Recherche fondamentale

Sélectionnés pour deux mutations spontanées qui les rendent obèses et diabétiques, 600 rats reçoivent une à deux administrations quotidiennes du composé à tester, puis cinq prises de sang après six heures de jeûne, avant traitement puis à deux, quatre, six et huit semaines. À six semaines viennent les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, de 210 minutes, la surcharge en insuline pouvant les mettre en difficulté pour revenir à une glycémie normale. Des cathéters sont ensuite implantés dans la jugulaire et la carotide sous anesthésie, avec cinq jours d'isolement, avant un "clamp" terminal de 210 minutes à jeun sous perfusion continue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour récupérer tissus et sang, le porteur ne rapportant l'effectif de 600 qu'au besoin de dix animaux exploitables par groupe en fin de clamp.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules béta pancréatiques sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, des animaux rendus obèses et diabétiques par l’apparition de deux mutations spontanées ont été séléctionnées puis reproduits entre eux pour créer une lignée. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant des radiotraceurs. Ainsi, au cours de ce projet, des rats obèses seront traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Également, comme le diabète évolue très vite vers une stade d’insulinopénie, c'est à dire que le corps ne sécrète plus d'insuline, des traitements ciblant les phases plus avancées du diabète peuvent être trouvées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 210 minutes. La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant du glucose. L’implantation de cathéters à demeure dans la veine jugulaire et dans l'artère carotide : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant les 5 jours post chirurgie. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – L’évolution de la maladie liée au phénotype des rats va induire une obésité et donc une baisse d’activité des animaux, lorsque le diabète va s’installer, les animaux vont uriner plus et avoir besoin de s’hydrater plus, ils peuvent également perdre du poids lors des stades plus avancés. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 4- Lors de la mesure de la composition corporelle, l'animal est placé dans un tube à contention pendant environ 2 minutes, cela peut engendrer un stress modéré. 5 –La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose. 6 – La chirurgie (implantation des cathéters jugulaire et carotide) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7- Les animaux seront hébergés en individuel après la chirurgie pendant 5 jours, cela va induire un stress. 8- Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. Après chaque prélèvement de sang, nous ajouterons des rouleaux de coton en guise de « récompense ». La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. La chirurgie sera effectuée sous une couverture analgésique adaptée. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites définis, l'animal serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques.

Choix des espèces

L’espèce a été choisie car son phénotype altéré induit le développement d’un diabète et de l’obésité sous régime normal avec une phase d’hyperinsulinémie à 5-7 semaines d’âges et une phase d’insulinopénie à l’âge de 13-15 semaines. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp lors de son jeune âge puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Lors des âges plus avancés, ces rats spontanément diabétiques et obèses développent un diabète avec une insulinopénie et une mort des cellules béta ce qui permet d’identifier ce modèle de rat comme étant adapté pour l’étude des stades avancés du diabète. Ainsi, il permet aussi d’évaluer l’effet préventif de certains traitements sur l’évolution du diabète. L’espèce a été choisie car son phénotype altéré induit le développement d’un diabète et de l’obésité sous régime normal avec une phase d’hyperinsulinémie à 5-7 semaines d’âge et une phase d’insulinopénie à 13-15 semaines d'âge.

Vingt-quatre souris subissent chacune six gavages, six anesthésies générales pouvant atteindre deux heures et douze injections intraveineuses, une fois leur tumeur greffée développée. 360 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses de tissus : 40 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, 320 une greffe chirurgicale dans le coussin graisseux, et 48 d'entre elles enchaînent trois anesthésies et six injections intraveineuses. Le porteur décrit des nuisances courtes et de faible intensité, hormis l'inflammation modérée au point d'injection des cellules tumorales. Il annonce des protocoles d'imagerie diagnostique transférables aux patients, quand le projet consiste à observer par scintigraphie et échographie comment une tumeur greffée contourne un traitement anti-angiogénique.

Objectifs

Les thérapies anti-cancéreuses dites anti-angiogéniques ont pour but d’arrêter la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans les tumeurs et ainsi empêcher leur croissance. Cependant, une reprise de la croissance des vaisseaux sanguins de la tumeur est observée après quelques mois de traitement dans la majorité des cas. Cette resistance au traitement est également observée dans le modèle de cancer chez la souris que nous développons. Ce projet propose une étude des vaisseaux sanguins et de la consommation de glucose de la tumeur lors du traitement anti-angiogénique. Nous utiliserons pour cela des caméras d’imagerie médicale non invasive, techniques utilisées également chez l'homme en clinique : scintigraphie et échographie. La scintigraphie permet d'acquérir une image révélant la consommation en glucose des tumeurs, paramètre lié à leur croissance et leur agressivité. L'échographie nous permettra d'obtenir une image des vaisseaux sanguins de la tumeur à l'échelle micrométrique. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les cancers adaptent leurs vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques.

Bénéfices attendus

Cette étude aura pour résultats: (1) de mieux comprendre comment les tumeurs adaptent leur vaisseaux sanguins et leur façon de se nourrir en réponse aux traitements anti-angiogéniques, (2) de développer des protocoles d'imagerie diagnostique permettant de classer les cancers au moment de leur détection entre tumeurs pouvant répondre favorablement aux traitements et tumeurs résistantes, méthodes pouvant in fine être transférée chez les patients, (3) de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant le métabolisme tumoral en complément de la destruction du réseau vasculaire.

Procédures

40 souris recevront une greffe de cellules par injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer moins de 10 minutes. 248 souris auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis auront une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. 72 animaux auront une contention pour recevoir une dose d’analgésique par injection puis une chirurgie pour avoir une greffe dans le coussin graisseux sous anesthésie gazeuse. Cette procédure devrait durer 10 à 15 minutes. Lorsque leur tumeur se sera développée, 48 de ces souris subiront : Gavage (

Impact sur les animaux

Lors des séances d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et de la fatigue suite aux anesthésies (nuisances courtes et de faible intensité). A la suite des injections intraveineuses d'agent de contraste d'imagerie sous anesthésie, les animaux peuvent ressentir une douleur légère et de courte durée au site d’injection. La chimiothérapie anti-angiogénique sera administrée par gavage, ce qui peut générer du stress et de l’inconfort de courte durée (nuisance légère). L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation (nuisances modérées courtes).

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude du lien entre métabolisme et vascularisation tumoraux, ce qui intègre le micro-environnement tumoral. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de paragangliomes ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle de tumeur chez la souris afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines. De plus, les méthodes de diagnostique testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale ayant vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué d'après nos précédentes études d'imagerie sur ce modèle, qui ont fait l'objet de publication. Nous nous aidons de plus d'une plateforme internet qui propose un outil de calcul statistique pour l'expérimentation animale. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour arriver à des conclusions robustes. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

La procédure chirurgicale sera pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 min avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenus par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été établis pour le suivi de l'état des animaux. Par ailleurs, les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux constituant un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou de souris. Nos lignées cellulaires sont issues de souris ayant un fonds génétique mixte, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse afin de minimiser le risque de rejet. Enfin, nous disposons au laboratoire de systèmes d’imagerie du petit animal particulièrement adaptés à la souris. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

Aucun des six macaques à longue queue de ce projet ne sera tué à l'issue, le porteur prévoyant de les transférer vers d'autres études sans retirer chirurgicalement le matériel implanté. Ils vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré, avec des injections intramusculaires d'aripiprazole par périodes de deux semaines sur quatre mois, quinze scans d'imagerie cérébrale sous anesthésie répartis sur plus d'un an, l'implantation par vis en titane d'un plot de tête et d'une chambre d'enregistrement ouvrant sur une craniotomie de 10 mm sur 10, puis trente injections intracérébrales hebdomadaires sur huit mois. Le porteur reconnaît un risque d'infection lié à la chambre et des lésions cérébrales à prévoir avec la répétition des pénétrations d'électrode, tout en jugeant une lésion débilitante "extrêmement rare". Le maintien en vie s'explique par la valeur acquise par ces animaux, entraînés à réaliser des tâches cognitives sur écran tactile et donc réutilisables pour des approches invasives.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.

580 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour éviter la souffrance liée à la croissance de la tumeur. Chacune reçoit une injection de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, parfois accompagnée de la pose d'un implant, avec un suivi par IRM hebdomadaire. Une partie d'entre elles fait, à chaque séance de radiothérapie, un trajet routier de 95 kilomètres entre deux établissements, soit deux heures de transport aller et retour. Le porteur écrit qu'il n'existe "pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques" pour ses questions, après avoir décrit les études protéomiques et la modélisation informatique déjà conduites sur cellules.

Objectifs

L’identification récente de nouvelles "cibles", pouvant constituer de véritables moteurs de la maladie cancéreuse fait naitre de nouveaux espoirs de prise en charge du glioblastome (GB), tumeur du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’homme. L'objectif de ce projet est : - dans un premier temps d'étudier la tumorigénicité et la radiorésistance, en utilisant la radiothérapie externe aux rayons X en tant que traitement de référence, des cellules de Glioblastome humaines exprimant ces "cibles" et en parrallèle, de concevoir des thérapies spécifiques dirigés contre ces "cibles" - dans un second temps d'appliquer ces thérapies dans le GB pour anéantir la fonction tumorigénique de ces "cibles". Deux modalités d’administration locorégionale sont envisagées : l’injection directe sur la tumeur en place et l’application d'implants pour une délivrance « long terme » au sein des cavités de résection. Ce projet permettra d’explorer davantage ces "cibles" dans le GB et de qualifier de nouveaux outils afin si possible d’ouvrir la voie à des essais chez l’homme. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (ici référencés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place. Mais également une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavités d'éxérèse dans le glioblastome en synergie avec d'autres thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose d'implants (durée d'environ 1h30) réalsiée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de thérapies spécifiques (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 2. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire à l'EU1. L'un des actes, la radiothérapie externe sera réalisé à l'EU2 et inclut un transport d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure) pour aller à de l'EU1 à l'EU2 et la même durée pour revenir à l'EU1.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe 1. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovantes sur tumeur en place et au travers de bio-implants polymères sur cavité d'exérèse pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des lignées) et celle d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par SiRNA et ASOs sur tumeur en place et sur la cavité d'exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernière validation dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces lignées cellulaires contrôles et exprimant les "cibles" ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu. Les mesures de raffinement pour le transport des animaux incluent : l’évaluation de la santé des animaux pour ne transporter que les animaux en bonne santé, le choix des contenants appropriés, la température et humidité contrôlées (véhicules climatisés), l’alimentation et hydratation, la minimisation du stress et la planification de l’arrivée.

Choix des espèces

Nous étudions la tumorigénicité de "cibles" d'intérêts dans des lignées cellulaires humaines qui nécessite donc que ce modèle soit utilisé chez la souris CB17-SCID. Les souris seront utilisés à 8 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

180 souris femelles reçoivent dès le sevrage, à trois semaines, un régime pauvre, modéré ou riche en zinc, et le suivent pendant un an. Chacune passe seize heures en cage métabolique individuelle à trois, six, neuf et douze mois pour le recueil des urines, puis est tuée sous anesthésie pour le prélèvement des reins et du cœur. Le groupe soumis à la ration pauvre en zinc risque de développer des calcifications et une insuffisance rénale, ce que le porteur présente comme l'objet même de l'étude. Le bénéfice espéré, proposer le zinc comme traitement des calcifications pathologiques, reste une hypothèse, quand les douze mois de régime contrôlé et les quatre passages en cage métabolique sont, eux, planifiés.

Objectifs

Les calculs rénaux (lithiase urinaire) voient leur incidence augmenter, affectant près de 10 pourcent de la population mondiale. La lithiase urinaire est à l’origine de nombreuses interventions chirurgicales et hospitalisations, source d’infections parfois gravissimes. La première étape de formation des calculs rénaux est très souvent le développement de plaques de Randall : des calcifications du tissu rénal qui affectent la papille rénale. De forts taux de zinc ont été identifiés dans les plaques de Randall des souris ; ce zinc pourrait jouer un rôle d’inhibiteur de la minéralisation. L’objectif du projet est de déterminer si les apports alimentaires en zinc ont un impact sur les calcifications vasculaires et rénales au long terme. L'hypothèse est que les apports de zinc protègent contre le développement des calcifications qui surviennent avec l’âge, et ce notamment chez des sujets prédisposés (mutations génétiques) pour ces calcifications.

Bénéfices attendus

Le zinc est un oligo-élément qui a prouvé avoir des effets bénéfiques sur les calcifications des valves aortiques. De forts taux de zinc ont été identifiés dans les plaques de Randall des souris et nous supposons que ce zinc pourrait jouer un rôle d’inhibiteur de la minéralisation. L’objectif du projet est de déterminer si les apports alimentaires en zinc ont un impact sur les calcifications vasculaires et rénales. L'hypothèse est que l’administration de faibles doses de zinc aggraverait le développement attendu des calcifications rénales et vasculaires tandis que l'administration de fortes doses de zinc protègerait contre les calcifications rénales (plaques de Randall) mais également vasculaires. Cela permettrait de proposer l’administration de zinc comme traitement contre les calcifications pathologiques. En effet, la formation de calculs rénaux affectent près de 10 pourcent de la population mondiale, et est à l’origine de nombreuses interventions chirurgicales et hospitalisations. Ces calculs peuvent conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères.

Procédures

Les souris vont être à partir du sevrage (environ 3 semaines), et cela pendant 1 an, soumis à un régime spécial pouvant impacter l'évolution de la survenue de calcifications rénales et aortiques : pauvre, modéré et riche en zinc. Elles seront également mises en cage métabolique afin de doser les paramètres urinaires à 3 mois 6 mois, 9 mois et 12 mois du traitement. Cette intervention sera de 16 heures mais pourra être adaptée si un point limite de l'animal est constaté. A la fin de l'étude les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis soumis à un prélèvement sanguin unique et différents prélèvements de tissus / organes nécessaires aux analyses (rein, cœur, etc.).

Impact sur les animaux

Le changement de régime pourrait causer un stress (néophobie) et une baisse de la consommation de manière transitoire. Le recueil d'urine en cage métabolique individuelle peut induire un stress pour les animaux (stress social). Il y a un risque de survenue de calcifications pouvant entraîner une insuffisance rénale pour le groupe exposé à une faible concentration en zinc, ceci en fait l'objet de cette étude.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'effet du zinc sur le développement de calcifications rénales et vasculaires. Le modèle murin est particulièrement approprié pour ce projet car nous possédons au sein de l'animalerie un modèle murin prédisposé à calcifier la papille rénale. Cette étude s'intéressant à l'évolution des calcifications au sein d'organes précis, elle ne peut donc pas être réalisée sur des cellules ou des organoïdes.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir d'un calcul de puissance et des données déjà connues dans ce modèle. Le nombre d'animaux prévu est de 180 souris (femelles de 3 semaines).Des tests statistiques seront mise en oeuvre pour l'analyse des données afin de réduire le nombre d'animaux dans les prochains groupes .

Raffinement

Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de dix pour cent du poids initial (les animaux seront pesés 1 fois par semaine). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Notre modèle de souris est le reflet de la pathologie humaine sur le développement de calcifications rénale et vasculaire. Les souris seront utilisées au sevrage (environ 3 semaines) car habituellement il y a un changement d'alimentation à cette étape de développement des animaux. Nous profitons donc de ce changement pour intégrer l’alimentation spécifique en zinc.

Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, la glycémie est suivie en cinétique et du glucose est administré si le seuil défini est franchi. 644 souris génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des contentions et des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine, un gavage, deux mises à jeun de cinq heures, des prélèvements de sang à la queue par microcoupure et un prélèvement rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur annonce un effectif calculé par analyse de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'individus par groupe.

Objectifs

L’obésité est associée à une augmentation du risque de développer des maladies cardiovasculaires, en particulier des pathologies des artères du cœur (maladie coronarienne) ou des artères carotides, pouvant entraîner l’infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ces maladies des artères sont causées par la formation de plaques d’athérome (ou athérosclérose). L’athérosclérose est caractérisée par une réaction inflammatoire chronique dans la paroi des artères, impliquant divers types de cellules immunitaires, dont les macrophages. Cependant, l’impact de l’obésité sur la fonction des macrophages dans l’athérosclérose reste méconnu. Ce projet a pour objectif de (i) caractériser avec précision les macrophages vasculaires dans un modèle combinant l’obésité et l’athérosclérose chez la souris et (ii) évaluer le ciblage thérapeutique des macrophages dans le traitement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité chez la souris, et utilisera pour ce faire un modèle d'athérosclérose associé à l'obésité induite par des régimes particuliers riches en gras et/ou cholesterol. Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Procédures

-Contention (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intrapéritonéales (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intraveineuses sous anesthésie (1 fois, quelques secondes) -Gavage par sonde gastrique (1 fois, quelques secondes) -Prélèvement de sang à la queue sur souris vigiles (2 fois prélèvements répétés sur une période de 2 heures) -Mise à jeun (2 fois 5 heures) -Individualisation pendant les tests de tolérance au glucose ou à l'insuline (2 fois; environ 2h)-Anesthésie (1 fois; quelques minutes) -Prélèvement sanguin rétroorbital sous anesthésie (1 fois; quelques secondes)

Impact sur les animaux

Inconfort lié à la préhension et contention des animaux (nuisance légère de courte durée); injections intrapéritonéales : douleur de courte durée au point d'injection (nuisance légère de courte durée); inconfort lié au gavage du glucose lors du test de tolérance au glucose (nuisance légère de courte durée); prélèvement de sang lors des tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: douleur de courte durée au site de prélèvement par microcoupure de la pointe de la queue (nuisance légère de courte durée); mise à jeun des souris avant tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: stress liée au retrait temporaire de la nourriture (nuisance légère de courte durée); stress lié à l'individualisation des animaux durant la durée des tests de tolérance à l'insuline et au glucose (nuisance légère de courte durée)

Devenir

Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Les questions scientifiques adréssées dans ce projet ne peuvent l'être que grâce à l'utilisation d'un modèle animal in vivo. En effet, l’athérosclérose et l’obésité sont des maladies impliquant divers organes et types cellulaires interagissant de manière complexe. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'athérosclérose et de l’obésité doivent être étudiés dans un modèle qui imite le plus fidèlement possible la pathologie humaine. Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité et de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie. Les modèles in vivo sont donc une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité et l’athérosclérose, ou pour évaluer le potentiel effet de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Nous avons déterminé un nombre minimum de souris par groupes expérimentaux pour garantir une analyse statistique fiable, à partir de calculs statistiques (analyse de puissance) et à partir de notre expérience préalable sur les méthodes utilisées dans ce projet. Les données obtenues seront analysés à l'aide de tests statistiques prédéfinis et appropriés. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un enrichissement complémentaire spécifique à la procédure sera implémenté : bâtonnets de bois pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale des animaux sous régime riche en gras (aliment mou). Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’athérosclérose dans un organisme biologique complexe, développant une pathologie présentant des similitudes à l'athérosclérose humaine. Les souris génétiquement modifiées présentant une prédisposition à l'athérosclérose utilisées dans ce projet représentent un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permettra une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. Les complications cardiovasculaires de l'obésité se manifestent à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des souris âgées de 8 à 12 semaines au début des expériences, ce qui constitute un âge adulte. De plus, cet âge est communément utilisé dans les modèles souris d'athérosclérose et d'obésité, facilitant ainsi l'intégration et la comparaison de nos données à la litérature existante.