Recherche fondamentale

Dépourvues de thymus, donc incapables de rejeter les cellules cancéreuses humaines qu'on leur greffe, 1 050 souris athymiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales mammaires sous anesthésie, puis jusqu'à quatre injections d'anticorps armés dans l'abdomen, réparties sur un mois. La tumeur, dont le volume est plafonné à 1 cm3, peut provoquer des douleurs et réduire leur liberté de mouvement, et toute médication est écartée pour ne pas brouiller la mesure de l'effet du traitement. Ne pouvant être réutilisées, elles sont tuées après deux mois d'observation, le porteur renvoyant à long terme le bénéfice espéré pour les personnes atteintes d'un cancer du sein.

Objectifs

Un conjugué anticorps-médicament ou anticorps armé (antibody-drug conjugate ou ADC) est une chimiothérapie vectorisée, permettant la délivrance sélective d'un agent cytotoxique, ce qui limite la toxicité systémique habituelle. Un anticorps armé résulte du greffage d'un agent cytotoxique puissant (drug) sur un anticorps thérapeutique (vecteur). Les anticorps armés, approuvés actuellement et commercialisés, sont construits à partir d’anticorps entiers. Afin d’améliorer l’efficacité et de réduire la toxicité, les fragments dérivés d’anticorps représentent aujourd’hui une véritable alternative comme vecteur. Le savoir-faire acquis aujourd’hui permet de développer une multitude d’anticorps armés innovants avec des caractéristiques in vitro, propres à chacun, sans pour autant être aujourd’hui capable de prédire leur efficacité in vivo, ainsi que leur niveau toxicité. Les objectifs du projet sont donc d’améliorer nos connaissances sur les caractéristiques d’intérêt des anticorps armés innovants développés, d’identifier le(s) candidat(s) démontrant la meilleure efficacité (régression tumorale) et de maitriser leur posologie afin de limiter les quantités à injecter.

Bénéfices attendus

Les résultats in vivo apporteront un vrai rationnel entre les qualités/quantités des anticorps armés injectés et la régression tumorale mesurée. Une connaissance plus approfondie de la posologie sera très intéressante afin d’avoir le meilleur rationnel dose/régression tumorale, ce qui contribuera, de plus, à réduire la toxicité dû à un traitement par les anticorps armés. Ceci permettra possiblement d’identifier des caractérisations in vitro, prédictifs des résultats in vivo, ce qui permettrait de réduire, par la suite, encore le nombre d’animaux à utiliser. Le bénéfice attendu finalement est l’obtention de candidats médicaments (santé humaine) encore plus efficaces et moins toxiques que les anticorps armés commerciaux, traitements utilisés couramment chez les personnes touchées notamment par le cancer du sein. L’échéance est à long terme, car après l’identification d’un candidat médicament (phase pré-clinique), le temps de développement d’un médicaments prend de nombreuses années (phases cliniques, …).

Procédures

Les animaux sont soumis, lors de la tumorisation, a 1 anesthésie générale (quelques minutes) et 1 injection par voie sous-cutané (quelques secondes). Lors du traitement avec les anticorps armés, les animaux sont soumis au maximum à 4 injections par voie intrapéritonéale (quelques secondes), réparties sur 1 mois et avec plusieurs jours entre chaque injection.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont liées au stress lors de la contention des animaux, voire à une légère douleur au niveau des sites d’injection (injection sous-cutanée de cellules tumorales ; injection intrapéritonéale des anticorps armés). Le développement de tumeurs mammaires peut engendrer des douleurs, une réduction de la liberté de mouvement (néanmoins, le volume tumorale ne dépassera pas 1 cm3).

Devenir

Les animaux ayant subis une tumorisation et un traitement à base d’anticorps armés ne peuvent pas être réutilisés et seront donc euthanasiées après deux mois d’observation après injection des traitements, à condition du respect des points limites. L'observation permet de suivre l’évolution de la taille de la tumeur, et en cas de régression totale, voire si la tumeur se redéveloppe.

Remplacement

Après avoir validé et sélectionné in vitro les anticorps armés, des études d’efficacité in vivo vis-à-vis de tumeurs de cancer du sein est absolument nécessaire. Il n'y a donc pas d'alternatives.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro et in vivo préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. D’après de précédentes données obtenues au laboratoire, utilisant des traitements similaires, le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques, soit 8 souris par lot (soit 10 souris implantées).

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Le modèle de développement tumoral a été choisi est pour être le moins lourd en termes de procédures pour l’animal. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Ainsi que d’un enrichissement ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid. Il n’y a pas de récompenses alimentaires. Les animaux seront surveillés une à deux fois par semaine après l'injection des cellules tumorales. La masse de l'animal sera relevée à chaque passage de l'expérimentateur et une estimation du volume tumoral sera réalisée en mesurant leurs dimensions à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la procédure. Cette procédure est modérée et n’a à ce jour jamais été à l’origine de symptômes nécessitant une prise en charge. Cependant, l’apparition de signes cliniques modérés engendrera une surveillance quotidienne de l’animal et conduira à la mort de l’animal si les signes persistent plusieurs jours. L’apparition de signes cliniques sévères conduira à la mise à mort de l’animal. Toute médication est proscrite, car il est très important d’évaluer uniquement les effets des traitements administrés sur la tumeur.

Choix des espèces

Les immunoconjugués anticancéreux préparés sont un matériel précieux et coûteux car nécessite plusieurs étapes de synthèse. Les volumes injectés doivent être les plus faibles possibles. D’où la nécessité de travailler chez le petit animal comme la souris. Afin de générer des modèles de cancers mammaires (xénogreffes), nous injecterons des cellules cancéreuses humaines. Afin que les cellules puissent se développer, il faut travailler avec des animaux immunodéprimés comme des souris athymiques. Les souris BALB/c-nu seront commandées à l’âge de 10 semaines pour un poids de 20g environ pour optimiser la prise de greffe. Elles seront hébergées en portoirs ventilés et manipulées sous poste de sécurité microbiologique. Il y aura ensuite un délai de 30 à 45 jours pour la prise tumorale avant l’administration des traitements.

Dix marmousets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant enchaîner jusqu'à cent séances d'électrophysiologie de trois à six heures, après trois à cinq mois d'entraînement sous contention cinq jours par semaine. Deux chirurgies crâniennes sous anesthésie générale précèdent ces séances, l'une de quatre heures pour fixer un plot sur le crâne, l'autre allant jusqu'à sept heures pour implanter les chambres d'enregistrement. Le porteur énumère les suites possibles, douleurs, inflammations, infections, difficultés respiratoires, abcès, œdème cérébral, et mentionne des restrictions alimentaires partielles pendant l'entraînement. Six animaux au plus seront tués en fin de protocole, les autres pouvant être réutilisés dans d'autres projets ou replacés après désimplantation.

Objectifs

Dans la nature, de nombreuses espèces animales doivent anticiper les mouvements de leurs proies pour pouvoir les capturer, ou ceux de leurs prédateurs pour pouvoir les éviter. Pour cela, leur cerveau doit compenser les délais inhérents aux traitements des informations visuelles et motrices. Cependant, on en sait encore peu sur la façon dont différentes régions du cerveau, comme celles liées à la vision et au mouvement, collaborent pour effectuer cette tâche. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment ces zones du cerveau communiquent et s'organisent pour permettre à un marmouset d'attraper un objet en mouvement. Notre hypothèse de travail est que les processus d’anticipation permettant de compenser les retards neuronaux des systèmes visuel et moteur reposent sur des propagations d’activité neuronale. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons une tâche où la position et l'orientation de la cible varient au cours du temps. Nous combinerons différentes techniques de mesure d’activité dans les régions cérébrales d’intérêt, à l’échelle d’une aire cérébrale (imagerie optique) et à l’échelle du neurone (électrophysiologie). Nous utiliserons ces données pour créer un modèle informatique de l’anticipation visuomotrice capable de prédire comment le système nerveux réagit lorsque des perturbations surviennent pendant la tâche. Ce projet fournira des informations nouvelles sur la manière dont le cerveau exécute une fonction essentielle, à savoir attraper de simples objets en mouvement, malgré les incertitudes et les délais dans le traitement de l'information.

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension des mécanismes par lesquels le cerveau traite et anticipe la trajectoire et l’orientation d’un objet en mouvement. Sur le plan visuel, il démontrera comment les propagations d’informations au sein de deux types de cartes corticales, l'une représentant la position de l’objet et l'autre son orientation, interviennent dans la prédiction des propriétés futures de l’objet (dans quelle position et quelle orientation il sera). Particulièrement, ces travaux vont nous apprendre comment ces deux informations se combinent pour former une image précise et anticipée des déplacements de l'objet. Sur le plan moteur, ce projet dévoilera comment les populations neuronales à moyenne et petite échelle coordonnent les mouvements proximaux du bras (pour la position de l’objet) et distaux de la main (pour son orientation). Pour finir, nous éclaircirons les phénomènes de transfert d’information de ces signaux d’anticipations, entre système visuel et moteur et leur rôle dans l’anticipation nécessaire à la tâche de capture. Dans un registre appliqué, ce travail contribuera à l’avancée de domaines tels que les interfaces cerveau-machine, en aidant par exemple à identifier quand et dans quelles zones du cerveau injecter des informations visuelles, ou comment utiliser les activités prémotrice et motrice pour optimiser le contrôle du mouvement.

Procédures

Les animaux participant à cette étude devront être progressivement habitués et entraînés pour passer les expériences, ce qui nécessitera de les manipuler plusieurs fois par semaine. Tous les animaux auront une Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) sous anesthésie générale (durée maximale : 2h30), une chirurgie crânienne sous anesthésie générale (durée maximale : 4h) pour la fixation d’un plot de tête, puis une série d’entraînements sous contention (5 fois/semaine pendant 3-5 mois, avec des sessions d’une heure maximum). Les animaux ayant réussi l'entraînement auront par la suite une 2ème chirurgie crânienne sous anesthésie générale pour implanter les chambres d’enregistrement ou les matrices multi-électrodes (durée maximale : 7h). Ensuite, des enregistrements cérébraux seront effectués, soit avec les animaux éveillés, soit sous anesthésie. Le nombre exact de sessions ne peut être déterminé à l’avance car il dépendra de l'état de santé des animaux, de la qualité des enregistrements, et de la quantité de données accumulée au fil des sessions. Cependant, nous estimons, pour les enregistrements éveillés, que le nombre maximum de sessions ne devrait pas excéder 20 et 50 pour les deux techniques d’imagerie optique utilisées, et 100 pour l’électrophysiologie. Ces sessions seront réparties à raison de 1 à 5 /semaine (durée entre 3 et 6h). Pour les enregistrements sous anesthésie, nous estimons un maximum de 10 sessions pour chacune des techniques, à raison d’une session/semaine (durée maximale : 6h). Certains animaux pourront également être soumis à une procédure terminale en fonction de leur état de bien-être et de la sévérité de la procédure, après concertation avec la SBEA et le vétérinaire référent. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et leur état de santé sera évalué tous les 6 mois. Les données nécessaires devraient être collectées sur une période de 36 mois.

Impact sur les animaux

Ces expérimentations impliquent des chirurgies, des anesthésies répétées dans le temps (IRM anatomique, chirurgie d’implantation des chambres d’enregistrement et du plot de tête), et une manipulation hebdomadaire voire quotidienne des animaux (entraînements vigiles, contention pour induction d'anesthésie, contention pendant les entraînements vigiles, enregistrements éveillés...) avec un isolement temporaire (≤24h) du groupe social lors des entraînements et enregistrements qui pourront induire du stress pendant les mois d'expérimentation. Du stress et des complications faisant suite aux chirurgies et anesthésies peuvent également survenir dans les jours qui suivent l'intervention (mise à jeun la veille de chaque anesthésie, isolement quelques heures en retour de chirurgie, douleurs, inflammation, infections, difficultés respiratoires, perte d'appétit, tremblements, abcès, oedème cérébral...). L’entraînement peut inclure des restrictions partielles de nourriture (fruits, porridge) qui sera fournie dans l’après-midi au lieu du matin/midi.

Devenir

Les animaux inclus dans la procédure terminale (≤6) seront mis à mort. En cas d’échec de l’entraînement, certains animaux pourront être sortis précocement du protocole en n’ayant subi que des procédures légères. Ils pourront alors être réutilisés dans d’autre protocoles. Pour les animaux implantés (plot de tête et chambres d’enregistrement) mais non inclus dans la procédure terminale, une décision sera prise en concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) sur leur devenir (ex : replacés après désimplantation) après avoir évalué l’état général et l’aspect cumulatif des procédures.

Remplacement

Ce projet porte sur l’étude de comportements visuomoteurs très précis dans l’espace et le temps et nécessite d’être réalisé sur des modèles animaux présentant une grande acuité visuelle et de bonnes capacités de contrôle du membre supérieur. Par ailleurs, il requiert l'enregistrement de l'activité cérébrale à des échelles mésoscopique et microscopique avec une grande résolution temporelle et spatiale, simultanément dans les aires visuelles et motrices, ce qu’il est impossible d’obtenir avec des méthodes non invasives. Le marmouset constitue un modèle idéal pour ce projet car il combine de très bonnes capacités de contrôle visuo-moteur avec un cerveau dont la petite taille facilite l’exploration simultanée de plusieurs structures corticales. L'utilisation du marmouset ne peut donc être remplacée.

Réduction

Globalement, nous estimons avoir besoin de 10 animaux pour ce projet. Afin de minimiser le nombre d'animaux, nous prévoyons d’utiliser plusieurs techniques d’enregistrement (imagerie et électrophysiologie) avec chaque animal. Il est vraisemblable que certains animaux (1-2) seront sortis du projet à des phases précoces et ne subiront que des procédures légères, car tous les animaux ne présentent pas la motivation nécessaire pour réaliser des tâches comportementales complexes (ici, fixation d’un point suivie de la capture d’un objet en mouvement, en situation de contention). Pour les animaux implantés (plot de tête et chambres d’enregistrement) mais non inclus dans la procédure terminale, une décision sera prise en concertation avec la SBEA sur leur devenir (ex : réutilisés après désimplantation) après avoir évalué l’état général et l’aspect cumulatif des procédures. Analyses et tests statistiques. Le faible nombre d'animaux estimé pour cette étude se justifie par le fait que l'unité d'observation « n » est l'activité d'un neurone ou d'une population de neurones, et non pas l'animal lui-même. C'est donc le nombre d'observations par animal, plutôt que le nombre d’animaux, qui est déterminant. Notre analyse sera basée sur l’élaboration de modèles prédictifs probabilistes (Bayesian) permettant de reconstruire l’activité neuronale dans différentes conditions expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par paires dans des volières adaptées et enrichies de plusieurs éléments (hamac, tunnels, nids suspendus, perchoirs...). Ils auront une phase d’habituation aux expérimentateurs, ce qui permettra de diminuer le stress lié à leur manipulation. Chaque étape de l’entraînement se fera par renforcement positif avec des cristaux de gomme arabique, des vers de farine ou de la gomme arabique diluée dans de l’eau (aliments présents dans le régime alimentaire des marmousets). Les phases d'apprentissage seront incrémentielles pour réduire au maximum le stress. Les procédures chirurgicales invasives seront effectuées sous anesthésie générale et une médication appropriée sera fournie dans le but d'éviter toute souffrance liée aux chirurgies. De plus, l’enregistrement simultané de grandes populations de neurones à l'aide d'électrodes à haute densité ou d’imagerie optique nous permettra d’acquérir rapidement une large quantité de données expérimentales, et donc de raffiner la méthodologie par rapport aux standards antérieurs en réduisant la durée des expériences. La chambre d'enregistrement a elle-même été raffinée et continue d’être améliorée au fur et à mesure de l'expérience acquise. Elle est composée d'un piston réglable en hauteur équipé d'une vitre courbe qui épouse la forme du cerveau sans le comprimer. Nous espérons ainsi limiter la repousse des tissus généralement observée, et par conséquent réduire le nombre d'interventions pour retirer ces tissus, ce qui minimisera les risques d'infection et le nombre d'interventions nécessaires à leur réalisation. L'état de santé des animaux sera suivi de près et quotidiennement par du personnel formé et qualifié, et une évaluation du vétérinaire référent et de la SBEA sera réalisée tous les 6 mois. L'expérience acquise au cours de ce projet nous permettra de raffiner nos techniques de chirurgie et d’assurer une meilleure récupération post-opératoire ainsi qu'une amélioration du bien-être tout au long de la période d’expérimentation.

Choix des espèces

Ce projet porte sur une tâche d’interception de cible et explore le fonctionnement du système visuel et moteur. Le système visuel diffère significativement d’un groupe d’espèces à l’autre (ex : rongeurs vs primates) et nécessite donc d'être étudié chez une espèce au plus proche de l’Homme. Le marmouset constitue un modèle tout à fait adéquat car c’est un primate non humain qui possède un système visuel très proche du nôtre, avec une hiérarchie des aires corticales supérieures identique. Concernant le volet moteur, la tâche étudiée se rapproche du répertoire comportemental naturel de cette espèce, qui capture et se nourrit de petites proies et d’insectes. Enfin, le marmouset est lissencéphale, ce qui rend l’ensemble des aires corticales visuelles et motrices facilement accessibles aux techniques d’imagerie et d’électrophysiologie. Age : à partir de 18 mois (animaux matures), car nous avons besoin que les animaux aient terminé leur croissance pour réaliser la tâche comportementale et pour supporter l'implantation de la chambre sur l'os du crâne. Poids : 0.3 à 0.5 kg

Immunisés à l'adjuvant de Freund par quatre à sept injections transdermiques, quatre lapins subissent aussi quatre à six prises de sang sur animal vigile, puis une anesthésie de quinze minutes suivie d'une ponction fémorale. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce que le projet produit est un réactif de laboratoire, des anticorps polyclonaux dirigés contre deux protéines de Pseudomonas aeruginosa, qui serviront à purifier ces protéines dans des extraits bactériens. L'adjuvant peut provoquer des douleurs articulaires et une forte inflammation aux points d'injection, et le lapin est retenu parce que sa taille moyenne donne beaucoup de sérum en consommant peu de protéine.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est devenue l'une des plus grandes menaces pour la santé mondiale. De plus en plus de bactéries sont résistantes, rendant ainsi ces molécules moins efficaces voire totalement inefficaces pour traiter les infections bactériennes. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable d'infections nosocomiales touchant principalement les patients immunodéprimés, les brûlés, ou encore les patients sous ventilation mécanique. Aujourd’hui, la lutte contre les souches de P. aeruginosa multi-résistantes aux antibiotiques, représente un enjeu sanitaire et médical important, enjeu souligné par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les modifications post-traductionnelles (PTM) constituent une piste de recherche innovante. Ce sont des ajouts de groupements chimiques qui s’effectuent notamment sur les protéines. Elles impactent alors les interactions, les structures et donc la fonction de ces protéines. Leur importance est clairement établie chez les eucaryotes puisqu’elles sont la cible de traitements contre certains cancers ou maladies neurodégénératives. En revanche chez les bactéries, leur mise en évidence est relativement récente et leur rôle reste encore à être déterminé. Si de nombreuses études ont été menées pour identifier les résidus modifiés, très peu d’entre elles, malheureusement, se focalisent sur leur rôle. Pourtant leur rôle, lors de la formation de biofilm, la résistance, la virulence ou la persistance bactérienne, semble important. Notre hypothèse est que cibler les PTMs bactériennes impliquées dans la pathogénèse, pourrait être utilisée comme une stratégie de lutte contre les infections causées par les pathogènes. Nous avons d’ores et déjà identifié de nombreux facteurs de virulence sécrétés par P. aeruginosa qui sont modifiés, parmi eux deux proteine B et D sont deux facteurs majeurs. Notre étude consiste donc à évaluer l’implication des différentes modifications dans l’acquisition de résistances aux antibiotiques, dans l’augmentation de la virulence et dans la formation de biofilms chez P. aeruginosa. La production d’anticorps polyclonaux chez le lapin pour chacune de ces protéines nous permettra d’isoler et de purifier B et D sous toutes leurs formes dans chacune de nos différentes souches cliniques de P. aeruginosa et ainsi de trouver le relationnel entre les modifications post-traductionnelles et l’augmentation de la pathogénicité chez cette bactérie.

Bénéfices attendus

L’obtention de ces anticorps polyclonaux ciblant B et D permettra de capturer et purifier ces deux protéines dans des lysas bactériens issus de différentes souches cliniques. Chaque souche ayant des particularités différentes de virulence de résistance aux antibiotiques ou de « culture » (planctonique ou en biofilm) nous effectuerons une cartographie des modifications post-traductionnelles de chaque protéine en corrélation avec son activité clinique. Le but final étant de cibler la ou les modifications pour développer un anticorps thérapeutique ou une stratégie antibactérienne sans utilisation d’antibiotique.

Procédures

4 à 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (5 minutes chacun)et 4 à 7 injections transdermiques (5minutes chacune). Une anesthésie générale de 15 minutes puis une ponction fémorale de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’utilisation de l’adjuvent de Freund peut induire des douleurs articulaires et provoque une forte inflammation au niveau des points d’injection. La réaction immunitaire peut aussi induire une hausse de la température.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des méthode de production d'anticorps recombinant existent mais ils ne permettent en aucun cas d'obtenir une polyclonalité aussi élevé que chez l'animal. Un système immunitaire mature et actif est indispensable pour la production de cet outil biologique fondamental dans nos travaux de recherche

Réduction

Nous avons utilisé les données de la littérature pour calculer de façon théorique les capacités moyennes de production d'anticorps pour chaque lapin. Nous avons donc pu déterminer que 2 lapins par protéine seraient nécessaires pour obtenir la quantité d'anticorps indispensable à nos études. Pour chaque protéine cible, deux lapins seront immunisés avec 15 jours de décalage ceci permettra d’évaluer la toxicité intrinsèque de la protéine recombinante et de ne pas immuniser le second lapin si la protéine était mal supportée par le premier lapin.

Raffinement

Afin de diminuer au maximum toute douleur articulaire et toute douleur due à l’inflammation des sites d’injection, les animaux recevront un patch transcutané de d'analgésique. Ce patch sera changé toutes les 72 heures. Le suivi sérologique de l’immunisation nous permettra de limiter au strict minimum les rappels d’immunisation et de mettre fin à la procédure au plus vite. L’observation des animaux au quotidien basée sur le score grimace scale permet d’établir un point limite précoce qui mettrait fin immédiatement à la procédure. Afin de limiter au maximum le stress des animaux pendant les manipulations, ils seront légèrement anesthésiés au masque.

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. Sa taille moyenne permet d’obtenir une bonne quantité de sérum riche en anticorps tout en utilisant peu de protéine pour l’immunisation. La longueur des CDRs des IgG de lapin leur confère une excellente affinité, de plus ces IgG sont facilement purifiable. Les animaux seront des jeunes adultes de 1,5 à 2 kg (30 à 45 jours) car ils possèdent un taux maximum d’anticorps circulant et un système immunitaire mature.

Injectées cinq jours de suite dans l'abdomen pour bloquer l'enzyme Alox15, 440 souris femelles subissent ensuite soit une greffe de cellules tumorales, soit une chirurgie destinée à provoquer un lymphœdème de la patte. Vient une lymphographie sous anesthésie générale, avec injection dans la patte saine et dans la patte gonflée, puis observation des vaisseaux au stéréomicroscope. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se déroulent dans deux établissements, entre lesquels les souris sont transportées. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les tissus, le porteur affirmant que l'inflammation chronique et la croissance tumorale ne sont modélisables par aucune approche sans animaux.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalement implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15- lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De meme, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet

Réduction

Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme Alox15 a ete generee seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de Alox15 de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines.

Immunodéficientes par construction, donc incapables de rejeter les cellules leucémiques humaines qu'on leur transplante, 288 souris vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules prélevées chez des patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique, développent le cancer dans leur moelle osseuse, leur sang et leur rate, puis subissent quatre injections de molécules inhibitrices et un prélèvement de sang à 35 jours, le tout à l'état vigile. Elles sont toutes tuées, en fin de procédure ou à l'atteinte des points limites, pour prélever la moelle et la rate et y doser les cellules leucémiques. Le porteur écrit que le remplacement par des méthodes sans animaux "n'est plus possible à ce stade" du projet, les molécules ayant déjà été testées sur des cellules de patients.

Objectifs

La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 25%). Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantations des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficients qui vont développer le cancer afin d’étudier l’effet thérapeutique de nouvelles molécules inhibitrices du cancer.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections des molécules inhibitrices se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.

Devenir

La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les anticorps et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être étudié en thérapie clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.

Transportées entre deux établissements selon une charte de transport, 440 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections intrapéritonéales à l'état vigile pour éteindre un gène, puis une greffe de cellules tumorales ou une chirurgie provoquant un lymphœdème, avant une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elles sont tuées sans réveil. L'objet est de comprendre pourquoi les lipides produits par l'enzyme ALOX15 manquent chez les patientes qui développent un lymphœdème après un cancer du sein. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement" pour ces processus, la réduction se limitant à n'utiliser que des femelles.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15-lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car l'invalidation génique de l’enzyme Alox15 a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant à une invalidation de Alox15 de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.