Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Diversité sensorielle et conséquences sur le comportement, la cognition et la neurobiologie du rat
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
96 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant 41 jours en cage individuelle et quatre heures par jour sans accès à la nourriture. Ils sont pesés neuf fois, observés chaque jour, et soumis à des tests de dix minutes portant sur la réactivité émotionnelle en environnement nouveau, la reconnaissance d'objets et la mémoire. Le projet évalue si varier les odeurs de leur cage et de leur aliment change leur comportement, leur cognition et leur neurobiologie. Le porteur annonce des retombées pour les élevages de rongeurs puis, plus loin, pour les bovins et les ovins, alors que les rats sont isolés puis tués pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les rats sont des animaux qui utilisent énormément leur odorat. Pourtant, ils sont le plus souvent élevés dans des cages monotones et peu variés d'un point de vue des stimulations olfactives. Si on considère plus particulièrement leur alimentation, ils sont le plus souvent nourris avec un seul aliment complet, sous forme de granulés ou de poudre, ce qui correspond à un environnement alimentaire monotone (même aliment tous les jours) et sans variété (un seul aliment complet offert). Les rats sont pourtant des animaux omnivores opportunistes et leur comportement alimentaire naturel incorpore divers types d'aliments, variant dans le temps et l'espace. Ainsi, dans la nature, les rats passent une grande partie de leur temps à rechercher des aliments, en utilisant leur odorat. L'objectif de ce projet est de proposer une diversité sensorielle dans l'environnement des rats (sur l'aliment ou dans la cage) et d'en évaluer les conséquences comportementales (comportement alimentaire, comportement d'exploration olfactive, réactivité émotionnelle), cognitives (mémoire, reconnaissance d’objets) et neurobiologiques (notamment système de la récompense).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure connaissance des réponses comportementales et neurobiologiques des animaux se voyant proposer une diversité sensorielle dans un milieu d'élevage classiquement monotone. Il s'agit d'acquérir des connaissances fondamentales qui pourront être appliquées dans les élevages de rongeurs, et être potentiellement transposées à des animaux d'intérêt agronomique (bovins, ovins, ...).
Procédures
Tous les animaux sont soumis à des observations comportementales quotidiennes dans leur milieu de vie. Ils sont tous soumis à des pesées hebdomadaires (9 pesées par animal au total ; durée maximale de la pesée = 1 min ; durée maximale des manipulations pour la pesée, incluant la pesée = 3 min). Tous les animaux sont soumis à des tests comportementaux individuels visant à évaluer leur réactivité émotionnelle face à un environnement nouveau (une seule fois, 10 min), leurs apprentissages pour des objets nouveaux dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), leur mémoire dans un environnement familier (une seule fois, 10 min), ainsi qu'un aliment odorisé nouveau dans leur cage de vie (deux fois, 1h - 30 min).
Impact sur les animaux
Les animaux rencontreront des situations pouvant être perçues comme stressantes au cours de ce projet, notamment : - Ce projet implique une légère restriction alimentaire (4h/j). Avant d'être habitués à ce rythme d'alimentation, les animaux peuvent ressentir une légère faim et/ou une frustration modérée. - Le suivi des consommations alimentaires à l'échelle individuelle implique une vie en cage individuelle, impliquant un isolement social partiel (j11-j52) pouvant impacter négativement et modérément le bien-être de l'animal. - Certains tests comportementaux sont mis en place pour évaluer la réactivité émotionnelle des animaux ; ils induisent donc un stress modéré. - Les pesées hebdomadaires nécessitent une manipulation douce de l'animal et le passage dans une cage de pesée (litière propre) sur une courte durée (
Devenir
Les animaux sont tous euthanasiés pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le rat est le modèle d'intérêt de cette problématique scientifique, cherchant à étudier l’influence d’une diversité sensorielle sur ses comportements alimentaires, sa cognition et sa neurobiologie, il ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Aux vues des variabilités inter-individuelles généralement observées dans le cas de mesures comportementales et d'analyses des structures et stimulations cérébrales, un effectif de 16 individus par groupe et par sexe (soit 96 animaux au total), divisé en deux sous-groupes pour les analyses des structures et stimulations cérébrales, est recommandé pour conduire cette expérimentation et permettre une analyse statistique fiable des données récoltées.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par la présence de bâtons de bois pouvant être grignotés, de matériel de nidification, d'objet à manipuler (boule à thé), et la présence de stimulations olfactives variées pour 2 groupes sur 3. Le raffinement des procédures expérimentales se traduit par la mise en place de phase d'acclimatation à l'environnement de vie, d'habituation aux procédures expérimentales, et de familiarisation progressive aux odeurs. La restriction alimentaire 4h/j est spécifiquement mise en place en fin de phase diurne, quand les animaux sont au repos et consomment pas (ou très peu) d'aliment pour réduire les effets négatifs potentiels. La période de vie en cage individuelle est réduite autant que possible au regard des objectifs scientifiques du projet. L'isolement social n'est pas total puisque des communications olfactives, visuelles et auditives sont possibles dans l'élevage. Une feuille de papier, type sopalin, est ajoutée en tant qu’enrichissement occupationnel, pouvant aussi servir de matériel de nidification, pendant les périodes d'isolement social partiel des animaux. De plus, lors de ces périodes, un enrichissement social est mis en place avec des animaux réunis en paires stables (toujours les mêmes animaux réunis ensemble), dans une cage d'hébergement standard dédiée, 1h/j, 6j/7. Lors du changement de litière dans les cages de vie, une partie du nid des animaux est transféré dans la nouvelle litière pour permettre une continuité olfactive et limiter le stress potentiellement induit par la modification sensorielle de leur environnement de vie.
Choix des espèces
Les rats représentent 8% des animaux utilisés à des fins scientifiques et ils sont élevés dans des conditions olfactives qui peuvent ne pas répondre à leurs besoins naturels et comportementaux. En effet, ce sont des animaux curieux, olfactifs, omnivores opportunistes qui sont pourtant élevés dans des environnements olfactifs et alimentaires plutôt monotones. La question de la diversité sensorielle et de son influence potentielle sur les comportements alimentaires, la cognition et la neurobiologie est donc tout à fait pertinente chez cette espèce. Les animaux étudiés sont âgés de 4 semaines (stade juvénile) à 11 semaines (début de la phase adulte). Cette période correspond à une période de maturation du système olfactif chez les rats, ce qui rend donc cette période pertinente pour répondre à nos questions de recherches.
Effet des ions bromure sur l’hyperactivité striatale chez un modèle murin du syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour porter le syndrome de Rett, une maladie qui touche presque exclusivement des filles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie gazeuse et quatorze injections intrapéritonéales, une par jour pendant deux semaines, chacune précédée d'une contention. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ne peut être modifiée pour imiter cette maladie humaine, et qualifie l'imagerie de non invasive. Toutes seront tuées, au motif qu'un animal ayant reçu un traitement pharmacologique ne peut pas être reclassé.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie rare qui touche principalement les filles. Elle se manifeste par des problèmes moteurs (comme des difficultés à bouger) et des troubles du comportement, comme ceux qu'on observe dans l'autisme. Les enfants atteints perdent des compétences qu'ils avaient avant, comme marcher ou parler. Actuellement, il n'existe pas de traitement qui permet de soulager ces symptômes. L’objectif de ce projet est d’essayer de trouver un traitement pour améliorer la situation. Dans une étude précédente, nous avons remarqué que certaines zones du cerveau des souris modèles de la maladie étaient trop actives, ce qui pourrait expliquer certains symptômes. Nous avons aussi découvert que des ions bromures, pourraient réduire les troubles moteurs et du comportement dans ce modèle de la maladie. Le but de ce projet est de vérifier si ces ions peuvent ramener l’activité cérébrale de ces souris à la normale, en utilisant une technique d’imagerie qui permet de voir comment leur cerveau fonctionne.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de vérifier si un traitement avec des ions bromure peut aider à améliorer les problèmes moteurs et les symptômes autistiques des souris atteintes d’un modèle de la maladie de Rett. L’idée est aussi de voir si ce traitement pourrait ramener l’activité du cerveau des souris à un niveau normal. Cela nous aidera à mieux comprendre comment ces ions bromure agissent et s’ils peuvent devenir une solution pour améliorer les traitements contre cette maladie.
Procédures
Les animaux subiront deux séances d'imagerie d’une heure sous anesthésie gazeuse. Ils recevront également des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux semaines (14 injections au total). Chaque injection nécessitera une contention de l'animal pendant quelques secondes
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une administration quotidienne d'agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale. Bien que la probabilité soit faible, une inflammation au niveau du site d'injection ne peut être totalement exclue. La technique d'imagerie utilisée est non invasive, ne générant pas de stress particulier, à l'exception du stress causé par la contention et la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, car il est impossible de reclasser des animaux ayant subi un traitement pharmacologique.
Remplacement
Pour mieux comprendre les causes de l’autisme et développer de nouveaux traitements, il est essentiel de disposer de modèles animaux que les scientifiques peuvent étudier. En examinant de près le comportement de ces animaux, nous pouvons vérifier s'ils représentent bien les caractéristiques de l'autisme. Cela nous aide également à tester l’efficacité de nouveaux traitements. L’évaluation des effets d’un traitement doit se faire principalement à travers le comportement des animaux, car il n’existe pas de test biologique permettant de diagnostiquer l’autisme. En effet, le diagnostic repose uniquement sur l’observation des comportements. C’est pourquoi nous devons étudier les animaux dans leur ensemble pour capturer toute la variété de leurs comportements.
Réduction
Nous utilisons des outils statistiques appropriés pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des expériences
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour que les animaux subissent le moins de stress ou d'inconfort possible tout au long de l’étude. Les souris sont logées en petits groupes, avec tout le nécessaire pour se sentir à l’aise, comme des matériaux pour faire leur nid. Elles sont également manipulées chaque jour pour les habituer à l'interaction avec les expérimentateurs. Pendant l'ensemble du protocole, nous suivons attentivement leur bien-être, en contrôlant leur poids et leur posture, et en surveillant des signes comme la perte de poils ou un dos voûté, pour nous assurer qu’elles ne souffrent pas. Lorsque nous testons de futurs médicaments, nous alternons les côtés pour les injections afin qu'elles soient le moins gênantes possible pour l'animal. Avant chaque expérience, les animaux sont doucement préparés pour les séances d’imagerie, avec une période d’habituation afin de réduire le stress. Lors des imageries, ils sont endormis sous anesthésie gazeuse et maintenus à une température constante grâce à un lit chauffant. Leur température corporelle et leur respiration sont surveillées en continu pour garantir leur confort. Enfin, pour évaluer de manière précise l'effet du traitement, chaque animal sera comparé à lui-même en mesurant son activité cérébrale avant et après le traitement.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, ce qui nous permet d’étudier facilement les problèmes de relations sociales, un symptôme clé de l’autisme. Leur comportement très riche nous aide aussi à évaluer d’autres réactions qui peuvent être affectées par l’autisme. Les problèmes de comportement observés chez les souris utilisées pour modéliser l’autisme sont suffisamment clairs pour tester si notre modèle est correct et, si c’est le cas, pour voir si certains traitements peuvent avoir des effets positifs. À l’exception des souris, aucune autre espèce animale ne peut être génétiquement modifiée pour imiter cette maladie humaine. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 à 12 semaines), car à cet âge leur comportement est bien développé et les problèmes de comportement se sont stabilisés.
Étude de l’activité phosphatase de l’époxyde hydrolase soluble comme nouvelle cible dans le traitement de pathologies cardio-métaboliques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 368
Deux chirurgies de vingt minutes espacées d'une semaine pour retirer une partie du rein et provoquer une insuffisance rénale chronique, une autre pour induire une hypertension, une pompe implantée pour en déclencher une seconde forme : 368 rats et 324 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. D'autres sont rendus obèses ou diabétiques par un régime ou par sélection génétique, puis suivis par échographie cardiaque et mesure de la pression artérielle à la queue. Tous sont tués à l'issue, par surdose d'anesthésique ou par dislocation cervicale sous anesthésie, la mort étant confirmée par exsanguination. Le porteur écrit que "tout sera mis en œuvre pour éviter les souffrances animales", et intègre par ailleurs à son calcul d'effectif un risque de mortalité de 25 % lié aux procédures chirurgicales.
Objectifs
Ce projet vise à explorer une nouvelle piste thérapeutique pour prévenir et traiter certaines maladies qui touchent le cœur et les vaisseaux sanguins, ainsi que les maladies métaboliques comme le diabète ou l'obésité. Plus précisément, il cherche à déterminer si bloquer une activité spécifique d’une enzyme appelée « époxyde hydrolase soluble » (sEH) pourrait offrir une solution innovante à ces problèmes. Pour cela, nous testerons l'efficacité et la sécurité de nouveaux médicaments en utilisant des modèles animaux reproduisant les caractéristiques des maladies humaines. Ces modèles, comme l’hypertension, l’obésité ou l’insuffisance rénale chronique, permettent d'étudier les maladies dans des conditions maîtrisées, tout en suivant les bonnes pratiques de bien-être animal. Nous espérons que cette approche contribuera à préserver la santé du cœur et des vaisseaux et à améliorer les traitements disponibles pour ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier comment des médicaments bloquant une fonction spécifique d'une enzyme appelée sEH (époxyde hydrolase soluble) peuvent aider à prévenir ou traiter des maladies qui affectent le cœur et le métabolisme, comme l’hypertension ou le diabète. Ces travaux complètent des recherches précédentes qui utilisaient une approche génétique pour désactiver cette enzyme. À long terme, ce projet espère ouvrir la voie à de nouveaux traitements efficaces contre ces maladies, en mettant en lumière le rôle clé de cette enzyme dans leur développement.
Procédures
Dans un premier temps, des tests seront réalisés sur des animaux en bonne santé afin de déterminer la dose optimale et la voie d’administration de nouveaux médicaments. Ces études incluront des analyses de sang (réalisées selon des normes strictes pour limiter la fréquence et le volume des prélèvements), la collecte d’urines pendant la nuit, et des examens d’organes en fin d’étude pour vérifier l’absence d’effets secondaires. Ensuite, les médicaments validés seront testés sur des animaux atteints de maladies courantes, telles que : • Hypertension Artérielle (HTA) : Reproduite par une intervention chirurgicale simple (15min). • Insuffisance Rénale Chronique (IRC) : Provoquée par des procédures chirurgicales spécifiques (2 chirurgies de 20min espacées de 7jours) • Hypertension induite par l’angiotensine : Une méthode utilisant un dispositif implantable permettra de recréer cette condition (chirurgie de 10 min). • Diabète de Type 2 (DT2) : Ce modèle repose sur un régime alimentaire adapté ou l'utilisation d’animaux présentant une prédisposition génétique. Les suivis comprendront des analyses biologiques, des mesures de la pression artérielle à la queue et des échographies cardiaques non invasives pour évaluer la santé cardiovasculaire Toutes les interventions sont planifiées pour minimiser les désagréments pour les animaux, conformément aux normes éthiques et réglementaires.
Impact sur les animaux
Tout au long des expérimentations, tout sera mis en œuvre pour éviter les souffrances animales. En cas de douleur non maîtrisable malgré les traitements analgésiques, l’animal sera euthanasié à la demande du vétérinaire. Certains effets secondaires pourraient survenir, notamment à la suite des prélèvements sanguins, des traitements administrés ou des interventions chirurgicales, comme l’ablation partielle du rein. Cette dernière, une procédure connue pour entraîner une insuffisance rénale chronique, est essentielle pour reproduire certains modèles de maladies. En ce qui concerne le modèle génétique d’obésité, les animaux présentent des facteurs de risques qui pourraient favoriser l’apparition d’effets secondaires lors de l’administration du traitement et des prélèvements sanguins. Si les modèles pathologiques fonctionnent, des signes de dysfonctionnements du cœur et, plus particulièrement, de la valve aortique, sont attendus et seront surveillés par échographie. À la fin des études, tous les animaux seront euthanasiés de manière éthique, et leurs tissus pourront être analysés pour mieux comprendre les effets des traitements testés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés de manière éthique, par surdose d’anesthésique pour les rats ou par dislocation cervicale sous anesthésie générale pour les souris. Cela permettra de procéder à une autopsie pour détecter d'éventuels signes de toxicité des composés sur le système cardiovasculaire ou d'autres fonctions biologiques. À la fin de chaque étude, après la dernière évaluation réalisée dans les modèles de maladies, les mêmes méthodes d’euthanasie seront utilisées, et le décès sera confirmé par une prise de sang finale. Tous les prélèvements et tissus récoltés seront conservés au laboratoire pour des analyses ultérieures, permettant d’approfondir les connaissances sur les effets des traitements testés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’étudier les effets cardiovasculaires de l’inhibition de la sEH-P dans un contexte physiopathologique complet, c’est-à-dire chez des animaux présentant des symptômes propres aux maladies étudiées. En raison de cette approche, l’utilisation de modèles cellulaires ou de techniques ex vivo ne permettrait pas de répondre de manière adéquate aux questions scientifiques du projet. Les procédures expérimentales sur animaux vivants sont donc essentielles, car aucune méthode alternative ne pourrait offrir des résultats équivalents.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe varie selon la conception de l’étude, prenant en compte des facteurs tels que le sexe des animaux, les types de mesures effectuées, les comparaisons avec des traitements de référence, et le nombre de doses testées. Une approche visant à minimiser le nombre et le volume des prélèvements a été mise en place, que ce soit pour les analyses pharmacocinétiques ou au moment de l'euthanasie. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque étude est optimisé grâce à des calculs de puissance, garantissant une fiabilité statistique suffisante (puissance P=0.80, risque alpha=0.05). Par exemple, un minimum de 6 animaux par groupe est prévu pour les études de pharmacocinétique/pharmacodynamie, et 12 pour les modèles chirurgicaux. Au total, 692 animaux seront impliqués dans l’ensemble du projet (368 rats et 324 souris), prenant en compte les données historiques du laboratoire et un risque de mortalité de 25% lié aux procédures chirurgicales. Les résultats seront analysés statistiquement en appliquant des tests de normalité, des analyses de variance, et des comparaisons entre les moyennes des groupes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux stables avec un enrichissement spécifique à chaque espèce pour minimiser le stress. Un suivi clinique quotidien est effectué pendant toute la durée du projet afin d'assurer leur bien-être. Les conditions d'hébergement sont contrôlées (température de 21°C, humidité de 55%, luminosité stable avec un cycle de lumière de 12h/12h). Afin de réduire le stress lié au transport, une période d'acclimatation d’une semaine est prévue avant le début des procédures expérimentales. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture à volonté, et les méthodes utilisées sont conçues pour limiter toute douleur, souffrance ou angoisse. Un suivi strict est réalisé pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, un animal sera exclu de l'étude et euthanasié, sur décision du responsable bien-être animal avec avis vétérinaire. Pendant les opérations chirurgicales, les animaux reçoivent un traitement hydratant et une injection de glucose pour faciliter leur récupération. Des analgésiques (anti-douleurs) sont administrés avant et après l’intervention pour assurer une gestion de la douleur efficace. Si un animal atteint un seuil de souffrance, un protocole de diminution de la douleur sera mis en place, et s’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié en accord avec les normes éthiques en vigueur, par surdose d’anesthésique ou dislocation cervicale, selon l'espèce. La mort sera confirmée par une exsanguination.
Choix des espèces
Le choix des rongeurs comme modèles animaux est justifié par plusieurs critères essentiels pour ce projet : • La disponibilité de modèles génétiques déjà existants, comme les rats transgéniques (KI) pour la sEH-P, permettant une étude pertinente des composés en question. • La possibilité de comparaison avec d’autres recherches déjà réalisées dans notre laboratoire, qui facilitent l’analyse des résultats. • L'abondance de données accumulées sur ces espèces, utiles pour une analyse plus précise. • Les connaissances existantes sur les composés étudiés in vitro sur l’activité enzymatique • Des raisons pratiques, comme la facilité de manipulation des rongeurs et leur place dans la phylogénie des mammifères. • Le faible coût des manipulations associées aux rongeurs, du fait de leur taille réduite. Pour garantir une bonne récupération et limiter les risques liés aux interventions chirurgicales, seuls des animaux matures seront utilisés : des souris âgées de 6 à 10 semaines et des rats âgés de 10 à 16 semaines. En effet, l'utilisation d'animaux plus jeunes ou vieillissants aurait un impact sur le coût des produits nécessaires, sans bénéfice scientifique supplémentaire. Les doses administrées sont également ajustées en fonction du poids de l'animal, ce qui rend l’utilisation de modèles plus jeunes inappropriée pour cet objectif.
Evaluation de l’immunogénicité de deux paires de vecteurs lentiviraux d’intérêt immuno-oncothérapeutique dans le contexte d’une co-administration dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système urogénital
Des injections de quelques secondes, une mise à mort quatorze jours plus tard : les souris de ce projet reçoivent des vecteurs lentiviraux candidats vaccins contre des cancers du col de l'utérus, de la prostate et du sein. 204 animaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le décompte varie à l'intérieur du même résumé, qui annonce ailleurs 228 souris immunisées au maximum, et le porteur affirme que "l'animal ne va pas souffrir" tout en prévoyant des mesures pour les poils hérissés et l'inactivité. Chaque souris est tuée pour le prélèvement de sa rate, où la réponse immunitaire sera analysée.
Objectifs
Le cancer est caractérisé par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, capables de lyser les cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des vecteurs lentiviraux ayant pour cible des antigènes tumoraux pertinents dans les cancers du col de l’utérus, de la prostate et du sein, pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle immunitaire de la prolifération tumorale. L’objectif du présent projet est d’établir la preuve de concept préclinique de la co-administration de deux paires de ces vecteurs, sélectionnés en fonction du profil d’expression des antigènes par les tumeurs des patients. Ultimement, la co-administration des candidats immuno-thérapeutiques ayant une immunogénicité préservée sera proposée en vue d’un essai clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept préclinique d'utilisation des paires vecteurs lentiviraux dans la vaccination thérapeutique contre le cancer du col de l’utérus ou de la prostate. Les vecteurs lentiviraux codant pour des antigènes pertinents se sont révélés sûrs et efficaces comme des candidats vaccins contre des flavivirus (ZIKA et Dengue), le SARS-CoV-2, Mycobacterium tuberculosis, d'autres agents pathologiques, ainsi que des tumeurs induites par des HPV. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vecteurs immuno-oncothérapeutiques dans le contexte d’une co-administration en clinique.
Procédures
Dans deux procédures de sévérité légère, environ 228 souris au maximum seront immunisées avec des candidats vaccins (injections de quelques secondes), et mises à mort au bout de 14 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection des vecteurs, pendant une courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous avons besoin de prélever leur rate pour réaliser les expériences nécessaires.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’humain. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale et immuno-thérapeutique sur les animaux, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation, car les mécanismes en jeu sont très multifactoriels et pas encore caractérisés de façon exhaustive.
Réduction
Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination étudiée et de définir la cinétique de vaccination permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins ont été préalablement validés par des études chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses contre des tumeurs pertinentes dans des modèles souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. L'objectif de ce projet est de vérifier l'absence de différence entre les groupes. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques. Le nombre de souris/groups expérimental a été de 6 dans chaque groupe expérimental, soit un total 204 souris.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de vecteurs lentiviraux n’induit aucun signe clinique chez les souris. L’animal ne va pas souffrir et l’injection sera faite en respectant les bonnes pratiques vétérinaires; matériel unique, peau désinfectée avant l’injection. Les animaux seront surveillés après l’injection. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés ou l’inactivité, plusieurs mesures seront prises, incluant surveillance renforcée, l’ajout de gel hydrique pour faciliter l’accès à l’hydratation, réhydratation sous cutanée ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les coupons de bois.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogéniques chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Etude des mécanismes physiopathologiques de l’athérosclérose EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
4 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures pourtant classées en gravité légère. Chacune reçoit un régime enrichi en gras pendant quatre, huit ou vingt semaines, avec une injection tous les deux jours sur toute la durée, ce qui approche les soixante-dix piqûres pour les séries les plus longues. Elles sont transportées entre deux établissements, puis tuées par perfusion intracardiaque après un dernier prélèvement sanguin réalisé sur animal vigile, afin d'examiner leurs artères. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles thérapeutiques contre l'athérosclérose, restent au conditionnel, quand l'effectif engagé, lui, est déjà arrêté.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde et sont en croissante progression dans les pays à revenus faibles ou modérés. La principale cause sous-jacente de ces maladies est l'athérosclérose, une pathologie complexe et multifactorielle qui touche principalement les artères de gros et moyens calibres. Cette pathologie consiste en un dépôt de lipide dans la paroi des artères. Elle se développe dès l'enfance mais la progression des lésions augmente avec l'âge et varie selon le mode de vie (alimentation, exrcice physique, stress, tabagisme...) et nos facteurs de risque (diabète, hypertension, obésité). La première étape du développement de la plaque d'athérome est la perte d'intégrité (ou dysfonction) de l'endothélium qui est une barriere entre le sang et paroi artérielle. Cette perte d'intégrité de la barrière endothéliale favorise l'infiltration des lipoprotéines de basses densité (LDL) circulantes dans l'espace sous-endothélial induisant des réponses cellulaires de type inflammatoires et fibroprolifératives à l'origine des lésions athéromateuses. Au cours du temps, cette plaque d'athérome vient obstruer la lumière de l'artère et sa rupture sera responsable des conséquences dramatiques de cette pathologie comme l'infarctus du myocarde ou l'accident vasculaire cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dès l'initiation de cette pathologie jusqu'aux stades tardifs pour évaluer la vulnérabilité de la plaque et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans ce contexte physiopathologique. Plusieurs travaux ont déjà identifié que des protéines de la famille des phosphoinositides 3-kinase (PI3K) pourraient être des cibles thérapeutiques intéressantes dans ce contexte et nous souhaitons valider leur implication au cours de ce travail. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être utilisées pour prévenir ou ralentir le développement de l'athérosclérose et diminuer ses conséquences dramatiques sur les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Tout ou partie des animaux enrolés dans ce protocole seront soumis à: 1/un régime enrichi en gras pendant 4 semaines ou 8 semaines ou 20 semaines 2/des injections tous les 2 jours 3/un prélèvement sanguin une seule fois le jour de la mise à mort sur animal vigile (durée: 1 min) 4/une perfusion intracardiaque une seule fois le jour de la mise à mort (durée: 10min). Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs avec un transport des animaux encadré par une procédure de transport déclarée (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les interventions 1, 2 sont réalisés dans l'EU1/2 et les interventions 3, 4 sont réalisés dans l'EU2/2.
Impact sur les animaux
La piqure d'une aiguille pour injecter des inhibiteur des cibles pharmacologiques étudiées entraine une douleur légère de courte durée . Un prélèvement sanguin sur animal vigile placé en décubitus latéral entraine une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issu de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort pour analyser par immunofluorescence l'endothélium (pour les étapes initiatrices du développement de l'athérosclérose) ou les dépôts lipidiques signant la présence de plaque d'athérome (pour les stades précoces à plus avancés).
Remplacement
Notre équipe développe des modèles in vitro en 2D et 3D des vaisseaux pour éviter à son maximum la nécessité d'avoir recours à des modèles animaux. Néanmoins, l'athérosclérose est une pathologie multifactorielle qui fait intervenir les cellules de paroi vasculaire mais également les cellules inflammatoires et plusieurs facteurs circulants. Il est encore prématuré de pouvoir complètement modéliser cette pathologie complexe in vitro. Les animaux vivants resprésentent le seul modèle intégré et restent indispensables pour obtenir des résultats fiables sur cette pathologie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs de l'étude et pour permettre de bonnes analyses statistiques. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés en fonction du design de chaque expérience. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 20 animaux sont requis pour obtenir une répartition normale des mesures et des résultats robustes dans notre contexte d'étude. Le choix du groupe témoin sera optimisé pour permettre sa comparaison avec plusieurs groupes expérimentaux et ainsi diminuer l'utilisation inutile d'animaux. Enfin, sur chaque animal le coeur et l'aorte seront simultanément prélevés et les autres tissus de l'animal mis à mort seront proposés aux autres membres de l'équipe et de notre institut de recherche pour permettre d'optimiser au maximum l'utilisation de chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest). Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement par du personnel compétent ayant un livret de compétence à jour et formé aux approches de chirurgie. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien être des animaux et le vétérinaire référent pour déterminer les soins ou l'action à appliquer pour réduire le stress, l'angoisse ou la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés: 1/ pour les différentes cibles étudiées dans ce projet et 2/permettant de récapituler de façon induite par un régime ou spontanée le développement de l'athérosclérose. De plus cette espèce de rongeur a des propriétés zootechniques (petite taille, un cycle de reproduction court permettant rapidement d’obtenir des générations successives pour les études à long terme) autorisant une mise en œuvre des protocoles expérimentaux de recherche facilitée et maîtrisée par notre équipe de recherche. Cette espèce présente également des paramètres physiologiques proches de l’Homme, la plaçant comme un organisme-modèle de choix pour l'étude des pathologies cardiovasculaires. Pour évaluer l'impact de l'invalidation de nos différentes cibles moléculaires au cours du développement de l'athérosclérose, les animaux utilisés seront agés de 14 semaines (étape initiatrice de l'athérosclérose), 18 semaines (stade précoce du développement de cette pathologie artérielle) ou 30 semaines (stade tardif du développement de cette pathologie artérielle).
Evaluation préclinique de dispositifs médicaux aprés implantation dans la cavité médullaire et sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Chèvres : 25
Moutons : 25
Le nombre d'animaux dépend directement du nombre d'études signées avec les donneurs d'ordre sur cinq ans. 100 lapins, 25 chèvres et 25 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Un dispositif médical à stimulation électrique leur est implanté dans l'os au cours d'une chirurgie d'une heure à deux heures trente, parfois suivie d'une seconde opération pour le retirer, avec une à trois séances de scanner ou d'IRM en cours d'étude. Le porteur annonce un risque infectieux "modéré à sévère", des hématomes ou œdèmes pouvant provoquer un déficit moteur des membres postérieurs, et justifie l'ensemble par une réglementation qui exige ces essais avant la mise sur le marché.
Objectifs
Ce projet vise à ameliorer la tolerance (ou la sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en orthopedie à stimulation éléctrique (ex: produits de fusion vertebrale). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance des produits de santé en orthopédie, à stimulation éléctrique. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.
Procédures
Pour cette procedure, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h00 et 2h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie . Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 00h30 et 2h30). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner, IRM ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère, dans des EU partenaires (scanner ou IRM) ou sur le site d'essai (radiographies). En général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : Nuisances liées à la chirurgie: douleur et stress liés à la chirurgie (nuisance modérée) - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours (nuisance légère) - risque infectieux lié à la chirurgie (nuisance moderée à sévère) - hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur (exemple : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs) (nuisance légère à modérée). Si nécessaire, les animaux pourront être hébergés individuellement pendant la période post-opératoire. Ceci peut engendrer un stress léger à modéré pour les animaux. Nuisances liées au transport: stress de l’animal occasioné par le transport (nuisance modérée).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de la procedure du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : exaluation de la regeneration osseuse suite stimulation éléctrique). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en orthopédie, à stimulation éléctrique.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal. Le nombre d’études sur 5 ans est donc estimé à 6 études reglementaires et maximum 20 études pilote (1 à 5 études par an ; pour 25 ovins ; 25 caprins ; 100 lapins).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites (listés dans la section 4.2.1) sont utilisé pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Si une stimulation électrique est réalisée et bien qu’aucune douleur associée ne soit attendue, si l'animal présente des signes de gêne, la même approche sera conduite. En cas de transport des animaux, des mesures sont mise en place pour diminuer le risque de blessures et pour minimiser le stress des animax lors du transport : - mise en place de conditions de transport adaptées à l’animal concerné (espace de taille adéquate, sans élément pouvant blesser les animaux, en cage de taille adaptée pour les lapins et en camion adapté et sur litière (paille) pour le transport des ovins ou caprins). Un examen clinique des animaux sera réalisé avant départ par un vétérinaire pour s’assurer qu’aucune contre-indication au transport n’est observée. Une observation supplémentaire des animaux sera faite au départ et là l’arrivée pour s’assurer du bon état clinique des animaux. Enfin, les temps de trajets seront optimisés (sélection d’établissements utilisateurs secondaires proches de l’établissement principal).
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (le long terme: espèces à longue durée de vie). Le choix repose aussi sur les similarités avec l’homme : caractéristiques anatomiques (structure de l'os...), poids, propriétés mécaniques et régénération osseuse. La litterature scientifique reporte l’utilisation du lapin comme un modèle de choix dans l’évaluation préliminaire des dispositifs médicaux à stimulation éléctrique ayant comme but la regeneration osseuse. Le choix des animaux peut se faire pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ). Dans le cas des études fonctionelles, le choix se portera sur les ovins/caprins par rapport à leur taille osseuse et la charge mécanique plus proche des humains. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2. Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière (ex : évaluation d’un implant osseux sur un animal dont l’ossature est mâture), le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée.
Transgénèse et transfert d’embryons pour la création de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Cent cinquante femelles subissent une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie gazeuse pour recevoir des embryons, trois injections sous-cutanées et la pose d'une agrafe sur le dos. Mille souris au pelage agouti sont ensuite anesthésiées pour qu'un bout de queue leur soit prélevé et qu'une boucle d'identification leur soit posée, l'ensemble représentant 1 150 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet est technique, il crée des lignées génétiquement modifiées pour des équipes travaillant sur les lymphocytes B et les lymphomes. Six cents animaux porteurs de la mutation recherchée partiront vers un autre projet autorisé, les 550 autres seront tués, dont les 150 femelles pseudo-gestantes une fois les portées nées et 400 souris qui n'ont pas la mutation attendue.
Objectifs
Ce projet technique de trangénèse permet de générer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées pour différentes équipes de recherche dans le cadre d'études portant sur le contrôle de la réponse immune des lymphocytes B et du développement des lymphomes. Ces modèles in vivo sont indispensables pour une compréhension globale des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. Les études in vitro utilisant des lignées cellulaires ou des études in silico ne peuvent pas remplacer l'animal pour ces études car elles ne permettent pas de retranscrire toutes les interactions existantes au sein du système immunitaire et entre le système immunitaire et d'autres systèmes physiologiques. Les modifications génétiques permettent de mieux comprendre le rôle d'un gène en particulier dans le développement normal et tumoral du système immunitaire B ce qui peut donner des pistes d'intervention thérapeutique innovante pour les lymphomes. Les souris sont utilisées pour ces études car leur génome (ensemble de leurs gènes) et leur système immunitaire est proche de celui de l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de créer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées permettant ainsi aux chercheurs de l'unité d'obtenir un modèle d'étude pour mener à bien leur projet de recherche. La technique de transgénèse est essentielle au developpement de modèles murins génétiquement modifié car elle permet d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme possèdant un système immunitaire physiologique complet. La modification spécifique d'un géne cible permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de nombreuses maladies en lien avec le dysfonctionnement du système immunitaire et particulièrement les lymphomes ou les maladies de depôts. Ces modèles peuvent également, à terme, servir dans le devellopement d'essai préclinique.
Procédures
Au cours de ce projet, 150 femelles seront soumises à 1 chirurgie de réimplantion d'embryons sous anesthésie gazeuse lors du transfert d'embryon d'une durée de 15 minutes maximum et 3 injections sous-cutanées. 1000 souris au pelage marron devant être identifiés comme possèdant ou non la mutation seront anesthésiées afin qu'un petit morceau de queue leur soit prélevé et qu'une boucle d'identification leur soit mise.
Impact sur les animaux
La piqûre d'aiguille pour l'injection de l'anti-douleur aux femelles recevant les embryons entraine une douleur légère et de courte durée et un stress physique de courte duré. L'intervention chirurgicale des femelles recevant les embryons entraine un stress physique ainsi qu'une gêne liée à la présence de l'agrafe sur le dos. Le prélèvement de bout de queue des animaux entraine une douleur légère et de courte durée au niveau du site de prélèvement et un stress physique de courte duré.
Devenir
En fin de procédure "transfert d'embryons"sur 5 ans : aucun animal ne sera réutilisé, ni replacé. En fin de procédure "genotypage de souris au pelage agouti" sur 5 ans: 600 animaux possédant la mutation génique d'interêt seront placés en zone d'élevage et utilisés dans un autre projet APAFIS sous la responsabilité d'un autre porteur de projet. Pour ce projet, ce sont 550 animaux qui seront euthanasiés (150 femelles pseudo-gestantes aprés la naissances des animaux chimériques + 400 animaux pelage agouti ne possédant pas la mutation génique d'interêt)
Remplacement
Ce projet permet de générer de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées pour différentes équipes de recherche dans le cadre d'études portant sur le contrôle de la réponse immunitaire et le développement de lymphomes. Ces modèles in vivo sont indispensables pour une compréhension globale des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. Les études in vitro utilisant des lignées cellulaires ne peuvent pas remplacer l'animal pour ces études car elles ne permettent pas de retranscrire toutes les interactions existantes au sein du système immunitaire et entre le système immunitaire et d'autres systèmes physiologiques.
Réduction
Les femelles utilisées pour la production d'embryons ne recevront pas de traitement de superovulation. En effet, la technique de micro-injection nécessite d'avoir un embryon resistant à la pression de la pipette de micro-injection. Or, aprés traitement hormonal, les embryons générés sont moins resistant à la pression ce qui rend plus diffcile la micro-injection. Le nombre de femelles utilisées sera donc limité au strict minimum nécessaire pour avoir suffisement d'embryons. Les femelles fertiles utilisées qui ne présentent pas de bouchon vaginal seront réutilisées pour une expérimentation ultérieure. Les accouplements de chimères seront arrétés dès que les premiers animaux agoutis positifs pour la mutation d'interêt seront génotypés. Ainsi, le nombre d'animal engendré est limité au strict minimum nécessaire pour générer les fondateurs de la nouvelle lignée. Le nombre d'animaux utilisé sera limité au strict minimum nécessaire pour mener à bien toutes les procèdures de la demande d'autorisation de projet.
Raffinement
Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum afin d'avoir suffisamment d'animaux pour les expérimentations. Les mâles seront hébergés deux par deux afin de limiter le nombre d'animal isolé. Le personnel menant à bien les expérimentations est formé aux gestes de manipulation sur le petit animal ainsi qu'aux techniques de chirurgie. Leurs compétences sont maintenus au cours du temps limitant ainsi la douleur liée à la manipulation et à l'expérimentation. Les animaux bénéficient d'enrichissement dans les cages conformes aux recomandations de la structure du bien être animal de l'établissement. Pour chaque expérimentation, des points limites spécifiques ont été définis et une prise en charge de la douleur est prévue avec un protocole utilisant des analgésiques afin de reduire la souffrance animal au cours du temps.
Choix des espèces
La modification du génome dans le cadre de recherches fondamentales visant à comprendre, dans sa globalité et sa complexité, le contrôle de la réponse immune et les lymphoproliférations ne peut s'effectuer que dans certaines espèces animales pour lesquelles les techniques de transgénèse ont été mises au point et ont fait leurs preuves. Les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas pour l'étude des systèmes complexes et multilocalisés tel que le système immunitaire. Les techniques de transgénèse sont très performantes dans l'espèce Mus musculus. Cette espèce possède un génome très proche de celui de l'Homme (99% d'homologie), ce qui en fait un outil idéal pour comprendre les effets de ces modifications génétiques sur les systèmes étudiés. Les systèmes immunitaires de l'Homme et de la souris sont très proches. Les animaux femelles utilisées, seront en âge de procréer (de 2 à 12 mois) que ce soit pour l'étape de production de blastocystes, l'étape de production de femelles pseudo-gestantes ou l'étape de transmission germinale des modifications génétiques. Pour l'étape de micro-injection de cellules ES modifiées dans des blastocystes, des embryons de 3,5 dpc (days post-coïtum) seront utilisés. Les animaux (mâles et femelles au pelage agoutti) seront génotypés au moment du sevrage soit aux alentours de 4 semaines.
Production d’anticorps chez le lapin
- Production de routine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".
Objectifs
Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.
Bénéfices attendus
Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.
Procédures
- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -
Impact sur les animaux
La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.
Remplacement
Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.
Réduction
Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.
Raffinement
Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.
Choix des espèces
Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.
Effet de la température sur la réponse dépendante des anticorps
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Selon le score de douleur atteint et sa persistance, les souris reçoivent un analgésique ou sont tuées. 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante une sonde thermique dans l'abdomen, puis pour une partie d'entre elles un objet métallique de un centimètre sur un sous la peau du flanc, que des champs magnétiques échauffent de deux à trois degrés pour reproduire une fièvre ou une inflammation locale. L'effectif de 880 est présenté comme le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans qu'aucun calcul ne soit donné.
Objectifs
La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.
Bénéfices attendus
Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.
Procédures
Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.
Impact sur les animaux
L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.
Remplacement
Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.
Réduction
Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.
Choix des espèces
La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),
La metformine peut elle promouvoir B. faecichinchillae, espèce commensale du microbiote intestinal humain possèdant des propriétés anti-diabétiques équivalentes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Un gavage orogastrique quotidien de metformine, un prélèvement de selles par semaine et trois minutes de contention dans un tube de PVC pour mesurer la composition corporelle : 192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont nés sans flore intestinale, puis colonisés par gavage avec le microbiote fécal d'un donneur humain volontaire. L'enjeu déclaré est de savoir si la metformine favorise une bactérie intestinale aux propriétés antidiabétiques, qui pourrait ensuite être proposée comme probiotique. Le porteur écarte l'anesthésie pendant les gavages pour éviter les fausses routes, et écarte les antalgiques au motif qu'ils modifieraient les métabolismes étudiés.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la metformine, traitement thérapeutique du diabète de type II, peut promouvoir la population bactérienne d'intérêt, Bacteroides Faecichinchillae, possédant également des propriétés anti-diabétiques, dont les effets sur la santé seront évalués, en particulier au niveau tissulaire.
Bénéfices attendus
Si le traitement à la metformine permet de promouvoir l’espèce commensale d’intérêt, B. faecichinchillaeae, l’utilisation de cette bactérie sera proposée comme probiotique chez l’homme soit en remplacement de la metformine soit en association avec la metformine. L’administration de la souche permettrait en effet de limiter les effets secondaires observés chez l’homme suite à la prise de ce médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, et enfin 3) une supplémentation quotidienne de Metformine par un gavage oro gastrique (200mg/kg de poids corporel) pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. Plus de 60 ans d'utilisation de la metformine en santé humaine ont démontré l'efficacité et l'inocuité de ce médicament, toutefois, selon les doses prescrites, des effets secondaires sont observés chez près de 25 % des patients en particuliers des intolérances gastrique et nausées. Si dans la bibliographie, ces symptômes ne sont pas mentionnés dans les éudes in vivo, une attention particulière sera, cependant, portée sur une apparition potentielle de ces symptômes lors de l'observation quotidienne des animaux. Le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact de la metformine sur le microbiote nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ce produit sur le rôle de la paroi intestinale (perméabilité, immunité) et sur les métabolismes hépatiques (céramides, voies métaboliques de l'insuline, etc...) chez l’homme. De plus, ceci nécessite une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques ainsi que les prélèvements de selles. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvements de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. l'anesthésie ne sera pas utilisée, il est nécessaire que les animaux restent vigils pour éviter les fausses routes qui pourraient être provoquées par son absence de consience. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement. Pas d'utilisation d'antalgiques qui pourraient modifier les métabolismes ciblés dans le projet et rendent incomparables les résultats.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 10 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 10 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.
Etude de la libération pulsatile de l’hormone de croissance sur l’inflammation et la fibrose hépatique dans un modèle murin de glycogénose de type 1a
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour tester si le rétablissement du rythme naturel de sécrétion de l'hormone de croissance freine l'atteinte du foie, 48 souris rendues malades d'une glycogénose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. À sept jours de vie, un morceau de queue leur est prélevé pour le génotypage, puis viennent cinq jours d'injections, une chirurgie de trente minutes pour poser un cathéter dans la veine jugulaire et une pompe programmable, cinq jours de perfusion et un jeûne de six heures avant la mise à mort. La glycémie se mesure sur une goutte de sang obtenue en sectionnant l'extrémité de la queue, ce que le porteur décrit comme douloureux. Il indique que ces souris peuvent faire des hypoglycémies sévères avec un mal-être important, et que la gestion de l'élevage laisse subsister 1 à 2 % de décès, généralement la nuit.
Objectifs
Alors que le diabète se caractérise par trop de sucre (glucose ; hyperglycémies) dans le sang, la glycogénose de type 1 est une maladie métabolique rare qui entraine des hypoglycémies (baisse du glucose dans le sang) pouvant être fatales. Elle est due à des mutations génétiques d’une enzyme qui permet à l’organisme de produire du glucose en dehors des périodes de prise alimentaire, pour maintenir un taux de glucose sanguin stable (1g/L). Une prise en charge nutritionnelle est basée sur la consommation de sucres complexes comme la Maïzena et sur une prise alimentaire régulière y compris la nuit. Ces patients développent aussi un foie gras, et environ 80% de ces patients présentent des tumeurs du foie. Contrairement à ce qui est observé chez la plupart des diabétiques, la maladie hépatique ne progresse pas avec la même incidence entre les femmes et les hommes et n’évolue pas vers le stade de cirrhose. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant toute la pathologie du foie de la glycogénose, il a été montré un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Cette hormone, produite par l’hypophyse, a la particularité d’être sécrétée différemment chez les mâles (de façon pulsatile) et les femelles (en continu à faible niveau), ce qui lui confère des effets sexe-dépendants sur un de ses organes cibles qu’est le foie. Cette pulsatilité de sécrétion est perdue chez les souris mâles atteints de glycogénose, ce qui pourrait expliquer l’évolution particulière de la maladie du foie dans cette maladie. Notre projet consiste à évaluer l’effet de la libération physiologique de l’hormone de croissance en rétablissant la pulsatilité de sécrétion de l’hormone de croissance chez des souris atteintes de glycogénose. Ceci sera réalisée grâce à une mini-pompe programmable délivrant l’hormone dans la circulation sanguine. L’importance de la pulsatilité sera évaluée par comparaison à des souris traitées avec une dose supra-physiologique quotidienne unique, qui reflète le mode de traitement administré chez l’homme. Le non-respect de la pulsatilité pourrait avoir un impact non négligeable sur l’évolution à long terme de la maladie hépatique de la glycogénose.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie hépatique associée à la glycogénose. A partir de nos données préliminaires démontrant un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance, nous avons émis l’hypothèse que le rétablissement de sa sécrétion à des rythmes physiologiques devrait permettre de retrouver un contexte hépatique similaire à ce qui est observé chez les patients diabétiques obèses qui présentent aussi un foie gras. Dans le cadre de la glycogénose, quelques rares données suggèrent des perturbations hormonales, en particulier une diminution de la sécrétion de l’hormone de croissance. Ceci explique les retards de croissance observés chez ces patients. Notre étude devrait mettre en évidence que ces perturbations hormonales ont un impact plus large, en particulier sur la progression de la maladie hépatique. Nos résultats pourraient être importants pour la prise en charge d’autres pathologies puisque la pulsatilité de la sécrétion de l’hormone de croissance n’est jamais prise en compte dans les traitements chez l’homme. Une délivrance plus physiologique de cette hormone pourrait éviter les effets secondaires liés à son injection chronique à des doses supra-physiologiques.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité de la queue pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Environ 4 mois après le développement de la glycogénose, une partie des souris subira une chirurgie afin de poser un cathéter en veine jugulaire et une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. La chirurgie devrait durer au maximum 30 min. Après une période de récupération post-opératoire d’au moins 1 semaine, les souris seront perfusées soit avec une solution d’hormone de croissance, soit avec du sérum physiologique, de façon pulsatile (changement de débit toutes les 3h), pendant 5 jours. Un autre lot de souris subira 1 injection quotidienne d’hormone de croissance pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Un groupe de souris saines injectées avec du sérum physiologique constituera le groupe de référence (quelques secondes/souris) pendant 5 jours. En fin de protocole (5 jours après le début des traitements à l’hormone de croissance), les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Une mesure de glycémie sera réalisée à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue dès 2h30 de jeûne. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie de la queue afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Dans ce cas, les souris présentent un mal-être important lié à l’hypoglycémie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Les hypoglycémies peuvent être plus fréquentes lors de l’anesthésie et lors de la mise à jeun en fin de protocole. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang obtenue après section de l’extrémité de la queue ce qui entraine de la douleur Au-delà de 15 mois de maladie, ces souris peuvent développer des tumeurs du foie. Dans ce projet, les souris seront mises à mort au plus tard 6 mois après l’induction de la maladie. Après 4 mois d’induction de la maladie, certaines souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter en veine jugulaire et d’une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. Le risque d’hémorragie lors de la chirurgie est très faible et la chirurgie est susceptible de provoquer de la douleur. Un autre lot de souris subira 1 injection/jour pendant 5 jours, ce qui peut induire une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour ces injections ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et les testicules afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires
Remplacement
Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. Une étude préliminaire réalisée in vitro sur des cellules du foie de souris traitées avec de l’hormone de croissance de façon cyclique a permis de valider notre hypothèse de travail. Cependant, il est important maintenant de conserver la physiologie de l'organisme pour comprendre les mécanismes initiés par la pulsatilité de l’hormone de croissance sur le foie. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme.
Réduction
-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 10 souris maximum, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Dans le but de réduire le nombre d’animaux à produire, certains animaux sont des souris déjà utilisées dans un autre protocole, sans avoir subi de procédures sévères entrainant un mal-être ou une douleur importante. -Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 48 souris, incluant l’obtention de 22 nouvelles souris transgéniques et de 26 souris « réutilisées ».
Raffinement
-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre (glucose) sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. Les animaux seront entraînés à recevoir du glucose à la pipette par voie orale avant l’induction de la maladie. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Elle sera réalisée dans des conditions d’asepsie afin d’éviter tout risque d’infection. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction et un tapis chauffant seront utilisés. La glycémie sera aussi contrôlée régulièrement afin d’intervenir au plus tôt pour administrer une solution de sucre. Enfin, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce permettant de garder les souris à thermoneutralité. Un suivi de poids hebdomadaire, puis quotidien pendant la période post-opératoire permettra d’identifier une perte de poids anormale de l’animal. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.
Choix des espèces
En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Le protocole sera débuté chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines. L’induction de la glycogénose sera réalisée à l’âge adulte ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans phénotype dommageable. Les perfusions seront réalisées 4 mois après le développement de la glycogénose. Seule la biopsie caudale pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7 jours.
Evaluation de l’immunogénicité de vaccins contre le SARS-CoV-2 (nouveaux variants), les virus Nipah et HBV, et les bactéries Chlamydiae trachomatis (CT), Bordetella pertussis ou encore Tuberculosis mycobacterium affectant l’homme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris reçoivent trois injections de vaccin en cinq semaines, selon les procédures dans l'abdomen, sous la peau, dans le derme, dans un muscle, par le nez ou par le vagin, et subissent six prises de sang entre la semaine qui précède la première injection et la cinquième semaine. 3 444 souris, dont des lignées génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester 18 vaccins contre le SARS-CoV-2, le virus Nipah, l'hépatite B, Chlamydia trachomatis, la coqueluche ou la tuberculose. Le porteur parle pourtant d'une nuisance légère au moment de chaque injection et de chaque prise de sang, et affirme que la réponse immunitaire est "sans conséquence sur l'animal". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour analyser leur moelle osseuse, leur rate, leurs ganglions et les tissus par lesquels entrent les pathogènes.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les plateformes vaccinales que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces plateformes vaccinales. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.
Procédures
Les interventions effectuées seront des injections de vaccins par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour) après la vaccination.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront 3 injections de vaccin (nuissance légère au moment de l'injection) et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers (nuissance légère au moment du prélèment). La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.
Remplacement
Les plateformes vaccinales utilisées dans ce projet ont déjà été évaluées dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos plateformes vaccinales. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.
Réduction
Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agi ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre, impliquant tous les groupes des six procédures, est estimé à 3444 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.
Raffinement
Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).