fournis pour la fabrication du nid et réduire l’anxiété générée par cet isolement social. Les souris sont habituées à ingérer volontairement, sans intervention de l’expérimentateur, le principe actif à la dose de travail pour éviter le stress intense provoqué par leur manipulation lors d’une injection par piqure, avec des effets physiologiques confondants évidents sur le sommeil.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées ouvrent d’immenses possibilités de recherche scientifique sur des mécanismes nerveux complexes. Il est ainsi possible de corréler l’action d’un gène avec à une fonction vitale comme le sommeil. La compréhension de ces mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par des techniques encore impossibles chez l’homme mais applicables chez la souris. Des animaux plus simples que la souris sont parfois utilisés (mouches, poissons rouges etc) mais ils ne sont pas pertinents pour comprendre le sommeil et ses fonctions chez l’homme. Des souris jeunes adultes (3-5 mois) seront utilisées car leur sommeil est mature et consolidé à cet âge-là.