Recherche fondamentale

Ovariectomisées puis pourvues d'un implant sous-cutané d'œstradiol, 256 souris femelles reçoivent pendant douze semaines une alimentation riche en graisses et en fructose associée à un mélange de phtalates. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leurs micro-vaisseaux cérébraux. La treizième semaine, elles reçoivent une injection de progestérone, parfois une injection intrapéritonéale de colorant, puis sont mises à mort dix minutes ou trois heures après. Le porteur qualifie les effets du régime de "très limités voire inexistants", tout en listant la douleur post-chirurgicale, les irritations et infections de sutures et une prise de poids qui nuirait à la mobilité.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet d’une co-exposition à un régime alimentaire riche en graisses et en fructose, mimant une alimentation déséquilibrée à l’origine de désordres métaboliques (régime obésogène et diabétogène), associée à l’exposition chronique à des doses environnementales de phtalates, composés chimiques utilisés comme plastifiants et reconnus comme perturbateurs endocriniens susceptibles de modifier le fonctionnement du système hormonal, sur les micro-vaisseaux cérébraux chez la souris femelle adulte : intégrité de la paroi des capillaires cérébraux, inflammation du tissu cérébral et dégénérescence neuronale. Ce travail permettra d’évaluer les effets sur les micro-vaisseaux cérébraux des inter-relations possibles entre alimentation obésogène-diabétogène, et contamination chimique environnementale par les perturbateurs endocriniens de type phtalates, qui pourraient être une des causes d’une altération de la santé reproductive chez la femelle.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans le contexte de la transition alimentaire, des changements des comportements de consommation et de l'exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens. Le projet analyse les altérations générées sur la fonction cérébrovasculaire et les positionne dans une perspective intégrative, permettant de progresser sur la notion de vulnérabilité des populations sensibles. A terme, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental pourront participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ce projet servira de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs.

Procédures

Les animaux sont exposées pendant 12 semaines à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre ou contôle, associé ou non à un mélange de phtalates mimant l’exposition environementale à des phtalates, composés chimiques perturbateurs endocriniens largement utilisés comme plastifiants, entre autres, dans les contenants alimentaires. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. Pour cette étude, toutes les souris femelles doivent avoir le même statut homonal. Pour ce faire, après la semaine d'habituation à l'animalerie, les animaux subissent sous analgésie et anesthésie préalables, une ovariectomie (10 min) associée à une supplémentation en oestradiol à l'aide d'un implant sous-cutané (3 min). Une semaine après rétablissement, les souris sont exposées au régime alimentaire pendant 12 semaines. Au début de la 13ème semaine, les souris vigiles reçoivent une supplémentation en progesterone par injection sous-cutanée (2 min), 4 à 5 heures avant leur euthanasie. Enfin, toujours à l’issue de ces 12 semaines et après l'injection de progesterone, une partie des animaux à l’état vigile reçoivent en plus une injection unique par voie intrapéritonéale (durée 1 min) d'une solution de colorant puis sont euthanasiés 10 min ou 3 h après. Tous les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables liés au régime alimentaire sont, à priori, très limités voire inexistants. Ce régime alimentaire décrit dans la littérature n'est pas connu pour causer des troubles digestifs et la surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les nuisances qui pourraient survenir sont celles liées 1) aux injections intra-péritonéale et sous-cutanée : inconfort passager dû à la manipulation et à la contention et douleur légère passagère au point d’injection ; 2) à l’ovariectomie et à la pose d’implant sous-cutané : douleur post-chirurgicale, problèmes liés aux sutures (irritations, infection); 3) une prise de poids qui nuirait à la mobilité; 4) effets indésirables de l'anesthésie inhérents à toute chirurgie et risques/contraintes opératoires (hypothermie, réveil/arrêt cardiorespiratoire (peu probable).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour effectuer les analyses post-mortem à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire dans les régions cérébrales concernées par l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène associé à une exposition à des doses environementales de phtalates.

Remplacement

La modélisation ou les études in vitro (lignées cellulaires, co-cultures, organoïdes, …) ou sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène (mimant le régime alimentaire occidental actuel) associé à l’exposition aux perturbateurs endocriniens environementaux, sur les micro-vaisseaux du cerveau et leur environnement. Les modèles in vitro de micro-vaisseaux cérébraux existant actuellement ne permettent pas encore ce type d’étude intégrée demandant de s’intéresser non seuleument aux vaisseaux cérébraux mais également à leur environnement, en lien avec les organes périphériques tels que les ovaires chez la femelles. Les invertébrés ne présentent pas de capillaires cérébraux de structure et de fonction semblables à ceux des mammifères. La modélisation nécessite des données cellulaires pour permettre d’apporter des informations sur le fonctionnement du cerveau et des micro-vaisseaux en particulier. De plus, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental doivent pouvoir participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ils serviront de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs. La souris est le modèle animal le plus approprié pour ce type d’étude physio-physiopathologique.

Réduction

Un total de 256 souris est nécessaire pour ce projet. Le dimensionnement des groupes expérimentaux pour chaque cohorte est déterminé au plus juste pour obtenir des données quantitatives permettant une analyse statistique robuste, recevable pour publication scientifique dans des journaux internationaux à comité de lecture, et en prenant en compte l’hétérogénéité inter-individuelle et les besoins et nécessités des protocoles expérimentaux, selon la règle des 3R. Ce projet est un projet de recherche original et ne bénéficie pas de résultats déjà existants sur lesquels s’appuyer. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été confirmé par un calcul de puissance et des tests statistiques pertinents seront faits pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles utilisés sont adaptés pour limiter le nombre d'animaux.

Raffinement

Les souris proviennent d’un fournisseur extérieur agréé, sont réparties par 5 maximum dans chaque cage pour éviter l’isolement et hébergées dans une pièce dédiée de notre animalerie dans des conditions contrôlées. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement afin de réduire le stress lors des expérimentations. Les cages sont en portoirs ventilés et contiennent de la sciure enrichies avec du nid végétal ; elles sont transparentes, placées les unes à côté des autres. Les animaux ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Aucune procédure expérimentale ne nécessite l’isolement d’animaux. La surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) par au moins une personne formée et compétente permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les données relatives à ces contrôles sont enregistrées et validées par la structure bien-être animal (SBEA) locale et des points limites définis pour permettre de repérer rapidement tout animal malade, blessé ou en souffrance (inconfort, stress, angoisse) et de prendre les mesures appropriées en interagissant avec la SBEA locale et le vétérinaire référent. Pour les actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et la douleur est prise en charge en pré- et post-opératoire par l’administration d’antalgiques. La surveillance post-opératoire est assurée 2 fois par jour pendant 3 jours lors de l’administration des antalgiques. Les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet également de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature et avec nos résultats précédents pour affiner nos hypothèses de travail. Le projet vise à étudier les effets d'une exposition à une alimentation déséquilibrée, associée à des perturbateurs endocriniens environementaux sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris femelle adulte: l'exposition au régime est donc faite chez l'adulte, il convient d'utiliser des animaux au stade adulte, âgés de 8 semaines au début du traitement. Les animaux sont commandés chez le fournisseur à l’âge 7 semaines pour éviter les effets du transport sur les derniers stades de maturation du système nerveux central. Les animaux sont acclimatés pendant 1 semaine dans notre animalerie (nouvel environnement).

Placées dès le sevrage, à trois semaines, sous régime hyperlipidique ou standard pendant douze semaines, 1 300 souris mâles et femelles enchaînent ensuite quatre tests comportementaux espacés d'au moins 48 heures. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'une heure, une partie des femelles une ovariectomie, et 52 d'entre elles un jeûne de cinq heures suivi de sept prélèvements sanguins en deux heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, le conditionnement de peur pouvant provoquer un stress aigu durant 24 heures et la chirurgie une perte de poids limitée à 13 %. Toutes finissent par une mesure de masse grasse de deux minutes, un dernier prélèvement de sang, puis la mise à mort pour récupérer les cerveaux.

Objectifs

Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabètes …), elle est également associée des déficits de mémoire. Ceci est d’autant plus problématique pendant l’enfance et l’adolescence qui représentent des périodes de maturation de certaines structures du cerveau indispensables pour la mémoire, comme l’hippocampe. Notre équipe a récemment mis en évidence chez la souris que la consommation d'une nourriture hyperlipidique (HL) pendant l'adolescence, en plus d'entrainer l’obésité, perturbe la mémoire et ceci implique un important système neuromodulateur, le système endocannabinoïde (SEC), au sein d’une structure particulière du cerveau (l'hippocampe). Nos études, tout comme la quasi-totalité des études de la littérature, ont utilisé des souris mâles comme modèle de l'obésité. Cependant chez l'humain, l'obésité affecte hommes et femmes de façon équivalente. Ainsi, pour élargir l'étendue de ces découvertes chez l'Homme, l’équipe s’est récemment intéressée aux deux sexes en incluant l'utilisation de souris femelles. Il a pu être démontrer que la nourriture HL consommée à l’adolescence a bien des effets délétères sur la mémoire des souris femelles, semblable à ceux observés ultérieurement chez les mâles. Bien que le SEC soit également impliqué chez la femelle, les types cellulaires et/ou les structures cérébrales mis en jeu semblent différentes de celles des mâles. L'objectif du présent projet est d'identifier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans les déficits de mémoire induit par la consommation d'un régime obésogène hyperlipidique à l’adolescence chez les deux sexes, afin de mieux considérer l'effet genre. Pour cela, des souris mâles et femelles seront exposées pendant 12 semaines à un régime hyperlipidique (HL) ou standard (Cont) avant de réaliser des tests comportementaux simples permettant d’évaluer la mémoire. L’ensemble des procédures proposées est en conformité avec les directives européennes 2010/63/UE et françaises, dans le respect des nouveaux standards de soin et de bien-être des animaux (règle des 3Rs).

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux. Chaque étape de ces tests dure entre 6 et 10 minutes. Une partie des animaux (52) subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une intervention chirurgicale. La chirurgie stéréotaxique, réalisée sous anestésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire, dure 1h avec une phase de réveil de 20 minutes. Une partie de femelles subira également une ovariectomie, réalisée sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Cette intervention dure 15 minutes avec une phase de réveil de 5 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme ceux utilisés dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. Les prélèvements de sang à la queue durant le test de tolérance au glucose (GTT) pourront engendrer une légère douleur aux animaux. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. La phase d'acquisition du conditionnement de peur pourrait induire une gêne passagère des animaux et entraîner un stress aigu qui pourrait se poursuivre pendant 24h, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur l’état général ou le poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses biochimiques ou des contrôles histologiques.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico. Les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements spontanées chez les rongeurs. Les chirurgies sont courtes mais nécessaires pour réaliser des manipulations chémogénétiques dans le cerveau et restent peu invasives dans la vie de l'animal. Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire les souffrances inutiles et réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables. Cela représente un total de 1300 (702 femelles et 598 mâles) sur 5 ans. Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Un soin particulier sera porté au bien-être de l'animal tout au long de sa vie. Les souris recevront de l’eau et de la nourriture à volonté et seront surveillées régulièrement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux (application d'un gel ophtalmique, opération sur tapis chauffant, ré-hydratation post-chirurgie). Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie, il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné par la prise d’un anti-inflammatoire pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront surveillés tous les jours de la semaine et pesés 1 fois par semaine par un personnel qualifié. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. L’expérimentateur prendra le plus grand soin en manipulant l’animal et les tests comportementaux seront le moins stressant (lieu calme, acclimaté et inoffensif) et les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de façon aigüe de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou contrôle dès le sevrage (3 semaines d’âge) et pendant 12 semaines afin de couvrir la période de l'adolescence. Les approches immunohistochimiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales.

Opérés un jour après leur naissance, au cours d'une chirurgie de quinze minutes, 240 ratons Wistar vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les seuls effets déclarés sont une fatigue et un ralentissement de la prise de poids pendant les 24 heures suivantes. L'objet du projet est de comparer le métabolisme énergétique du cerveau des nouveau-nés mâles et femelles, le porteur écrivant que les organoïdes et les modèles d'hypoxie cellulaire "s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier". L'effectif est présenté comme intégrant une marge pour les injections qui n'auraient pas fonctionné, sans chiffre associé, et les 240 ratons sont tués pour prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le cerveau, bien qu’il ne représente que 2 % de la masse corporelle d’un adulte, consomme à lui seul 25 % des besoins énergétiques totaux, une proportion qui atteint jusqu’à 40 % chez les enfants. Si le glucose demeure la principale source d’énergie pour le cerveau adulte, le rôle du lactate dans son métabolisme est également un sujet d'exploration. Une meilleure compréhension du métabolisme énergétique cérébral chez le nouveau-né, en prenant en compte les différences liées au sexe, pourrait permettre de définir de nouvelles pistes thérapeutiques dans un contexte de pathologies cérébrales pédriatiques caractérisées par un déficit énergétique.

Bénéfices attendus

Il est attendu de ce projet de combler une lacune dans le domaine de la neuroénergétique. Ce projet offrira une compréhension de la coopération cellulaire qui sous-tend les différences entre le cerveau des nouveau-nés masculins et féminins.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention. Un jour après la naissance, ils subiront une chirurgie d'une durée de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Fatigue et ralentissement de la prise de poids modérés pendant les 24h suivant le geste chirurgical.

Devenir

Mise à mort de tous les aniamux pour prélèvement du cerveau post-mortem (n=240).

Remplacement

Des modèles d’organoïdes ainsi que des modèles d’hypoxie cellulaires existent (OGD : oxygen glucose deprivation), cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative, prenant en compte, entre autres la dimension sexuée. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de comprendre le métabolisme cérébral en fonction du sexe il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Notre projet est construit avec un nombre d’animaux prenant en compte un nombre d’animaux pour lesquels les injections n’auraient pas fonctionné. Si les injections sont réussies à 100%, nous utiliserons moins d’animaux. Les différences inter-groupes seront mises en évidence par des tests statistiques.

Raffinement

Lors des chirurgies, avant anesthésie un antalgique sera administré. Le réveil des ratons et la récupération de la température corporelle s’effectueront dans un caisson ventilé. Les ratons seront surveillés plusieurs fois par jour pendant 3 j puis de manière hebdomadaire. La mise en place d’une grille de scorage et l’utilisation de points limites adaptés permettront la délivrance d’un antalgique si une douleur est constatée. La cicatrisation sera contrôlée ; en cas d’infection de la plaie un désinfectant et un antalgique seront administrés. Au niveau de l'hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un sizzle pad (lanière de papier kraft vierge).

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat Wistar. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences. Enfin, cette étude viendra complétée les investigations menées par nos collaborateurs.

Implantés d'un faisceau d'électrodes dans la cochlée au cours d'une chirurgie de 45 minutes, 24 rats Wistar sont ensuite reliés cinq heures par jour, cinq jours sur sept pendant un mois, à un émulateur d'implant cochléaire. Ils reçoivent par ailleurs de la rapamycine par voie orale ou de la chloroquine en intrapéritonéal, avec perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation et dysfonction hépatique parmi les effets attendus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués au bout d'un mois pour l'étude des tissus de l'oreille interne, l'objet étant de comprendre la fibrose qui dégrade le fonctionnement des implants chez l'être humain. L'isolement quotidien pendant les phases de stimulation figure parmi les nuisances déclarées, et une cage à rails coulissants est présentée comme permettant à l'animal de se mouvoir "sans contraintes".

Objectifs

L'implant cochléaire est un dispositif médical permettant en cas de surdité de stimuler électriquement les fibres nerveuses du nerf auditif. Les sons sont convertis en impulsions électriques avec un processeur de son, puis transmis à la partie implantée qui délivre le courant dans la cochlée. Chez le rongeur, un implant cochléaire ne pouvant pas être implanté en raison de sa taille, il peut être émulé par un dispositif externe. Dans des études préliminaires, nous avons démontré que le produit TIPH-1 permet de réduire la fibrose après implantation cochléaire et stimulation électrique de la cochlée avec un émulateur d'implant cochléaire. Le mécanisme d'action de TIPH-1 dans la réduction de la fibrose semble être lié à une modulation de l'autophagie. Afin de confirmer cette hypothèse nous allons moduler l'autophagie in vivo par l'administration de rapamycine et de chloroquine sur un modèle d'implantation cochléaire murin (rat) développé dans le laboratoire. Le volume de la fibrose cochléaire sera évaluée 1 mois après l'implantation.

Bénéfices attendus

A l'issue de ce projet, la connaissance des mécanismes responsables de la fibrose après implantation cochléaire permettra de développer des stratégies thérapeutiques pour limiter ce phénomène chez l'Homme et pour lequel il n'existe aucun traitement efficace à l'heure actuelle. Cette fibrose dégrade le fonctionnement de l'implant cochléaire et limite leur utilisation à des personnes présentant une surdité déjà avancée, car la fibrose contribue à la perte de l'audition naturelle chez la personne implantée.

Procédures

Les animaux auront tous une intervention chirurgicale de mise en place d'implant cochléaire sous anesthésie générale (durée 45 minutes) suivie d'une prise en charge de la douleur et du risque d'infection. Les animaux implantés recevront pour la moitié d'entre eux un traitement oral par rapamycine, et pour l'autre moitié des injections intrapéritonéales de chloroquine. Suite à la chirurgie les animaux auront une stimulation électrique de l'audition par implant cochléaire 5 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 1 mois dans une cage adaptée pour ne pas les gêner dans leurs déplacements et autres activités.

Impact sur les animaux

Les procédures suivantes vont être réalisées: /implantation cochléaire: nuisances attendues : stress, douleurs au site opératoire, vertiges, infection du site opératoire /stimulation électrique avec l'implant cochléaire : nuisances attendues: isolement pendant la phase de stimulation (5h/j, 5 jours/7) /administration orale de rapamycine : nuisances attendues : perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation, réduction de l'activité motrice, sensibilité accrue aux infections / administration intrapéritonéale de choloroquine : douleur passagère au point d'injection, perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation, réduction de l'activité motrice, sensibilité accrue aux infections, dysfonction hépatique.

Devenir

A l'issue de la période d'un mois de stimulation électrique, les animaux seront euthanasiés pour réaliser une étude des tissus de l'oreille interne.

Remplacement

Il n'est pas possible à ce jour d'étudier in vitro le développement de la fibrose cochléaire après implantation et stimulation électrique. Il n'existe pas de modèle de remplacement pour mener à bien cette étude. Il n'existe pas de méthode d'imagerie non invasive permettant d'évaluer précisément la fibrose cochléaire. Néanmoins, les études in vivo feront suite à la validation in vitro des cibles mécanistiques et tous les efforts ont été portés sur les points concernant la réduction et le raffinement pour limiter l'usage d'animaux vivants.

Réduction

Afin de limiter au maximum le recours aux animaux vivants, nous avons procédé à l'utilisation du logiciel G power pour calculer le nombre nécessaire et suffisant d’animaux sur la base des résultats obtenus dans des expérimentations antérieures. Sur la base d'un test ANOVA , il est nécessaire d'analyser 10 animaux dans chaque groupe pour obtenir des résultats avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%. Sachant qu'il n'y aura que 2 groupes experimentaux il faudra donc analyser les os temporaux de 20 animaux. Dans notre expérience, la stimulation électrique prolongée 1 mois peut entraîner un descellement du connecteur de stimulation et rendre la stimulation électrique impossible. Nous avons estimé à 20% de nombre de rats supplémentaires à opérer pour anticiper ce problème. Cela porte le nombre total d'animaux à 24 au maximum. Les 4 animaux supplémentaires ne seront utilisés qu'en cas de problème technique en cours d'expérimentation.

Raffinement

Afin de pouvoir réduire le recours aux animaux vivants, les techniques utilisées dans ce projet ont été adaptées. La technique d'implantation cochléaire est utilisée en routine chez le rat dans le laboratoire. Les nuisances liées à l’implantation cochléaire seront limitées par la réalisation du geste sous anesthésie générale, suivie d’un traitement antalgique poursuivi après le geste et une antibioprophylaxie. En période post-opératoire immédiate, les animaux seront surveillés en cage individuelle jusqu'à reprise des activités normale. Les nuisances liées à la stimulation électrique sont davantage liées à la connexion de l’animal à l’émulateur qu’à la stimulation électrique elle-même. Le niveau de stimulation électrique est adapté à partir d'enregistrements électrophysiologiques réalisés à travers l'implant de sorte à ce que l'intensité des sons perçus par l'animal via l'implant soit identique à celle des sons perçus naturellement. La stimulation électrique par implant cochléaire nécessite de connecter un plot électrique à un système de câbles. Afin que ce système n'entrave pas les déplacements et l'activité des animaux, une cage spécifique a été développée pour permettre à l'animal de se mouvoir, s'alimenter et se reposer sans contraintes. Les câbles électriques sont attachés sur un système de rails coulissants au couvercle de la cage qui se déplacent avec l'animal sans tension. En dehors des périodes de stimulation électrique, les animaux seront stabulés par groupes de 2 à 3 animaux dans des cages avec enrichissement, et avec nourriture et boisson ad libitum. Les nuisances possibles liées à la chloroquine et à la rapamycine seront limitées grâce à l’antibioprophylaxie donnée pendant la chirurgie, la surveillance quotidienne des animaux avec pesée, et si besoin réhydratation et alimentation adaptée par gavage.

Choix des espèces

Le rat de souche Wistar offre le compromis le plus intéressant entre la faisabilité d’une implantation chirurgicale d’un faiseau d'électrodes dans la cochlée, et la possibilité d’utiliser les outils classiques de biologie moléculaire et cellulaire. D'autres modèles murins tels que la souris ne permettent pas de positionner le plot de connexion de manière suffisament stable pour pouvoir conserver l'animal pendant la durée de l'experience. La souche Wistar est préférée aux autres souches car 1/ les travaux antérieurs ont été effectués sur cette souche, et la comparaison ne serait pas possible en choissisant une autre souche, 2/ la plupart des kits de biologie moléculaire ont été conçus sur des séquences génomiques de cette souche. Ce modèle offre en outre la transférabilité de nos données in vitro, acquises sur macrophages de rat, vers in modèle in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Des jeunes adultes (environ 250 grammes) seront utilisés. La résistance à l’anesthésie et la taille des animaux rend plus facile l’implantation des animaux, et limitera donc des pertes inutiles.

Six macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à la fin du projet pour une étude post-mortem du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation pouvant durer six heures, des injections répétées de neurotoxine sur quatre mois qui les rendent parkinsoniens, un isolement de 72 heures après chaque injection, une tâche de vigilance de deux heures trois jours par semaine et des tests de latence d'endormissement de trois heures répétés au moins dix fois par condition. Un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place pour maintenir leur motivation. La luminothérapie ayant déjà été publiée chez la souris et le rat, avec des essais cliniques en cours, le porteur affirme qu'une étude chez le primate non humain reste "nécessaire" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude dans le temps et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

Une injection d'ARN interférents dans le ganglion trigéminal provoque une douleur modérée, puis des filaments fins sont appliqués sur la face et un jet d'air envoyé toutes les trente minutes pendant quatre heures. 150 rats mâles et femelles vont être utilisés, tous tués pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si moduler l'activité des cellules satellites gliales perturbe la transmission de la douleur, avec une comparaison entre les sexes. La description des procédures se limite à la mesure de sensibilité cutanée, sans préciser la durée de l'injection intra-ganglionnaire ni les modalités du modèle de migraine que la rubrique réduction mentionne.

Objectifs

L'objectif de cette étude est de moduler l'activité des cellules satellites gliales du ganglion trigéminal à l'aide d'ARN interférents (siRNA) pour observer l'impact sur les mécanismes de la douleur chez les rats. Les cellules gliales jouent un rôle clé dans la réponse à la douleur en produisant des médiateurs inflammatoires qui amplifient la douleur. En ciblant ces cellules par siRNA, l'étude cherche à déterminer si la modulation de leur activité perturbe la transmission de la douleur, ce qui pourrait améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la douleur. L'étude inclura aussi des comparaisons entre rats mâles et femelles pour explorer les différences liées au sexe dans la réponse à la douleur, en tenant compte des influences hormonales et génétiques sur l'intervention gliale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre comment la douleur se transmet en modifiant l'activité de cellules spécifiques, les cellules satellites gliales, qui jouent un rôle clé dans la douleur, notamment dans des pathologies comme la migraine. En ciblant ces cellules, nous espérons découvrir de nouvelles cibles pour des traitements plus efficaces, notamment contre les douleurs chroniques. Nous comparerons aussi les réponses à la douleur entre les rats mâles et femelles pour voir si le sexe influence la douleur, ce qui pourrait mener à des traitements plus personnalisés. En résumé, ce projet pourrait améliorer les traitements de la douleur en les adaptant mieux à chaque patient.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée : le jour de l'injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en intra-ganglionnaire (chaque application dure 3 secondes).

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle par injection de siRNA qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une période d’adaptation suite à la livraison suivie d'une période d’habituation. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien-être des animaux au quotidien suite aux injections. Enfin, les stimulations mécaniques ou les jets d’air induisent un retrait de la face/patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation et seront mis à mort.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est fixé à un maximum de 10 pour assurer une étude fiable, en tenant compte des étapes clés comme l’habituation, les injections, les observations comportementales, les prélèvements et la préparation des échantillons. Les études comportementales étant un facteur limitant, nous prévoyons suffisamment d'animaux pour garantir des résultats solides pour ce modèle de migraine. Enfin, pour prendre en compte les différences entre mâles et femelles dues aux hormones, l’étude inclura les deux sexes.

Raffinement

Avant les études comportementales, les animaux sont placés dans des cages enrichies (tunnels et contacts sociaux) pendant une semaine, puis habitués au nouvel environnement pendant 4 jours pour réduire leur stress. Avant les injections, les rats sont anesthésiés, vérifié par l'absence de réflexe de retrait. La douleur est la principale nuisance identifiée, et pour les stimulations mécaniques, nous suivons les recommandations internationales pour limiter leur durée et intensité.

Choix des espèces

Le rat est couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature.

5 652 souris et 1 296 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères subissent des injections et des gavages à l'état vigile, une césarienne sous anesthésie, une perfusion de deux heures et une traite de quinze à trente minutes, tandis qu'une partie de la descendance reçoit un produit chimique déclenchant une colite pendant deux cycles de six jours. Les régimes imposés aux mères simulent un retard de croissance intra-utérin ou un diabète gestationnel, pour observer les conséquences sur l'immunité intestinale des petits, tués à trois ou cinq semaines. Aucun modèle cellulaire in vitro ne pourrait reproduire l'intégralité de ces interactions, affirme le porteur, qui annonce par ailleurs recourir à des organoïdes intestinaux pour l'analyse fine des mécanismes.

Objectifs

La période périnatale (gestation et allaitement) est une période déterminante pour le développement de l'immunité chez le bébé. Certaines complications pendant la grossesse, comme un retard de croissance du bébé dans l'utérus ou le diabète gestationnel, augmentent le risque que l'enfant développe plus tard des maladies inflammatoires chroniques. Et nous manquons encore de données scientifiques pour comprendre précisément comment ces problèmes perturbent l’immunité du bébé et comment cela perdure dans le temps. Nous utilisons différents régimes alimentaires sur des modèles de rongeurs pour simuler ces complications de la grossesse et étudier leur impact sur le développement de l’immunité du bébé et si cela augmente le risque de maladies chroniques intestinales à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer notre hypothèse quant au problème de transfert de l’immunité de la mère à son bébé lors de complications de la grossesse. Notre projet permettra d’identifier les acteurs et les mécanismes mis en jeu, responsables du problème initial et à l’âge adulte. Il permettra de trouver le ou les nutriments manquants pour restaurer les défauts. Le projet devrait ainsi fournir des bases scientifiques pour de futurs essais cliniques afin d’améliorer la santé de la maman et de son bébé, réduisant l'impact des maladies inflammatoires chroniques chez le futur adulte en vue de l'amélioration de la santé de toute la population.

Procédures

Nos deux premiers groupes d'animaux recevront 2 à 3 injections à l'état vigile, et notre troisième groupe, à l'état vigile, recevra 4 administrations par voie orale. Chacun de ces actes sera d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute. Le prélèvement de lait réalisé sous anesthésie durera entre 15 et 30minutes. L'étude des flux de nutriments nécessite de réaliser une perfusion sur animal anesthésié d'une durée de 2h. Les animaux subiront un seul acte chirurgical, une césarienne, effectué sous anesthésie et analgésie, la durée de cet acte est de 10 à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Pour nos trois procédures expérimentales, les préhensions, injections ou administrations par voie orale sur les animaux vigiles devraient constituer un stress et une douleur de faible intensité et d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute, il s'agit d'actes expérimentaux de sévérité légère. Néanmoins, la réalisation consécutive de plusieurs actes expérimentaux incluant nos manipulations à l'état vigil, cités précédemment, avec des actes sur animaux anesthésiés et sous anti-douleur, requalifie nos procédures 1 et 2 en procédures de sévérité modérée. Notre procédure 3 constitue une procédure de sévérité modérée. En effet, l’administration du produit induisant la colite, a un impact modéré au dosage administré au vu des tests déjà effectués au sein de notre animalerie. Cet acte expérimental devrait occasionner une inflammation de grade modéré au niveau du côlon distal durant les deux cycles de 6 jours de traitement. Celle-ci peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt de l’administration du produit (remplacé par de l’eau de boisson seule) entraîne l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Pour toutes nos procédures, l’habituation à la préhension et l’administration par voie orale par des techniciens expérimentés, et l’utilisation de sondes souples, réduira les nuisances à leur niveau minimum. Les animaux auront une inflammation modérée du côlon, ou colite, qui durera 6 jours sur deux périodes espacées d'une période de 14 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 6 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et un retour à la normale dès 4 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe.

Remplacement

Notre étude implique de suivre l’évolution physiopathologique de la transmission de l’immunité de la mère à sa descendance en situation de complications de la gestation tels que le retard de croissance intra-utérin ou le diabète gestationnel, et d’analyser les conséquences sur la santé intestinale de l’adulte en devenir. L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact au long cours des complications de la gestation qui sont initiées in utero et qui nécessitent d’étudier l’interface mère-enfant. Par ailleurs, notre projet de recherche implique des interactions multi-systèmes complexes, tels que le microbiote intestinal, l’écosystème microbien le plus riche sur terre, et la muqueuse intestinale, qui met en jeu un système immunitaire très dense. Il n’existe pas de modèle cellulaire in vitro pouvant reproduire l’intégralité de ces interactions. Néanmoins, nous envisageons d’utiliser, pour les analyses plus précises des mécanismes en jeu, des systèmes in vitro de culture cellulaire et des cultures d’organoïdes intestinaux.

Réduction

Ce projet de recherche sur cinq ans implique l'utilisation d'un total de 5652 souris et 1296 rats pour trois procédures distinctes. Le nombre d'animaux par procédure a été déterminé en tenant compte de la variabilité intra- et intergroupe inhérente à l'expérimentation in vivo, avec un minimum de trois répétitions indépendantes pour assurer la reproductibilité des résultats. Cette stratégie permettra une évaluation statistique robuste des effets des régimes alimentaires sur les réponses immunitaires placentaires et intestinales, ainsi que sur l'inflammation intestinale, en incluant des analyses statistiques guidées par des logiciels et des références bibliographiques d’aide à la décision statistique. Ces différents outils nous ont permis de déterminer le nombre optimal d’animaux par groupe pour obtenir des résultats significatifs permettant de répondre à nos hypothèses. Enfin, les schémas expérimentaux et le nombre d'animaux associés à chaque procédure ont été validés par les statisticiens de l'équipe pour garantir leur robustesse et leur efficacité dans la génération de données scientifiques fiables.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis, dôme). Après deux semaines d'acclimitation à leur environnement les femelles seront mises en reproduction. Une observation hebdomadaire avec suivi du poids des animaux sera réalisée dès leur arrivée dans l’animalerie de façon à identifier un éventuel problème. Les quatre gavages de la procédure 3 seront effectués par un personnel animalier expérimenté et ils seront réalisés en utilisant des sondes fines et souples. Lors de l’induction de l’inflammation intestinale (colite par traitement chimique), les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel animalier compétent pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique -pelage, posture-, activité, comportement, fréquence respiratoire). Si une douleur était constatée chez un animal durant le traitement induisant la colite, un analgésique de type central sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée en nutrition, est idéale pour les études sur les régimes obésogènes, les colites expérimentales et l'âge maternel avancé. Elle offre l'avantage d'être immunologiquement bien caractérisée et d'accéder à de nombreux modèles génétiquement modifiés dans ce fond génétique. La ratte est un modèle maîtrisé au laboratoire, est adaptée à l’étude du retard de croissance intra-utérin induit par un régime pauvre en protéines. Son système immunitaire, proche de celui de l’humain, renforce le potentiel translationnel des résultats. Ce modèle permet également d’évaluer, lors de transferts de microbiote, d’éventuels obstacles interespèces liés à des spécificités microbiennes d’hôte. Ces analyses anticipent la faisabilité du transfert de microbiote humain à murin et ajustent le choix du modèle axénique. De façon à étudier l’effet de l’âge maternel sur le transfert immunitaire de la mère à la descendance, les animaux (rattes et souris) commandés auprès de l’établissement éleveur, pour la première partie du protocole, seront âgés soit de 7 semaines soit de 24 semaines. Après une phase d’acclimatation de deux semaines, les animaux seront mis en reproduction. De façon à étudier l’effet de nos différents régimes sur le transfert d’immunité de la mère à la descendance, une partie des mères gestantes et des fœtus sera mise à mort au dernier tiers de la gestation. L’autre partie des animaux sera maintenue sous leurs régimes respectifs jusqu’au sevrage. Au sevrage, les mères seront traites pour récupération du lait puis mises à mort pour l’analyse de populations immunitaires intestinales. Les petits âgés de 3 semaines seront alors mis à mort pour l’analyse des marqueurs de maturation immunitaire intestinale ou seront placés sous régime contrôle. L’évolution de leur maturation immunitaire sera étudiée et les derniers groupes de descendants seront mis à mort à 5 semaines de vie. Pour la troisième partie du projet, les souris axéniques, sans germe, âgées de 3-4 semaines seront commandées auprès de l’établissement éleveur de façon à réaliser immédiatement à leur arrivée un transfert microbien en période de sevrage. Une partie des animaux sera mise à mort à l’âge de 8 semaines avant l’induction de la colite pour regarder l’état de maturation immunitaire puis à 4 temps différents au cours de la colite pour suivre l'évolution inflammatoire et mimer la pathologie humaine.