Recherche fondamentale

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments et des agents perturbateurs de la respiration, jusqu'à deux fois par jour pendant 30 jours consécutifs, subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang après section de la pointe de la queue, et peuvent présenter bronchoconstriction, dépression respiratoire ou bronchospasme. Le porteur présente ces micro-prélèvements sur animal non contenu comme laissant la souris "signifier librement tout manquement à leur bien-être". L'effectif de 1 080 découle d'une estimation de quinze candidats médicaments sur cinq ans dans "l'hypothèse la plus défavorable", sans que ce nombre de composés soit justifié.

Objectifs

La pléthysmographie sur animaux vigiles et non contraints et la mesure des oscillations forcées sur animaux anesthésiés sont des techniques utilisées pour étudier la fonction pulmonaire chez les rongeurs de laboratoire. Ces techniques mesurent les variations de fréquence, de débit et de pression qui se produisent avant et après l'exposition à un médicament ou toutes autres provocations. A ce jour, aucun modèle alternatif n’est suffisamment intégré et complexe pour permettre d’étudier l’effet d’un candidat-médicament sur la fonction pulmonaire et seule la mesure directe sur animal vivant permet de mettre en évidence l’absence d’effet ou un effet délétère d’un candidat-médicament sur la fonction pulmonaire. Il est également possible de mesurer une activité bénéfique si le candidat-médicament permet de rétablir une fonction respiratoire normale après qu’elle est été perturbée par un agent perturbateur (constituant bactérien, allergènes, médicaments…) Notre objectif est de mesurer l’effet de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, sur la fonction pulmonaire chez la souris dans le but de sélectionner les traitements sans impact ou rétablissant une fonction respiratoire normale.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité des composés pharmacologiques sur les paramètres respiratoires permettra de sélectionner les composés ne présentant aucun effet délétère et ceux présentant une activité bénéfique lorsqu’il permet de rétablir une fonction respiratoire normale après qu’elle est été perturbée par un agent sensibilisant (constituant bactérien, allergènes, médicaments…). Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour administrer les candidats-médicaments étudiés et des agents perturbateurs de la fonction respiratoire. Ces composés pourront être administrés sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 30 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres sanguins (biochimiques, formule sanguine…) au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang sur une durée minimum de 72h. Un prelèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins de 0.5mm) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. Les agents perturbateurs peuvent entrainer un remodelage bronchique (sans phénotype visible), ou des effets transitoires tel qu’une bronchoconstriction, une dépression respiratoire ou un léger bronchospasme qui se traduit par une courte période d’apathie (quelques secondes à quelques dizaines de minutes et visible des expérimentateurs les plus aguerris) suivi d’une récupération rapide et complète de l’animal

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires, circulatoires et de la fonction pulmonaire. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament (Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination). Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur efficacité.

Réduction

L’étude de la variabilité des paramètres mesurés dans les études précédentes a permis de calculer que des lots de 6 à 12 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats. Les effectifs utilisés seront déterminés en fonction des analyses réalisées. D’après notre expérience, nous estimons qu’un maximum de 15 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 1080 souris selon l’hypothèse la plus défavorable (6 groupes de 12 souris pour chaque candidat-médicament étudié).

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contrainte temporelle (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou de vide sanitaire…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur avant le début de l’étude puis plusieurs fois par jour. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments, pour mettre en évidence l'atteinte d'un point limite. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude de la fonction pulmonaire, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses biologiques sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines, animaux adultes afin que les systèmes respiratoire, circulatoire et immunitaire soient entièrement développés et mature.

1 214 souris vont être utilisées dans un modèle de sclérodermie, chacune pouvant recevoir 24 injections intrapéritonéales, 40 gavages, deux injections intraveineuses caudales et deux instillations oro-pharyngées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cela s'ajoutent une imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements, dont le porteur reconnaît qu'ils stressent les animaux. Les atteintes cutanées apparaissent vers la quatorzième semaine, la perte de poids et la mobilité réduite vers la dix-septième. Toutes les souris sont tuées, une partie faute de porter le génotype recherché, tandis que les bénéfices annoncés se limitent à identifier "à terme" de nouveaux candidats médicaments.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Tuées au bout d'un mois pour que soient prélevées la tumeur greffée et les tissus atteints à distance, 44 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans la prostate, sous anesthésie, une greffe de cellules de cancer prostatique humain, et une partie d'entre elles trois injections intrapéritonéales par semaine d'un inhibiteur d'entrée du cholestérol. Le porteur fixe le protocole à un mois, durée qu'il présente comme suffisante pour quantifier l'essaimage métastatique avant que les métastases n'atteignent des tailles douloureuses. S'agissant d'une prolongation, il affirme qu'une analyse rétrospective confirme l'absence de toute nuisance liée à l'implantation, tout en maintenant un suivi renforcé pour détecter des nuisances inattendues.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude et la compréhension des mécanismes promoteurs de la dissémination métastatique de cellules tumorales prostatiques. Nous analysons l’étendue de la dissémination tumorale dans les tissus distants de la tumeur greffée grâce au suivi de fluorescence émise par les cellules. Plusieurs types de cellules modèles seront utilisées présentant des modifications génétiques d'intérêts. Alternativement, les souris porteurs de greffes seront traitées avec des inhibiteurs d'entrée du cholestérol. Un mois post-greffe, les tissus seront prélevés et analysés par des techniques permettant l’étude de marqueurs d’agressivité tumorale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d'évaluer le bénéfice thérapeutique potentiel d'un ciblage du récepteur des HDL pour le traitement des lésions métastatique de cancer de la prostate sur un modèle préclinique. Bien entendu, ces résultats sont à intégrer dans un projet de recherche plus large conduit sur les modèles cellulaires, pour définir les paramètres d'invasion et de migration des cellules, et un volet d'étude conduit sur une cohorte humaine de tumeurs prostatique visant à définir le potentiel pronostique et thérapeutique de cette cible.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à réaliser la greffe des cellules d'intérêt qui dure environ 15 minutes (procédure de mise en anesthésie + geste opératoire + réveil). Cette intervention sera réalisé avec les préconisations d'usage pre, per et post-opératoire qui assureront une absence de nuisance lié à la prise en charge anesthésique et antalgique. Puisqu'il s'agit d'une demande de prolongation, nous bénéficions d'une analyse retrospective qui confirme qu'aucune nuisance n'est observée suite à la procédure d'implantation. Néanmoins, nous maintenons un suivi post-procédure renforcé, comme indiqué dans la demande, pour assurer un bien-être optimal des animaux inclus dans le protocole. Les animaux des lots 5 et 6 correspondant aux traitements pharmacologiques seront soumis à des injections par voie intraperitoneale trois fois par semaine. Cette injection nécessite une contention de l'animal et une nuisance lié à la piqure, l'intégralité du geste ayant une durée de 10 à 15 secondes.

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3 est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal, en fonction de la pousse tumoral. Le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque limité à 1 mois. Nous avons un bon recul sur la cinétique de développement de la tumeur et métastases associées, la cinétique de 1 mois est optimale car permet de quantifier l'esseimage métastatique sans permettre aux métastases d'attendre des tailles critiques qui seraient suceptibles d'induire de la souffrance chez l'animal. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de souffrance éventuelle de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements du site primaire d'implantation de la tumeur et des tissus distants pour un bilan d'extension métastatique.

Remplacement

Cette étude fait suite à des tests réalisés ex vivo en culture de cellules ayant permis de caractériser les paramètres d’agressivité. Grâce à cette approche rationnelle, nous avons ainsi sélectionné les modèles ayant démontrés leur efficacité, nous avons également déterminé les doses optimales pour les traitements pharmacologiques. Une partie des tests seront également complété par des analyses sur des tumoroïdes en culture 3D pour apprécier certain paramètres biologiques. L'ensemble de ces travaux complémentaires nous permet de réduire de manière considérable la quantité d'animaux utilisés en les substituant par des approches alternatives.

Réduction

le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 44 individus.

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal

Choix des espèces

Le modèle souris correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la formation de métastases chez les mammifères. En effet, ce modèle vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire. Il est important de noter que les cellules utilisées in vivo ont été validés en amont sur leurs propriétés d’agressivité tumorale (migration, invasion, prolifération). Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

À 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, des souris sont exposées à un son qui déclenche aussitôt une crise convulsive, et certaines subissent dix expositions déclenchant des crises, jusqu'à trois par jour. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection dans le cerveau sous anesthésie à 1 ou 3 jours de vie, puis à 56 jours une chirurgie de deux à trois heures qui perce quatre orifices dans leur crâne, et une partie passe des séances quotidiennes d'imagerie d'une à deux heures, tête fixée, sur 31 jours. Le porteur prévoit qu'une crise peut entraîner une "douleur musculaire modérée et de courte durée", et affirme qu'il n'y a "pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance". Il écrit que les souris, toutes tuées à la fin de chaque procédure, ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, et annonce que "Certains animaux utilisés pour un type d'expériences seront réutilisés pour un autre type d'expériences".

Objectifs

Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Procédures

Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.

Remplacement

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Réduction

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Raffinement

L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.

Choix des espèces

Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).

Rendues sensibles par un antibiotique injecté dans l'abdomen, 300 souris de six à sept semaines sont ensuite infectées par gavage avec une souche pathogène de Clostridioides difficile. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin. Elles reçoivent trois injections vaccinales sous la peau et deux prises de sang à la mandibule, avec un recueil de selles tous les deux jours, l'infection provoquant deux à trois jours de diarrhée et une perte de poids de 5 à 15 %. Le porteur justifie la mise à mort par l'infection elle-même et par l'analyse des tissus, et présente la vérification des candidats vaccins chez l'animal comme "exigible réglementairement" avant toute phase clinique.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser des tests in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire induite par la vaccination. L'objectif de ce projet est d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité in vivo de ces nouveaux antigènes. Une analyse de l’immunité des animaux sera vérifiée avant et après immunisation. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la présence de la bactérie pathogène dans le tube digestif (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux), une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Le développement d'un vaccin permettrait de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire efficace est induite lors de ces essais de vaccination, la bacterie sera limitée dans son développement et les symptomes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles.

Procédures

Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée, l’administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement par lidocaïne, 2 prélèvements à J-52 et J-5. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.

Impact sur les animaux

Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de C. difficile et 3 injections par voie parentérale (sous-cutanée) pour les immunisations, 1 injection intrapéritonéale (moins de 5 secondes) d’un antibiotique et 2 prélèvements sanguins (moins de 10 secondes) par voie submandibulaire. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection. La procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée (moins de 5 secondes) ; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.

Devenir

Ayant été infectés par une souche pathogène de C. difficile, et en raison de l'interet de l'analyse des prélèvements des tissus, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro et in silico ont permis d'évaluer l'intérêt des candidats vaccins. L'étape de vérification de leurs qualités antigéniques in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre, l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.

Les souris subissent cinq injections sous-cutanées par semaine pendant dix, vingt-huit ou quarante-deux jours, ou une incision dorsale sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant un inducteur de fibrose pendant sept à vingt-huit jours. 126 souris âgées de six à huit semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le produit injecté enflamme et épaissit la peau, les poumons et les reins, ce qui reproduit une partie de la sclérodermie systémique pour y repérer des pièges extracellulaires de neutrophiles. Le porteur annonce une surveillance rapprochée destinée à détecter des points limites "préalablement établis", sans indiquer lesquels.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie qui modifie et épaissit la peau et d’autres organes les empêchant de fonctionner correctement. Il n’existe pas encore de traitement efficace. Certains globules blancs de notre organisme (les neutrophiles) sont capables d’éjecter autour d’eux un ensemble de molécules que l’on appelle NETs et qui dans des conditions normales forment des pièges à bactéries. Cependant, ces molécules peuvent être libérées de façon incontrôlée et être impliquées dans la progression de certaines maladies. Le rôle des NETs dans la sclérodermie est encore mal compris. Nous avons montré que des neutrophiles de patients libérent plus de NETs que ceux de sujets sains lorsqu’ils sont stimulés in vitro. Dans ce projet, nous visons à mettre en évidence l’existence de NETs dans des souris chez lesquelles nous aurons reproduit en partie la sclérodermie afin de pouvoir tester dans le futur des médicaments qui empêcheraient la formation des NETs et qui potentiellement freineraient l’avancement de la maladie.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur les phénomènes mettant en jeu les NETs dans les tissus et dans la circulation sanguine lors de la progression de la maladie et ainsi démontrer la pertinence de chacun des modèles pour l’utilisation ultérieur d’un inhibiteur de NETs. A plus long terme, cela nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les NETs dans un contexte de sclérodermie systémique.

Procédures

Dans une première procédure, les souris subiront une injection sous-cutanée d'une solution induisant la fibrose ou d'une solution saline, 5 fois par semaine pendant 10, 28 ou 42 jours. Dans une seconde procédure, les souris subiront 1) une injection sous-cutanée d'une solution d'anesthésiant, 2) une incision au niveau dorsal pour créer une poche sous-cutanée dans laquelle sera implantée la mini-pompe osmotique contenant une solution induisant la fibrose ou une solution saline et 3) une suture. La durée de l'intervention sera de 10 à 15 minutes et la diffusion sous-cutanée de la solution fibrosante durera 7, 18 ou 28 jours.

Impact sur les animaux

L’injection sous-cutanée peut causer une douleur légère de courte durée. La manipulation, l’anesthésie et l’intervention chirurgicale peuvent être des sources importantes de stress physiologique et psychologique chez la souris. Lors de la pose de la mini-pompe, les souris peuvent ressentir de la douleur ou de l’inconfort à l’endroit de l’implantation. Les injections répétées ainsi que la diffusion sous-cutanée des inducteurs de fibrose induisent une inflammation et un épaississement des tissus cutané, pulmonaire et rénal.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire et des NETs en particulier nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publiés par la communauté scientifique nous ont confirmé qu’il n’existe pas d'autre possibilité que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes mettant en jeu plusieurs types cellulaires au cours de la sclérodermie systémique. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécéssaire au plus juste grâce à un logiciel de statistique afin de limiter le nombre de souris utilisées. Pour l’analyse des résultats a posteriori, des tests statistiques adaptés seront utilisés. Une répartition aléatoire des animaux sera réalisée dès leur arrivée. Une banque de tissus sera récupérée pour éviter de refaire des expériences dans l’avenir.

Raffinement

Nous utiliserons une mini-pompe pour faire diffuser l'inducteur de fibrose dans la peau, évitant les injections répétées. Le deuxième inducteur de fibrose que nous utiliserons est très instable dans le temps et nécessite d’être préparé extemporanément. Dans le cas des injections répétées de ce second inducteur, les injections seront réalisées par deux expérimentateurs au niveau du dos de l’animal. Une rotation systématique dans le sens des aiguilles d’une montre sera faite afin de ne pas injecter quotidiennement au niveau du même site. Par ailleurs, ces expériences (injections multiples ou implantation pompe) ne se feront pas en un seul essai (126 animaux) mais seront fractionnées de façon à travailler sur des groupes plus petits améliorant la prise en charge de chacune des souris. Dans le cas de l’implantation de la mini-pompe, une analgésie pré-opératoire sera effectuée par injection sous-cutanée de buprénorphine. Une surveillance post-opératoire rigoureuse sera mise en place après l’intervention pour détecter tout signe de douleur, d’infection ou autres complications. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter les points limites préalablement établis et d’éviter ainsi tout stress et souffrance. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle cellulaire capable de reproduire la complexité des interactions entre le système immunitaire, le système vasculaire et les tissus. La souris est considérée comme le modèle le plus approprié à l’étude de ces interactions complexes et plus particulièrement à l’étude du système immunitaire. En effet, la maturation ainsi que la réponse à un stimulus du système immunitaire murin sont très proches de celles de l’Homme. Les souris utilisées dans ce projet seront des souris « jeune adulte » âgées de 6 à 8 semaines. Les souris à cet âge ont un système immunitaire mature, essentiel pour modéliser la réponse inflammatoire et fibrotique propre à la sclérodermie. En termes de poids et de taille, les souris de 6 à 8 semaines sont assez robustes pour tolérer les injections répétées sans causer de stress excessif pouvant conduire à une mort prématurée. Les souris de cet âge peuvent par ailleurs subir l’intervention chirurgicale associée à l’implantation de la mini-pompe sans complication post-opératoire. Enfin, ce stade de développement permet une tolérance à la mini-pompe sous-cutanée et favorise une diffusion homogène de l'inducteur de fibrose.