Recherche fondamentale

240 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une restriction alimentaire de 20 % pendant quinze mois à partir de l'âge de six mois, et toutes passent de seize à vingt jours en hébergement individuel avant un gavage, une thoracotomie sous anesthésie profonde, un prélèvement total du sang et une perfusion de paraformaldéhyde. L'objet reste exploratoire, comprendre comment une réaction inflammatoire cérébrale qui suit un repas gras évolue avec l'âge. Le porteur écrit que la restriction alimentaire prolonge la durée de vie de plusieurs mois, et affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'équilibre énergétique de façon intégrée.

Objectifs

L’existence d’une réaction inflammatoire postprandiale (ou postprandial inflammatory reaction, PIR) est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. De même, les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR ne sont pas tous élucidés. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau chez la souris. La PIR cérébrale se caractérise notamment par une activation des cellules microgliales chez le jeune mâle adulte, sain, en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas et se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les mécanismes biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables d’activer directement les cellules microgliales de l’hypothalamus. Dans ce projet, nous allons étudier l’influence de l’âge sur la PIR cérébrale en l’analysant de manière comparée entre de jeunes adultes (2-3 mois) et des individus âgés (20-21 mois). En effet il a été montré que la régulation de la prise alimentaire se fait moins bien avec l’âge et que la réponse physiologique à un repas gras pourrait en être affectée. D’autre part, une restriction calorique modérée (20%) sur le long terme étant connue pour retarder le vieillissement, nous allons comparer l’installation de la PIR cérébrale chez des individus mâles âgés nourris ad libitum versus soumis à une restriction calorique modérée prolongée. Les résultats seront comparés aux données obtenues sur de jeunes mâles adultes. Au travers de différentes mesures, nous chercherons à établir des corrélations entre développement de la PIR cérébrale, comportement alimentaire, statut neuro-inflammatoire et compétences cognitives. PIR cérébrale et statut neuro-inflammatoire seront étudiés par histologie post mortem des cerveaux. Ce projet prévoit une étude sur 240 souris.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants biologiques de la PIR cérébrale chez la souris, et donneront des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et permettra de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire qui surviennent lors du vieillissement.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont : -1 gavage 1 à 3 heures avant la mise à mort (durée

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont le stress et la douleur lors de la contention et du gavage, la douleur lors de l’injection intrapéritonéale d’anesthésique en point terminal pour tous les animaux, la douleur en point final lors de la thoracotomie ainsi que l’isolement de tous les animaux en fin de procédure, de 16 à 20 jours selon les procédures. La restriction alimentaire des animaux, même modérée, est source de stress à court terme. Elle est cependant bénéfique sur le long terme avec une courbe de poids stationnaire et une durée de vie prolongée de plusieurs mois.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des deux procédures afin de prélever : - le sang en vue d’analyses biochimiques plasmatiques - le cerveau en vue d’analyses histologiques

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou par simulation informatique. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

La mise en place de conditions prandiales définies a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Le nombre d’individu par lot (n=12) pour les analyses histologiques, biochimiques, et comportementales a été défini précédemment. Ces effectifs sont appropriés pour réaliser des tests de corrélation et des études statistiques comparatives suffisamment robustes. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux sur des effectifs réduits. Dans le détail, une fois les conditions d’application des analyses vérifiées (nombre d’individus par lot, tests de normalité, test d’égalité des variances) les analyses comparées des groupes expérimentaux deux à deux seront réalisées à l’aide de tests t de student en cas de normalité des données ou de tests de rang dans le cas contraire.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, deux semaines d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux avec la mise en place d’une grille de score, l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance, et de méthodes de mises à mort si nécessaire.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Pour l’influence de l’âge et le bénéfice de la restriction calorique, les expériences seront réalisées sur des souris (mâles) jeunes adultes (2-3 mois) et âgées (20-21 mois), afin de comparer les réponses cérébrales en fonction de l’âge.

Modifiées pour suractiver leur système lymphatique, 430 souris femelles vont être utilisées à partir de cinq semaines, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant trois semaines, avant d'être transportées vers un second établissement où leur est infligée une perfusion intracardiaque sans réveil. Le porteur résume les atteintes en une phrase, des douleurs modérées et un léger stress liés au développement de la tumeur. La mise à mort sert à récolter les tissus, et le résumé revendique l'expérimentation animale comme "l'unique approche" pour comprendre ces processus.

Objectifs

Le système vasculaire lymphatique a pour but de drainer les graisses, les liquides interstitiels, les macromolécules et les cellules immunitaires afin de maintenir l'homéostasie tissulaire. En condition pathologique, il joue un rôle primordial dans le cancer. En effet, le système lymphatique est le premier site de dissémination métastatique des tumeurs solides, notamment au niveau des ganglions lymphatiques. La lymphangiogenèse, croissance de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants, se développe à la fois sur le pourtour des tumeurs et dans le ganglion sentinelle afin de préparer la « niche métastatique ». Bien que ce processus ait été clairement démontré au cours des 20 dernières années, les mécanismes moléculaires restent encore à élucider. Dans ce projet, nous postulons que la croissance du système vasculaire lymphatique péritumoral est stimulée à la fois par la tumeur primaire, mais également par son microenvironement (tissu adipeux). Nous postulons qu’en ciblant le microenvironement tumoral, nous allons pouvoir réduire la lymphangiogenèse et inhibiter la formation de métastases. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques anti-lymphangiogéniques, nous allons utiliser trois modèles murins de tumeurs solides ainsi qu’un modèle spontané de carcinome mammaire. D’autre part, des études récentes ont démontré que le système lymphatique participait activement à l’échappement des tumeurs face au système immunitaire en exprimant des récepteurs des points de contrôle immunitaires. Nous allons dans un deuxième temps évaluer les inhibiteurs des points de contrôle dans ces modèles.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle du système lymphatique dans la progression cancéreuse. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Nous espérons pouvoir identifier quels sont les points de contrôle immunitaires exprimés par le système lymphatique afin de proposer des agents anti-lymphangiogéniques en combinaison avec ces molécules.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, 2 interventions : injection de cellules tumorales en sous-cutané (une seule fois) suivi d'injections intraperitonéales tous les 2 jours pendant 3 semaines. Dans le second établissement utilisateur, 1 intervention : perfusion intracardiaque sans réveil.

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Le système lymphatique joue un rôle primordial dans les communications inter-organes et dans l’homéostasie tissulaire. Les effets pléiotropiques de ce système font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l'expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est calculé à l'aide d'un logiciel dédié (G power). Le logiciel utilise un modèle mathématique pour déterminer le nombre d'animaux minimum pour avoir des résultats stastitiquement significatifs à l'aide d'un test two way ANOVA afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement. Nous nous tiendrons au nombre d'animaux par groupes indiqués par le logiciel. Ainsi, il est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car la suractivation du système lymphatique par expression du transgène Ap2-VEGFC a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des modèles de carcinomes murins (PyMT, LLC, B16). Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 26 semaines.

1 560 souris vont être élevées puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever leurs organes lymphoïdes. Une partie reçoit un produit inducteur par voie intrapéritonéale, une injection par jour pendant trois jours espacées de deux jours, geste qui dure une vingtaine de secondes. Les souris privées en permanence de la protéine étudiée développent des lymphomes T à partir de dix semaines : le porteur prévoit de les tuer à neuf semaines, avant que le "phénotype dommageable" ne s'exprime. Il affirme que ces souris sont "indispensables" parce qu'elles seules fournissent des lymphocytes T naïfs dans leur état naturel, qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit à ce jour.

Objectifs

Notre équipe étudie une protéine essentielle pour le développement des cellules sanguines et le fonctionnement des lymphocytes B et T. Nos recherches montrent qu'elle joue un rôle clé dans l’activation et la spécialisation des lymphocytes T, mais ses mécanismes d’action restent à élucider. L’objectif de ce projet est de déterminer comment cette protéine contrôle la génération et la maintenance des lymphocytes T inflammatoires. Nous élèverons des souris n'ayant plus cette protéine soit de manière chronique et spécifique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Ces souris sont indispensables car elles seules permettent d’obtenir des cellules T « naïves » dans leur état naturel, qui sont les cellules dont nous avons besoin pour étudier leur destin inflammatoire et que nous ne pouvons remplacer par un modèle alternatif. Ce projet pourra ouvrir de nouvelles perspectives pour mieux comprendre et traiter les maladies immunitaires. Après mise à mort, les organes lymphoïdes seront récupérés et des expériences in vitro seront réalisées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre les mécanismes qui contrôlent l'activation et la polarisation des lymphocytes B et T, acteurs principaux de la réponse immunitaire adaptative jouant un rôle crucial dans le développement de cancers et pathologies auto-immunes et inflammatoires. Cela permettra d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Procédures

Les injections du produit permettant la suppression de nos protéines se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours, à 2 jours d'intervalle. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant plus la protéine d'intérêt peuvent développer des lymphomes T à partir de 10 semaines, ce qui peut rester asymptomatique mais dans certains cas pourrait conduire à une perte de poids, une prostration. Les animaux seront alors mises à mort à l'âge de 9 semaines pour ne pas atteindre un phénotype dommageable. L'injection de tamoxifène par voie intrapéritonéale ne prendra que quelques secondes. Une infection pourrait se développer au niveau du site d'injection du tamoxifène, ce qui pourrait entraîner une douleur. Ce site sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin.

Devenir

mise à mort et prélèvement d'organes

Remplacement

Nous travaillons sur le devenir des cellules T naïves, qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le seul but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des cellules T naïves in vitro. Les souris présentant une absence chronique de notre protéine ont un phénotype dommageable et seront observées quotidiennement selon la règlementation. Les souris ne possédant plus notre protéine après injection d'un produit, ne possèdent pas de phénotype dommageable car elles seront utilisées rapidement après induction. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Selon les expériences menées in vitro, un test statistique de Mann-Whitney sera effectuée pour comparer les groupes.

Raffinement

Les animaux seront utilisés avant qu'aucun problème de santé potentiel ne se développe. Les zootechniciens surveilleront les souris quotidiennement selon la procédure règlementaire afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration, en s’assurant de ne jamais atteindre un point limite. Les animaux seront élevés en groupe dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Lors de l’injection du produit entraînant la disparition de notre protéine d'interêt, le risque d’infection dans la zone d’intérêt sera pris en considération.

Choix des espèces

Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement (souris- knock-out, transgéniques), ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme, ce qui permet de travailler dans un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T. Pour ces raisons, les souris représentent un modèle de référence dans l’étude des mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des maladies auto-immunes, ce qui est l’objet de notre recherche. Les souris ayant une absence chronique de la protéine d'interêt, sont susceptibles de développer des lymphomes à partir de 10 semaines. Dans ce cas, les expériences seront effectuées sur des animaux adultes sevrés et âgées entre 4 et 9 semaines afin d’isoler les cellules T naïves sans prendre le risque d'une présence de lymphome. Pour la lignée de souris inductibles, nous induirons la délétion d’Ikaros après injection d'un produit. En utilisant ce protocole d’induction, les souris n’auront pas le temps de développer de lymphomes au moment où les organes lymphoides seront récupérés. Le nombre de cellules T naïves diminue avec l'âge. cependant, nous savons qu'un nombre suffisant de cellules T naïves peut être récupéré dans les organes lymphoïdes secondaires jusqu'à l'âge d'environ 20 semaines. Pour notre étude, nous pourrons donc induire la suppression de nos protéines et récupérer les organes pour les études in vitro sur des animaux entre 4 et 15 semaines.

Une incision au niveau du cou, refermée par un fil de suture, pour instiller dans la trachée une élastase qui détruit une partie des alvéoles pulmonaires : 288 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs prélèvent les poumons sous anesthésie après exsanguination, à vingt et un, quatre-vingt-dix ou cent cinquante jours selon les groupes. Le projet teste si l'activation d'une protéine du métabolisme des lipides dans les fibroblastes permet de reformer des alvéoles, piste qui déboucherait sur un traitement de l'emphysème humain, aujourd'hui inexistant. Le porteur dispose de co-cultures 3D de cellules humaines qu'il décrit comme des "outils in vitro d'intérêt", tout en concluant qu'elles "ne peuvent pas se substituer complètement" au modèle murin.

Objectifs

L’emphysème est une maladie pulmonaire provoquant une destruction alvéolaire irréversible, sans traitement disponible actuellement. Une des causes de l’absence de réparation des alvéoles est le manque de lipides dans les fibroblastes (cellules de structure) qui entourent les cellules souches épithéliales des alvéoles. Activer les voies qui augmentent la synthèse de lipides dans les fibroblastes pourraient être un moyen d’induire une réparation des alvéoles au cours de l’emphysème. SREBP (Sterol regulatory element-binding proteins) est une protéine importante impliquée dans la synthèse des lipides. Notre hypothèse est que l'augmentation de la protéine SREBP dans les fibroblastes pourrait favoriser la réparation des alvéoles au cours de l’emphysème. Pour tester cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant une délétion de deux protéines (Insig1 et Insig2) qui empêchent la synthèse de lipides. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. Le niveau de sévérité de l’emphysème sera évalué par des analyses morphologiques du poumon. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous mettrons en culture 3D des fibroblastes issus de ces souris avec des cellules épithéliales de souris contrôles. Nous anticipons l'augmentation du nombre d'alvéoles chez les souris génétiquement modifiées et une augmentation de la prolifération et de la différentiation cellulaire en culture 3D.

Bénéfices attendus

Si les souris ayant une absence de Insig1 et 2 présentent une réparation alvéolaire suite à l'injection d'élastase, cette voie sera considérée comme cruciale dans la réparation alvéolaire et pourrait mieux être étudiée chez l'homme pour créer de nouvelles alvéoles chez les patients souffrant d'emphysème pulmonaire. Les agonistes de la voie SREBP pourraient alors être envisagés pour traiter l'emphysème chez l'Homme.

Procédures

Instillation dans la trachée sous anesthésie générale, injection dans le péritoine sur animal vigile et prélèvement des poumons sous anesthésie générale après exanguination, sans réveil. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 24 souris seront injectées à l’élastase vs 24 souris au PBS (contrôle), ii) la co-culture 3D permettra d'étudier les capacités des fibroblastes à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 24 souris seront injectées à l'élastase et 24 souris a PBS (contrôle).

Impact sur les animaux

Le modèle génétique induisant la délétion de Insig1 et Insig2 dans les fibroblastes n'est pas un phénotype dommageable pour les animaux. L’injection d'élastase nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. Cette procédure est modérée avec un faible risque d'infection au niveau de la plaie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.

Remplacement

La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une activation de SREBP permettra de déterminer si les cellules responsables de la régénération sont les fibroblastes dans l’emphysème pulmonaire et si SREBP est la protéine clé dans ce processus. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles de co-culture cellulaire 3D chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfonction cellulaire chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variabilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 288, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales nous utiliserons 3 groupes : Le groupe ayant une activation de SREBP et deux groupes contrôles nécessaires pour ce type de modification génétique. Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris, les animaux seront injéctés soit à l'élastase, soit au PBS. Pour résumer, nous aurons 8 animaux par condition, c'est à dire 16 animaux par modèle génétique, donc 48 animaux par expérience. Nous faisons 2 expériences (nombre d'alvéole et culture 3D) à 3 temps différents, ce qui fait un total de 288 animaux.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière sur le comportement et les signes de douleurs des animaux ayant reçu une injection dans la trachée. Cela permettre de ne pas rater une mauvaise réaction de l’animal à l’instillation d’élastase lorsqu’il se réveille de l’anesthésie et ainsi d’agir à temps pour éviter toute souffrance. Une surveillance sur 24h est faite de principe, il y a très exceptionnellement un problème dans les suites de l’injection. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Une grille d’évaluation des points limites sera utilisée pour graduer le mal être, avec mise à mort compassionnelle si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.

Six heures de perfusion de glucose radiomarqué par pompe osmotique implantée sous la peau, trois prélèvements de sang, puis deux séances d'IRM séparées par un trajet en voiture d'un site à l'autre : 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des souris Nude, immunodéficientes, dont le porteur reconnaît le "phénotype dommageable", choisies pour qu'elles ne rejettent pas les greffes de cellules tumorales de surrénale posées dans leur flanc ou dans le coussin graisseux du cou. Ces greffes peuvent gagner en profondeur, fusionner avec les muscles dorsaux et comprimer la colonne vertébrale, jusqu'à une paraplégie. Toutes seront tuées pour récupérer la tumeur, le porteur estimant qu'il ne serait "pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur".

Objectifs

Les cancers de la glande surrénale sont des cancers rares qui ont la particularité d’être fréquemment héréditaires. Les patients sont porteurs d’anomalies génétiques qui leur procurent un risque très important de développer une ou plusieurs de ces tumeurs au cours de leur vie. Dans certains cas, ces anomalies génétiques sont par ailleurs la cause de forme plus agressives de la maladie avec le développement de métastases dans les os ou le foie notamment. A l’heure actuelle, les traitements sont peu efficaces pour traiter ces patients et le diagnostic précoce de la présence d’une tumeur, permettant de la retirer par chirurgie reste le traitement le plus efficace. Dans le cas des formes héréditaires, l’identification d’une anomalie génétique permet de proposer un test génétique au membre de la famille pour identifier les individus porteurs de l’anomalie et leur proposer un suivi préventif. Des travaux antérieurs ont montré que l’une des conséquences de ces anomalies génétiques étaient une modification de la façon dont les cellules cancéreuses transforment les sucres, en particulier le glucose. Ces modifications du métabolisme peuvent être utilisées à la fois comme outils diagnostiques (les modifications étant différentes en fonctions du type d’anomalie génétique) et thérapeutique (le ciblage de ces modifications pourrait empêcher les cellules cancéreuses de se nourrir et donc de proliférer). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles souris chez qui nous grefferons sous la peau des cellules tumorales ayant différentes anomalies génétiques retrouvées chez les patients. Dans ces modèles, nous étudierons comment les cellules cancéreuses utilisent le glucose pour proliférer. Nous développerons également des techniques d’imagerie par IRM qui permettront d’identifier les anomalies du métabolisme du glucose, en lien avec chaque type d’anomalie génétique. Ces travaux devraient permettre à fois d’identifier des voies qui pourraient être la cible de thérapie anti-cancéreuses spécifiques des anomalies génétiques (et donc potentiellement responsables de moins d’effets secondaires des traitements), et de développer des outils facilement utilisables en radiologie pour détecter les patients porteurs de ces anomalies génétiques. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs ou "EU. La mise en place des modèles de souris est réalisée dans l'EU1 et l'imagerie sera effectuée sur deux appareils d’IRM différents situés sur 2 sites distincts (EU2 et EU3).

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des différents mécanismes de malignité des tumeurs en fonction de leurs mutations ainsi qu’à la compréhension de leur métabolisme complexe dans un contexte in vivo, le laboratoire pourra proposer de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant des métabolites uniquement dans les cellules tumorales de la surrénale. Cette étude pourrait également permettre de développer une méthode innovante de diagnostic précoce ou de réponse thérapeutique pour les tumeurs pouvant, in fine, être transférée chez les patients.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour avoir une greffe de cellules tumorales dans le flanc ou dans le coussin graisseux sous anesthésie et analgésie (moins de 10 minutes). Une partie des animaux subira une perfusion intraveineuse de glucose radiomarqué durant 3h, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une autre partie des animaux subira une perfusion de glucose radiomarqué durant 6h par pompe osmotique, avec 3 prélèvements de sang de 50 µL (30 secondes par prélèvement), sous anesthésie gazeuse et analgésie. Une troisième partie des animaux sera transportée en voiture du site 1 vers le site 2 pour une première séance d’imagerie IRM de 30 minutes sous anesthésie gazeuse. Après transport en voiture de 30 minutes vers le site 3, ces animaux auront une acclimatation de 3 à 7 jours puis une seconde séance d’imagerie IRM de 30 minutes sur le site 3.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un léger stress lors de la contention, de l’anesthésie et lors du transport vers les différents sites d'expérimentation. L’injection de cellules tumorales peut provoquer de l’inflammation au niveau de la zone d’injection pouvant induire une irritation. L'implantation d’une pompe osmotique sous cutanée ainsi que le développement d’une tumeur dans le coussinet graisseux peuvent causer une légère douleur et potentiellement une réduction temporaire de la mobilité de la souris. Les tumeurs greffées sous le coussinet graisseux des souris peuvent potentiellement se développer en profondeur et adopter un comportement métastatique en fusionnant avec les muscles dorsaux résultant en une compression de la colonne vertébrale. Les animaux peuvent rarement montrer rapidement des signes de difficultés motrices dans les postérieurs, se développant en paraplégie.

Devenir

Les animaux seront élevés pour être utilisés lors d’expérience où ils développeront des tumeurs, suite à une injection de cellules ou une greffe d’un fragment de tumeur dans le flanc ou dans la graisse du cou. À la fin de ces expériences les animaux seront euthanasiés pour récupérer la tumeur car il ne serait pas possible de maintenir les animaux en vie tout en respectant leur bien être après avoir retiré la tumeur.

Remplacement

Les analyses in vitro ne sont pas suffisantes pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse, notamment la caractérisation des évènements menant au processus métastatique, qui intègre le microenvironnement tumoral, la néovascularisation, et les régulations endocrines. Il est donc très difficile voire impossible de reproduire fidèlement l'ensemble de ces interactions in vitro, dans des modèles de cellules isolées. De plus, les cellules humaines de ce cancer ne poussent pas en culture in vitro. Il est donc encore nécessaire d’utiliser un modèle murin afin de s’approcher au plus des tumeurs humaines.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitement, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre restreint d’animaux au maximum de sorte à pallier le problème de variation observable in vivo mais également dû à la différence de taille des tumeurs qui peut considérablement altérer le métabolisme intra tumoral, soit 2240 animaux au total sur 5 ans. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.

Raffinement

Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des maisonnettes et morceaux de bois si nécessaire. Les animaux sont hébergés à un maximum de 5 par cage et s'il y a nécessité d'un hébergement individuel dû à une blessure ou une bagarre, il sera placé en cage double séparé d’un congénère par une cloison transparente trouée. Les animaux Nude présentent un phénotype considéré comme dommageable à cause de leur statut immuno-déficient. Ils seront hébergés en zone d’expérimentation dédiée aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous une hotte de change préalablement désinfectée afin de réduire l'impact de leur phénotype et qu'il ne s’exprime en développant une quelconque maladie. La procédure chirurgicale pour les greffes est pratiquée après administration en sous-cutané d’un analgésique 30 minutes avant la chirurgie. Les animaux sont ensuite endormis et maintenu par anesthésie gazeuse sur un tapis chauffant puis surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux est observé, au minimum, deux fois par semaine afin de monitorer leur bien-être et d’observer l’apparition des tumeurs. Les souris sont pesées toutes les semaines pour détecter toute variation de poids anormal, ou stagnation malgré l’augmentation du volume tumoral. Dès l’apparition de tumeurs, celles-ci seront mesurées avec un pied à coulisse deux fois par semaine. Les animaux ayant reçu une greffe de pompe osmotique seront monitorés toutes les heures jusqu’à la fin de l’expérimentation. Le transport des animaux entre les sites d'expérimentation se fera en voiture dans des cages de transport adaptée avec litière, cotons compactés et gelée alimentaire adaptée au besoin des animaux. Des points limites adaptés ont été défini au préalable afin de réduire au maximum la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’augmenter les chances de prise tumorale à partir des greffes de cellules, nos lignées cellulaires étant également d’origine murine. Par ailleurs le modèle murin nous permet d’avoir accès à des animaux immunodéficients qui constituent un modèle préclinique particulièrement adapté à la réalisation de greffes de cellules et/ou tumeurs humaines ou murines. Nos lignées cellulaires sont issues de différentes souris, rendant préférable l’utilisation d’une souris receveuse immunodéficiente afin de minimiser le risque de rejet de greffes. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines (jeunes adultes ayant atteint la maturité ; cet âge correspond à l’âge médian de développement de la maladie chez l’Homme). C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

8 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau et, par chirurgie, dans le colon et dans le foie, puis jusqu'à trois traitements, deux vaccins, douze injections de substrat et treize anesthésies gazeuses, avec prélèvements de sang et de fèces. Le porteur attend de ces modèles qu'ils éclairent le rôle de lymphocytes intestinaux dont il a déjà breveté l'"énorme potentiel clinique", les retombées pour les patients restant au conditionnel. Il écrit par ailleurs qu'"en général, aucun signe de souffrance des animaux n'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs".

Objectifs

Notre projet vise à améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, souvent incurable. Nous cherchons à développer de nouvelles thérapies, en particulier des immunothérapies. Pour cela, nous voulons mieux comprendre l’immunité développée dans les tumeurs primitives, situées au niveau du colon, ainsi que dans les tumeurs secondaires (les métastases), principalement situées au niveau du foie dans ce type de cancer. Nos travaux précédents, ainsi que ceux d’autres groupes, ont démontré que l’immunité mise en place spécifiquement dans l’intestin, jouait un rôle déterminant dans le devenir des tumeurs aussi bien localement dans le colon qu’à distance, dans les métastases hépatiques ou dans d’autres localisations métastatiques. La réponse immunitaire, développée localement dans l’intestin, est très particulière et comprend notamment des lymphocytes intestinaux spécifiques (cellules immunitaires « tueuses » de tumeurs), qui ont des propriétés et des caractéristiques différentes des lymphocytes localisés dans les autres organes. Dans les modèles murins, ces lymphocytes intestinaux spécifiques ont la capacité, après avoir été activés par les tumeurs de colon, de sortir de l’intestin, migrer dans l’organisme et aller infiltrer et éliminer des tumeurs « extra-intestinales » localisées par exemple dans le foie ou sous la peau. Ainsi, pour étudier ces lymphoyctes intestinaux spécifiques, leurs voies d’activation dans l’intestin, leurs « super-propriétés » anti-tumorales, leurs migrations dans l’organisme, nous devons reproduire la maladie dans sa complexité multi-tumorale chez l’animal, avec des tumeurs primitives localisées dans l’intestin (dans le colon) et des métastases à distance. A terme, étudier ces cellules « tueuses » de l’intestin, nous permettra d’exploiter i) leur potentiel à représenter chez le patient un marqueur biologique (biomarqueur) traduisant la réponse aux thérapies ou ii) leur potentiel à représenter une cible thérapeutique, par exemple pour le développement d’un vaccin.

Bénéfices attendus

Dans le but d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de cancer colorectal métastatique, nous utilisons dans ce projet des modèles précliniques afin d’étudier en détail les lymphocytes intestinaux spécifiques "cellules immunitaires tueuses de tumeurs" chez la souris. Nous avons montré que ces cellules sont particulièrement performantes pour éliminer les tumeurs primitives de colon mais aussi leurs métastases (tumeurs secondaires à distance). Nous avons récemment publié des travaux scientifiques dans lesquels nous avions déjà utilisé ces modèles précliniques, ainsi que des cohortes de patients. Nous avons également breveté l’énorme potentiel clinique derrière l’exploitation de ces cellules antitumorales mais beaucoup reste à faire et plusieurs bénéfices sur la prise en charge des patients peuvent decouler de notre projet. Nous pensons que ces lymphocytes spécifiques, provenant de l’intestin, pourraient être augmentés dans la circulation sanguine lors d’un cancer colorectal métastatique, chez les patients avec un bon pronostic. Ainsi, ces cellules pourraient être utilisées comme biomarqueur d’une bonne réponse des patients aux immunothérapies. De plus, nous pensons que ces cellules intestinales ont des meilleures capacités anti-tumorales comparées à des lymphocytes non intestinaux. Il serait potentiellement possible, à l’avenir, de les exploiter pour le développement de vaccins anti-cancer colorectal métastatique chez la souris, puis chez l’homme.

Procédures

Les animaux sont soumis à: 1) des procédures d'implantation de cellules tumorales par voie sous-cutanée mais aussi par chirurgie au niveau du colon et du foie (1 seule fois par animal et dure 5 min par animal) 2) des procédures d'injection intra-péritonéale d’anesthésiant (1 fois à l'implantation du cancer, 2 min par animal), de substrat ( 12 fois par animal, sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal à chaque mesure lors du suivi d’imagerie), de traitements (3 fois par animal, elle dure 2 min par animal) 3) une procédure d'administration sous-cutanée de vaccin (2 fois par animal, elle prendra 5 min par animal) 4) un prélèvement sanguin dans la veine maxillaire qui dure 2 minutes par animal 5) des prélèvements de fécès sur animal vigile, 6 fois max par animal, qui dure entre 5 sec et 2 min. L’anesthésie par voie gaseuse sera effectuée 13 fois par animal (12 fois pour le suivi biolum, 1 fois pour l’euthanasie).

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort. Des mesures seront effectuées, des tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés post-mortem. Ces organes comprennent: tumeurs, sang, organes lymphoides secondaires (ganglions lymphatiques, rate), organes sains en bordure de tumeurs (poumons, muqueuse orale, peau). Ces organes ainsi que les cellules immunitaires extraites seront analysés par des approches de protéomique et de transcriptomique.

Remplacement

Notre projet a pour but de comprendre comment l’immunité localement développée dans l’intestin, en particulier par des tumeurs intestinales lors d’un cancer colorectal métastatique, peut impacter l’organisme entier. Pour cela, nous avons absolument besoin d’utiliser un organisme entier, afin d’explorer une immunité locale, intégrant tous les composants cellulaires et la complexité de tumeurs localisées dans le colon et dans d’autres organes (le foie, la peau). Les tumeurs doivent se développer dans leur organe d’origine, afin de développer une architecture, une vascularisation, un réseau cellulaire au plus proche de la réalité d’un organisme. Par ailleurs, nous travaillons sur la migration des cellules immunitaires entre les orgranes ou entre les tumeurs (du colon vers le foie, du colon vers la peau). Pour cela, nous devons travailler sur un système vasculaire et lymphatique complet, tel que l’on peut retrouver uniquement dans un organisme entier. Les études déjà réalisées ex vivo ou in vitro (par exemple dans des organoïdes ou des flasques de culture) ne permettent pas de conserver et reconstituer le microenvironnement des tumeurs et de reproduire sa constitution globale, son évolution complète, sa vascularisation et ainsi que le réseau vasculaire élaboré reliant plusieurs tumeurs dans l’organisme, tels qu’ils ont lieu in vivo. Ainsi, nous ne pouvons pas Remplacer le modèle animal in vivo.

Réduction

Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous limitons nos expériences au nombre de 2 (et non 3 comme classiquement fait dans la littérature) car au vu du nombre d’animaux inclus dans chaque groupe, cela suffit pour obtenir des statistiques solides sur nos expériences. Nous concevons également nos expériences afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, en prélevant en fin d’expérience un nombre important d’organes et de compartiments chez l’animal, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Toutes les mises au point sur l’utilisation de ces modèles précliniques ont déjà été validée dans nos précédentes études, de façon la plus rigoureuse et solide possible (dose de cellules à implanter, fenêtre de traitements et de prélèvements). Ainsi, nos protocoles expérimentaux sont verouillés et suivis à la lettre, afin que chaque expérience réalisée dans ce projet soit reproductible et comparables aux autres et que des animaux ne soient pas injectés en vain.

Raffinement

Pour optimiser le Raffinement, notre long recul (>18 ans) sur ces modèles permettra d'évaluer précisément l’apparition de souffrance. Moins de 15% des animaux développeront un cancer au delà du 14eme jour. Un suivi quotidien permettra d’anticiper et d'euthanasier immédiatement les animaux en cas d’apparition de douleur ou de stress. Aucun animal ne sera maintenu en souffrance, ils seront euthanasiés en anticipation du point limite. Toutes les procédures seront réalisées sous narcolepsie. Notre expérience nous permet de réaliser des gestes rapides et précis pour les implantations, diminuant ainsi le temps de manipulation des animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et co-analgésique myorelaxant. Les animaux seront opérés sur des tapis chauffants, jusqu’à leur réveil pour éviter l’hypothermie. Le risque d’hypoventilation sera diminué par oxygénation des animaux opérés. Du gel occulaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. De plus, lors des chirurgies, nous veillerons à bien refermer la membrane péritonéale et la peau séparément afin de ne pas entrainer des adhérences et réduire la douleur post-opératoire. Après intervention, les animaux seront remis en cages, sous surveillance, et les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien vigiles, afin d’éviter que la ventilation du rack ne provoque une hypothermie chez les souris. En général, aucun signe de souffrance des animaux n 'est observé dans les jours qui suivent les implantations de tumeurs. Cependant, si des signes de douleur ou stress venaient à apparaitre rapidement en post-opératoire (4 ou 5 jours), cela serait exceptionnel et inhabituel et la décision d’euthanasier les animaux serait immédiatement prise. Cela conduirait à l'exclusion de ces animaux de nos expériences. Les conditions d’hébergement suivront les recommandations de la directive européenne en vigueur. Les souris recevront une alimentation enrichie ainsi que des granulés alimentaires déposés dans les cages afin de limiter le redressement pour se nourrir. Du papier absorbant, des lanières de papier kraft, des rouleaux de carton seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, réduire l’ennui, et leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. Ces produits d'enrichissement contribuent à diminuer le stress et facilitent la thermorégulation des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées dans le domaine de l’onco-immunologie car: -d’apres la litérature scientifique, le système immunitaire murin, proche de celui de l’Homme est pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo. -la biodisponibilité. Les souris adultes seront utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.