Recherche fondamentale

Chaque souris peut recevoir jusqu'à quatre-vingt-dix injections dans l'abdomen et quatre-vingt-dix gavages au cours d'une même procédure, plus dix prélèvements sanguins, un prélèvement dans le fémur et une greffe de cellules leucémiques par voie rétro-orbitale. 668 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range ces effets parmi une gêne oculaire, un boitement transitoire et une gêne transitoire. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes, la mort étant confirmée par l'absence de réflexes et de signes cardiaques.

Objectifs

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est un cancer du sang dû à l’apparition d’une anomalie dans la cellule souche sanguine, cellule à l’origine des différentes cellules du sang. Cette anomalie entraîne une sur-production de globules blancs (un des premiers symptômes de la LMC). Dans les années 2000, des médicaments ont été développés et permettent d’empêcher la sur-production de globules blancs. Ces traitements ont été révolutionnaires mais ils provoquent chez certains patients des effets secondaires tels que des nausées, des douleurs musculaires, des œdèmes ou des diarrhées. Des essais cliniques visant à arrêter le traitement après plusieurs années ont permis de montrer que 40% des patients restent sans traitement et sont donc guéris. Cependant, 60% des patients rechutent démontrant la persistance de cellules souches sanguines leucémiques dans leur moelle osseuse qui n’ont pas été éliminées par le traitement. Ce médicament seul ne suffit donc pas. Notre but est d’identifier et les cellules souches leucémiques qui persistent lorsque l’on traitera nos souris avec les médicaments utilisés chez l’homme. Puis, nous essaierons de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient éliminer ces cellules souches leucémiques persistantes.

Bénéfices attendus

Modéliser la leucémie myéloïde chronique est un enjeu majeur pour « guérir » la LMC dans les années à venir. En effet, ce modèle va permettre d'identifier et caractériser les cellules souches leucémiques persistantes à l’origine des rechutes observées dans les études d’arrêt de traitement et trouver d’autres médicaments.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animaux vigiles – 5 à 10 fois/procédure – durée 1min Prélèvements intrafémoraux sur animaux anesthésiés – 1 fois par procédure – durée

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une gêne oculaire suite à l’injection en retro-orbitale pour les greffes, 3/ un perte de poids transitoire lors des traitements, 4/ un boitement transitoire lors des prélèvements intrafémoraux 5/ une gêne transitoire lors des injections intrapéritonéales. 6/ Les animaux peuvent subir une perte ou une prise de poids transitoire en fonction des traitements. 7/ potentiels effets secondaires des molécules injectées.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses phénotypiques, moléculaires et histologiques nécessaires à la conclusion de l'étude. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Les leucémies sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal. Cependant, des analyses ex vivo réalisées à partir de moelle osseuse provenant de nos souris leucémiques nous ont permis de valider et déterminer l’efficacité des différents traitements seuls ou en combinaison et de ne choisir que les plus efficaces pour les traitements in vivo.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. Les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour chaque expérience en utilisant un test de puissance et des tests statistiques seront utilisés post expérimentation pour évaluer la significativité de nos résultats.

Raffinement

Les lignées transgéniques utilisées comportent des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de détecter l’apparition de cellules leucémiques très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou post opératoire Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. De surcroit, toute la collection des systèmes inductibles nécessaires à nos études n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle.

Dès l'âge de 4 ou 6 semaines et jusqu'à 60 semaines, des souris, des rats et des hamsters dorés reçoivent une alimentation hypercalorique, avec ou sans boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, pour provoquer obésité, diabète ou stéatose du foie. 4 750 rongeurs, soit 2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine sous anesthésie, subissent trois prises de sang et passent à trois reprises 40 heures seuls en cage sans enrichissement, et 24 heures sur grille en cage métabolique en fin de projet. Le porteur retient le hamster parce qu'il "consomme spontanément" l'éthanol, et invoque la hausse de la consommation d'alcool depuis la pandémie de COVID-19. En fin de projet, tous sont tués pour prélever leurs tissus et leur sang.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit analysé, 400 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre elles reçoivent deux chirurgies cérébrales successives, lésionnelle puis implantation de sondes, de deux à deux heures trente chacune, espacées de dix jours. Suivent trente jours d'hébergement individuel, la coupe des vibrisses et une restriction alimentaire d'une vingtaine de jours qui les ramène à 85 % de leur poids initial, condition posée par le porteur pour qu'elles exécutent la tâche comportementale. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que chez des animaux vigiles et qu'aucun modèle in vitro ne peut être utilisé ici.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). La finalité des tests comportement est d’étudier la prise de décision lorsqu’elle est dirigée pas la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie.● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour qu’elles atteignent 85% de leur poids initial, soit une réduction maximal de 15%. •La coupe des vibrisses.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Pour tester si une protéine protège les vaisseaux du cerveau pendant un sepsis, 280 rats reçoivent une injection de lipopolysaccharide qui déclenche une inflammation généralisée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reste anesthésié environ deux heures trente, dont une heure trente d'imagerie, avec deux prélèvements sanguins à la veine de la queue et une injection de radiotraceur dans la veine du pénis. L'inflammation provoquée peut entraîner une perte de poids, une baisse de mobilité et une diminution des interactions sociales. Tous les rats sont tués pour prélever organes et cerveau, et le porteur justifie le choix du rat plutôt que de la souris par sa plus grande taille, qui donne des images de meilleure qualité.

Objectifs

Le sepsis est une réaction inflammatoire exagérée qui force le corps à s’attaquer à ses propres tissus et organes. Il peut se produire en réponse à n’importe quelle infection, que ce soit par la présence d’une bactérie, d’un virus ou d’un parasite dans le corps. La forme la plus grave est le choc septique qui est une cause fréquente de décès. Cette inflammation entraîne des problèmes dans tout le corps, jusqu’à la baisse de la pression sanguine qui peut causer des défaillances d'organes. Si cette défaillance atteint le cerveau et les vaisseaux sanguins qui l’alimentent il peut y avoir des conséquences graves pour les patients, en accélérant l'apparition de problèmes de mémoire à long terme. Si l’inflammation reste excessive et continue dans le temps, elle va endommager la barrière qui sépare le sang et le cerveau entraînant un gonflement du cerveau et l'activation de certaines cellules immunitaires qui vont accentuer l'inflammation au niveau du cerveau. De plus, il peut y avoir des problèmes avec la circulation sanguine et provoquer des saignements dans le cerveau. Pour traiter le choc septique, on utilise des antibiotiques et on traite l'infection initiale. On s'assure aussi que la pression sanguine reste normale pour que les organes fonctionnent de manière normale. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour traiter les problèmes qui touchent les vaisseaux altérés par cette maladie, ni l'inflammation du cerveau. Notre équipe de recherche étudie une protéine qui pourrait aider à conserver la fonction des vaisseaux pendant l'inflammation et empêcher les problèmes qu’elle provoque. Pour cela, nous utilisons un modèle chez le rat chez qui nous allons injecter une substance appelée Lipopolysaccharide (LPS). Le LPS est une molécule qu’on retrouve autour de certaines bactéries et son injection va provoquer l'inflammation au niveau du cerveau. Nous allons faire des imageries du cerveau de ces animaux pour voir si la protéine d’intérêt peut empêcher les problèmes liés à l'inflammation dans le cerveau, en étudiant l’intégrité de la barrière qui sépare le sang du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à examiner comment la protéine agit sur la réponse de la barrière entre le sang et le cerveau en cas d'inflammation dans tout le corps. Avant de pouvoir envisager de tester cette protéine chez l'homme, il est important de vérifier son efficacité dans le traitement de l'infection grave chez le rat. Les résultats attendus aideront à mieux comprendre comment traiter ce genre d'inflammation chez les humains et à réduire le risque de développer des troubles de la mémoire graves. Il est possible qu'une première phase d'essais chez l'homme puisse être envisagée dans les cinq prochaines années.

Procédures

Dans cette étude, nous avons besoin d'endormir les animaux pour les examens d'imagerie. Les animaux seront imagés pendant environ 1h30. La phase de sommeil va durer aux alentours des 2h30 heures, du démarrage de l’anesthésie jusqu’à la fin du protocole complet. Pour induire l’anesthésie générale, nous injecterons au niveau abdominal un produit dont on ajustera la concentration en fonction du poids de l’animal. Après 5 minutes et confirmation de l'anesthésie générale, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la veine de la queue, ce geste expérimental prend 2 à 3 minutes. Nous allons mesurer dans ce prélèvement les différentes protéines impactées par la protéine d’intérêt pour voir si elle a bien effet. Ce prélèvement sera réalisé 2 fois au cours de ce projet, une première après vérification de la qualité d’anesthésie et une deuxième en fin de protocole d’imagerie toujours sous anesthésie générale. L’injection de lipopolysaccharide est réalisée par une injection au niveau abdominal en moins d’une minute, de même pour la protéine d’intérêt. L’injection du produit radiotraceur est réalisée au niveau de la veine du pénis après anesthésie générale et dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des injections dans la cavité abdominale pour administrer la protéine d’intérêt, le lipopolysaccharide (LPS) pour provoquer l’inflammation générale ainsi que pour le produit anesthésique. Lors de ces injections l’animal est tenu dans les mains de l’opérateur ce qui peut entraîner du stress et une légère douleur lors de l’injection. L'injection du produit d'anesthésie peut être répétée avec une concentration plus faible pendant l'examen d'imagerie dans le cas où l'animal commence à présenter des signes de réveil. Le LPS est la substance qui va provoquer une réaction inflammatoire généralisée semblable à celle observée dans le sepsis. L’inflammation provoquée peut entraîner à court terme une perte de poids, une réduction de la mobilité et une diminution des interactions sociales chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés pour effectuer des prélèvements d'organes et de sang. Ces prélèvements seront utilisés pour une analyse tissulaire au niveau microscopique afin d'évaluer le rôle protecteur de la protéine. Plus particulièrement pour les prélèvements de cerveau, nous allons les comparer aux données obtenues par imagerie.

Remplacement

L'inflammation du cerveau est un phénomène complexe résultant de l'interaction de différents types cellulaires et la barrière qui sépare le sang du cerveau. Cette interaction est encore partiellement connue. L'approche avec des modèles théoriques ou de remplacement ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions. Le modèle animal utilisé sera celui le plus validé à l'heure actuelle pour l'étude de l'inflammation du cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet a été déterminé à l’aide d’outils mathématiques spécialisés pour permettre une analyse cohérente et juste des données obtenues. Les données d'imagerie seront analysées au fur et à mesure, si les résultats sont satisfaisants avec moins d'animaux que prévu, les protocoles d'imagerie seront arrêtés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sur la totalité du projet.

Raffinement

Une période minimale d'acclimation de 7 jours à la réception des animaux du fournisseur sera respectée. Le nombre d'individus par cage sera adapté à leur taille mais aucun animal ne sera laissé seul en cage de plus les animaux auront à disposition du coton pour fabriquer leur nid et des objets récréatifs. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de mouvement par pression sur la patte. Une évaluation en temps réel de l'anesthésie sera réalisée pendant les protocoles d’imagerie. Si la fonction respiratoire se dégrade et se maintient dégradée, le protocole d'imagerie sera interrompu pour permettre une surveillance accrue de l'animal dans une cage de réveil dédiée placée sous une lampe chauffante. Pour garantir un maintien de la température corporelle pendant le protocole d'imagerie, l’animal est réchauffé pendant tout le protocole d’imagerie. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et les points limites seront étudiés par les responsables de projet 2 fois par semaine pour s’assurer du bien-être des animaux et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Si la mise en place d’un traitement anti-douleur ne permet de pas d’améliorer le bien-être animal, le protocole d’euthanasie sera réalisé.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats pour cette étude car c'est l'espèce utilisée dans les études sur ce modèle pathologique. Le rat est une espèce couramment utilisée pour les travaux d'expertise par imagerie chez le petit animal et les outils utilisés sont dédiés à cette espèce. De plus, c’est une espèce de plus grande taille par rapport à la souris ce qui permet d’avoir une qualité d’image supérieure avec plus de détails et précision pour les expérimentations d’imagerie préclinique. Nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 12 semaines pesant entre 400 et 600g. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions pathologiques retrouvées chez l'Homme.

Une restriction alimentaire ramenant les animaux à 85 % de leur poids initial conditionne la tâche comportementale : 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ou deux neurochirurgies de deux à deux heures trente, lésion cérébrale, implantation de sondes ou les deux, puis trente jours d'hébergement individuel pour éviter l'arrachement du matériel, et une coupe des vibrisses. Les tests durent une vingtaine de jours, avec jusqu'à soixante essais quotidiens sur environ deux heures, et le porteur revendique des conditions "quasi-naturelles" obtenues en laboratoire. Le projet relève de la science fondamentale, ses retombées cliniques restant à l'état d'orientation pour des études ultérieures.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette integration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Ces tests comportementaux permettront d'étudier la prise de décision lorsqu'elle est dirigée par la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial. ● Coupe des vibrisses

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébergés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Pour vérifier si la graisse corporelle protège le foie des polluants, 192 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection déclenche chez elles une fonte progressive du tissu adipeux, de 50 % en un mois et de 80 % en trois mois, puis elles reçoivent les polluants par gavage hebdomadaire et subissent des tests de tolérance mensuels au glucose et à l'insuline, avec prélèvements sanguins à la queue. Le porteur affirme que ce dialogue entre organes ne peut être étudié hors d'un organisme vivant. Il ajoute que si un effet apparaît, les mécanismes seront ensuite explorés sur des modèles cellulaires déjà utilisés au laboratoire.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Le tissu adipeux, aussi appelé graisse corporelle, est l'endroit principal où notre corps stocke les lipides, c'est-à-dire les graisses. En plus de cette fonction de réserve d'énergie, il joue un rôle important en capturant les perturbateurs endocriniens (PE), des substances chimiques pouvant perturber le fonctionnement de nos hormones, et aide ainsi à protéger les autres organes de leurs effets nocifs. Certaines études ont montré que plusieurs polluants présents dans notre environnement favoriseraient le développement de maladies du foie liées à des troubles métaboliques, comme le « foie gras ». Nous faisons l'hypothèse que le tissu adipeux pourrait agir comme un bouclier pour le foie, en le protégeant des effets de ces polluants.

Bénéfices attendus

Ce travail expérimental pourrait permettre de démontrer le potentiel protecteur du tissu adipeux contre l’exposition aux polluants. Ces résultats pourraient avoir des répercussions importantes en termes de santé publique, notamment en soulignant l’importance du tissu adipeux dans la protection contre les effets néfastes des polluants environnementaux. Une meilleure compréhension de ce mécanisme de protection pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la prévention des maladies hépatiques liées à l'exposition aux polluants, et renforcer les politiques de santé publique visant à limiter cette exposition.

Procédures

Pour induire la délétion du tissu adipeux, nous injectons des souris transgéniques avec un agent pharamacologique donné . Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que l’injection par voie intrapéritonéale. L’exposition aux polluants se fait par gavage hebdomadaire. Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que celle d’un gavage. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont des irritations aux points d'injection, des douleurs lors des prélèvement à la queue (prise de glycémie), et de l'inconfort lors des gavages oraux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir l’effet du tissu adipeux sur le développement de la NASH en situation d’exposition aux polluants.

Remplacement

Le but de notre étude est d’étudier l’effet du tissu adipeux sur les maladies métaboliques lors d’une exposition à des polluants. Ce dialogue inter-organe ne peut être utilisé hors d’un organisme vivant. Si un phénotype est observé, les mécanismes pourront être abordé ultérieurement sur des modèles cellulaires utilisés au laboratoire.

Réduction

Le projet nécessite l’utilisation d’un total de 192 animaux, ce qui, dans un souci de réduction, correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. L'utilisation d'un ouill statistique de prédiction prévoit un usage de 16 animaux par groupe pour obtenir des données robustes, notamment pour les tests métaboliques. La répartition du tissu adipeux étant différente chez les mâles et les femelles, il est indispensable de réaliser les analyses sur les deux sexes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour évaluer la relevance de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis, ainsi qu'un tube tunnel, tous deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se dérouleront avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée pour les gestes invasif et en conditions de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, ce qui réduit la douleur. Nous utilisons des sondes de gavage en polypropylène, ce qui diminue la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradués et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne, y compris le week-end, permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Nous avons généré et étudié des souris qui présente une perte progressive du tiss adipeux. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que suite à l’injection de tamoxifene, la masse adipeuse va progressivement réduire, de 50% en 1 mois et de 80% en 3 mois. Adulte, des souris de 8 semaines, le phénotype des animaux à cet âge a été caractérisé dans notre publication précédente et nous avons montré que, à ce stade, les animaux traités développent une perte de tissus adipeux.

2 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune peut être bloquée jusqu'à quatre fois, sans anesthésie, en position fœtale au bout d'un tube en plastique percé, pour mesurer sa masse grasse. Pour celles nourries d'un régime riche en graisses avant l'âge adulte, le porteur estime que la prise de poids "ne devrait pas dépasser 200% du poids initial". 1 472 souris subissent une neurochirurgie de 90 minutes et autant un gavage quotidien de cinq jours. 1 312 passent dix jours seules en cage hermétique, et autant subissent un jeûne de 7 heures puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec des glycémies prises par entaille de la queue, une zone que le porteur dit "non innervée". Toutes sont tuées à l'issue, 2 560 d'entre elles par une injection dans l'abdomen sous sédation et sans anesthésie, pour prélever cerveau et tissu gras. Les thérapies contre l'obésité restent au conditionnel : ce projet "pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques", écrit le porteur.

Objectifs

Le poids de notre corps reste assez stable tout au long de la vie adulte grâce à un mécanisme que l'on appelle le "set-point", qui correspond à un poids de référence que notre organisme cherchera à conserver Ce mécanisme est contrôlé par le cerveau, en particulier par une région appelée l'hypothalamus, qui communique avec les graisses du corps pour gérer l'énergie disponible en modifiant le comportement alimentaire, le stockage et l’utilisation des calories ingérées. Cependant, des facteurs biologiques et environnementaux peuvent modifier le set-point du poids corporel comme c’est le cas dans la maladie de l'obésité. Lorsqu'une personne prend du poids, le corps met en place des mécanismes pour le maintenir, ce qui rend difficile de perdre du poids de manière durable. Cela explique pourquoi 80 % des personnes qui ont suivi un régime ou ont recours à une thérapie de l’obésité reprennent du poids rapidement après l'avoir perdu. De récentes recherches scientifiques suggèrent que les altérations du système nerveux et des cellules du système immunitaire du cerveau, appelées microglie, puissent jouer un rôle dans le set-point du poids. Elles pourraient expliquer pourquoi le corps "se souvient" de l'obésité, ce qui facilite la reprise de poids. Ici nous proposons d’étudier leur rôle dans le maintien et dans la reprise du poids.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes souffrant d’obésité à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malgré l’existence de thérapies pour la réduction du poids, la plupart des patients reprennent du poids. Cette reprise de poids et l’incapacité de maintenir dans le temps le poids perdu sont de vraies urgences clinques pour la gestion de l’obésité. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au changement du set-point du poids corporel, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques concernant l’altération du set-point du poids corporel, qui contribue au maintien de l’obésité et des comorbidités associées. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité

Procédures

Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle (2624 souris) : l’analyse de la composition corporelle (mesure de la masse grasse et de la masse maigre) nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique présentant des trous afin de permettre le passage de l’air, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris feront au maximum quatre analyses de ce type au cours du projet. 2) Neurochirurgie : (1472 souris) cette technique d’injection intra-cérébrale est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 90 minutes. Une injection sous-cutanée sera réalisée sur souris vigiles 30 minutes avant la neurochirurgie, puis 1 par jour dans les 2 jours suivants, afin d’administrer les médicaments anti-douleurs. Cinq autres injections sous-cutanées seront réalisées lorsque les souris seront anesthésiées (2 d’anesthésiques locaux, 1 d’anti-douleur et 2 de réhydratation). Les souris concernées n’auront qu’une seule neurochirurgie au cours de l’étude. 3) Injections abdominales (2624 souris) : 1152 souris recevront des molécules par injection abdominales ponctuelle sans anesthésie durant deux semaines maximums. Toutes les souris (2560) recevront également un euthanasiant par voie abdominale (injection unique), sans anesthésie préalable mais sous sédation, après une injection sous-cutanée d’un sédatif. 4) Gavage oral (1472 souris) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. 5) Cages pour l’étude de la dépense énergétique (1312 souris) : les souris seront transférées dans des cages hermétiquement fermées pour étudier leur dépense énergétique, ce qui augmente leur état d’isolation social. Elles vivront dans ces cages pour une durée de 10 jours. Cela n’aura lieu qu’une seule fois au cours de l’étude. 6) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) (1312 souris): ces tests nécessitent de réaliser, après un jeûne d’une durée maximale de 7 heures, une injection dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Entre 4 et 6 mesures de glycémie se font grâce à une goutte de sang obtenue après entaille de l’extrémité de la queue, une région non innervée qui ne cause pas de douleur. Ces tests se réalisent sans anesthésique ou analgésique qui biaisent les résultats de glycémie. Ces tests durent au maximum 120 minutes et ne seront réalisés qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet permettent un hébergement en cage collective tout le long de l’expérience. Cependant, pour les tests de dépense énergétique au sein de cages hermétiquement fermées, les souris adultes devront être hébergées de manière individuelle pendant 10 jours maximum, empêchant ainsi les interactions sociales. Pour l’ensemble des procédures, les souris subiront un stress d’immobilisation d’une durée de 5 minutes au maximum lors de l’analyse de composition corporelle, qui nécessite l’insertion de la souris dans un tube en plastique afin de pouvoir faire l’analyse, avec des trous pour le passage d’air. Les souris sous régime alimentaire gras vont prendre du poids de manière significative. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Les souris qui passeront les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent perdre du poids après le jeûne, d’une durée totale de 7 h. La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris ayant une neurochirurgie. Il est possible d’observer une perte de poids/appétit lors de la période post-opératoire. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés et certains de leurs organes seront récupérés (cerveaux, tissu gras, autres) pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle du système nerveux et des cellules immunitaires du cerveau dans la reprise de poids et l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et communique avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu gras…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de ce dialogue entre le cerveau et différents organes. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire, le changement du poids, la dépense énergétique, nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu nos expériences de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximum dont nous estimons avoir besoin durant les 5 ans que durera ce projet. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence pas les résultats de nos tests).

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 4 semaines et y seront habitués pendant 1 semaine minimum. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux possiblement dû au nouvel espace d’hébergement. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages inclut l’utilisation de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons les tunnels pour manipuler les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès le début de l’anesthésie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée d’une solution de réhydratation. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropries ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie/suture (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire est depuis longtemps étudiée chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à̀ ce type d’études. En effet, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel fait de cette espèce un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de notre étude, la réaction inflammatoire induite par un régime alimentaire riche en graisses est retrouvée à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui rend d’autant plus pertinent l’étude de ce phénomène chez cette espèce. Enfin, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Toutes les souris de cette étude arriveront à 4 semaines d’âge dans notre animalerie. Cet âge a été choisi car il est important que le début du régime riche en graisses commence avant l'âge adulte. En effet, des scientifiques ont montré que les effets de l'obésité sont plus marqués lorsqu'ils sont induits avant l'âge adulte.