Recherche fondamentale

Deux sessions de douze heures pendant lesquelles l'animal s'injecte lui-même de la cocaïne, puis cinq sessions de deux heures : 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Chacun reçoit un cathéter intraveineux posé sous anesthésie, jusqu'à quinze pesées et quatorze injections, et 96 d'entre eux subissent une chirurgie crânienne sans réveil de deux à quatre heures. Le projet vise à raccourcir un protocole d'auto-administration déjà en usage, qui sera validé si plus de 90 pour cent des rats rechutent. Le porteur retient le rat parce qu'il s'auto-administre spontanément toutes les drogues consommées par les humains, ce que d'autres espèces font moins facilement.

Objectifs

L'addiction aux drogues est une maladie chronique qui a des conséquences importantes sur la santé, la société et l'économie. Un des problèmes principaux de l'addiction est le risque de rechute, même après une longue période d'arrêt. Ce risque est lié à des changements durables dans le cerveau causés par la drogue. Comprendre ces changements est essentiel pour développer de nouveaux traitements qui aident les personnes dépendantes à rester abstinentes. Pour étudier l'addiction et la rechute à la cocaïne, les chercheurs utilisent un modèle sur des rats où les animaux s'administrent eux-mêmes de la drogue pendant 10 sessions de 6 heures, avec une session par jour. Ce projet a pour but de modifier ce protocole pour rendre les expériences plus efficaces tout en réduisant l'exposition des rats à la drogue. L'idée est de remplacer les 10 sessions habituelles par une ou deux sessions plus longues (de 8 à 12 heures), suivies de 5 sessions plus courtes de 2 heures. Les chercheurs veulent voir si ces changements donnent les mêmes résultats que le protocole classique, en observant le comportement des rats et l'activité de leurs neurones. Ce projet s'inscrit parfaitement dans tous les axes de recherche de l'équipe en proposant un nouveau protocole d'auto-administration, qui est complémentaire des travaux actuels et permettra de mettre en place de façon plus efficace des projets pilotes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider ou non un nouveau protocole d’auto-administration de cocaïne chez le rat afin de proposer une optimisation des expériences au laboratoire (moins de sessions, sessions plus courtes). Ce protocole sera validé si plus de 90 pour cent des animaux rechutent (taux de rechute comparé aux résultats publiés) et si l’activité dopaminergique est diminuée significativement comparé aux animaux contrôle.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter intraveineux (durée : 15minutes par animal, 192 animaux) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 96 animaux). Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutanée d'antalgiques (192 animaux) - après la chirurgie, 2 injections sous cutanée d’antalgiques (192 animaux) - au maximum 15 pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 192 animaux) - 1 injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (14 injections , 192 rats) -au maximum 7 sessions d’auto-administration (2 sessions de 12 heures et 5 sessions de 2 heures, 1 session / jour, 192 animaux) - test de recherche de drogue (1 session / rat de 6 heures, 96 rats)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, douleur minimisée par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress -Isolement : stress modéré -L’acte de pesée, l'injection sous-cutanée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Cette recherche vise à comprendre les effets des drogues sur le comportement en utilisant des animaux vivants, car il est essentiel d'observer leur comportement dans des situations réelles. Cela ne peut pas être fait avec des cellules en laboratoire ou des modèles informatiques. En effet, pour étudier le comportement, il faut que les réseaux de neurones soient intacts et fonctionnent comme dans un cerveau vivant, ce qui n'est possible qu'avec des animaux entiers. Après vérification, aucune méthode alternative en laboratoire ou sur ordinateur ne permet de mener ce type d'étude, donc l'utilisation d'animaux est nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet est basé sur un calcul qui tient compte des variations dans les tests de comportement et d’activité cérébrale. Ce calcul permet de déterminer combien d'animaux par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables et détecter des différences significatives entre les groupes. Pour cette étude, nous nous appuyons sur des expériences précédentes et des analyses statistiques. Nous avons calculé que 24 animaux par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats solides. Comme il existe des différences entre les mâles et les femelles dans le phénomène de rechute, nous devons inclure des groupes des deux sexes. Toutefois, pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous commencerons avec 12 mâles et 12 femelles par groupe. Si les premiers résultats montrent des tendances à la différence, nous ajouterons 12 mâles et 12 femelles supplémentaires pour atteindre les 24 animaux par groupe. Au total, pour cette étude, un maximum de 192 rats pourrait être nécessaire. Si, après l'analyse des données de deux groupes d'animaux, aucune tendance n'est observée, l'étude sera arrêtée. À l'inverse, si un effet significatif est détecté avant d'atteindre un total de 24 animaux/lot, l'étude sera également interrompue. Par conséquent, le nombre d'animaux indiqué correspond à un maximum prévu et non à une valeur absolue.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité à chaque étape du projet. Nous surveillons régulièrement leur état de santé, y compris leur alimentation, leur apparence et leur comportement. Si un problème est détecté, des actions correctrices sont mise en place immédiatement, selon une grille d’évaluation précise. Nous utilisons un système de points limites qui nous permet d'intervenir rapidement si un animal montre des signes de souffrance. Si un animal atteint l'un de ces points limites, il est pris en charge sans délai. Les rats sont pesés chaque semaine pour suivre leur état de santé. Ils sont hébergés dans des conditions normales, avec une température et une humidité contrôlées, dans des cages ventilées. Des éléments pour ronger, comme des bâtonnets ou des morceaux de bois, sont fournis pour répondre à leur besoin naturel de ronger. Ils ont accès à de la nourriture et de l'eau en permanence. Avant de commencer les procédures, les rats s'acclimatent pendant au moins 7 jours à leur nouvel environnement. Pendant les chirurgies, les animaux sont sous anesthésie générale et locale, avec des médicaments contre la douleur et un tapis chauffant pour maintenir leur température. Le traitement contre la douleur se poursuit pendant 48 heures après la chirurgie, pour un total de 72 heures avant et après. De plus, les animaux sont habitués à la manipulation par l’expérimentateur deux fois avant la chirurgie pour réduire leur stress.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. En effet, les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Humain. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

Toutes tuées à l'issue pour que leurs tissus soient prélevés, 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui les fait cesser de prendre du poids vers dix semaines, développer une pathologie musculaire vers un an, puis une atteinte cardiaque qui les tue autour de quatorze mois, avec une survie médiane de 10,8 mois. À 5 et 10 mois, elles passent une semaine de tests comportementaux que le porteur qualifie d'inoffensifs sans les nommer, avant une chirurgie sans réveil. Sur le remplacement, il indique que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier des profils de comportement et affirme devoir passer par la souris, y compris pour accéder à des tissus inaccessibles chez l'humain.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones, entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. A ce jour, il n'existe pas de traitement contre la SLA car les mécanismes sont méconnus. La SLA touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. De manière intéressante, elle peut dans certains cas être associée à des troubles de type démence. Des travaux précèdent sur une cohorte de patients souffrant de cette forme de démense, avait permis d’identifier une mutation sur un gène . Un modèle murin a été créé et caractérisé. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, certains défauts dans la cellule s’avèrent essentiels et pourrait contribuer à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous émettons l'hypothèse qu’un type de désorganisation cellulaire déclenche des cascades dans le système nerveux central, contribuant à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous voulons ainsi tester l’inhibition de cette cascade sur la neurodégénération.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes moléculaires conduisant à la neurodégénérescence. Ils pourraient également permettre le développement de modèle pouvant être utilisés pour développer de nouveaux médicaments ciblant les mécanismes imlpliqués, pour permettre de prévenir ou freiner le développement des maladies neurologiques chez les patients. Dans cette optique, notre partenaire va tester sur des modèles cellulaires l'efficacité de l'Elamipretide (un médicament déjà utilisé dans des essais cliniques en phase précoce). A plus long terme, un essai préclinique dans notre modèle murin pourrait être développé. Ce projet présente également potentiellement des bénéfices clinique et sociétal : Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet financer par l'Agence Nationale de la Recherche et il se fait en collaboration avec des cliniciens. Ainsi les résultats obtenus ont le potentiel d'améliorer la prise en charge de plusieurs maladies rares en termes de diagnostic moléculaire et d'engagement des patients/public. En mettant l'accent sur les processus pathogènes dans les maladies mitochondriales reconnues et les maladies neurodégénératives, ce projet contribuera à la définition de cibles thérapeutiques. Actuellement, les traitements pour les maladies mitochondriales et les maladies neurodégénératives sont inefficaces et la prise en charge des patients a un coût important en termes de santé publique en raison de la gravité de l'invalidité présentée par ces patients. Les avantages économiques de cette recherche sont difficiles à évaluer à ce stade. Néanmoins, les bénéfices pour les patients en termes d'optimisation du diagnostic sont inestimables et les possibilités thérapeutiques potentielles permettront de réduire le coût des soins.

Procédures

Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux de 5 et 10 mois pendant 1 semaine. Aucune nuisance d’ordre général n’est attendue durant ses tests compte-tenu de leurs innocuités. Une étape d’habituation sera effectuée en amont pour limiter les perturbations dues à la manipulation. Une chirurgie sans réveil sera effectuée avant analyse de certains tissus.

Impact sur les animaux

L'étude de la lignée murine réalisée par nos collaborateurs indique qu’elles sont normales à la naissance mais à partir de 10 semaines commencent à moins prendre de poids. Vers l'âge d'un an, elles présentent une pathologie des muscles . Leur état s'aggrave rapidement avec une perte de poids importante et des tremblements, et elles développent une pathologie du coeur sévère, conduisant à la mort des animaux vers 14 mois. Cette étude indique également que le modèle présente une altération des capacités d'apprentissage et de mémoire dès 10 mois. L’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la pathologie cardiaque. Les signes cliniques apparaissent au stade terminal, débutant par une perte de poids importante. De même, l’apparition de symptômes tels qu’un affaiblissement partiel de l’extension des pattes ou des tremblements, combinée à l’incapacité de la souris à se retourner sur le flanc en moins de 15 secondes, indiquera une réduction significative de la mobilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car leurs tissus seront récoltés pour analyse.

Remplacement

La caractérisation du modèle a d’abord été réalisée avec des modèles cellulaires. Les expériences réalisées sur des fibroblastes issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans les atteintes mitochondriale et neurodégénérative. Cependant, pour l’étude de maladies neurodégénératives avec des composantes motrices et cognitives, les modelés cellulaires ne peuvent pas être utilisés pour disséquer les effets des variations moléculaires sur des profils de comportements. C’est pourquoi nous devons utiliser le modèle murin pour mieux comprendre la pathologie au cours du temps et pour tester si l’inactivation d’un processus moléculaire peut ralentir ou inverser les processus pathologiques permettant d’envisager des voies d’intérêt thérapeutiques dans l’avenir. L'utilisation de modèles murins, permet aussi d'accéder à des tissus auxquels on n'a pas accès chez l'homme.

Réduction

Avec l’aide des statisticiens de notre institut de recherche, les protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement ont été établis, réduisant au maximum le nombre d’animaux. Ainsi dans un but de réduction du nombre d’animaux à utiliser pour cette étude, des statistiques prédictives ont été réalisées dans le but d’utiliser le minimum d’animaux nécessaires et les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, vérifiée par les statisticiens.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux inclus dans le projet, axé sur leur état général de santé, est prévu. Il sera associé à l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée permettant un suivi optimal des animaux. Ce suivi quotidien permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de notre modèle murin étant associé à une perte de poids. En effet à partir de l'âge de 10 semaines, les souris malgré un apport calorique normal ne prennent plus de poids normalement. Les courbes de poids au cours des 5 dernières semaines de vie montrent qu’une perte rapide de poids peut être observée avant le stade final. De plus l'analyse de survie a révélé que les souris avaient une survie significativement réduite par rapport à leurs compagnons de cages non génétiquement modifiés, avec une survie médiane de 10.8 mois. Ainsi, dès 8 mois, en plus d’être pesés une fois par semaine, une surveillance accrue sera mise en place : la fréquence du suivi augmentera, de l'eau et de la nourriture gélifiées seront placées au sol dans la cage pour éviter des complications si les animaux éprouvent de l'inconfort ou des difficultés à atteindre la trémie alimentaire et la source d'eau. De plus si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié (avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc.). Enfin, lors de cette surveillance quotidienne, si la perte de poids dépasse un seuil par rapport à la pesée précédente, cela conduira à la mise à mort.

Choix des espèces

La caractérisation du modèle murin a permis de mieux comprendre comment la mutation étudiée (chez l'Homme) d'un gène codant pour une protéine mitochondriale est impliqué dans le dysfonctionnement mitochondrial. Cette caractérisation a en particulier permis de montrer que le modèle murin présente des déficits moteurs ou cognitifs qui sont liés à un déficit de traitement des signaux de communication chez la souris mesurée par des méthodes d’électrophysiologie L'analyse du phénotype neurodégénératif des souris pourra permettre d’étudier si l’invalidation de certains gènes permet une protection contre la neurodégénérescence. L'évolution du phénotype pourra également être étudiée au cours de la vie relativement courte de l'animal et seul le modèle murin permet cette étude comportementale. Nous avons identifié les stades de développement intéressant à étudier sur la base de résultats publiés précédemment. - stade précoce, apparition des premiers signes moléculaires = 5 mois de vie : dans ce modèle l’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la cardiomyopathie. Ce modèle ne présente aucun phénotype avant l’âge de 6 mois et le stade 5 mois correspond à l’apparition d’une atteinte mitochondriale au niveau moléculaire. - stade final précédant l'atteinte finale de la maladie = 10 mois de vie : à partir de l’âge de 6 mois les animaux commencent à perdre du poids et développent une cardiomyopathie mitochondriale fatale avant l’âge de 14 mois (survie médiane de 10.8 mois).

1 250 souris vont être utilisées, dont cinquante pour entraîner le geste chirurgical et quinze par donneur humain, avec des mises à mort échelonnées sur trois dates. Une partie est immunodéficiente, donc exposée aux infections et aux tumeurs, ce que le porteur nomme un phénotype dommageable. Chacune subit deux chirurgies de la moelle épinière à quarante-huit heures d'intervalle, l'une pour détruire la myéline, l'autre pour y greffer des cellules immunitaires humaines, puis des tests de traversée d'une barre crantée et de force des pattes avant. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour fabriquer le modèle animal de sclérose en plaques qui manque aujourd'hui.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central. Dans cette pathologie les macrophages et lymphocytes du sang pénètrent le cerveau et la moelle épinière et viennent détruire une composante essentielle du système nerveux : la myéline. On distingue différent type de lésions décrites chez les patients atteints de sclérose en plaques. Un type de lésion en particulier est associé à une maladie plus agressive. Mais, à l’heure actuelle, aucun modèle animal ne permet l’étude de ce genre de lésion. L’objectif de ce projet sera de développer un nouveau modèle animal de lésions chroniques actives afin d’étudier la formation et l’évolution de ces lésions que l’on observe chez les patients atteints de forme agressive de la maladie.

Bénéfices attendus

En France, plus de 130 000 personnes vivent avec la sclérose en plaques (SEP), une maladie qui touche 2,8 millions de personnes dans le monde. Elle est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans, mais peut aussi apparaître plus tôt ou plus tard. Chaque année, 5 000 nouveaux cas sont recensés en France. La SEP concerne principalement les femmes (trois malades sur quatre), mais leur progression vers le handicap est plus lente que chez les hommes, qui présentent un risque plus élevé de complications neurologiques. Il existe deux formes principales de la maladie : La forme rémittente (RR) : elle évolue par poussées, avec des symptômes qui apparaissent puis disparaissent. C'est la forme la plus fréquente et elle débute souvent entre 25 et 35 ans. Avec le temps, elle peut évoluer vers une forme plus sévère. La forme progressive (PP) : plus rare, elle se développe généralement après 40 ans et entraîne un handicap progressif, sans poussées distinctes. Les traitements actuels sont efficaces pour la forme rémittente, mais restent très limités pour la forme progressive, qui est la plus sévère. Certains types de lésions sont associés à cette forme aggressive de de la maladie, mais il manque aujourd’hui un modèle animal permettant de étudier en détail la formation et le développement de ce type de lésion. Notre recherche vise à mieux comprendre ces lésions et, à terme, à tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Une partie des animaux auront une seule procédure chirurgicale pour optimiser le geste chirurgical menant à une lésion de démyélinisation de la moelle épinière. Les animaux participeront à deux tests comportementaux afin d’évaluer leurs capacités motrices. Dans le premier test, l'animal est placé sur une barre crantée et on mesure la durée de la traversée de la barre et le nombre d'erreurs, l'animal étant libre de ces mouvements durant le test. Dans le deuxième test l'animal est placé sur une grille sur laquelle l'animal s'accroche ce qui nous permet de mesurer la force de ses pattes avant. Ces deux tests comportementaux durent respectivement 90 secondes et 60 secondes. Les animaux réaliseront 2 procédures chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée, à 48 heures d’intervalle, l’une pour la mise en place de la lésion de démyélinisation et la deuxième pour l’injection de cellules immunitaires humaines sur le site lésionnel. Chaque chirurgie durera 15 minutes. Une dernière procédure sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour évaluer les voies sensorielles de l’animal entre une zone stimulée et le cerveau (1 fois, 30 minutes maximum par animal). Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux utilisés dans le projet sont immunodéficients (phénotype dommageable) et seront donc susceptibles de contracter des infections et des tumeurs. Les tests comportementaux pourront générer un stress aux animaux dû au changement d’environnement et aux manipulations. Les procédures chirurgicales (lésion de démyélinisation, greffe de cellules humaines) génèreront une douleur et un inconfort post-opératoire, et pourront être associées à des complications inattendues telles qu’un saignement ou une infection. L’anesthésie générale nécessaire pour leur réalisation impliquera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de remyélinisation endogène et de démyélinisation chronique est d’utiliser un modèle animal bien établi du processus de démyélinisation/ remyélinisation développé il y a 20 ans que nous avons réadapté pour le rendre plus proche des conditions pathologiques des patients. En ce qui concerne la souche de souris immunodéficiente utilisées, la greffe de cellules humaines nous contraint à utiliser les souris les plus adaptée pour éviter le rejet de greffe. Pour étudier le processus de développement d’une lésion chronique l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. En effet des alternatives pour étudier la remyélinisation existe (comme l’utilisation de culture ex vivo de cervelet) mais celles-ci ne peuvent pas être utilisé dans notre cas car nous étudions l’évolution d’une lésion à long terme (3mois). De plus l’étude de tissus humain ne nous permet l’étude qu’à un temps donné des lésion chronique et non l’évolution. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux

Réduction

Pour l'optimisation du geste chirurgical, des souris seront utilisées. Nous avons défini qu’un maximum de 50 souris pourrons être utilisées sur les 5 années du projet afin de perfectionner la technique d’injection dans le cordon dorsal de la moelle épinière. De plus, nous allons étudier la mise en place d’une lésion chronique en greffant les lymphocytes de deux types de patients atteints de sclérose en plaque, nous aurons 2 groupes de patients avec 20 patients par groupe et 40 donneurs sains, soit 80 sujets au total. Pour chaque patient, nous injecterons 15 souris puis nous échelonnerons les euthanasies sur 3 temps différents nous permettant ainsi d’avoir au final 5 souris par temps d’euthanasie et par patient. Par expérience nous savons que cet effectif sera suffisant pour des tests statistiques fiables. Pour les analyses statistiques nous aurons donc pour chaque temps 400 souris au total, 100 pour le premier groupe de patient avec une forme modérée de la maladie , 100 pour le deuxième groupe de patient avec une forme aggressive de la maladie et enfin 200 pour le groupe de donneurs sains. Nous aurons donc besoin au total de 1250 souris au total.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (directive européenne 2010/63/UE) soit 22Cplus ou moins 2C pour la température et entre 45 et 65 pourcent d’hygrométrie avec un cycle jour,nuit progressif de 12h. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec carré de coton et bâton à ronger) et observés quotidiennement. Ils bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à leur arrivée. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans des cages à ventilation individuelles, des précautions lors de la manipulation sont prises comme manipulation sous hotte, changement de gant et nettoyage de l’endroit de manipulation entre chaque cage. Ils seront ensuite habitués à l’expérimentateur pendant 1 semaine avant le début des procédures pour réduire leur stress. Les animaux auront une période d’acclimatation aux pièces à raison de 30min à 1h avant chaque début des expériences comportementales, acclimatation également aux tests comportementaux à raison de 3 essais/tests/jours avant d’établir la performance basale de l’animal, pour diminuer le stress de l’animal. Entre chaque essais l’animal aura un temps de repos au minimum égal à son temps passé à faire le test. De plus les animaux seront manipulés de façon à diminuer le stress Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésiques adaptée. Une surveillance renforcée sera mise en place en période post-chirurgie pendant 2 jours et puis 2 fois par semaine après la première semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et afin d’adapter la prise en charge analgésique en fonction de l’observation de signes de douleurs une grille de score (mise au point avec la structure du bien être animal est utilisée pour définir la prise en charge de l’animal. En cas de signe de mauvaise santé (stress, blessure, comportements anormaux) un avis vétérinaire sera demandé, Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Notre projet nécessitant un acte chirugical d’injection dans la moelle épinière, nous prévoyons d’optimiser le geste chirurgical des personnes (étudiants ou ingénieurs) associés à ce projet sur des souris immunocompétentes avant de réaliser ce geste ainsi que les injections de cellules humaines aux souris immunodéficiences. Notre projet nécessitant des greffes de cellules immunitaires humaines, nous utiliserons des souris immunodéprimées. En effet, ces souris présentent un système immunitaire déficient, elles sont donc de bonnes candidates pour la greffe de cellules humaines car il n’y aura pas de rejet de greffe. Les souris sont utilisées car le modèle de démyélinisation a été bien décrite chez la souris et nous avons une grande expérience de ce modèle dans notre équipe. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 8 semaines afin d’avoir une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes).

Issus d'un croisement entre une femelle témoin et un mâle porteur d'une mutation du gène Magel2, 612 souriceaux naissent pour être testés puis tués au premier ou au deuxième jour de vie. Avec les 40 femelles allaitantes qui servent de support au test, 652 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souriceau est séparé de sa mère quatre heures, puis reçoit une injection d'ocytocine ou de véhicule avant un test de saisie de tétine de deux minutes. Leur mise à mort sert à prélever un fragment pour le génotypage, et les femelles sont tuées en fin de projet, à six ou huit mois, après trois ou quatre portées.

Objectifs

Ce projet porte sur la compréhension des déficits de tétée chez des souris modèles d’une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW) et le rôle d’une hormone, l’ocytocine, comme effet thérapeutique. En effet, il a été montré que l’ocytocine (OT) est impliquée dans l’initiation ou le maintien de l’activité de tétée, qu’il y a un dysfonctionnement de cette activité de tétée chez les souris déficiente en OT, aboutissant à une mortalité d’environ 50 % des souriceaux deux jours après la naissance (P2) pour les souriceaux qui n’arrivent pas à téter après 24 post-natal, mais une survie équivalente à des souriceaux contrôle pour les souriceaux qui ont réussi à initier une tétée dès la naissance (P0). Ces études ont également montré que l’administration d’OT à la naissance supprime la mortalité entre P0 et P2 en rétablissant l’activité de tétée chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques chez des bébés atteints du SPW qui ont montré une stimulation de l’activité de tétée par l’OT chez ces bébés. Les travaux précédents suggèrent également que chez la souris, l’effet de l’OT est différent entre la première tétée et les tétées suivantes. Dans la continuité de ces travaux l’objectif de ce projet est donc de caractériser précisément 1) les étapes de la succion qui sont altérées chez les souriceaux déficientes en OT et 2) l’effet d’une administration oro-nasale ou d’une injection sous cutanée d’OT juste après la naissance sur la survie et la restauration de la séquence comportementale de tétée chez ces souriceaux. Au total 652 animaux (612 souriceaux et les 40 femelles adultes) seront inclus dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les objectifs permettront d’identifier le rôle de l’ocytocine (OT) dans la tétée, d’argumenter l’intérêt d’utiliser l’OT dans le traitement de déficit de succion afin de définir les conditions optimales pour traiter les souris modèles du syndrome Prader-Willi chez l’homme (SPW). Cette étude aura des retombées sur le traitement des patients SPW.

Procédures

Souriceaux : 1 test de saisie de tétine sur femelles allaitantes (2 min) et/ou 1 injection d’ocytocine ou véhicule (

Impact sur les animaux

Les injections d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère nociceptif, malgré la durée très courte de cette intervention. Les injections d’ocytocine sur souriceaux à P0 et P2 peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère nociceptif, malgré la durée très courte de cette intervention. La séparation de 4h des souriceaux de leur mère avant le test de saisie de tétine peut engendrer un stress pour les souriceaux.

Devenir

L’ensemble des souriceaux produits et testés dans ce projet sont euthanasiés au 1er ou 2ième jour après la naissance, après avoir réalisé le test de saisie. Cela permettra de réaliser la biopsie post-mortem pour le génotypage. Ils ne peuvent pas être gardés dans les structures d’élevage de l’unité ou pour d’autres projets du fait qu’ils proviennent d’un croisement entre une femelle contrôle et un mâle mutant. Les 40 femelles allaitantes, support du test de saisie de tétine, seront euthanasiés en fin de projet du fait qu’elles auront entre 6 et 8 mois et qu’elles auront déjà donné 3-4 portées.

Remplacement

Nous travaillons sur la physiologie et la physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW). Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur des modèles humains dans un cadre thérapeutique et des spuris modèle, génétiquement modifiésmodèles en fonction des questions posées, afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients atteints de ces troubles précoces de la succion.

Réduction

L'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance ou à P2. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour ces tests, appuyée par des tests de Puissance montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe pour valider la démarche statistique. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée entre P0 et P2) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Le bien-être et la bonne santé des animaux adultes est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (absence de poils hirsutes, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (absence d’apathie, d’agressivité, de nidation, ou de déplacement sur la pointe des pattes). Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie seront isolés de leur mère pendant 4h avant le test (afin de standardiser leur motivation à téter). Pendant les temps de séparation de leur mère les souriceaux seront laissés dans leur nid, dans leur cage (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Lors des injections sur les souriceaux à P0 et P2 de la lidocaïne 5% (gel anesthésique local) sera appliquée sur la peau 5 minutes avant l’injection pour diminuer la sensation de douleur potentielle.

Choix des espèces

L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude nécessite d’évaluer des paramètres de comportement de tétée qui nécessitent d’étudier des mammifères et en particulier des modèles de maladies rares mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles d’animaux génétiquement modifiés. A ce jour, les rongeurs sont les animaux les plus adaptés à ce type d’étude. Nous étudions l’activité de succion des souriceaux le jour de la naissance (P0), après la première tétée afin d’étudier les déficits moteurs de la séquence comportementale des souriceaux mutant mis en évidence dans notre étude précédente. Nous les étudions également à P2 puisqu’il a été montré qu’à ce stade, ces animaux sont les plus discriminants et les plus sensibles au contexte sensoriel au cours de la tétée.

Pour comprendre le rôle des cellules qui tapissent les vaisseaux de la moelle osseuse dans la myélofibrose, 75 souris subissent des lésions provoquées de ces cellules, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur trente jours, chacune reçoit jusqu'à huit injections intraveineuses et subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sous anesthésie, avant un prélèvement terminal de 800 microlitres qui exclut tout réveil : elles sont tuées par dislocation cervicale. Le porteur attend une perte de poids, une baisse d'activité, un poil rude, des paupières en partie closes et une respiration accélérée. Il annonce des points limites spécifiques permettant de soustraire l'animal aux procédures, sans dire lesquels.

Objectifs

La moelle osseuse est le lieu de la production des cellules du sang, dont les plaquettes. La myélofibrose est une maladie de la moelle osseuse caractérisée par l'accumulation de tissu fibreux, avec de graves complications au niveau des vaisseaux et du sang. Au fur et à mesure que la myélofibrose progresse, la production de cellules sanguines est inefficace et le nombre de plaquettes circulantes est réduit pouvant induire des saignements. Les traitements actuels visent à soulager les symptômes, en dehors de la greffe de cellules souches visant à remplacer ces dernières. La myélofibrose peut survenir à la suite de mutations de gènes ou d'anomalies affectant la moelle. Les cellules de la surface des vaisseaux, en interagissant avec les cellules souches, jouent un rôle clé dans le soutien de l’environnement de la moelle. En fournissant des éléments essentiels, les cellules à la surface des vaisseaux régulent les cellules souches. Des études menées sur des patients atteints de myélofibrose ont révélé des perturbations majeures des vaisseaux dans la moelle osseuse, sans explication claire. Nous faisons l’hypothèse que les cellules de la surface des vaisseaux protègent la moelle du développement de la fibrose. Pour répondre à cette question, nous utiliserons un modèle de souris qui permet d'induire des lésions dans les cellules de la surface des vaisseaux, sans atteinte des cellules souches. Ce modèle donne la possibilité de décrypter le rôle des cellules de la surface des vaisseaux sur la fibrose de la moelle et le repeuplement progressif de la moelle. L'objectif à long terme est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les cellules de la surface des vaisseaux exercent une influence sur les cellules souches. Cela permettra d'identifier de nouvelles pistes de traitement pour freiner la progression de la myélofibrose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer le rôle des cellules de la surface des vaisseaux dans la protection de la moelle face au développement de la fibrose. Cela pourrait permettre d'identifier de nouvelles pistes de traitement pour freiner la progression de la myélofibrose.

Procédures

Les souris anesthésiées seront soumises à des prélèvements de sang (maximum 8 prélèvements sur 30 jours, 10 µL par prélèvement) et à des injections intraveineuses (maximum 8 sur 30 jours, 5 mL/kg au maximum). Les souris anesthésiées subiront un prélèvement de sang terminal (800 µL).

Impact sur les animaux

Pour le prélèvement de sang à la queue, les nuisances attendues sont un saignement de courte durée, une douleur localisée et un stress de l’animal. Pour l’injection du produit, on s’attend à une inflammation et une douleur localisée au point d’injection et un stress. De manière générale, les nuisances attendues sont une perte de poids, une réduction de l’activité, une apparence anormale (poil rude, paupières en partie closes) et une respiration accélérée.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale car le prélèvement de sang de grande quantité n’est pas compatible avec un réveil de l’animal.

Remplacement

Ce projet a pour but de décrypter le rôle des cellules de la surface des vaisseaux sur la fibrose de la moelle et le repeuplement progressif de la moelle par des cellules souches. Le processus étudié est un processus complexe et intégré qui relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, moelle osseuse, os, cellules souches, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet. De plus, il est extrêmement difficile de cultiver les cellules primaires endothéliales (isolement très délicat, rendement faible et culture longue), qui n’arborent pas les spécificités nécessaires à l’objectif poursuivi (morphologie, jonctions cellulaires, expression de récepteurs, source de molécules). Il n’est donc pas possible de remplacer l’animal par des techniques in vitro.

Réduction

Pour évaluer la fibrose de la moelle, on utilisera une coloration de coupes histologiques mettant en évidence le collagène, nous permettant de déterminer le pourcentage de fibrose. Nous comparerons alors la moyenne des souris témoins à celle des souris traitées. Selon les données de la littérature, on s’attend à ne voir aucune fibrose chez les témoins et en moyenne 25% de fibrose chez les souris traitées. Ces moyennes théoriques ainsi que l’écart type théorique permettent de réaliser le calcul du nombre de souris nécessaires par groupe.

Raffinement

Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la manipulation d’une durée de 5 jours est prévue et pourra démarrer 7 jours après l’arrivée des animaux dans notre animalerie. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront afin de ne pas laisser des animaux qui subiront des injections avec d’autres qui ne seront pas manipulés. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une analgésie de l’animal avant le prélèvement de sang terminal. Et par traitement antalgique en cas de signes de douleur • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local après les injections • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. La moelle osseuse de souris ainsi que la production des cellules du sang est largement maitrisée, en faisant un bon modèle pour l’étude du rôle des cellules de la surface des vaisseaux sur la fibrose de la moelle et son repeuplement progressif. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

188 souris BALB/c reçoivent chacune une injection unique de chimiothérapie, sous la peau du dos rasé ou dans la veine de la queue, sous anesthésie gazeuse. Le protocole consiste à monter les doses sur quatre paliers pour trouver la dose maximale tolérée, celle qui produit l'effet recherché juste avant les effets indésirables jugés inacceptables, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est saignée par ponction cardiaque après injection d'une dose létale de pentobarbital, la mort étant achevée par élongation cervicale, les autres tuées pour prélever les organes et la zone d'injection. Le porteur met en avant une administration sous-cutanée plus confortable pour le patient et bien moins coûteuse que les chimiothérapies actuelles.

Objectifs

L’administration de médicaments anticancéreux par voie sous-cutanée est actuellement limitée par leur faible solubilité, leur viscosité et leur toxicité au niveau du site d’injection (irritations voire nécroses cutanées). Nous proposons dans ce projet une nouvelle approche permettant d’administrer efficacement par voie sous-cutanée des chimiothérapies anticancéreuses déjà présentes sur le marché. Nous avons en effet développé une technologie innovante qui consiste à coupler un agent de chimiothérapie existant, la Vinblastine, à une succession de molécules pour le rendre soluble et injectable par voie sous-cutané. L’objectif de cette étude est d’étudier la toxicité et la distribution dans l'organisme de cette prodrogue de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC), comparativement à la Vinblastine seule, administrée en intraveineuse (IV). L’étude de toxicité a pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT, dose la plus élevée qui produira l’effet souhaité sans entrainer d’effets indésirables inacceptables) par voie SC de la prodrogue de Vinblastine, et de vérifier qu’elle n’induit pas de toxicité au niveau du site d’injection. L’étude de pharmacocinétique permettra de vérifier qu’il est possible d’avoir une exposition au principe actif comparable à la voie intraveineuse, et donc une efficacité thérapeutique similaire.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de démontrer l’innocuité de la prodrogue polymère de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC) et de comparer son profil pharmacocinétique à celui de la Vinblastine libre administrée en intraveineuse (IV). De tels résultats permettraient d’envisager la délivrance des principes actifs anticancéreux par voie sous-cutanée, qui seraient à la fois efficace, confortable pour le patient et bien moins couteuse dans son utilisation que les chimiothérapies actuelles.

Procédures

Chaque souris recevra une seule injection de la prodrogue polymère par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%) dans la région dorsale préalablement rasée ou de la Vinblastine libre en intraveineuse sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%). Cette intervention durera environ 10 minutes, anesthésie comprise. Certaines souris subiront également un prélèvement sanguin terminal effectué par ponction cardiaque après injection d’une dose léthale d'anesthésique de pentobarbital, un anesthésique puissant, et la mise à mort de l'animak sera confirmée par élongation cervicale. Cette intervention durera environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont attendues : - L'anesthésie par cage à induction qui pourrait entrainer un stress de l'animal avant endormissement. - Les injections de la vinblastine en intraveineuse dans la veine de la queue et de la prodrogue en sous-cutané, qui pourraient causer une gène ou une inflammation au niveau du site d'injection - Les pesées qui peuvent entrainer un stress chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de prélever les organes et la zone d'injection pour des études histologiques afin de vérifier l’absence de toxicité systémique et de toxicité locale aigue (procédure 1) ou pour effectuer des prélèvements sanguins terminaux (procédure 2).

Remplacement

Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisée ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang.

Réduction

Les études préliminaires in vitro ont permis le criblage de différentes formulations dont une seule sera testée in vivo, permettant ainsi une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans cette étude. Une planification statistique minutieuse permet aussi de réduire le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l’étude. La DMT de la prodrogue sera déterminée en testant des doses croissantes de prodrogue à partir de la dose équivalente à la DMT par voie IV de la molécule libre (connu dans la littérature) car la prodrogue polymère est censée avoir une DMT supérieure à celle de la molécule libre. Quatre doses seront testées au maximum, nous nous arrêterons avant si la DMT de la prodrogue est atteinte. Le dimensionnement des groupes a été déterminé par un test de puissance (erreur de 5% et puissance de 80%) qui permet de mettre en évidence une perte de poids de 10% avec une variabilité de 10% avec 4 animaux par groupe. La DMT du principe actif libre, bien décrite dans la littérature, ne sera testée qu’à deux doses maximum pour tenir compte de la variabilité inter-souche. Pour la pharmacocinétique de libération du principe actif, une seule dose sera testée pour déterminer quelle est la prodrogue qui permet une libération optimale du principe actif dans le sang. La prodrogue polymère et la molécule libre seront administrées à une dose équivalente permettant leur détection pendant 48 à 72 heures, afin de pouvoir comparer la cinétique de la molécule libre et de la prodrogue. Nous cherchons à mettre en évidence une augmentation du temps de présence de la molécule dans l'organisme. Le nombre d’animaux nécessaire (erreur 5%, puissance 90%) a été évalué à 4 animaux par groupe. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non-paramétrique.

Raffinement

Dans notre laboratoire, les animaux en provenance des centres d'élevage sont pris en charge dès leur arrivée (environ 8 jours avant le début de l'expérimentation), jusqu'à l'euthanasie. Le bien-être animal sera respecté : -Conditions d’hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d’un cycle jour/nuit inversé par période de 12 heures. -Temps d’acclimatation de 8 jours avant toute procédure -Souris hébergées en groupes (6 par cage) -Enrichissement des cages : dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques (Cell Nest) -Définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (difficultés respiratoires, prostration, atonie, défaut d’alimentation, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). La définition exacte des points limites se trouve dans une grille des scores de la douleur, qui évalue le bien-être animal sur chacun de ces points et décrit la conduite à tenir en fonction de l’état de l’animal (par exemple augmentation de la fréquence du suivi, utilisation d’analgésique…). De plus, toutes les procédures se feront sous anesthésie pour éviter toute forme de douleur.

Choix des espèces

Pour la réalisation de nos études, nous utiliserons des souris BALB/c. Les souris BALB/c sont un bon modèle car elles sont blanches et permettent de suivre plus facilement les apparitions de nécroses ou d’irritations au niveau cutané. Les premières études ayant été réalisées sur cette souche, cela nous permettra aussi de comparer les résultats. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 7-10 semaines qui ont un système immunitaire mature et des fonctions physiologiques bien établies.

Les souris sont tuées quand le volume de leur tumeur atteint le maximum toléré, ou plus tôt en cas de nécrose ou d'ulcération de la tumeur, de poil hérissé, de dos voûté ou de déshydratation. 1 466 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur système immunitaire est d'abord affaibli par une irradiation à 2 grays ou neuf jours de gavage à la ciclosporine, avant la greffe de cellules tumorales humaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie. Le porteur affirme que la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur jusqu'à cette limite, tout en citant la nécrose et l'ulcération parmi les motifs d'arrêt.

Objectifs

Les lymphomes cutanés à cellules T (CTCL) touchent environ 1/100 000 adultes chaque année. On estime que l’incidence a triplé en 30 ans. Des données préliminaires ont démontré que deux traitements (anti-CCR8 et anti-PAR2) sont capables de recruter des cellules immunitaires ce qui permet d’induire la mort des cellules tumorales. Pour aller en phase I d’essai chez l’Homme, nous devons tester l’efficacité de ces traitements sur des souris. Pour cela nous devons avoir une souris qui possède un système immunitaire (nos deux traitements reposent sur une coopération avec le système immunitaire) et qui permet une prise des cellules tumorales dans l’organisme. Nous allons tester 3 modèles de souris différents pour réussir à avoir des souris xénogreffées avec un système immunitaire. Nous testerons les 3 possibilités et nous garderons in fine qu’une seule de ces 3 méthodes en fonction des résultats (prise de la greffe, nombre de cellules immunitaires). Nous testerons ensuite les deux traitements, ciblant CCR8 ou PAR2, sur le modèle le plus efficace. Le but de ce projet étant de prouver, in vivo, l’efficacité de ces nouveaux traitements contre les lymphomes cutanés à cellules T.

Bénéfices attendus

Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes cutanés à cellules T). Les lymphomes sont des maladies rares avec un manque de traitements. Ce projet nous permettra de démontrer l’efficacité de ces deux traitements grâce aux cellules immunitaires présentes dans ces souris qui permettent de détruire les cellules tumorales liées aux anticorps que nous testons. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I d’essai chez l’Homme.

Procédures

Pour réussir à greffer des cellules tumorales dans des souris, nous allons devoir diminuer le système manière de façon transitoire, pour cela nous irradierons les souris. Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous allons prélever de façon hebdomadaire 75uL de sang. Pour cela, les souris seront préalablement anesthésiées pour réduire leur douleur.

Impact sur les animaux

Dans notre protocole, soit nous irradions des souris, soit nous injectons de la cyclosporine par gavage pendant 9 jours avant la greffe de cellules tumorales humaines. Les souris seront irradiées une fois 24h ou 48h avant la greffe à 2 grays. Cette faible dose de radiation induit une perte de poids à 7-10 jours avant que les souris reprennent leurs poids initiaux. Selon la littérature, cette dose n’affecterait pas la durée de vie de la souris. Si le protocole d’irradiation ne fonctionne pas, nous allons traiter les souris oralement avec de la cyclosporine. Le gavage se fera sur souris anesthésiées par isoflurane. Il est attendu une perte de poids au jour 5 avant un retour aux poids initiaux à jour 12. Ensuite, nous injecterons des cellules tumorales humaines aux souris en intrapéritonéales. Au bout de 2 semaines nous prévoyons la formation de tumeur. Nous injecterons en intrapéritonéale des cellules immunitaires ce qui provoquera une douleur modérée. Dans toutes les contritions, nous injecterons les deux traitements en intrapéritonéale ce qui provoquera une douleur modérée. Nous arrêterons le protocole quand le volume de leur tumeur sera trop important ou que l’animal présente des signes de mal-être (poil hérissé, dos vouté, déshydratation) ou en cas de nécrose ou d’ulcérisation des tumeurs. Nous prélèverons du sang toutes les semaines pour doser les cellules tumorales circulantes dans le sang. Les souris seront alors anesthésiées et 75uL de sang sera prélevé de façon hebdomadaire.

Devenir

Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de douleur pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.

Remplacement

Nous utilisons différentes lignées humaines de lymphomes ainsi que des cellules de patients. Ces cellules nous ont permis d’obtenir nos données préliminaires, et de confirmer l’activité anti-tumorale des anticorps en question. Nous devons donc maintenant tester les deux traitements dans des modèles in vivo. Pour cela nous souhaitons utiliser deux modèles de souris immunodéficientes pour confirmer l’intérêt thérapeutiques des anticorps et leur capacité à induire une forte régression tumorale. Nous pourrons également obtenir par ces modèles, des données pharmacocinétiques (demi-vie de l’anticorps, concentration dans le sang) et des données d’histopathologie. Cela nous permettra ainsi d’aller en essai de phase I chez l’Homme.

Réduction

Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet des deux traitements sur des lignées cellulaires. Ces tests nous ont permis d'évaluer l'efficacité et la toxicité des traitements et de sélectionner les combinaisons les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de tests nécessaires sur les souris. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests.

Raffinement

Afin de limiter la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur, perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation de cellules tumorales dans des souris, les souris seront anesthésiées sous isoflurane. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des roues d'exercice, et des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.