Recherche fondamentale

150 chevaux âgés de 5 à 15 ans reçoivent chacun vingt nébulisations, matin et soir pendant dix jours, et subissent deux fois à onze jours d'intervalle une prise de sang, un lavage trachéal et un lavage broncho-alvéolaire d'un poumon sous endoscope et sédation, dans des procédures déclarées de niveau léger. Le porteur signale une gêne au passage de l'endoscope, de la toux, des saignements pouvant aller de quelques stries à un flux continu, et des réactions aux sédatifs allant du tremblement au choc allergique. Les mélanges d'huiles essentielles testés sont déjà employés sur le terrain sans qu'aucune étude n'ait établi leur innocuité ni leur efficacité. Tous les chevaux sont gardés en vie, et le porteur présente les données recherchées comme "indispensables" aux vétérinaires pour répondre à la croissance des demandes de leurs clients.

Objectifs

Les affections des voies respiratoires représentent la deuxième cause de baisse de performance chez le cheval de course et de sport après les affections musculosquelettiques. Le nombre de chevaux présentant une inflammation des voies respiratoires profondes ne cesse de croître, en raison de plusieurs facteurs : pollution environnementale, réchauffement climatique avec diminution des pâturages, dégradation de la qualité des fourrages avec augmentation des poussières, facteurs génétiques, mais aussi des contaminations fongiques et des surinfections bactériennes. L’enjeu économique et sanitaire est donc majeur. Leur traitement repose sur l’utilisation de corticoïdes éventuellement associés à des bronchodilatateurs. En cas de surinfection, des traitements antifongiques et/ou antibiotiques sont également recommandés. Les thérapies complémentaires sont largement employées, sur prescription vétérinaire ou par automédication de la part des propriétaires. Parmi celles-ci, l’utilisation de produits à base de mélange d’huiles essentielles (HE) par nébulisation prend de plus en plus d’ampleur. Elles sont administrées par voie orale ou par inhalation à l’aide de dispositifs adaptés aux équidés assurant leur distribution directe au niveau de l’arbre respiratoire. Ces thérapies complémentaires ont pour but de diminuer l’utilisation des médicaments et leurs effets secondaires et risques associés (fourbure dans le cas des corticoïdes, résistance antimicrobienne dans le cas des surinfections bactériennes). A ce jour, aucune étude n’a montré l’innocuité de l’utilisation quotidienne par inhalation des HE (ou mélange d’HE) sur les voies respiratoires profondes du cheval. De même, aucune étude n’a permis de montrer leur efficacité clinique (diminution de l’inflammation pulmonaire) et spécifique (propriétés antibactériennes et antifongiques) alors qu’elles sont largement utilisées en pratique. Le but du projet est d’évaluer l’innocuité et efficacité des huiles essentielles (HE) en inhalation pour le traitement des affections respiratoires équines, afin de proposer aux vétérinaires et autres utilisateurs des données scientifiques fiables sur l’emploi des composés à base d’HE, qui, s’ils s’avèrent pertinents, pourront être utilisés comme alternatifs aux traitements classiquement utilisés.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit dans l’étude des effets antibactériens et antiviraux des huiles essentielles. La réalisation d’une étude terrain basée sur des utilisations fréquemment rencontrées en pratique va permettre de récolter de données scientifiques, exploitables par les vétérinaires, et indispensable pour leur permettre de répondre à la forte croissance des demandes de leurs clients dans ce domaine.

Procédures

Après un examen clinque, chaque individu de chaque lot sera prélevé avant et après traitement (soit 2 fois durant l'étude à 11 jours d'intervalle). Il sera réalisé des prélèvements de sang, un lavage trachéal et un lavage broncho-alvéolaire d’un des deux poumons. Les lavages seront réalisés avec l'aide d'un endoscope et après sédation. Pour chaque animal, l'ensemble de ces interventions durera moins de 30 min. Le traitement consiste en la nébulisation matin et soir (10 min / nébulisation) pendant 10 jours de sérum physiologique (groupe témoin) ou de produits à base de mélange d’HE (les 2 autres groupes de chevaux).

Impact sur les animaux

Du stress peut être induit par les différents actes. Une gêne peut également être ressentie par le cheval au moment du passage de l'endoscope et du liquide dans les voies respiratoires pouvant occasioner de la toux qui sera limitée par les effets de la sédation. . Des saignements, lors de prélèvements respiratoires, peuvent survenir en cas d'irritations des cavités nasales ou lorsqu'on tape l’ethmoïde (ce qui peut arriver lorsque le cheval bouge ou qu'il lève la tête brusquement). Une évaluation initiale permet de qualifier la quantité de sang visible. Si elle est minime (stries ou petites gouttes), la situation est souvent bénigne. Si cette quantité est modérée à abondante (c’est à dire un flux continu ou une accumulation dans les voies respiratoires), cela signale une complication nécessitant une intervention immédiate. Une réaction à l'administration des sédatifs peut également survenir (tremblements, sudation excessive, hyperthermie, malaise, choc allergique).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie.

Remplacement

La caractérisation des Huile Essentielles (HE) a été réalisée in vitro sur quatre espèces bactériennes lors d’un précédent projet. Les effets antimicrobiens évalués sur différentes HE pures ou leurs principes actifs sont significatifs pour certaines combination HE/espèce bactérienne. Il est maintenant nécessaire de transposer cette évaluation sur des mélanges d’HE utilisées sur le terrain sans que leurs effets n’aient été scientifiquement évalués sur le terrain. La caractérisation des mélanges à bases d’HE et la démonstration de leur effet antimicrobien à travers l’étude terrain imaginée ici pourrait conduire à terme à les proposer comme thérapie complémentaire en médecine vétérinaire équin, en lieu et place des antibiotiques et des anti-inflammatoires. Il n'y a pas à ce jour d'alternative in vitro à ce projet car : - les modèles sur culture cellulaire (Cellules dermiques) ont été évaluées pour caractérisées les effets antiviraux des HE pures et de leurs principes actifs. Ils ont permis de démontrer un effet cytotoxique des HE important comparés à d'autres molécules antivirales. - les modèles de type "organoïde' sont en phase expérimentale de conception pour le volet respiratoire équin et ne sont pas disponibles à ce jour.

Réduction

Comme il n'y a pas d'études publiées sur l'innocuité et l'efficacité des mélanges d'HE retenus. Nous sommes ici dans le cadre d'une étude pilote. Dans notre étude avec 3 groupes de 50 chevaux, le scénario peut impliquer une comparaison entre les trois groupes pour évaluer l'effet des deux mélanges d'huiles essentielles par rapport à un contrôle ou entre eux. Nous allons donc comparer des groupes indépendants (chaque groupe reçoit un mélange différent), avec des mesures répétées sur les mêmes individus (avant/après application). L'effectif de chevaux défini a été calculé de manière être suffisamment puissant pour détecter des effets moyens ou grands, mais insuffisant pour des effets très faibles. Dans ce dernier cas, une nouvelle étude avec des effectifs plus grands sera à envisager. Tous les échantillons seront conservés en bio-banques et pourront être utilisés dans d’autres travaux réduisant le besoin d’effectuer de nouveaux prélèvements biologiques.

Raffinement

Les procédures sont réalisées selon un protocole standardisé par un vétérinaire. La gêne (et/ou douleur) et le stress induits par ces procédures seront contrôlés par la sédation réalisée par intraveineuse (posologie définie en fonction de l’équidé par le vétérinaire). Si des saignements apparaissent, une évaluation initiale permettra de qualifier la quantité de sang visible. Si elle est minime (stries ou petites gouttes), la situation est souvent bénigne. Si cette quantité est modérée à abondante (c’est à dire un flux continu ou une accumulation dans les voies respiratoires), cela signale une complication et une intervention du vétérinaire sera immédiate. A la fin de chaque prélèvement, les chevaux utilisés seront surveillés et hébergés dans un box avec litière, proche d’un autre congénère, avec un panier de jeûne, évitant tout risque de fausse déglutition, et ce jusqu’à absence d’effet visible de la sédation (locomotion normale, port de tête au-dessus de l’horizontal, réactivité face au test de clignement à la menace, test de sensibilité tactile, attention à l’environnement). Le cheval sera dans son environnement familier non stressant, ce sont les vétérinaires qui se déplacement sur son lieu d’élevage. Il sera manipulé par des personnes qui ont en régulièrement la charge.

Choix des espèces

Les travaux menés ont pour espèce cible le cheval où les mélanges à base d’HE sont déjà utilisés sans aucun référentiel. Il est donc important d’accumuler des données de terrain pour établir à termes ces référentiels utilisables par l’ensemble des acteurs de la filière équine. Les chevaux inclus seront âgés entre 5 et 15 ans pour correspondre à ce qui est réalisé sur le terrain, à savoir que les mélanges d’HE sélectionnés sont déjà utilisés sur cette population d’animaux.

Les souris dont le phénotype dommageable risque de s'exprimer avec l'âge seront tuées avant l'apparition des symptômes. 808 souris génétiquement modifiées, dont une partie immunodéprimée et hébergée en animalerie protégée des pathogènes, vont être utilisées dans des procédures déclarées de niveau léger. 712 subissent au sevrage une biopsie d'un millimètre de la queue et un prélèvement de sang sous anesthésie, et 96 des prises de sang toutes les six semaines jusqu'à l'âge de quarante-huit semaines. 370 des souris génotypées retournent à l'élevage, 246 sont tuées faute d'avoir les bonnes caractéristiques génétiques, et aucune de celles engagées dans la seconde procédure n'est gardée en vie.

Objectifs

L’immunoglobuline A (IgA) est une protéine clé du système immunitaire, jouant un rôle prépondérant dans la défense des muqueuses contre les organismes étrangers. Cependant, une production excessive et/ou altérée d'IgA peut être à l'origine de pathologies, comme la néphropathie à IgA (NIgA). Cette affection rénale est caractérisée par l'accumulation de dépôts d'IgA1 au niveau des reins, entraînant une inflammation persistante pouvant conduire, dans les cas les plus sévères, à une insuffisance rénale. A ce jour, cette maladie est encore mal comprise, et les traitements actuels visent à principalement ralentir la progression de la dégradation rénale sans véritable spécificité. Plusieurs modèles murins ont été développés afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et ainsi proposer des traitements plus ciblés. Cependant, ces modèles ne reproduisent toujours pas pleinement les symptômes et caractéristiques de la NIgA. Afin de surmonter ces limites et de progresser dans le développement d’un modèle reproduisant fidèlement la maladie, nous envisageons de croiser un modèle murin dans lequel l’IgA murine a été remplacé par l’humaine avec des modèles dont les mutations auront la possibilité d’augmenter ou réduire les dépôts précédemment observés chez ces souris. Cela aura pour conséquences d'activer ou non des cellules particulières que nous supposons être les cellules productrices de ces IgA1 dysfonctionnelles. Ces nouvelles lignées seront de meilleurs modèles d’aggravation ou d’amélioration pour étudier la NIgA. Les objectifs du projet sont donc les suivants : d'une part, créer et maintenir en élevage pendant cinq ans les lignées actuelles et nouvellement créées, ainsi que constituer des cohortes de suivi en analysant les caractéristiques géniques chaque animal issu des croisements par une biopsie de l'extrémité de la queue et un prélèvement sanguin au moment du sevrage ; d'autre part, évaluer le bien-être animal de ces deux nouvelles lignées et enfin d'étudier le développement de la maladie induite par les mutations exprimées dans ces nouvelles lignées, grâce à des prélèvements sanguins réguliers effectués chez des cohortes d'animaux d'âges différents, afin de suivre l’évolution de la maladie par la quantification du taux d'IgA1 dans le sang.

Bénéfices attendus

Ce projet est indispensable car, bien que l’IgA soit l’immunoglobuline la plus abondante et diversifiée chez l’homme, sa complexité et les pathologies qui lui sont associées restent encore largement méconnues. Actuellement, la néphropathie à dépôts mésangiaux d’IgA est la glomérulopathie la plus fréquente et constitue l’une des principales causes d’insuffisance rénale. Pourtant, elle est très mal comprise, ce qui entraîne un cruel manque de thérapies spécifiques. En développant des modèles murins plus précis, ce projet permettrait de mieux modéliser la NIgA, afin d’en découvrir les mécanismes sous-jacents, ouvrant ainsi la voie à des tests plus spécifiques pour traiter la maladie de manière plus ciblée et efficace. En conséquence, d’ici cinq ans, des avancées significatives pourraient être réalisées, offrant aux patients atteints de meilleures options de diagnostic et de traitement.

Procédures

Les animaux de ce projet seront sujets pour 712 d’entre eux, au moment du sevrage, à un prélèvement de sang et de tissu (biopsie d'1mm à l'extrémité de la queue) après avoir été anesthésiés. 96 autres, feront l’objet d’un prélèvement sanguin, toutes les 6 semaines, sur une période allant de 6 à 48 semaines après la naissance.

Impact sur les animaux

Les différents prélèvements réalisés sur les souris de ce projet tels que la biopsie et le prélèvement sanguin pour des analyses génétiques et le suivi du développement de la maladie sur les deux nouvelles lignées ainsi que leur contrôle ne devraient entraîner une douleur que de courte durée après leur réveil suite à l’anesthésie. Les animaux immunodéprimés sont maintenus dans des conditions particulières afin que leur phénotype dommageable ne s'exprime pas et qu'ils ne soient pas en contact avec des agents infectieux.

Devenir

Concernant la première procédure, nous estimons devoir génotyper 712 animaux. Parmi eux, 96 seront utilisés en continue pour rentrer dans la deuxième procédure. Pour les restants, 60% soit 370 animaux auront les bonnes caractéristiques génétiques et seront replacés dans l’élevage et les 40% soit 246 restant ne l’ayant pas seront euthanasiés. Aucun des animaux de la seconde procédure ne sera gardé en vie. Nous souhaitons analyser les effets des mutations sur le développement de la maladie chez les deux nouvelles lignées créées dans ce projet en réalisant des analyses plus complètes que celles faites avec les prélèvements sanguins.

Remplacement

La néphropathie à dépôts mésangiaux d’IgA est une maladie complexe et hétérogène. Elle est multifactorielle du fait que plusieurs facteurs contribuent à son apparition. Les modèles cellulaires ne parviennent pas à reproduire la complexité des mécanismes moléculaires et physiologiques, notamment les interactions tissulaires et cellulaires propres à l'organisme dans son ensemble.

Réduction

Notre laboratoire possède une expertise dans l’élevage et la création de lignées murines, ce qui nous permet d’anticiper avec rigueur le nombre nécessaire d’animaux reproducteurs et de générations pour ce projet. Grâce à cette expérience, nous pouvons également optimiser l’utilisation des ressources tout en garantissant des résultats scientifiques fiables. Les expérimentations seront menées de manière structurée et éthique, avec une organisation soignée des groupes témoins afin d’éviter les redondances et de maximiser l’efficacité. Les manipulations seront équitablement réparties entre mâles et femelles, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires, tout en assurant des données robustes. Enfin, toutes les souris seront euthanasiées en fin d’expérimentation, conformément aux normes éthiques, et tous les organes d’intérêt seront prélevés pour les analyses.

Raffinement

Les procédures de ce projet seront réalisées pour limiter au maximum le stress et la souffrance des animaux. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale gazeuse par du personnel qualifié, et les souris seront surveillées jusqu’à leur réveil complet. Des observations régulières permettront de suivre leur comportement et leur état de santé. Si un animal montre des signes de souffrance, il sera immédiatement euthanasié pour éviter toute douleur prolongée. Pour les animaux susceptibles de présenter un phénotype pouvant nuire à leur bien-être, une surveillance renforcée sera mise en place. Ces souris seront hébergées dans un environnement contrôlé, appelé animalerie SOPF (sans pathogènes opportunistes et spécifiques), afin de les protéger contre des infections. Si des problèmes liés à ce phénotype apparaissent avec l’âge, les animaux seront euthanasiés avant que ces symptômes ne se manifestent.

Choix des espèces

Travailler avec des modèles murins est justifié par la forte ressemblance de plusieurs paramètres entre l’homme et la souris. En effet, ce modèle est particulièrement pertinent en raison de la similitude de sa physiologie rénale avec celle de l'homme, ainsi que de la proximité de son système immunitaire. Notre étude vise à identifier les tenants et aboutissants de cette maladie et donc nécessite l'utilisation des souris génétiquement modifiés pour répondre de la meilleure façon aux problématiques actuelles. Dans ce projet, les animaux pourront être mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines après la naissance, âge pour lequel les animaux seront sexuellement matures. Cette période de reproduction pourra être emmené jusqu’à 20 semaines, après quoi les animaux commenceront à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage par biopsie de la queue et prélèvement sanguin de tous les animaux engendrer à la suite d’accouplements sera réalisé à partir de 4 semaines, c’est-à-dire au moment du sevrage. Enfin, les premiers prélèvements sanguins de la seconde procédure seront réalisés à partir de la sixième semaine après la naissance, âge pour lequel les premiers dépôts apparaitront de même que l'augmentation du taux d’IgA1 humaine dans le sang. Ces prélèvements prendront fin à l’âge de 42 semaines après la naissance étant donné que cette maladie possède un charactère chronique et une évolution lente au fil du temps. Réaliser ces prélèvements sur les souris nous permettra d’obtenir une vue complète de son développement et d’identifier les changements progressifs.

Pour alimenter des fermenteurs in vitro en jus de rumen, 9 moutons castrés adultes porteurs d'une canule donnant accès à leur rumen subissent des prélèvements de contenu ruminal, dans des procédures déclarées de niveau léger. Chaque prélèvement dure quelques minutes et l'animal est placé en case individuelle pour le contrôle de son ingestion. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue et que les moutons "supportent bien" une canule qui ne cause selon lui qu'une "légère gêne mécanique", tout en revendiquant un "besoin constant d'animaux" et le caractère "indispensable" du recours à des animaux canulés. Gardés en vie après chaque prélèvement, les 9 moutons seront tués à l'arrêt du dispositif, prévu en décembre 2025.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié plusieurs programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, pollution des sols...) ou les attentes sociétales (bien-être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants, les animaux modèles utilisés sont des moutons castrés. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux). Pour cette étude, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. Il existe des méthodes alternatives (incubateurs artificiels sans jus de rumen, utilisant des enzymes) mais dont la précision est limitée et qui ne donnent pas accès aux paramètres fermentaires d’intérêt (méthane entérique, acides gras volatiles et ammoniac, notamment). Ces méthodes in vitro nécessitent des animaux canulés (donneur de jus de rumen pour alimenter les fermenteurs), mais en nombre moindre que pour des expérimentations in vivo (3 donneurs pour caractériser plusieurs dizaines d’aliments, contre 6 / aliments pour les approches in vivo). Ces prélèvements de jus de rumen permettront de réaliser plusieurs mesures : pH, dégradabilité des substrats végétaux, produits de fin de fermentation, production et composition des gaz de fermentation. Par ailleurs, elles permettront d'établir des lois de réponses entre alimentation et processus digestifs, afin de construire des modèles permettant de limiter le recours à l’expérimentation in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser finement les processus digestifs dans le rumen lors de la digestion de substrats végétaux contrastés (plantes fourragères provenant de différentes régions bioclimatiques, mélanges fourragers) ou lors de l’addition d’additifs destinés à réduire la production de gaz à effet de serre par les ruminants (méthane entérique, ammoniac). A plus long terme, les bénéfices attendus d’une meilleure compréhension de ces mécanismes sont une utilisation plus raisonnée des ressources fourragères dans les élevages et une réduction de l’impact environnemental des productions de ruminants. Pour les essais de fermentation in vitro, leur objectif est de tester en grand nombre des solutions alimentaires (plantes, additifs) pour réduire les émissions de méthane entérique afin de sélectionner les plus prometteuses qui seront ensuite testées in vivo sur un nombre réduit d’animaux.

Procédures

Prélèvements de contenu de rumen à l'aide d'une canule qui ne dure que quelques minutes, un prélèvement par mouton.

Impact sur les animaux

Il n'est pas attendu de nuisances sur les animaux durant l'expérimentation. Pour le contrôle individuel d'ingestion : l'animal est placé en case individuelle : toutes les cases individuelles sont installées dans une même pièce (à proximité de la case collective : leur lieu de vie habituel), les barrières ajourées permettent aux animaux de se sentir, se voir et de s'entendre, et se toucher (à travers les barreaux). Les animaux supportent bien la canule qui n’entraine généralement qu’une légère gêne mécanique. Lors du prélèvement, le stress éventuel lié à la manipulation est limité voir supprimé par la phase d'habituation de 15 jours.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issu de la procédure expérimentale. Le dispositif d'animaux canulés s'arrétant en décembre 2025, ces animaux seront euthanasiés à la fin de ce projet.

Remplacement

Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion et la mesure des produits de fin de fermentation ruminale, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (incubateurs artificiels utilisant des enzymes). C'est pour cela que nous avons recours à des ovins dans ce projet

Réduction

Pour chaque série de prélèvements 3 individus sont nécessaires pour assurer les 3 répétitions des essais de fermentation : 1 seul animal utilisé à chaque répétition, chaque animal n'aura donc qu'un seul prélèvement de jus de rumen à chaque demande expérimentale . 9 animaux seront disponibles afin de supporter toutes les demandes annuelles, et permettront de ne pas répéter ou de façon trés limitée les prélèvements sur les mêmes animaux.

Raffinement

Lors de la mise en œuvre de ce projet, la plupart du temps les animaux ont une conduite classique d’élevage avec une alimentation classique permettant de couvrir les besoins alimentaires. Si un animal se blesse ou est malade, une décision sera rapidement prise en accord avec le vétérinaire. Toute intervention sera consignée sur un cahier d’expérimentation et le carnet sanitaire pour les traitements éventuels. Tout le personnel, formé et compétent, impliqué dans l’expérimentation est attentif aux signes de stress et de douleur des ovins. Les animaux seront suivis quotidiennement au niveau de leur ingestion, de leur état et de leur comportement général, et hebdomadairement pour leur poids. Ce suivi étroit permettra de s’assurer que les animaux sont en bonne santé et ne perdent pas significativement de poids. Si malgré ces dispositions un animal montre des signes de mal être, il sera retiré de l'expérimentation et le vétérinaire référent sera contacté. Lors des phases de prélèvement, une habituation des animaux sera réalisée quotidiennement durant 2 semaines précédant le jour du prélèvement afin de supprimer le stress de la manipulation.

Choix des espèces

Nous étudions la digestion des ruminants et le mouton est l'un de nos modèles d'étude de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce ovine Dans la plupart de nos études l'animal modèle que nous étudions est à l'entretien sans besoin de croissance et donc adulte (24 mois et plus). Nos équations de prédictions sont basées sur des animaux adultes sur ce principe si nous voulons extrapoler nos résultats à d'autres modèles animaux.

Soumises à un régime enrichi en graisses pendant quatre, huit ou vingt semaines, puis à des injections tous les deux jours, 4 560 souris subissent des procédures déclarées de niveau léger et seront toutes tuées, le jour même d'un prélèvement sanguin sur animal vigile et d'une perfusion intracardiaque. L'objectif est de suivre le dépôt de lipides dans la paroi des artères, du tout premier stade jusqu'aux plaques avancées, sur des souris de quatorze, dix-huit ou trente semaines. Le porteur ne retient comme nuisances que la piqûre de l'aiguille et le prélèvement sanguin, et ne dit rien du régime gras suivi pendant cinq mois ni des transports entre les deux établissements utilisateurs. Il indique par ailleurs avoir réduit l'effectif "en respectant les contraintes de publication".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde et sont en croissante progression dans les pays à revenus faibles ou modérés. La principale cause sous-jacente de ces maladies est l'athérosclérose, une pathologie complexe et multifactorielle qui touche principalement les artères de gros et moyens calibres. Cette pathologie consiste en un dépôt de lipide dans la paroi des artères. Elle se développe dès l'enfance mais la progression des lésions augmente avec l'âge et varie selon le mode de vie (alimentation, exrcice physique, stress, tabagisme...) et nos facteurs de risque (diabète, hypertension, obésité). La première étape du développement de la plaque d'athérome est la perte d'intégrité (ou dysfonction) de l'endothélium qui est une barriere entre le sang et paroi artérielle. Cette perte d'intégrité de la barrière endothéliale favorise l'infiltration des lipoprotéines de basses densité (LDL) circulantes dans l'espace sous-endothélial induisant des réponses cellulaires de type inflammatoires et fibroprolifératives à l'origine des lésions athéromateuses. Au cours du temps, cette plaque d'athérome vient obstruer la lumière de l'artère et sa rupture sera responsable des conséquences dramatiques de cette pathologie comme l'infarctus du myocarde ou l'accident vasculaire cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dès l'initiation de cette pathologie jusqu'aux stades tardifs pour évaluer la vulnérabilité de la plaque et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans ce contexte physiopathologique. Plusieurs travaux ont déjà identifié que des protéines de la famille des phosphoinositides 3-kinase (PI3K) pourraient être des cibles thérapeutiques intéressantes dans ce contexte et nous souhaitons valider leur implication au cours de ce travail. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être utilisées pour prévenir ou ralentir le développement de l'athérosclérose et diminuer ses conséquences dramatiques sur les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Tout ou partie des animaux enrolés dans ce protocole seront soumis à: 1/un régime enrichi en gras pendant 4 semaines ou 8 semaines ou 20 semaines 2/des injections tous les 2 jours 3/un prélèvement sanguin une seule fois le jour de la mise à mort sur animal vigile (durée: 1 min) 4/une perfusion intracardiaque une seule fois le jour de la mise à mort (durée: 10min). Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs avec un transport des animaux encadré par une procédure de transport déclarée (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les interventions 1, 2 sont réalisés dans l'EU1/2 et les interventions 3, 4 sont réalisés dans l'EU2/2.

Impact sur les animaux

La piqure d'une aiguille pour injecter des inhibiteur des cibles pharmacologiques étudiées entraine une douleur légère de courte durée . Un prélèvement sanguin sur animal vigile placé en décubitus latéral entraine une douleur légère de courte durée.

Devenir

A l'issu de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort pour analyser par immunofluorescence l'endothélium (pour les étapes initiatrices du développement de l'athérosclérose) ou les dépôts lipidiques signant la présence de plaque d'athérome (pour les stades précoces à plus avancés).

Remplacement

Notre équipe développe des modèles in vitro en 2D et 3D des vaisseaux pour éviter à son maximum la nécessité d'avoir recours à des modèles animaux. Néanmoins, l'athérosclérose est une pathologie multifactorielle qui fait intervenir les cellules de paroi vasculaire mais également les cellules inflammatoires et plusieurs facteurs circulants. Il est encore prématuré de pouvoir complètement modéliser cette pathologie complexe in vitro. Les animaux vivants resprésentent le seul modèle intégré et restent indispensables pour obtenir des résultats fiables sur cette pathologie.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs de l'étude et pour permettre de bonnes analyses statistiques. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés en fonction du design de chaque expérience. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 20 animaux sont requis pour obtenir une répartition normale des mesures et des résultats robustes dans notre contexte d'étude. Le choix du groupe témoin sera optimisé pour permettre sa comparaison avec plusieurs groupes expérimentaux et ainsi diminuer l'utilisation inutile d'animaux. Enfin, sur chaque animal le coeur et l'aorte seront simultanément prélevés et les autres tissus de l'animal mis à mort seront proposés aux autres membres de l'équipe et de notre institut de recherche pour permettre d'optimiser au maximum l'utilisation de chaque animal.

Raffinement

Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest). Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement par du personnel compétent ayant un livret de compétence à jour et formé aux approches de chirurgie. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien être des animaux et le vétérinaire référent pour déterminer les soins ou l'action à appliquer pour réduire le stress, l'angoisse ou la souffrance animale.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés: 1/ pour les différentes cibles étudiées dans ce projet et 2/permettant de récapituler de façon induite par un régime ou spontanée le développement de l'athérosclérose. De plus cette espèce de rongeur a des propriétés zootechniques (petite taille, un cycle de reproduction court permettant rapidement d’obtenir des générations successives pour les études à long terme) autorisant une mise en œuvre des protocoles expérimentaux de recherche facilitée et maîtrisée par notre équipe de recherche. Cette espèce présente également des paramètres physiologiques proches de l’Homme, la plaçant comme un organisme-modèle de choix pour l'étude des pathologies cardiovasculaires. Pour évaluer l'impact de l'invalidation de nos différentes cibles moléculaires au cours du développement de l'athérosclérose, les animaux utilisés seront agés de 14 semaines (étape initiatrice de l'athérosclérose), 18 semaines (stade précoce du développement de cette pathologie artérielle) ou 30 semaines (stade tardif du développement de cette pathologie artérielle).

Pour savoir si un signal 5G à 3,5 gigahertz modifie la régulation de la température du corps et abîme la peau, 160 souris sans poil vont être utilisées dans des procédures classées comme légères, toutes tuées à l'issue. Elles restent dans leur cage, placée au centre d'une chambre réverbérante, exposées aux radiofréquences pendant quatre semaines, ou reçoivent une minute d'ultraviolets B connus pour provoquer rougeur et inflammation locale. Leur peau et leur tissu adipeux brun sont prélevés après la mise à mort. Sur les 160 souris, 64 sont prévues en réserve, mobilisables seulement si une expérience s'interrompt pour un problème technique.

Objectifs

La 5G, ou cinquième génération de réseau mobile, est en cours de déploiement afin de répondre à l’augmentation des besoins en connectivité et en services numériques. Toutefois, comme pour les générations précédentes, des interrogations subsistent quant à ses effets potentiels sur la santé. En 2020, une nouvelle bande de fréquence autour de 3,5 GHz a été attribuée à la 5G. Cette fréquence, bien que proche de celles déjà utilisées, a la particularité de pénétrer légèrement dans les tissus biologiques, sur quelques centimètres. Notre étude vise à explorer si une exposition à cette fréquence pourrait influencer la régulation de la température corporelle, en particulier chez les rongeurs. Nous nous intéresserons aux récepteurs impliqués dans la perception du froid afin de mieux comprendre leur rôle dans cette réponse. Par ailleurs, nous examinerons si la 5G pourrait avoir un impact sur la peau en favorisant un déséquilibre entre la production et l’élimination de certaines molécules agressives pour les cellules, appelées radicaux libres. Pour cela, nous analyserons plusieurs indicateurs de dommages cellulaires, notamment des modifications dans les lipides et le matériel génétique des cellules, ainsi que les mécanismes naturels de protection mis en place par l’organisme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des radiofréquences sur la thermorégulation et sur la peau. Il existe encore peu de données publiées sur les effets toxicologiques des bandes de fréquence utilisées dans la 5G. Ceci ne permet pas à ce jour d'avoir une réponse claire sur leurs effets. Les résultats obtenus permettront de compléter les données pour l’évaluation des risques des radiofréquences.

Procédures

Les souris seront exposées libres de leurs mouvements aux radiofréquences pendant 4 semaines ou aux ultraviolets pendant 1 min maximum.

Impact sur les animaux

L’exposition aux radiofréquences peut induire des modifications physiologiques subtiles et un certain inconfort chez les animaux. L’exposition aux rayonnement ultraviolets B est connue pour induire des réactions telles que l’érythème, une augmentation des radicaux libres et une amplification de l’inflammation locale.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de chaque procédure avant le prélèvement des tissus adipeux bruns et de la peau.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle animal dans ce projet, car il étudie des processus dynamiques de thermorégulation et de la peau qui ne peuvent être reproduits par des modèles in vitro. Par conséquent, nos expérimentations ne peuvent en aucun cas être remplacées par d'autres méthodes alternatives.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d'animaux nécessaire pour réaliser l'ensemble des tests, avec des groupes de 8 souris par sexe et par condition d'exposition. Quatre niveaux d'exposition sont prévus ainsi qu'un groupe dit contrôle qui restera à l'animalerie. Un groupe supplémentaire servira à valider nos techniques de prélèvements et d’analyses. Nous utiliserons la même souris pour l’étude sur la régulation de la température du corps et sur les effets de l’exposition sur la peau. Un total de 160 souris sera utilisé, incluant 64 souris supplémentaires réservées uniquement en cas d'interruption d'une expérimentation en cours due à un problème technique. Ces souris supplémentaires seront utilisées uniquement si cela s'avère nécessaire.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront placées dans des cages en plexiglas utilisées dans l’animalerie, avec un maximum de 8 souris par cage, et y resteront pendant une semaine. Elles seront ensuite exposées aux ondes en restant dans leur cage d’hébergement, qui sera placée au centre d’une chambre réverbérante, sans manipulation supplémentaire, ce qui permettra de réduire leur stress. La salle d’exposition des animaux et les chambres réverbérantes bénéficient d’un environnement contrôlé quotidiennement, incluant une vérification des températures. Une surveillance quotidienne sera effectuée par le personnel de l’équipe pour vérifier l'apparence physique et des changements de comportement. Une fiche de suivi permettra d’évaluer les points limites en cas de signes de souffrance et de mettre en place les mesures appropriées.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. L'utilisation de souris sans poil est particulièrement pertinente pour notre étude car leur absence permet une meilleure exposition de leur peau aux stimuli externes tels que les radiofréquences ou les ultraviolets de type B et facilite le prélèvement d’échantillons. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 5 semaines. A cet âge, elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un stade de développement où leur peau est pleinement formée et fonctionnelle .