Recherche fondamentale

Opérées une ou deux fois du crâne sous anesthésie, certaines subissant en plus une intervention de deux heures pour mesurer leur activité musculaire, 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse histologique du cerveau. Elles enchaînent ensuite une quinzaine de sessions d'enregistrement de trente à quarante minutes, jusqu'à deux par jour, la tête fixée et les mouvements limités. Le projet cherche à comprendre comment le cervelet et le cortex coordonnent la marche et l'orientation dans l'espace. Une partie des souris est hébergée seule pour protéger les implants, sans que le RNT précise combien ni pendant combien de temps, et aucun des tests comportementaux annoncés n'est nommé.

Objectifs

Dans ce projet, nous étudierons l'orientation spatiale et le contrôle moteur, ainsi que l'intégration multisensorielle et les transformations sensorimotrices nécessaires à ces processus. Nous étudierons comment le cerveau code et combine les informations provenant de sources internes et externes pour percevoir l'environnement, produire un sens de l'orientation et exécuter les réponses comportementales appropriées. Nous utilisons des approches expérimentales complémentaires à plusieurs niveaux chez les rongeurs, au niveau des cellules et des circuits in vivo. Avec nos expériences, nous voulons répondre aux questions suivantes: Comment l'activité cérébelleuse et l'interaction entre le cervelet et le cortex cérébral génèrent-elles une production motrice coordonnée et facilitent-elles l'orientation ? Comment l'activité neuronale se traduit-elle par une activation musculaire et, à son tour, par une production motrice ? Comment des sous-classes de neurones spécifiques contribuent-elles au contrôle moteur et à l'orientation ? Nous visons à étudier l'activité de la population neuronale liée aux schémas de marche spatiale et à l'orientation de la tête, révélant ainsi les mécanismes cérébraux du contrôle moteur, de la coordination, de la navigation spatiale, de la cognition et de l'apprentissage.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation.

Procédures

Dans cette étude, les souris participeront à l’une des trois approches expérimentales suivantes : Approche 1 : Étude de l’activité cérébrale pour comprendre le rôle du cervelet et de son interaction avec le cortex dans le contrôle des mouvements et l’orientation dans l’espace. Approche 2 : Enregistrement simultané de l’activité cérébrale et de l’activité musculaire pour explorer comment le cerveau contrôle les mouvements. Approche 3 : Analyse des liens de cause à effet entre l’activité cérébrale et les comportements des souris. Selon l’approche, les souris seront soumises à une ou deux interventions chirurgicales pour permettre la mesure optique ou électrique de l'activité neuronale. Ces interventions chirurgicales durent 1 heure. Quelques souris subissent une intervention chirurgicale pour mesurer l'activité musculaire qui dure 2 heures. Les souris participeront ensuite à environ 15 sessions de tests comportementaux pendant lesquelles leurs mouvements, leur activité cérébrale et, dans certains cas, leur activité musculaire ou leurs réponses optogénétiques seront mesurés. Chacun de ces enregistrements dure de 30 à 40 minutes, avec un maximum de deux par jour. Pour éviter que leurs congénères n’endommagent les dispositifs implantés, certaines souris seront hébergées individuellement après l’implantation. Pendant les enregistrements, les animaux seront placés de manière à limiter leurs mouvements pour garantir la précision des mesures.

Impact sur les animaux

Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 2 à 3 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation de la tête pendant l'exécution d'une tâche motrice complexe peut induire un état de stress chez l'animal. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Pour éviter cette situation, chaque animal subira un protocole d'habitutation progressive sur une période de 2 à 3 jours comprenant une augmentation progressive du temps passé en situation de tête immobilisée.

Devenir

Le cerveau des 500 animaux est utilisé après le protocole expérimental pour effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movements afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses.

Raffinement

Les animaux de l'étude optogénétique sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les animaux sous examen électrophysiologique doivent être hébergés seuls après l'étape d'implantation afin de protéger l'implant des dommages causés par les congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec eau et nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative. En combinant souris transgénique et injections virales nous serons en mesure de mesurer l’impact fonctionnel d’une population neurale spécifique. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (>P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures.

Éveillées, les souris subissent quatre prises de sang, deux ou trois instillations de vaccin dans le nez et, pour certaines, une ou deux injections dans le derme et un poinçon à l'oreille. 73 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour un vaccin destiné aux bovins contre la besnoitiose, une maladie parasitaire des troupeaux. Le porteur écrit qu'"aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie", et que le choix de la souris "peut se justifier" par la présence du parasite chez des souris sauvages. Il prévoit de mesurer la multiplication du parasite et la baisse de la charge parasitaire, sans qu'aucune procédure ne décrive l'infection des souris.

Objectifs

La besnoitiose, causée par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), représente une menace significative pour l’élevage bovin. Cette maladie entraîne des conséquences graves telles que l’infertilité, des atteintes cutanées, une perte de poids et une mortalité jusqu’à 10% au sein des troupeaux. Maladie ré-émergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites présents dans la peau peuvent être transmis par l’intermédiaire d’insectes ou d’aiguilles avec une progression jusqu’à 20% de nouveaux animaux infectés par an dans les troupeaux touchés. Une transmission par ingestion de parasites présents dans l’environnement sous forme d’oocystes est également suspectée. Aucun traitement curatif n’est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limités au dépistage et à l’élimination des animaux malades ou à l’application d’insecticides. Le développement d’un vaccin efficace offrirait aux éleveurs une meilleure stratégie de contrôle de cette maladie. Le but de ce projet est d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité d’un vaccin sous-unitaire à administration nasale et dermique contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitué de protéines et de glycolipides de B. besnoiti associés à un muco-excipient à base d’amidon. Les souris seront immunisées par voie nasale seule ou par voie nasale puis par voie intradermique afin de déterminer la meilleure stratégie d’administration pour déclencher une réponse immunitaire optimale, tant systémique que locale (cutanée). En effet, la voie nasale d’administration du vaccin devrait déclencher une réponse immunitaire muqueuse, notamment du système respiratoire et de l’intestin, permettant une protection contre une infection orale. Cependant, il n’est pas certain que cette voie d’administration déclenche une réponse immunitaire protectrice contre une infection cutanée. Dans ce cas, une administration intradermique pourrait être nécessaire. Au total, 73 souris adultes seront nécessaires. Puisque le remplacement par des méthodes in vitro n'est pas envisageable en raison de la complexité du système immunitaire et de la nécessité d'étudier l'ensemble de ses réponses, le nombre de souris a été réduit au minimum requis pour obtenir des résultats significatifs. Les souris seront hébergées conformément aux directives européennes, avec un enrichissement (cachette, matériaux à ronger, renforcement positif alimentaire). Toute médication interférant avec la réponse immunitaire est proscrite.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise en évidence du développement d’une immunité protectrice contre Besnoitia besnoiti associée à un effet protecteur contre une infection par le parasite. Ces résultats sont essentiels pour envisager une vaccination de bovins, cibles du vaccin anti-besnoitiose.

Procédures

Les animaux vigiles subiront 4 prises de sang et 4 pesées à 2 semaines d’intervalle et recevront 2 ou 3 instillations par voie nasale à 2 semaines d’intervalle. Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 administrations intradermiques à deux semaines d’intervalle et certains animaux seront identifiés une fois à l'oreille. Chacune de ces interventions dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire pour les administrations nasales et intradermiques ainsi que pour les prises de sang peut engendrer du stress. L’identification des animaux par poinçon à l’oreille peut entrainer une douleur locale temporaire. Les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur localisée temporaire. L’injection intradermique peut entrainer une douleur locale temporaire. L’administration du vaccin peut entraîner une inflammation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d'étudier les réponses immunitaires cellulaires induites par les différentes formulations vaccinales, de déterminer la capacité du parasite à se multiplier in vivo et de déterminer la protection induite par la vaccination en terme de réduction de la charge parasitaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience acquise sur des projets de vaccination contre des parasites de la même famille. Les analyses statistiques seront faites sur les dosages des molécules produites par les cellules du système immunitaire et sur le nombre de parasites.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés à raison de 4 maximum par cage, dans un environnement enrichi permanent (de type igloo pour se cacher) ou ponctuel (de type carré en cellulose pouvant être dépouillé pour la confection d’un nid) après chaque procédure. Une habituation à la prise en main sera réalisée avant le début du protocole. Un renforcement positif sous forme de récompense alimentaire (par exemple : rondelle de banane séchée, popcorn…) sera appliqué après chaque utilisation d’aiguille. Les responsables du projet ont l’habitude de pratiquer les procédures mises en place. Des points limites sont déterminés en vue de mettre fin à d'éventuelles souffrances.

Choix des espèces

Les rares essais d’infection expérimentale par Besnoitia besnoiti sont peu concluants puisqu’aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie. De plus, le parasite n’est pas détecté chez tous les individus infectés lors d’une même expérience. Le choix de la souris peut se justifier par le fait que Besnoitia besnoiti a déjà été détecté chez la souris sauvage, que les parasites ont été localisés dans la cavité péritonéale et les organes internes après infection intrapéritonéale de souris et que les parasites présentaient la même morphologie chez des souris expérimentalement infectées que chez des bovins naturellement infectés. Animaux adultes. Cette expérience ne nécessite pas un stade de développement particulier.

Greffés d'une tumeur sous la peau, dans la peau ou dans le coussinet graisseux mammaire, gavés jusqu'à cinq fois par jour et saignés jusqu'à quatre fois par jour à la veine saphène, 88 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme réduire le nombre de manipulations au strict nécessaire, dans un projet dimensionné pour environ 170 études par an pendant cinq ans, à la demande de clients. Les animaux dont la tumeur ne pousse pas sont utilisés pour entraîner le personnel au gavage et aux prélèvements sanguins, ou tués pour fournir des organes témoins. Ceux qui passent d'une procédure à la suivante sont tués à la fin de la seconde, les autres à la fin de la leur.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements dans des modèles ectopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses à un site ne correspondant pas à celui de la tumeur d’origine) chez la souris ou le rat pour les cancers dont les besoins sont non satisfaits. Ce projet comprend quatre procédures : -Développement de modèles ectopiques - Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie (PK/PD) d’une molécule d’intérêt chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de la tolérabilité d’une molécule d’intérêt après administration unique ou répétée chez le rongeur porteur de tumeur - Evaluation de l’efficacité d’une molécule d’intérêt sur des modèles ectopiques chez le rongeur. La première étape qui permettra par la suite d’évaluer une nouvelle molécule d’intérêt thérapeutique est le développement de modèles ectopiques. La greffe sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour des cellules tumorales d’origine humaine (xénogreffe) ou sur des animaux immunocompétents de même espèce que la lignée tumorale (modèles syngéniques). En fonction des cellules injectées, les greffes seront réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire. Trois types d’études pourront ensuite être réalisées sur ces souris/rats porteurs de tumeurs décrites ci-dessous. L’évaluation de la PK/PD est réalisée en analysant les concentrations sanguines et/ou tissulaires d’un composé ainsi que les niveaux d’expression/activation de biomarqueurs associés après administration unique ou répétée du composé. Le modèle PK/PD établi est indispensable pour la détermination des doses et fréquence à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et il permet également de prédire les doses à administrer lors des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’Homme. L’évaluation de la tolérabilité d’un composé est réalisée à des doses thérapeutiques déterminées par des études de pharmacocinétique sur souris naïves et des études PK/PD effectuées en amont. Elle consiste en l’administration unique ou répétée d’un composé et à l’observation de signes cliniques des animaux pour déterminer la/les doses et/ou la fréquence d’administration qui pourront être utilisées dans les études consécutives.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie. A long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales à l’aide d’une aiguille réalisées par voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire sous anesthésie gazeuse : durée 30 secondes 1 seule fois pendant l’étude. Dans le cas de l’utilisation d’un trocart, sous anesthésie gazeuse : durée 30 sec 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs : o Avec le pied à coulisse : durée 30 secondes 2 à 3 fois par semaine sur animaux vigiles. o Avec l’appareil de bioluminescence : durée 10 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour), intratumorale (1 injection/jour), ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irraidation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence o par voie intrapéritonéale (max3xsemaine) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine caudale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) o via amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l’extrémité non innervée de la queue) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront injectés avec des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (sévérité légère) et tatoués (sévérité légère). Certains modèles tumoraux peuvent nécroser, d’où l’intérêt de choisir un site d’injection de cellules tumorales adapté (voie sous-cutanée, intradermique, interscapulaire ou dans le coussinet graisseux mammaire) grâce à la procédure de développement de modèles pour éviter ces nuisances aux animaux. Pour les procédures de PK/PD, de tolérabilité et d'efficacité, les animaux sont traités avec des molécules pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées notamment durant les études de tolérabilité (dose du composé importante) et d’efficacité (traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour la procédure de développement de modèles peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou de tolérabilité puis seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de tolérabilité peuvent être réutilisés pour effectuer une étude de PK/PD ou d'efficacité et seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Pour les procédures de PK/PD et d'efficacité, ainsi que pour les animaux des procédures développement de modèles et de tolérabilité non-réutilisés, les animaux seront mis à mort à l’issue de leur procédure respective. Quelque soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, ils ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive avec une multitude de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme) sans recours à l’animal. En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’études prévues pour ce projet se base sur l’analyse rétrospective des trois dernières années, nous estimons que pour les 5 ans de ce projet, 170 études environ seront conduites par an. Les données de mise en place des modèles obtenus dans la procédure développement de modèle" permettront de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de PK/PD, de tolérabilité ou d'efficacité. Une analyse de puissance statistique sera appliquée pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée. Les animaux qui sont exclus des études pour des raisons de taille tumorale trop petite ou trop grande sont toujours utilisés pour permettre d’avoir soit des tissus témoins pour la détermination du pourcentage de liaison aspécifique ou de la concentration des molécules d’intérêt dans les tumeurs. Si des tumeurs n’ont pas du tout poussé, les animaux pourront être utilisés pour des entraînements à différents gestes techniques tels que le gavage ou les prélèvements sanguins ou pour récupérer des matrices blanches (organes, sang, plasma). De plus les procédures sont interconnectées et les animaux peuvent être utilisés pour plusieurs procédures limitant de ce fait l’utilisation d’animaux. Les animaux de la procédure "développement de modèle" peuvent être inclus dans une procédure de PK/PD ou de tolérabilité. Les animaux inclus dans une procédure de tolérabilité pourront également être inclus dans une étude de PK/PD ou d’efficacité.

Raffinement

Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée des procédures. En cas d’apparition de signe de douleur, une injection unique en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Une fiche de suivi des signes cliniques sera mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées et d’appliquer des points d’arrêt anticipés les plus précoces possibles. Ainsi, à partir d’un total de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seront prises telles qu’aliment humide au sol ou ajout d’enrichissement, et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer, nous utiliserons donc des animaux adultes.

Une injection de composant bactérien, deux prélèvements de sang à la joue sans anesthésie et une prise de température rectale toutes les deux heures, le tout en six heures : 648 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à vérifier chez l'animal vivant des mécanismes régulateurs de l'inflammation repérés en culture cellulaire, en comparant des souris génétiquement invalidées à des témoins. Toutes sont tuées, le porteur indiquant que l'injection rend leur survie difficile au-delà de six heures et que les prélèvements les affaiblissent. La souris est retenue parce qu'elle est l'animal le plus utilisé en immunologie et que les lignées modifiées sont déjà disponibles.

Objectifs

La réponse inflammatoire est bénéfique pour l'organisme humain car elle le protège efficacement contre les infections et favorise également la réparation des tissus lésés. Cependant, lorsque l'inflammation devient excessive, elle peut devenir délétère et causer des syndromes auto-inflammatoires. L'inflammation est déclenchée par des senseurs de pathogènes ou de stress, notamment au sein des plateformes de signalisation qui contrôlent la sécrétion de composants dans notre sang. Ces composants indiquent à notre système immunitaire de réagir à quelque chose de nocif, comme une infection. Les mécanismes de régulation ainsi que l'activation de la voie de l'inflammation restent peu compris. De nouveaux mécanismes régulateurs de l'inflammation ont été découverts grâce à des approches in vitro. Le projet vise donc à valider l'importance de ces régulateurs in vivo. Pour cela, nous testerons la réponse inflammatoire de souris génétiquement invalidées pour ces mécanismes régulateurs. L'inflammation sera déclenchée par l'injection d'un composant bactérien connu pour induire une inflammation systémique chez la souris, caractérisée par des symptômes précoces tels que l'abaissement de la température et l'élévation des signaux d'alarme déclenchant les mécanismes de défense de l'organisme contre les infections. Ce projet vise donc à comparer ces deux paramètres entre des souris témoins (sauvages) et des souris invalidées pour les mécanismes régulateurs de l'inflammation, 4 à 6 heures après l'injection du composant bactérien. Au cours de ce projet, nous allons étudier plus précisément le rôle respectif des différents composants de cette voie inflammatoire en utilisant des souris génétiquement modifiées capables ou non d'activer cette voie. En résumé, le projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires régulant l'inflammation. Cette recherche pourrait avoir des implications importantes pour la compréhension et le traitement des maladies inflammatoires chez les humains.

Bénéfices attendus

Une inflammation excessive et dérégulée est associée à des syndromes auto-inflammatoires, entraînant des symptômes qui altèrent la qualité de vie des patients. L'activation d'une voie spécifique de l'inflammation pourrait contribuer à ce phénomène. Les souris souffrant d'une infection sévère présentent une activation de cette voie. L'injection d'un composant bactérien est largement utilisée dans la recherche pour induire une inflammation en formant des complexes protéiques appelés inflammasomes. Jusqu'à présent, les mécanismes de régulation et d'activation de cette voie inflammatoire restent mal compris. Des ligneées des souris chez lesquelles certains régulateurs spécifiques de cette voie inflammatoire ont été désactivés ont été générées afin d'étudier l'impact de ces régulateurs dans la régulation de cette voie chez la souris après une infection sévère. En plus de ces souris, des modèles de souris présentant une fonction inflammatoire dérégulée ont également été créés. En étudiant spécifiquement le rôle de différents composants de cette voie inflammatoire, nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de prévenir une inflammation excessive. En résumé, notre projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents à l'inflammation excessive, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des stratégies de traitement pour les maladies inflammatoires.

Procédures

Le projet repose sur un modèle d'infections chez la souris, impliquant l'injection d'un composant bactérien sur des animaux éveillés. Cette injection, réalisée sur une durée de 10 secondes, est effectuée une seule fois au début de la procédure sur 648 animaux. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sans anesthésie pour prelever petite quantité de sang sur une durée de 10 secondes sur 648 animaux. Un seul prélèvement sur 648 animaux sur une durée de 20 secondes seront realises sous anesthésie générale à la fin de l'expérience.

Impact sur les animaux

Lors de l'injection, il peut y avoir une douleur au point d'injection ainsi qu'une réduction de l'activité et de la mobilité des animaux. De plus, il existe un risque d'hypothermie consécutive à l'injection de substance bactérienne pendant les premières heures. Les prélèvements de sang au niveau de la joue peut induire du stress chez les animaux. En outre, les prises de température rectale peuvent également causer du stress chez les animaux.

Devenir

Tout les animaux utilisés dans procédure seront mis à mort selon une méthode réglementaire. Les souris seront euthanasiées après la procédure, car l'injection de LPS provoque un état inflammatoire chez les souris, rendant difficile leur survie au-delà de 6 heures. De plus, le sang est prélevé à plusieurs reprises pendant la procédure, ce qui affaiblit les souris.

Remplacement

Un modèle basé uniquement sur des cellules isolées ou l'utilisation d'outils informatiques ne pourrait pas refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire face aux infections sévères, ni les interactions entre les différentes cellules immunitaires. Une étude menée sur un animal entier est donc indispensable à des fins exploratoires, et nous utiliserons un modèle d'infection largement validé dans d'autres études.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été effectué afin de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, plusieurs analyses utilisant diverses techniques seront effectuées sur les prélèvements, ce qui permettra de minimiser le nombre de souris utilisées. L'utilisation à la fois de mâles et de femelles permet ainsi de limiter la perte d'animaux.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été optimisées pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. Leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans toutes les procédures en termes de conditions d'élevage. Il y a un suivi des souris sur 6 heures, la prise de température toutes les 2 heures, l'utilisation de la grille d'évaluation du comportement des souris. La surveillance raprochée des animaux nous permettra d'identifier précocement tout changement physique (blessure) ou comportemental, qui sont des signes de stress. Des points limites bien définis permettent de limiter la souffrance animale au minimum.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie, avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement. Des modèles génétiquement modifiés sont d'ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.