Recherche fondamentale

Une échelle de douleur à quatre niveaux encadre le protocole, le niveau 3 correspondant à une paralysie des membres, qui déclenche un analgésique plus puissant puis la mise à mort si nécessaire. 454 souris mâles porteuses de la dystrophie de Duchenne vont être utilisées, 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un virus vecteur par voie intramusculaire à six semaines, dans l'abdomen à deux à quatre jours de vie, ou dans le sinus rétro-orbitaire à dix-sept mois, et la mesure de la force contractile se fait sous anesthésie par huit stimulations successives, sans réveil. Le porteur écrit collecter les biopsies musculaires de tous les animaux et ne prévoir ni réutilisation ni adoption.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie dégénérative grave et progressive causée par des mutations du gène DMD codant pour la protéine dystrophine. Malgré des efforts considérables, la DMD reste incurable et de nombreuses questions fondamentales sur ses mécanismes pathologiques restent en suspens. Une question particulièrement importante est de savoir quelle partie du muscle la dystrophine (perdue dans la DMD) est fonctionnellement importante pour prévenir le développement de la DMD. La dystrophine est une protéine structurelle clé qui aide à maintenir l'intégrité des fibres musculaires pendant la contraction. Il y a trois décennies déjà, il a été reconnu qu’elle est plus fortement exprimée à la jonction neuromusculaire (JNM) et à la jonction myotendineuse (JMT), que dans le reste de la myofibre. Ces sites sont essentiels à la fonction musculaire : la JNM est l'endroit où les impulsions nerveuses déclenchent la contraction musculaire, et la JMT est l'endroit où les fibres musculaires se connectent aux tendons, dissipant ainsi la force de contraction. L'accumulation de preuves commence à suggérer que la dystrophine pourrait être plus importante dans certaines zones musculaires que d'autres. Par exemple, des études récentes sur l'expression génétique ont révélé que le gène responsable de la pathologie est plus fortement exprimé dans la JMT. De plus, une étude de thérapie génique à faible dose a suggéré que la restauration de ce gène dans la JMT pourrait être suffisante. En outre, des perturbations de la JMT et de la JNM ont été signalées chez les souris mutantes pour ce gène avant le début de la nécrose. Compte tenu de ces observations, il devient de plus en plus essentiel de comprendre les contributions fonctionnelles de la dystrophine dans les différents domaines musculaires. Cependant, cette question est difficile à étudier avec les constructions génétiques conventionnels chez la souris car ils n'ont pas de spécificité spatiale. Nous avons donc développé de nouvelles constructions génétiques permettant de manipuler uniquement les noyaux de la JNM ou de la JMT. L'objectif de notre projet est maintenant de répondre à cette question en utilisant notre approche unique. De plus cette nouvelle approche pourrait donner lieu à une thérapie génique plus ciblée et donc potentiellement avec moins d’effets secondaires.

Bénéfices attendus

La réponse à la question de notre projet de recherche devrait avoir un impact significatif sur la façon dont nous comprenons la DMD et sur l'élaboration de meilleures stratégies thérapeutiques. Cependant, les outils précédemment disponibles dans le domaine musculaire ne peuvent pas être utilisés car ils n'ont pas de précision spatiale à l'intérieur des cellules musculaires. En revanche, les outils que nous avons développés permettent de manipuler la dystrophine uniquement dans des zones précises de la cellule musculaire et donc d’aller plus loin dans la compréhension du fonctionnement de la pathologie et de sa prise en charge.

Procédures

1. Injection intramusculaire d’AAV (Virus Adéno Associé) sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les jeunes adultes de 6 semaines, injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours et injection d’AAV dans le sinus retro-orbitale sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les animaux âgés de 17 mois. 2. Prélèvement de sang au sinus retro-orbital sera immédiatement suivi de la mesure de la force contractile sous la même anesthésie générale (sans réveil). Le prélèvement ne durera qu’une minute. 3. Mesure de la force contractile in situ (sans réveil) : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation et les souris encore sous anesthésie seront mises à mort.

Impact sur les animaux

La souris que nous utiliserons dans ce projet est un modèle animal largement utilisé pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. En tant que telles, ces souris sont atteintes de dystrophie, elles présentent un phénotype de faiblesse de sévérité légère musculaire à partir de l’âge de 4 mois, qui n’est pas encore visible d’un point de vue physique ou comportemental, puis une fibrose et des faiblesses évidentes au niveau des muscles du diaphragme et du cœur de sévérité modérée aux alentours de 17 à 22 mois pouvant entraîner des difficultés pour se déplacer et donc se nourrir et s’abreuver. Bien que nous générions de nouvelles lignées en croisant les souris atteintes de DMD avec d’autres lignées, ces autres lignées elles-mêmes n'ont pas de phénotype. Par conséquent, le phénotype des nouvelles lignées est équivalent à celui des souris atteintes de DMD. Nous espérons supprimer ou atténuer les symptômes chez ces souris mutantes injectées avec notre AAV (Virus Adéno-Associé), en restaurant la présence d’une protéine dystrophine courte et donc passer d’une sévérité modérée à une sévérité légère pour les animaux âgés et de légère à pas de phénotype visible pour les jeunes animaux et les adultes de moins de 4 mois. Les jeunes animaux qui seront injectés avec des AAV ayant pour but de muter la dystrophine devraient voir apparaître un phénotype semblable aux souris présentant la DMD et donc passer de «pas de phénotype » à un phénotype de sévérité légère. Nous utiliserons également différentes techniques d'injection à différents âges : l’injection intraveineuse dans le sinus retro-orbital, l’injection intra-musculaires, le prélèvement de sang dans le sinus retro-orbital. L’injection intraveineuse et le prélèvement de sang ne seront réalisés qu’une seule fois par animal sous anesthésie. Il s’agit de techniques fiables qui n’induisent pas d’effets indésirables. L’injection intramusculaire qui sera aussi réalisée sous anesthésie provoque une douleur musculaire passagère due à l’introduction de l’aiguille qui endommage les fibres musculaires. Les animaux seront aussi soumis à la mesure de la force de contraction musculaire sous anesthésie finale.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de différencier les cellules musculaires in vitro, ces cellules ne contiennent pas de domaines musculaires (JNM et JMT) et sont toujours immatures. Par conséquent, de nombreux aspects de la DMD ne peuvent pas être modélisés en culture cellulaire. De plus, notre projet vise à étudier l'impact thérapeutique sur la physiologie animale complète qui implique de multiples types de cellules et de tissus. L'expérimentation animale est donc essentielle à la réalisation de notre projet.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous choisirons un point temporel par condition expérimentale. Grâce à des recherches antérieures approfondies dans le domaine de la DMD, ces points expérimentaux sont déjà bien établis, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux. L’utilisation d’AAV nous permet de produire moins d’animaux pour obtenir nos animaux d’expériences. Nous avons déterminé que 7 animaux par groupe de traitement seront nécessaires afin d'obtenir une robustesse statistique. Nous n'utiliserons que des souris mâles car le gène responsable de la pathologie est localisé sur le chromosome X et les patients atteints sont principalement des hommes. Nous utiliserons également des contrôles internes pour réduire le nombre d'animaux. Pour l'injection intramusculaire, le muscle controlatéral sera injecté avec un virus vide pour servir de contrôle négatif. Pour l'injection intrapéritonéale chez les nouveau-nés, des animaux sans génotype complet mais injectés avec le virus serviront de contrôle négatif. Ces considérations permettent d'éviter de mettre à mort des animaux supplémentaires pour obtenir des échantillons de contrôle.

Raffinement

Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre traité ou non, type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres traités ou non), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les injections, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les prélèvements sanguins et la mesure de la force musculaire in situ seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter et les animaux seront mis à mort avant leur réveil.

Choix des espèces

Les outils génétiques que nous avons construits sont créés chez la souris car les modifications génétiques utilisées sont mieux établies dans ce modèle. De plus, la souris mutante que nous utiliserons est un modèle de DMD déjà existant et bien connu. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. En fonction de l'objectif des expériences, nous devrons modifier le temps d'injection. Pour obtenir une promesse de thérapie rapide et simple, l'injection intramusculaire sur un jeune animal (6 semaines) est appropriée. Pour obtenir un effet de « sauvetage » (réexpression de la protéine active) et prévenir la maladie, une injection intrapéritonéale précoce sur un nouveau-né est appropriée. Enfin, pour pouvoir guérir une maladie déjà existante ou tardive, l'injection dans le sinus retro-orbital sur un animal âgé (17 mois) est appropriée. Notre projet couvre ces trois scénarios pathologiques. Nous attendrons l’apparition des phénotypes dommageables qui devraient survenir à partir de l’âge de 4 mois pour réaliser le dosage de la créatine kinase sérique, la mesure de la force contractile et collecter les tissus pour les analyses histologiques. Les animaux seront donc testés et mis à mort à l’âge de 6 mois sauf pour l’injection dans le sinus retro-orbital sur animaux âgés qui seront mis à mort à 22 mois.

Des femelles gestantes reçoivent un complément alimentaire jusqu'au dix-neuvième jour de gestation, puis sont tuées pour une césarienne. Les nouveau-nés sont confiés à des femelles adoptantes dont la portée est tuée aussitôt le remplacement fait, et les adoptantes le sont à leur tour après le sevrage. La descendance reçoit deux injections d'allergène à vingt-huit et trente-huit jours, puis un gavage à quarante-cinq jours qui déclenche la réaction allergique, chute de température, irritation de la bouche et des oreilles, isolement, avant d'être tuée à son tour. 193 souris vont être utilisées au total, 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et aucun des trois groupes ne sort vivant du protocole.

Objectifs

La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.

Procédures

L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendants au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur la descendance. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.

Devenir

Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes seront mises à mort après le sexage et la fin du sevrage. La descendance seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.

Remplacement

Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.

Réduction

Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendants) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.

Choix des espèces

Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles et femelles seront séparés, afin de poursuivre le protococole.