Recherche fondamentale
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Evaluation des effets d’un traitement innovant au niveau des muscles squelettiques pendant un choc endotoxémique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Pour tester si une molécule limite la fuite de plasma hors des vaisseaux pendant un choc septique, 12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Six reçoivent le traitement, six un placebo, après une injection intrapéritonéale d'un produit pro-inflammatoire qui fait chuter la pression artérielle et peut aller jusqu'à l'insuffisance circulatoire avec troubles de la conscience. Le protocole s'arrête à 24 heures, délai que le porteur présente comme une limitation des effets secondaires, et une IRM d'une heure sous anesthésie clôture l'expérience. Il décrit cet examen comme "parfaitement atraumatique", tout en attendant une possible détresse respiratoire au moment de l'endormissement.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60 pourcents, soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, une équipe de recherche Française a identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible thérapeutique spécifique, cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept in vivo que la modulation de l’activité de cette molécule permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Les muscles squelettiques étant des tissus richement vascularisés, la fuite capillaire y est cliniquement importante. L’imagerie médicale étant une technique non-invasive et atraumatique de référence dans l’étude du tissu musculaire, l’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet protecteur de ce médicament candidate sur le muscle squelettique dans le contexte du sepsis.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Tous les animaux (12) auront des injections intrapéritonéales (geste rapide de quelques secondes chez une animal vigile) d'une substance pro-inflammatoire et d'un placebo (6) ou du traitement à évaluer (6). Les injections seront réalisées par un personnel formé à cette technique. Après 24 heures, les acquisitions images par résonnance magnétique (IRM) d’une durée d’environ une heure, se feront sous anesthésie légère pour obtenir l'immobilité pendant environ une heure, mais sont parfaitement atraumatiques et n'induisent pas de souffrance par elles-mêmes.
Impact sur les animaux
L’induction d’un syndrome de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection d’un produit pro-inflammatoire en intra-péritonéal. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer le syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS), en particulier chez la souris. L’injection entraine une baisse de pression artérielle, pouvant aller jusqu'à une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience. Le présent protocole limite donc la durée à 24 heures maximum, en rapport avec la question scientifique posée et afin de limiter les effets secondaires induits. Concernant l’IRM, les modalités utilisées dans ce projet seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité. Les principales nuisances qui sont attendues peuvent être une détresse respiratoire au moment de l’anesthésie. De plus le monitorage de la température corporelle est réalisé couplé à un matelas thermostaté afin de maintenir la normothermie de la souris durant l'examen.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus afin de pouvoir faire une confrontation anatomo-pathologique avec les images in vivo.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et le peptide d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
L’IRM permet d’acquérir des données multiparamétriques dans un système expérimental complexe, tel l’animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par IRM autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Enfin par son caractère atraumatique, l’IRM offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effet nocif pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Les hypothèses du calcul du nombre de sujets nécessaires se basent sur les données préalables acquises lors de la mise au point du modèle. L’effet étudié (choc endotoxémique) touche tous les individus exposés et la différence entre individus exposés et contrôles est très nette, ce qui permet de faire un calcul de puissance a priori. Le nombre total d’individu nécessaire pour tirer une conclusion est de 12 individus. Les sous-groupes d’animaux sont ainsi au minimum de 6 individus. Des tests statistiques étayeront l’interprétation fiable des résultats avant de tirer des conclusions.
Raffinement
L’IRM répond enfin au 3ème R de la règle des 3R, Raffinement, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques au niveau électronique qui permettent d’atteindre des résolutions en préclinique environ 3000 fois supérieures à celles obtenues sur les aimants cliniques de pointe. De plus, le raffinement avant expérimentation s’applique aussi à l’hébergement des animaux en groupes dans des cages à usage unique sur des portoirs ventilés et en enrichissant l’environnement à l’aide de papier absorbant et de tubes en carton pour la fabrication de nids. La phase d'induction du sepsis sera couverte systématiquement par une analgésie et la survaillance du comportement et de l'état général des souirs permettr a de définir des points limites qui justifieraient une euthanisie prématurée. De plus, toutes les expérimentations IRM se feront sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress pendant l’examen. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant et la fréquence respiratoire est contrôlée en permanence pendant toute la durée de l’examen à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement en accord avec la législation en vigueur par du personnel compétent afin de s’assurer du bon état de santé de ces derniers.
Choix des espèces
Le choc septique constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable importante dans le monde. En recherche fondamentale, on peut mimer certains aspects du choc septique, en particulier la perméabilité des vaisseaux sanguins qui augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Les souris miment bien cette réponse, mais la tolèrent mieux que l’homme. La souris d’âge adulte jeune représente ainsi un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire induite sans entrainer une surmortalité. Le présent projet a été mis en place chez la souris et a déjà reçu une autorisation par le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. L’évaluation par IRM in vivo vient en complétement à des tests faits sur ce même modèle avec une vision d’applicabilité en clinique humaine.
Rôle des émotions dans la formation et le stockage à long terme des souvenirs des épisodes de vie non traumatiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un contrôle de l'accès à l'eau mis en place progressivement sur deux semaines, une chirurgie d'injection de vecteurs dans le cerveau, un gilet de télémétrie porté jusqu'à une heure trente par séance. 404 rats Long-Evans vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 380 d'entre eux et léger pour les 24 autres. Le porteur présente la tâche de mémoire comme une "exploration libre où chaque animal fait à son rythme l'expérience de situations", alors que la motivation des rats repose sur une restriction d'eau maintenue plusieurs semaines et levée seulement les week-ends. Tous seront tués par chirurgie terminale sous anesthésie, avec perfusion intracardiaque, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Une question majeure des Neurosciences est de comprendre comment les souvenirs sont formés et stockés à très long terme dans le cerveau. La mémoire épisodique permet au travers d’un voyage dans le temps et dans le souvenir de reconstruire, parfois dans les moindres détails, des épisodes personnels de sa vie, des années plus tard. Elle se forme de façon occasionnelle et incidente par l'association de plusieurs types d’informations (Quoi ? Où ? Quand / Dans quel contexte ?). Comprendre pourquoi et comment ces souvenirs anciens sont stockés, permettrait de mieux comprendre le fonctionnement normal de cette mémoire qui est au cœur de l’identité individuelle et de son dysfonctionnement dans différentes pathologies. Le rôle des émotions et des circuits cérébraux impliqués est connu depuis longtemps comme ayant une place centrale dans les processus de consolidation des mémoires soit traumatiques (mémoires de peur et syndromes post-traumatiques…), soit appétitives (mémoires addictives…). Cependant, l’impact de la charge émotionnelle dans des mémoires non pathologiques, mais qui sont importantes pour l’individu, telle que la mémoire épisodique, n’a jamais été exploré.
Bénéfices attendus
Parce qu’elle est difficile à modéliser chez l’Homme comme chez l’animal, peu de données sont accessibles sur les processus qui sous-tendent la mémoire épisodique. Nous utilisons une nouvelle tâche de mémoire épisodique qui nous permet aujourd’hui d’en étudier les caractéristiques précises chez le rat dans des conditions très comparables à celle observée chez l’Homme. Le bénéfice principal attendu est de comprendre si la variabilité de la charge émotionnelle vécue à l’échelle de l’individu durant un épisode de vie non traumatique renforce l’ancrage et le stockage à très long terme de cette mémoire et pourrait expliquer au final la variabilité des compétences mnésiques individuelles. Parce qu’elle est au cœur des histoires individuelles et qu’elle est altérée lors d’un vieillissement normal et pathologique, une meilleure compréhension de la mémoire épisodique représente un enjeu important en recherche fondamentale et en recherche appliquée pour mieux cibler des outils de diagnostics, thérapeutiques et de remédiation.
Procédures
-Les rats réaliseront une tâche comportementale de mémoire épisodique qui consiste à leur faire vivre des épisodes de vie durant lesquels ils explorent librement et associent des odeurs à des localisations et à des contextes de l’environnement, puis à tester la qualité de leur souvenir plusieurs jours après en les replaçant dans la même situation. -Les rats seront équipés d’un gilet qui enregistre de façon non invasive l’activité cardiaque respiratoire et l’actimétrie. Pour cela les rats seront habitués à enfiler le gilet sans contention et à le garder au maximum 1h30 par session de comportement. -Les rats subiront une chirurgie pour l’injection de vecteurs et ils réaliseront une partie de la tâche comportementale de mémoire épisodique 4 semaines après la chirurgie,
Impact sur les animaux
- Les animaux sont soumis à une tâche comportementale avec enregistrement non invasif des variables physiologiques. Seul un stress très léger est attendu au début de l’habituation au gilet et au début de la mise en place du contrôle hydrique. - Les animaux subissent des nuisances en lien avec la chirurgie et l’injection de vecteurs : anesthésie, injection du ligand et douleurs post-opératoires. -Les rats seront mis à mort avec une perfusion intracardiaque qui peut provoquer un léger stress chez l’animal due à l’injection des analgésiques et anesthésiques.
Devenir
Tous les rats utilisés seront mis à mort par une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement d’organes afin d’analyser en imagerie cellulaire ex vivo la diffusion effective et l’efficacité des vecteurs, des marqueurs cellulaires liés à l’anxiété, à l’activation et à la plasticité neuronale. Nous avons prévu d’étudier sur les mêmes animaux des variables comportementales, physiologiques et d’imagerie cellulaire afin de limiter au maximum le nombre de procédures et d’animaux utilisés dans ce projet.
Remplacement
L’analyse de marqueurs cérébraux et l’utilisation des vecteurs rendent ces expériences inenvisageables chez le sujet humain. L’analyse de comportements complexes tels que les processus de mémoire avec plusieurs composantes (Quoi ? Où ? Quand / Dans quel contexte ?) ne permettent pas d’utiliser des modèles in vitro ou d’autres modèles animaux.
Réduction
i) Le nombre de rats utilisés dans ce projet a été réduit au minimum en nous basant sur les données que nous avons acquises et permettant de réaliser des analyses statistiques valides en ayant suffisamment d’animaux pour chaque profil mnésique analysé en tant que tel, et une reproductibilité suffisante en terme d’injections de vecteurs; ii) Nous avons prévu de mettre au point les injections de vecteurs afin d’éviter d’utiliser trop d’animaux; iii) Nous avons prévu d’étudier des variables comportementales, physiologiques et d’imagerie cellulaire sur les mêmes animaux afin de limiter le nombre de procédures et d’animaux utilisés ; iv) Nous proposons de modifier notre protocole initial de comportement pour accéder aux performances de mémoire à court et à très long terme sur les mêmes animaux, ce qui diminue par 2 le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
-Dans ce projet, le bien-être est un point critique pour les animaux eux-mêmes, et pour la reproductibilité et la validité de ces expériences qui y sont sensibles puisque portant sur le statut émotionnel individuel et l’impact sur une mémoire formée de façon incidente, lors d’une exploration libre et sans apprentissage extensif. La santé et le confort des animaux sont donc des aspects centraux continuellement évalués lors de leur manipulation quotidienne. -Nous allons utiliser un gilet de télémétrie, pour enregistrer de façon non invasive les variables physiologiques des rats, qui est aussi utilisé en recherche pharmaceutique pour évaluer le bien-être animal. - Les rats sont hébergés par 2 en respectant le groupage utilisé pendant le transport afin de maintenir les groupes sociaux déjà formés. Ils sont acclimatés à l’animalerie pendant 1-2 semaines puis ils sont manipulés individuellement et quotidiennement au moins 15 minutes par jour par l’expérimentateur. Les rats ont une habituation de 4 semaines au total qui permet d’introduire progressivement toute nouveauté (expérimentateur, gilet, tondeuse, salle d’expérience, contrôle hydrique). Du matériel d’enrichissement/nidification est rajouté dans chaque cage afin que les rats tondus ne perdent pas de chaleur. Le contrôle hydrique est mis en place progressivement durant 2 semaines et elle est levée tous les WE. L’habituation à l’enceinte expérimentale est progressive et se déroule sur 2 semaines. -La tâche de mémoire épisodique est une tâche d’exploration libre où chaque animal fait à son rythme l’expérience de situations avec des renforcements positif (boisson sucrée) ou négatif (boisson légèrement amère).
Choix des espèces
Le rat (Long-Evans) est une espèce utilisée de longue date dans les études de comportement ce qui a permis de constituer une base importante d’informations permettant de guider la conception de nos protocoles expérimentaux et d’obtenir une bonne reproductibilité des expériences. En cohérence avec nos travaux antérieurs et les données de la littérature, le rat est aussi une espèce de choix compte-tenu de ses capacités importantes d’apprentissage. Plus particulièrement la souche Long-Evans a été retenue en raison de son adaptation à l’étude du comportement et de l’absence d’altération de la vision par rapport aux souches albinos, un aspect important pour l’exploration spatiale et d’un contexte environnemental. Nous utiliserons le stade adulte avec des rats de 6 semaines à leur arrivée pour commencer les expériences d’habituation à l’expérimentateur à l’âge de 8 semaines. Notre projet nécessite des animaux qui ont atteint leur maturité cérébrale pour étudier les processus de mémoire du cerveau adulte. La question de ces mêmes processus chez le rat jeune est une autre question de recherche qui n’est pas abordée dans notre projet
Etude du rôle d’une protéine dans la progression de l’ostéosarcome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules cancéreuses injectées dans le tibia sous anesthésie, puis huit semaines d'injections intrapéritonéales jusqu'à deux fois par semaine. 252 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit ne prévoir aucun effet secondaire particulier, et décrit dans le même paragraphe une lyse osseuse avec boitement, une perte de poids surveillée jusqu'à 15 % et des difficultés respiratoires liées aux métastases qui déclenchent une mise à mort immédiate. La mise à mort finale sert à recueillir les tissus, étape qu'il qualifie d'"essentielle" à la fiabilité des conclusions.
Objectifs
L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus courante chez les enfants, les adolescents et les jeunes adultes. Malheureusement, les traitements actuels ne sont pas toujours efficaces, et 40 % des patients ne peuvent pas être guéris. Notre objectif est d'étudier le rôle d'une protéine dans ce cancer, en voyant notamment comment elle influence la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Nos premières recherches, réalisées à l'aide d'analyses informatiques et sur des cellules en laboratoire, montrent que cette protéine pourrait avoir des effets anti-cancer. Ce projet est essentiel pour comprendre si cette protéine peut ralentir la progression de l'ostéosarcome en stimulant le système immunitaire, et si elle pourrait devenir une nouvelle cible de traitement pour améliorer les chances de survie des jeunes atteints de ce cancer.
Bénéfices attendus
Les ostéosarcomes restent des cancers compliqués à soigner. Les traitements actuels sont agressifs (chimiothérapie lourde, amputation) et largement inefficaces dans de nombreux cas. Nous avons absolument besoin de mieux comprendre la biologie de ces cancers pour mieux soigner les enfants et les jeunes qui en sont atteints. Notre projet s’inscrit dans cette perspective et permettra de définir la pertinence de cibler une protéine -dont le rôle n’a pas été décrit jusqu’ici dans cette pathologie- dans la mise en place d’immunothérapies.
Procédures
1 : Injection sous la peau d’antidouleur avant la greffe (durée : 30 secondes/animal) 2 : Injection des cellules dans le tibia des souris sous anesthésie (durée 1min/animal) 3 : Injection en intrapéritonéale 1x/sem (pendant 8 semaines maximum) pour rendre la tumeur visible en imagerie (durée 30 sec/animal) 4 : injection en intrapéritonéale 2x/sem (pendant 8 semaines maximum) d’un traitement de chimiothérapie (durée: 30 sec/animal)
Impact sur les animaux
Nous utilisons uniquement des doses de traitement sans toxicité attendue et ne prévoyons pas d’effets secondaires particuliers. Cependant, des effets temporaires peuvent survenir, comme une légère inflammation pendant 2 à 3 jours après l'injection de cellules dans la jambe, parfois accompagnée d’un boitement lié à une lyse osseuse. Les injections peuvent également entraîner des réactions locales, comme des rougeurs ou des gonflements, et l’anesthésie peut provoquer des troubles passagers, tels qu’une baisse de température ou une respiration ralentie. La perte de poids des animaux sera suivie de près, avec une limite fixée à 15 % par rapport à leur poids initial. Si des difficultés respiratoires apparaissent en lien avec des métastases, les animaux seront observés et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance. Enfin, les manipulations régulières, comme les pesées ou les déplacements, provoqueront un stress modéré
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de recueillir les données nécessaires à l’analyse des résultats et de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cette étape est essentielle pour garantir la fiabilité et la précision des conclusions.
Remplacement
Le microenvironnement de la tumeur étant très complexe, il n’existe pas de méthode en laboratoire, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires. De plus, on ne peut pas étudier la propagation des cellules cancéreuses dans le corps avec nos méthodes en laboratoire.
Réduction
Nous utiliserons différents types de tests statistiques en fonction des comparaisons que nous voulons faire. Selon ce que montrent les recherches et notre propre expérience, nous pensons que 90 % des greffes vont réussir. En général, nous avons besoin d'au moins 14 animaux par groupe pour être sûrs que les résultats statistiques montrent une différence significative entre les groupes.
Raffinement
Toute intervention d’injection intratibiale sera faite sous anesthésie générale. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux, une surveillance adaptée des animaux, une pesée bi-hebdomadaire et une observation minimum 3 fois par semaine permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal, le plus souvent observée par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera un antalgique sans influence sur le système immunitaire. Après l’intervention, les animaux sont remis dans leur cage d’origine et auront une surveillance accrue.
Choix des espèces
Nous avons développé un modèle d'ostéosarcome en injectant des cellules cancéreuses dans le tibia de souris. Étant donné que ces cellules proviennent également de souris, ce modèle reproduit le développement de la tumeur dans un organisme doté d’un système immunitaire complet, ce qui est crucial pour comprendre la réaction du corps face à la tumeur. Ce modèle nous permet également d'observer la propagation du cancer vers les poumons. Nous choisissons des souris de 5 semaines, car l'ostéosarcome étant un cancer pédiatrique, cet âge reflète au mieux la réalité de la maladie chez l’homme.
role de l’inflammation dans le syndrome de Dravet
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
L'induction de crise s'arrête quand la souris convulse ou quand sa température corporelle atteint 43 degrés, selon ce qui vient en premier. 698 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles sont biopsiées à 15 jours pour le génotypage, entrent en procédure à 20 jours, reçoivent une injection intraveineuse sous anesthésie, et une partie subit l'implantation chirurgicale d'électrodes d'électroencéphalographie. Le porteur écrit que les crises spontanées sont "fréquentes et non douloureuses" du fait de la perte de conscience, tout en indiquant qu'elles provoquent une mort subite chez 35 % des animaux avant l'âge de 40 jours.
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une épilepsie génétique sévère qui se développe avant l'âge de 1 an. Outre les crises d'épilepsie, ce trouble se caractérise par des comorbidités comportementales, telles qu'un retard cognitif et une déficience motrice. Ce syndrome est causé par un déséquilibre excitation/inhibition qui conduit à des crises d'épilepsie. Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises, ni d’amélioration des retards cognitifs avec les traitements pharmacologiques actuels. Notre projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique avec trois composés potentiels sur le développement de différents symptômes dans un modèle murin du syndrome de Dravet. Notre modèle murin récapitule les symptômes observés chez les patients ; Les premières crises chez l’Homme apparaissent avant l'âge d'un an et se stabilisent à l’adolescence, chez les souris elles apparaissent dès 20 jours et se stabilise autour de 30 jours. A l’adolescence, le syndrome évolue vers un retard cognitif et moteur visible aussi chez la souris.
Bénéfices attendus
Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises, ni d’amélioration des retards cognitifs avec les traitements pharmacologiques actuels. Notre projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique avec trois composés potentiels sur le développement de différents symptômes dans un modèle murin de ce syndrome. Nous présentons une nouvelle version de la ligne de traitement existante pouvant améliorer ou modifier la trajectoire à long terme de la pathologie.
Procédures
A 15 jours les animaux sont biopsiés pour analyse du génotype pour la répartition des groupes expérimentaux, puis les souris entrent en procédure à l'age de 20 jours. La totalité des souris recevra une injection intraveineuse sous anesthésie qui peut provoquer une inflammation locale. Un premier lot d'animaux sera implanté avec un système d'enregistrement électrocéphalographique (EEG). Ils seront soumis à une anesthésie générale pour l'implantation par chirurgie du système d'électroencéphalographie (EEG, 20 min). Deux séries d'enregistrements électroencéphalographiques impliquant une contention pour branchement au système. Un deuxième lot subira une induction de crise induite par l'hyperthermie. Il s'agit d'une procédure unique qui dure environ 20 minutes et se termine lorsque l'animal développe une crise d'épilepsie ou lorsque sa température corporelle atteint 43 degrés Celsius. Un troisième lot effectura des tests comportementaux. Les test comportementaux qui seront utilisés, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront sur deux semaines. Un dernier lot sera soumis à des tests comportementaux (les mêmes que précédement) puis les animaux seront implanté avec un système d'enregistrement EEG comme présenté précédement.
Impact sur les animaux
Les souris entrent en procédure à 15 jours, après une biopsie entraînant une douleur de courte durée. Les souris développent des crises tonico-cloniques spontanées à partir de l'âge de 3 semaines environ (P20), ces crises sont fréquentes et non douloureuses car il y a perte de conscience pendant la crise, comme chez les patients. Les crises sont néanmoins dangereuses pour les souris durant ce stade de développement jusqu'à environ P40 car elles provoquent la mort subite (SUDEP) chez 35% des animaux. Après les crises, les souris reprennent lentement conscience et recommencent à bouger sans aucun signe clair de douleur (pas de posture, de cri ou d'expression faciale de douleur). La fréquence moyenne des crises spontanées dans ce modèle de souris est de 1 crise tous les 2 jours. Les souris seront injectées par voie intraveineuse, ce qui peut provoquer une inflammation locale ponctuelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour analyses.
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal in vivo mimant le phénotype clinique observé chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cruciale pour l'objectif de notre projet qui est de tester l'efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) qui surviennent dans ce syndrome, il n'y a pas de remplacement possible.
Réduction
Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences (analyse a priori à l'aide du logiciel Gpower). Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris mutantes avec les souris controles des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.
Raffinement
Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (plusieurs animaux par cage, abri, buchette, et coton pour le nid). Nous manipulerons les animaux régulièrement pour les habituer à notre présence. Tout au long de chaque procédure, les animaux seront surveillés (hebdomadaire). Nous utiliserons une grille de score pour apporter les réponses adaptées et nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité, décrit dans les points limites. Pour aider à la prise de décision, cette grille de score contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par mise à mort. Ce suivi tout au long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitués. En outre, toutes les douleurs opératoires et postopératoires liées aux chirurgies prévues seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie, Le modèle animal que nous utilisons pour le projet (Scn1a mutant) développé par notre collaborateur est le plus utilisé. Il constitue un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'unité neuro-glio-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des crises sur les marqueurs d'inflammation. L'évaluation du potentiel thérapeutique des quatres composés sur le phénotype épileptique et non épileptique débutera après la première crise d'épilepsie, soit entre 20 jours et 30 jours. Les tests comportementaux, les électroencéphalogramme seront eux menés à l'âge adulte
Emergence de la résistance bactérienne aux antibiotiques dans des microbiotes digestifs traités par anticancéreux (Projet RAMA – Emergence of bacterial Resistance to Antibiotics in digestive Microbiota treated with Anticancer drugs)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leur microbiote intestinal est d'abord éliminé par quatre gavages d'une solution purgative à vingt minutes d'intervalle, ce qui provoque des diarrhées, puis remplacé par un microbiote humain administré en trois gavages espacés de trois jours, avant des injections d'anticancéreux et d'antibiotique dans l'abdomen. Elles passent huit jours isolées, cage par cage, pour éviter que les bactéries ne circulent entre elles. Le porteur écrit qu'un placement auprès d'une association de protection animale ne semble pas approprié vu l'état de santé de l'animal, et que le recours aux souris est "indispensable" faute de méthode reproduisant un microbiote humain in vitro.
Objectifs
Le traitement des cancers solides consiste fréquemment en l’utilisation de médicaments cytotoxiques (chimiothérapies) lesquels ciblent l’ADN des cellules cancéreuses, dont la prolifération est rapide. Les très nombreuses bactéries du microbiote digestif du patient sont des cellules à prolifération rapide et il a récemment été montré qu’elles sont aussi la cible des médicaments cytotoxiques. L’altération de l’ADN bactérien par les molécules antimitotiques strese les bactéries et favorise l’émergence de mutants in vitro. Dans le tube digestif des patients traités par anticancéreux, ces mutants résistants pourraient être ensuite sélectionnés par un traitement antibiotique (très fréquemment prescrite en traitement des complications infectieuses en cours de chimiothérapie), et ainsi augmenter le risque d'infections nosocomiales à bactéries résistantes aux antibiotiques, plus difficiles à traiter. Les résultats obtenus jusqu’à présent résultaient d’expérimentations in vitro, qui confrontaient une molécule anticancéreuse à une seule espèce bactérienne, ne tenant compte ni de la composition en nutriments du système digestif, ni de la complexité du microbiote digestif. Il est en effet établi que la communauté bactérienne digestive (composée d’environ 500 espèces) protège de la colonisation par les bactéries résistantes en raison de compétition pour les nutriments chez des individus sains. Dans ce projet, nous souhaitons de manière inédite mesurer l’influence d’un traitement par des molécules anticancéreuses connues pour stresser les bactéries sur l’émergence de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques dans le microbiote digestif d’un modèle murin de microbiote humanisé par greffe fécale. Nous souhaitons ainsi démontrer que les traitements anticancéreux favorisent l'apparition de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques (objectif principal). Nous explorerons aussi les mécanismes sous-jacents à cette émergence, en mesurant les modifications de la composition et des fonctions biologiques des microbiotes soumis à des doses thérapeutiques d’anticancéreux (objectif secondaire).
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le modèle murin et combinées à celles d’une étude clinique qui sera réalisée en parallèle, permettront de générer de nouvelles hypothèses d’optimisation des stratégies thérapeutiques des cancers chez l’Homme.
Procédures
Tous les animaux auront les interventions suivantes : gavage (4 fois avec une solution purgative à 20 min d’intervalle, 3 gavages de greffon, à 3 jours d’intervalle, durée de gavage < 1 min) ; injections intra-péritonéales (1 fois l’anticancéreux/sérum physiologique, 3 fois l’antibiotique, durée d’injection < 10 s).
Impact sur les animaux
Des nuisances d'intensités légères dues aux injections intra-péritonéales des chimiothérapies/sérum physiologique et de l’antibiotique ainsi que des douleurs au niveau des points d’injection peuvent être attendues. Par ailleurs, même si l’expérience montre que l’injection de molécules anticancéreuses est bien tolérée par les souris, des effets indésirables liés à l’administration d’agents cytotoxiques ne peuvent pas être exclus (nuisances modérées). Le mode d’élimination du microbiote naturel de la souris par une solution purgative (préalable à l’installation du microbiote humain) risque de causer des diarrhées ainsi qu’un inconfort de courte durée (< 30 min) et le gavage oro-gastrique peut induire du stress responsable d’une augmentation de la morbidité et mortalité des souris (évèvements rares, nuisances modérées). Les implantations de microbiote humain ne présentent a priori aucune implication pathologique pour les animaux. En effet, l'introduction d'un microbiote particulier n'induira pas le développement de maladies. Cependant les souris seront étroitement surveillées par un vétérinaire en cas de survenue de diarrhées (nuisance modérée).
Devenir
Les animaux seront mis à mort car il ne sera pas possible de réutiliser ces animaux pour une autre expérimentation en raison de l’administration d’anticancéreux notamment. Un placement de l’animal auprès d’une association de protection animale ne semble pas non plus appropriée en raison de l’état de santé de l’animal qui ne peut être garanti à l’issue de l’expérimentation.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable un microbiote intestinal humain in vitro d’autant plus qu’une partie du microbiote est constitué de bactéries viables mais non cultivables. Les modèles les plus fiables requièrent l’humanisation, partielle et temporaire, du microbiote d’animaux. Actuellement, il est impossible de ne pas recourir à des modèles animaux. Le recours aux souris est donc indispensable pour ce projet qui utilisera le minimum de souris nécessaire en respectant le plus possible le bien-être animal.
Réduction
Cette étude comportera des petits groupes animaux (n=10) pour pouvoir faire des tests statistiques validant les résultats. Un support en biostatistique est apporté par un expert de la spécialité, afin d’optimiser les méthodes expérimentales. L’utilisation de 10 souris par lot permet de lisser les variations interindividuelles. Les souris utilisées pour l’étude pilote des points limites pourront entrer dans les statistiques finales, réduisant ainsi le nombre de souris par lot dans l’étude principale.
Raffinement
L'hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignées de souris. La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), et maintien des animaux en groupes de 5 afin d’éviter le stress de l’isolement jusqu’à l’administration des antibiotiques (J8). Ensuite les souris devront impérativement être hébergées individuellement pour éviter les contaminations croisées par les bactéries du microbiote digestif (objet de l’étude). Nous limiterons l’hébergement individuel à 8 jours (entre J6 et J14) pour réduire l’inconfort des souris. Pendant cette période, les animaux garderont un contact visuel et olfatif avec leurs congénères et l’enrichissement dans leur cage sera augmenté et varié. Les conditions d’hébergement seront optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), En rapprochant les cages au maximum, nous nous assurerons que les animaux puissent communiquer. Les Souris pourront voir leurs congénères (cages transparentes) et les sentir (pas de couvercle filtrants). L’enrichissement sera renforcé (tubes en Plexiglas, billes de bois à ronger). La durée maximale de leur vie solitaire sera de 8 jours (J6 à J14). Une surveillance attentive est assurée quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. Une intervention immédiate et appropriée sera entreprise dès l'apparition de tout signe de détresse selon les scores des points limites fixes dans la procedure.
Choix des espèces
En plus des avantages pratiques liés à l’élevage ainsi qu’à l’expérimentation sur ce modèle animal parmi toutes les possibilités qu’offre l’expérimentation animale, la Souris est celui le plus utilisé dans les études sur le microbiote intestinal en général et plus particulièrement sur la greffe de microbiote fécal. En utilisant des souris, nous pouvons bénéficier des retours d’expérience d’autres équipes et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés pour la mise au point des protocoles. De plus, les résultats obtenus pourront être comparés aux études précédentes et permettre une analyse plus fine. Le protocole que nous allons suivre utilise des souris adultes de 8 semaines. Nous n’avons pas de raison de modifier ce paramètre dans notre étude.
Infection expérimentale de rongeurs par Plasmodium : production de parasites génétiquement modifiés et test de nouvelles molécules
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Certaines souris de ce projet sont désignées comme donneuses de globules rouges parasités, d'autres comme receveuses, les premières étant infectées puis tuées pour transmettre le parasite aux secondes. 4 545 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées. Elles sont infectées par Plasmodium berghei, agent du paludisme du rongeur, par groupes de 8 ou de 12, et leur parasitémie est suivie par frottis à partir d'une micro-goutte de sang. Le porteur indique que l'infection non contrôlée tue les souris par hyperparasitémie et anémie, et qu'elles sont mises à mort lorsque la parasitémie atteint environ 5 %, pour prélever leur sang et constituer des stocks de globules rouges parasités.
Objectifs
Le paludisme reste encore à l’heure actuelle un problème de santé publique majeur. L’apparition de résistances aux traitements thérapeutiques et l’absence de vaccin efficace motivent l’intérêt que nous portons à la biologie du parasite responsable : le Plasmodium. Nous nous intéressons à des phénomènes cruciaux pour la survie du parasite dans le but de confirmer l'essentialité de certaines protéines pour le parasite et de tester de potentiels nouveaux médicaments antipaludiques ciblant ces protéines. Si la plus grande partie de nos expériences fait appel à des techniques de biologie moléculaire et biochimie, il est indispensable de valider nos résultats sur le parasite directement. Pour cela nous cultivons le parasite Plasmodium falciparum in vitro. Nous pouvons ainsi non seulement suivre la localisation des différentes protéines d’intérêt chez le parasite, mais également tenter de générer des parasites génétiquement atténués afin de tester l’essentialité des gènes correspondants. Ces différentes étapes in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés pour la suite de nos projets. De fait, le modèle in vitro présente des limites. L’utilisation de P. berghei (parasite spécifique du rongeur) est donc une approche de choix en cas d’échec de l’approche in vitro. Dans ce contexte, nous réalisons des infections expérimentales de souris par P. berghei. Les animaux sont utilisés dans le but soit de générer des parasites génétiquement modifiés, soit de tester des composés à potentiel thérapeutique dans le cadre d’études pré-cliniques (composés préalablement sélectionnés in vitro).
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet doit permettre une meilleure compréhension du rôle de certaines protéines chez le parasite Plasmodium. La génération de parasites génétiquement modifiés n’exprimant pas ces protéines permet en effet d’en étudier l’essentialité pour le parasite et ce à différents stades de son cycle. Outre l’avancée en termes de connaissances scientifiques, cette étude ouvre la possibilité de développement de nouveaux composés anti-malariques. En effet, une protéine essentielle représente une cible potentielle dans le cadre d’une stratégie chimio-thérapeutique. Notre deuxième objectif vise donc au développement de nouveaux composés anti-malariques. Ainsi, notre projet permettra de tester in vivo des composés conçus avec l’aide de collaborateurs chimistes. Ces composés auront été préalablement sélectionnés in vitro pour leur potentiel anti-malarique d’une part, et leur non-toxicité sur cellules de mammifères d’autre part.
Procédures
La procédure 1 a pour objectif la préservation des différentes souches de parasites utilisées dans les procédures 2 et 3. Cela consiste à infecter de groupes de 12 souris (injection de globules rouges parasités) et suivre la parasitémie par frottis sanguin à l’aide d’une micro-goutte de sang. Lorsque la parasitémie atteint environ 5%, les souris sont euthanasiées et leur sang est prélevé afin de constituer des stocks de globules rouges parasités qui seront conservés à très basse température. La procédure 2 vise à générer des parasites génétiquement modifiés afin d’analyser le rôle d’un gène d’intérêt pour le parasite. Pour cela, des groupes de souris sont infectées avec des parasites modifiés. Si les parasites sont viables (suivi sur frottis sanguin), les souris sont euthanasiées et leur sang est prélevé afin de conserver/propager les parasites et vérifier les modifications génétiques introduites. L’effet de l’extinction du gène d’intérêt sera alors étudié à différents stades de développement du parasite chez des souris infectées avec ces parasites génétiquement modifiés, en comparaison avec des souris infectées avec les parasites non modifiés. La procédure 3 consiste en l’étude préclinique de nouveaux composés anti-malariques. Des composés développés en collaboration avec des collègues chimistes et conçus pour cibler des protéines essentielles pour le parasite sont testés pour leur capaciter à protéger des souris d’une infection. Des groupes de 8 souris sont infectées par le parasite et traitées avec les composés. Leur parasitémie est observée 4 jours après l’infection sur frottis sanguin et la protection est évaluée par rapport aux souris contrôles infectées et non-traitées. Si une protection est observée, la parasitémie est suivie pendant 1 à 2 semaines puis les souris sont euthanasiées.
Impact sur les animaux
L’infection expérimentale par Plasmodium berghei, si elle n’est pas contrôlée, conduit à la mort des souris par hyperparasitémie et anémie. Cependant, dans le cadre du suivi de l’infection par des parasites génétiquement atténués ou dans celui des tests de composés à potentiel thérapeutique, l’objectif de notre projet est de diminuer la gravité de l’infection, soit par l’utilisation de parasites moins viables soit par l’utilisation de composés thérapeutiques. La souffrance potentiellement engendrée par l’infection palustre doit donc être diminuée. Un suivi quotidien des animaux (signes cliniques, parasitémie sanguine) permet de contrôler l’évolution de l’infection et d’euthanasier par anticipation les animaux présentant des risques de souffrance.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort au cours ou à la fin des procédures, soit pour prélever le sang et préserver/propager les parasites, soit pour éviter la douleur engendrée par l'infection palustre, soit pour mettre fin à un suivi de parasitémie qui serait négatif. En effet, il a été démontré qu'une souris infectée mais ne prenant pas l'infection (absence de parasites sanguins sur frottis) ne peut être ré-infectée.
Remplacement
L’utilisation des animaux est remplacée par des tests in vitro chaque fois que possible : les parasites génétiquement modifiés sont générés chez Plasmodium falciparum (espèce que l’on peut cultiver in vitro), et l’efficacité anti-malarique des composés est toujours testée en première intention in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la question posée et grâce à notre connaissance de longue date du modèle expérimental, dans le but de permettre une analyse statistique des résultats. Le suivi cinétique de la parasitémie d’un même animal permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les expérimentations sur animaux ne sont répétées que lorsque les effets observés sont au minimum intermédiaires.
Raffinement
Les conditions de détention des animaux sont améliorées grâce à des enrichissements (coton, batônnets de bois, maisons), le nombre d’animaux par cage permet de leur garantir à la fois un espace suffisant et une sociabilité. Dans le cadre du suivi de l’infection par le parasite Plasmodium, les animaux sont observés une à deux fois par jour afin d’évaluer l’apparition de douleur (grille de suivi) et sont euthanasiés si nécessaire (score de douleur atteignant le point limite).
Choix des espèces
Le protocole de production de parasites génétiquement modifiés que nous utilisons est un protocole validé au niveau international et implique l’utilisation de souris ‘donneuses’ de globules rouges parasités (souris non consanguines ; faible parasitémie donc pathologie modérée) et de souris receveuses qui seront infectées avec les parasites transfectés. D’autres souris seront ensuite nécessaires pour propager les parasites transfectés, et analyser les parasites mutants et l'effet de la non-fonctionnalité d'un gène, ou encore étudier la localisation de la protéine d’intérêt, voire caractériser l'ensemble des protéines interagissant avec elle. Les tests antipaludiques sont faits sur souris non-consanguines ou consanguines. Différents couples souche de souris – souche de Plasmodium sont utilisés car la réponse et la sensibilité du rongeur au Plasmodium dépend du fond génétique de l’animal (différents modèles expérimentaux de paludisme). Toutes les souris sont utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines)
Evaluation d’un médicament biologique innovant chez la souris pour favoriser la cicatrisation des brûlures sévères
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
L'ablation d'un morceau de peau sur le dos, sous anesthésie, en quinze minutes de chirurgie, puis la pose d'un dispositif de protection et des injections du produit testé tous les trois ou sept jours pendant sept, quatorze ou vingt-huit jours. 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever du sang et la peau en cours de cicatrisation. Le porteur décrit pourtant les nuisances attendues comme une douleur et une légère perte de poids pendant trois à quatre jours, plus le stress de l'isolement et du pansement. Le titre annonce des brûlures sévères et le texte parle d'un contexte d'inflammation élevée, sans dire comment cette inflammation est provoquée ni en quoi une excision cutanée reproduit une brûlure du troisième degré.
Objectifs
En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de greffe de peau ou dans les cas les plus graves de substituts cutanés artificiels. Pourtant, malgré leur utilisation courante, la prise de greffe reste assez aléatoire avec une cicatrisation longue et incomplète, qui aboutit souvent à une cicatrice douloureuse et invalidante. Un traitement capable de favoriser significativement la prise de greffe est donc souhaitable pour augmenter les chances de survie et la récupération des patients. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’un médicament innovant basé sur les produits sécrétés par des cellules, appelés vésicules extracellulaires, pour favoriser la cicatrisation. Le but est d’améliorer la qualité de la cicatrisation des grands brûlés. Nous souhaitons ainsi évaluer l’efficacité de notre médicament dans un modèle de cicatrisation dans un contexte d’inflammation élevée que l’on retrouve dans les cas de brûlures graves.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’apporter les preuves d’efficacité et de sécurité d’utilisation d’un nouveau médicament biologique pour la mise au point d’un protocole de prise en charge de patients atteints de brûlure sévères.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à l’enlèvement d’un morceau de peau avec pose d’un dispositif de protection sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 minutes par souris pour éviter qu’elle ne se blesse en se grattant et/ou abîme la zone de cicatrisation. Selon les étapes du projet, des injections du produit à tester d’environ 30 secondes seront réalisées sur animaux anesthésiés tous les 3 jours ou 7 jours pendant 7, 14 ou 28 jours. Des prélèvements sanguins et tissulaires sont réalisés lors de la mise à mort des animaux pour procéder à des analyses.
Impact sur les animaux
La nécessité d’isoler les animaux le temps de la procédure et le port du dispositif de protection de plaie sur le dos des animaux peut induire un stress. L’anesthésie peut provoquer chez les animaux une légère baisse d’activité au réveil pendant une ½ journée. La chirurgie peut provoquer une douleur et une légère perte de poids pendant 3 à 4 jours.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour prélever du sang et la peau en cours de cicatrisation pour réaliser les analyses qui viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du médicament.
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules, les mécanismes mis en jeu dans la cicatrisation et après une brûlure diffèrent de ceux induits en laboratoire. Par exemple, le test de blessure en laboratoire est biaisé car il se fait sur une surface plane avec du plastique, alors que dans le corps humain la peau est un système en 3 dimensions et l’environnement est plus hostile, impliquant de nombreux acteurs et mécanismes interdépendants. Les modèles de cicatrisation et/ou de brûlure à partir d’échantillons de peau ou de peau artificielle par exemple reproduisent plus fidèlement l’environnement de la peau mais sont limités par l’absence de nombreux mécanismes retrouvés dans l’organisme, à l’échelle du corps humain comme l’inflammation. Le remplacement par ces modèles n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire, notamment des effets induits par l’inflammation suite à une brûlure, et d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études en laboratoire sur différents types de cellules de la peau ont été effectuées afin de restreindre la fenêtre de doses de médicament utiles à tester sur les animaux et ainsi déterminer 3 doses potentielles de médicament. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, différentes étapes de mise au point successives seront effectuées avec des étapes conditionnelles aux résultats précédemment obtenus. Des tests statistiques ont été réalisés pour prédire le nombre nécessaire d’animaux pour qu’une procédure soit valide mathématiquement et soit représentative.
Raffinement
Tout le long du projet, les animaux auront un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux (abris, jeux à ronger, cages en plastique transparent permettant un échange visuel avec les congénères), par une visite quotidienne et un suivi analgésique avant, pendant et après les chirurgies. Pour pallier l’éventuelle perte de poids, des gelées enrichies sont données aux animaux quotidiennement. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites ont été définis afin de réduire la souffrance animale.
Choix des espèces
Nous avons choisi l’espèce de souris car c’est une des espèces les plus utilisées dans la littérature scientifique pour les gestes que nous souhaitons réaliser et l’évaluation de la cicatrisation. De plus, la manipulation de cette espèce et de cette technique de chirurgie sont bien maîtrisées au sein du laboratoire. Nous avons choisi une lignée stable permettant l’obtention d’une meilleure reproductibilité des résultats obtenus (et donc en faveur d’une réduction du nombre d’animaux). Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Un compromis a été effectué pour utiliser des souris à un stade du développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de cicatrisation) mais suffisamment jeunes pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris.
Etude de l’effet protecteur de la neurogenèse dans le conditionnement contextuel chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des chocs électriques sont administrés aux souris pour leur associer un lieu à la peur, deux chocs suffisant à installer l'évitement et la vigilance que le projet mesure ensuite. 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec une chirurgie cérébrale de près de deux heures sous anesthésie et des injections répétées sur plusieurs semaines. Le porteur qualifie l'intensité du choc de "fortement désagréable mais sans induire de douleur", et décrit les tests comportementaux d'exploration et de mémoire contextuelle comme bien caractérisés et sans effet physiologique indésirable. Toutes les souris sont tuées pour récupérer leur cerveau, d'abord pour vérifier que la lentille optique était bien positionnée, ensuite pour doser des protéines cérébrales.
Objectifs
L’objectif principal du projet est d’évaluer l’implication de circuits cérébraux dans les effets protecteurs de la production de nouveaux neurones dans le cerveau, dans une zone appelée hippocampe, sur le comportement de peur. Pour cela, des souris transgéniques chez lesquelles il est possible de favoriser la production de nouveaux neurones chez l’adulte seront évaluées dans des tests comportementaux d’exploration et de mémoire contextuelle. Afin d’identifier quel circuit cérébral porte spécifiquement les éventuels effets positifs de l’augmentation de nouveaux neurones, nous inhiberons certaines voies de sortie de l’hippocampe qui projettent vers d’autres zones du cerveau et évaluerons son impact dans les mêmes tests comportementaux et de mémoire. La caractérisation précise du rôle des nouveaux neurones et l’identification du circuit impliqué dans de tels effets protecteurs pourrait ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les troubles liés au stress.
Bénéfices attendus
Une compréhension approfondie des réseaux neuronaux impliqués dans les réponses comportementales liées à la mémoire contextuelle, au stress et à la résilience, notamment du rôle potentiellement protecteur de la production de nouveaux neurones chez l’adulte, représente un enjeu majeur dans le traitement des pathologies associées au stress aigu et à la peur, telles que le trouble de stress post-traumatique. À ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour ces troubles : les approches actuelles se limitent généralement à l’administration d’antidépresseurs et/ou d’anxiolytiques, des traitements non spécifiques et d’une efficacité souvent limitée pour de nombreux patients. Dès lors, une meilleure compréhension des mécanismes neuronaux sous-tendant la résilience face au stress pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des traitements plus adaptés et efficaces
Procédures
Certaines souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale gazeuse d’environ 2 heures. Les souris subiront plusieurs injections (sous-cutanées et intrapéritonéales) étalées sur plusieurs semaines. Les injections seront réalisées avec soin et tact sur des animaux vigiles par des expérimentateurs expérimentés. Des récompenses appétentes seront offertes à la suite de chaque injection afin de réduire le stress associé. Enfin, les résultats principaux seront obtenus à partir de tests comportementaux basés sur l’exploration d’arènes de tailles et de formes différentes, pouvant être associées à une tâche d’apprentissage ou non. Dans quelques procédures les souris seront soumises à un choc électrique léger et aversif pour produire le conditionnement contextuel lié à la peur. Le choc est paramétré pour avoir une intensité fortement désagréable mais sans induire de douleur mais pouvant induire un stress sur le moment, sans effet néfaste sur la santé ou sur la physiologie à court et long-terme. L’étude évaluera ensuite les comportements associés au rappel de la peur et à l’évitement, comme pour les troubles liés au stress chez l’homme.
Impact sur les animaux
Modèle de conditionnement contextuel de la peur : Le principal risque associé à ce modèle est le stress psychologique et, potentiellement, une gêne ou légère douleur physique chez les souris expérimentales lors des deux chocs électriques. Nous n’anticipons aucune conséquence sur la santé des souris, uniquement de légères répercussions comportementales observables chez les souris notamment dans le contexte d’apprentissage lors de la réexposition au contexte (augmentation des comportements d’évitement, vigilance et peur dans le contexte de conditionnement), et éventuellement une généralisation de ces comportements à d’autres contextes dans les autres tests comportementaux. Tests comportementaux : Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration, bien caractérisés dans la littérature. Bien que ces tests puissent générer un certain stress de manipulation, il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’effets physiologiques indésirables immédiats ou à long terme. Souris transgénique. Le phénotype associé est non dommageable (voir ci-dessus). Les souris transgeniques proviennent d’un élevage et seront donc génotypée en amont de leur incorportation dans la saisine. Pour information, ce génotypage est réalisé à partir de prélèvement de bulbes pileux de l'animal au moment du placement de la puce d’identification sous anesthésie. Ainsi, toute nuisance supplémentaire associé au génotypage est évitée. Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la canule optique peuvent entraîner des douleurs post-opératoires légères à modérées, avec un impact limité dans le temps (quelques jours) sur le bien-être des animaux. Ceux-ci seront rigoureusement suivis en phase post-opératoire et traités avec un analgésique, ce qui leur permettra de récupérer rapidement de ce type de chirurgie. Anesthésie gazeuse : La manipulation des animaux peut engendrer un stress. Isolement en cage indivisuelle : après la chirurgie pour une durée pouvant aller jusqu’à 12 semaines, en fonction du temps de récupération post-chirurgicale et du début des injections de tamoxifène. Injection ip/sc : Une douleur légère peut être ressentie au niveau du site d’injection (ip, sc). Des récompenses appétentes seront offertes à la suite de chaque injection afin de réduire le stress associé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celles-ci ont été influencées par les conditions expérimentales.
Remplacement
L’étude des circuits cérébraux, de la production de neurones et de leur implication dans les réponses comportementales, telles que la mémoire ou l’adaptation au stress, ne peut être réalisée qu’à partir d’un cerveau et d’un organisme entier vivant.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés grâce à une approche statistique visant à optimiser leur réduction, conformément aux recommandations éthiques.
Raffinement
Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisées : les injections ou implantations intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale ainsi qu’un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures plus tard. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie, et les cornées seront protégées contre la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est privilégiée afin de mieux contrôler la profondeur de l’anesthésie et pour garantir une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est assurée afin de suivre chaque souris et d’intervenir si nécessaire (par exemple, en cas de perte de poids ou de température élevée nécessitant un traitement antibiotique). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique, et la plaie sera désinfectée par application de bétadine dermique. Une surveillance accrue est mise en place pour les souris montrant des signes de mal-être, avec des interventions si nécessaire, telles que des injections de solution saline pour l’hydratation ou la fourniture de nourriture appétente. Les injections sous-cutanées sont privilégiées par rapport aux injections intrapéritonéales en raison de leur plus grande sûreté et de leur moindre invasivité. Afin de réduire le stress des animaux, une habituation à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure est réalisée avant les tests comportementaux. Les expérimentateurs, experts dans la préhension et la contention des souris, veillent à minimiser tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont définis : en cas de blessures en cage ou d’infections, les animaux sont pesés et examinés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure). La décision d’euthanasie est prise en l’absence d’amélioration au bout d’une semaine.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de cette espèce, qui constitue un modèle de référence pour l’étude des bases neurobiologiques du comportement. Les souris utilisées seront des individus adultes.
Rôle des GPCRas dans le développement des métastases de mélanome dans le foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à vingt séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse par animal, une injection de cellules cancéreuses dans l'oreille, l'ablation de cette oreille si la tumeur grossit trop vite, puis une injection dans la rate. 724 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur régresse. Les métastases hépatiques attendues peuvent provoquer douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et perte de poids, et chaque animal reçoit en plus une injection de médicament tous les deux jours pendant quatre à huit semaines. Le choix de la souris est justifié par un contexte immunitaire complet et par des molécules cibles que le porteur décrit comme conservées à 100 % chez l'humain, les animaux étant utilisés à six ou sept semaines pour limiter les variations physiologiques.
Objectifs
Le mélanome est une tumeur qui se développe à partir de cellules épidermiques appelées mélanocytes. Bien qu’il ne représente qu’environ 1% des cancers cutanés, le mélanome est responsable de 75% des décès dus aux cancers de la peau. L’agressivité du mélanome est liée à son très fort potentiel métastatique et à la capacité de ces cellules cancéreuses à proliférer dans les organes vitaux, notamment le foie. Il est donc crucial de comprendre quels sont les mécanismes qui gouvernent le développement des métastases, pour envisager des traitements qui bloqueront ou ralentiront la progression tumorale dans les organes vitaux. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous avons mis en place une méthode qui nous a permis d’identifier des gènes impliqués dans le développement des métastases pulmonaires et nous souhaitons maintenant étendre cette méthode aux métastases hépatiques. Les mélanomes utilisent des signaux produits localement dans chaque organe pour stimuler leur croissance. Empêcher les mélanomes de percevoir ces signaux, devrait en théorie prévenir leur croissance. Dans le but de tester cette hypothèse, nous avons mis au point un système qui permet d’éteindre individuellement l’expression d’une sélection de gènes impliqués dans la réception des signaux stimulant la croissance des mélanomes. Grace à cette méthode, nous avons pu déterminer quels sont les récepteurs qui sont responsables de la croissance des mélanomes dans les poumons. Nous souhaitons maintenant étendre notre étude au foie car le mélanome conduit fréquemment à des métastases dans cet organe. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome ainsi que la réponse anti-tumorale. Le modèle cellulaire choisi récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique chez les souris . Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur pourra être administré et un enrichisement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Pour réduire le nombre d'animaux, une étude statistique préliminaire a été réalisée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir l’implication des gènes étudiés dans la croissance des métastases de mélanomes. Il permettra d’identifier précisément quels récepteurs sont utilisés lors de la colonisation spécifique du foie. Ces gènes ont un potentiel thérapeutique formidable puisqu’environ 40% des médicaments sur le marché sont des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.
Procédures
Injection de cellules dans l'oreille 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Procedure chirurgicale d'ablation de l'oreille (uniquement si la tumeur atteint un certain volume avant l'apparition des métastases) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min. Injection de cellules 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Injection de cellules en dans la rate : 1 par souris sous anesthésie générale, durée maximale 20 min. Injection de médicaments : 1 fois tous les deux jours après anesthésie locale (Lidocaïne) pendant 4 à 8 semaines (en fonction des résultats). Anesthésie gazeuse pour imagerie, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au maximum 10 semaines soit 20 séances maximum, durée maximale des procédures.
Impact sur les animaux
Les animaux auront des nuisances légères dues aux injections sous anesthésie locale ou générale dans le derme (flanc (anesthésie locale), ou oreille (anesthésie générale)) ou dans la rate (anesthésie générale). Avant l'anesthésie, une analgésie adaptée sera administrée. L'excision d'une oreille sous anesthésie générale avec analgésie pourra entraîner une gêne et un handicap modérés. La croissance de tumeurs dans le derme peu entraîner une gêne physique et des douleurs modérées. La croissance de tumeur dans la rate peut entraîner des symtômes de douleur abdominale modérée. L'apparition de métastases hépatiques peut entraîner des symptômes de gravité modérée: douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et éventuellement perte de poids.
Devenir
Tous les animaux ayant reçu une injection de cellules seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases. Pour les animaux pour lesquels on observerait une régression tumorale, ils seront aussi euthanasiés car on ne peut pas éliminer la possibilité d'une reprise de la tumeur et/ou une progression lente. Tous les animaux ayant été utilisés pour la procédure de détermination de la dose maximale d'antagonistes seront aussi euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme entier (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Enfin, notre projet offre une opportunité thérapeutique qui justifie la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.
Réduction
Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire permet d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les étapes de validation des gènes d'intérêt et l'étude de leur effets sur la croissance primaire et pour l'étude des effets des antagonistes. De même, seuls les gènes d'intérêt validés seront étudiés par la suite. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses d'antagonistes seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. De même, une période de wash out sera observée entre l'injection de deux doses lors de l'évaluation de la dose maximale tolérée , ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont observés tous les jours par le personnel de l'équipe de recherche. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Un score de contrainte est établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines. Des points limites pour traitement ou arrêt ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront anesthésiées lors des différentes procédures. Si des métastases hépatiques se développent, nos méthodes de suivi (palpation abdominale et luminescence) nous permettront d'arrêter le procédure à un stade de gravité modérée.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser le modèle de la souris pour étudier les mécanismes de développement de métastases de mélanome. L'utilisation de ce modèle nous permet d'être dans un contexte immunitaire complet. Ce modèle nous a déjà permis d'identifier des molécules impliquées dans la croissance métastatique du mélanome dans les poumons. D'une part, le modèle cellulaire choisis récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique. D'autre part, les molécules identifiées chez les souris sont 100% conservés chez l'homme. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines, jeunes adultes. En effet, le développement de la souris entraîne des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression des gènes étudiés et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris à un jeune âge.
Étude des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’addiction et de la dépression chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Placées dix fois pendant cinq minutes face à une souris d'une lignée agressive qui les attaque, une partie des souris de ce projet subit un modèle de défaite sociale chronique. 1 408 souris vont être utilisées au total, toutes tuées pour observer leur cerveau au microscope, dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère. Elles reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique dans le cerveau, avec pose d'une fibre optique pour certaines, seize ou dix-sept injections dans l'abdomen, et un sevrage à la morphine qui provoque un état de manque avec signes somatiques et perte de poids. Le porteur annonce un fort potentiel translationnel pour traiter conjointement addiction et dépression, quand l'acquis immédiat du projet reste la description d'une interaction entre deux récepteurs.
Objectifs
La forte prévalence des comorbidités entre dépression et addiction aux drogues a un impact majeur sur la santé mentale et les systèmes de santé. En témoigne l'épidémie d'opioïdes touchant les Etats-Unis, où la consommation de drogues est fortement associée à des symptômes de dépression, et a fait chuter l'espérance de vie jusqu’à son plus bas niveau. La comorbidité entre l’addiction aux drogues d’abus et la dépression ainsi que l’impact du stress sur la rechute après sevrage et la dépression, s’expliquent en partie par le fait que des circuits cérébraux communs sont mis en jeu. Ainsi, des recommandations récentes soulignent que les développements thérapeutiques futurs doivent se concentrer sur les comorbidités, plutôt que de traiter chaque maladie indépendamment. Un mécanisme cellulaire clé par lequel deux récepteurs cellulaires interagissent a été découvert et cette interaction régule les comportements dépressifs et d’addiction. Pour ce projet, nous allons étudier comment cette interaction entre récepteurs, identifiés dans une population de neurones, modifie l’équilibre des activités entre différents types de neurones dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Des outils qui permettent de cibler très spécifiquement des interactions moléculaires entre récepteurs dans le cerveau ont été développés. Le présent projet permettra d’élucider le mécanismes expliquant les effets thérapeutiques potentiels que nous avons publiés dans le contexte de l’addiction aux psychostimulants. De plus, ce projet vise à tester l’efficacité de notre approche dans le contexte de l’addiction aux opiacés, et dans la dépression, car il existe une forte comorbidité. En effet, la prévalence de la dépression parmi les patients souffrant d’une addiction est de 30 pour cent. Ce projet revêt donc un fort potentiel translationnel car il ouvre la porte à de futurs développement thérapeutiques pour traiter à la fois les addictions et la dépression comorbide.
Procédures
Les interventions nécessaires à la réalisation du projet permettant d'identifier une nouvelle approche thérapeutique sera soit l'injection de vecteurs de type thérapie génique dans le cerveau (une fois par animal, durée 10min) soit l'injection de vecteurs de type thérapie génique et fixation d’une fibre optique dans le cerveau (une fois par animal, durée 45min), qui se fera en condition d'analgésie et anesthésie générale. Des injections intrapéritonéales seront réalisées (16 ou 17 selon procédure, 2 par jour maximum). Les effets anti-dépresseurs seront mesurés par l'observation du comportement dans des cages spécifiquement dédiées. Pour un groupe de souris, celles-ci seront mises en compagnie d'une souris d'une lignée différente pendant 5 minutes 10 fois, puis placées dans différentes cages permettant l'observation de différents types de comportement (durées : 5min, 10min, 5min, 1fois) puis dans une cage permettant de mesurer la consommation d'eau de boissson (72 heures, 1 fois). Deux groupes de souris seront placés dans une enceinte 1 fois pendant 30 minutes pour observer le comportement spontané. Deux groupes de souris seront placés dans une cage à deux compartiments pour mesurer les effets hédoniques de la morphine (8 fois 30 minutes).
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux par l’expérimentateur, ainsi que l’exposition à un nouvel environnement (cage de test de comportement) peut engendrer un stress. Les injections intra-péritonéales engendrent une douleur de très courte durée au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, l’anesthésie peut engendrer une baisse de température corporelle et une déshydratation. Dans de très rares cas, l’anesthésie peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire.En post opératoire de la chirurgie, les nuisances possibles sont une douleur, et une infection au niveau de la suture due la peau du crâne. Suite au traitement à la morphine, la phase de sevrage entraîne un état de manque associé à des signes somatiques et une perte de poids transitoire. Lors du test de défaite sociale chronique, la mise en place du modèle de stress social implique que les souris soient agressées par d'autres souris. Le modèle animal de stress chronique implique que les souris soient stressées. Les souris qui sont les agresseurs doivent être maintenues en hébergement individuel, soit 1 souris par cage, ce qui peut engender un stress.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés afin d'étudier le cerveau. Il est nécessaire de prélever le cerveau car seule une observation par microscopie permettra de connaître les événements cellulaires associés aux effets thérapeutiques attendus.
Remplacement
Les études in vitro et sur invertébrés ne permettent d’étudier les comportements de type dépressif ou addictif car la neuropathologie de ces troubles psychiatriques est complexe, évolutive et multicellulaire. L’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études, ni de développer des stratégies à visée thérapeutique pour obtenir des preuves de concepts en vue d’une application translationnelle. Cependant, avant chaque procédure décrite dans ce projet, des résultats obtenus sur des cultures de cellules ont permis d’obtenir des résultats préliminaires solides afin de limiter les études in vivo chez la souris.
Réduction
Le projet impliquera un nombre maximum de 1408 animaux.Les résultats publiés, y compris par notre équipe, nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux par groupe expérimental permettant de générer des données statistiquement solides. De plus, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Le nombre d’animaux utilisés correspond au plus petit nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats scientifique valide et reproductibles.
Raffinement
Afin de minimiser le stress lors de l’interaction avec l’expérimentateur et le nouvel environnement, une phase d’habituation permet d’habituer progressivement les animaux. L’utilisation d’une aiguille de taille minimale contribue à diminuer l’impact des injections intra-péritonéales. Lors des actes de chirurgie, la température corporelle est maintenue grâce à un tapis chauffant, et la déshydratation est empêchée par l’injection par voie intra péritonéale de sérum physiologique. L’effet de l’hébergement individuel des souris est attenué car les souris sont dans des cages placés côte à côte d’autres cages en apportant une interaction visuelle, et les cages étant pourvues d’un grillage, une interaction par les odeurs est maintenue. Un enrichissement de la cage est réalisé́ par un apport de « nid ». Les souris font l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Les points limites sont définis et des méthodes sont mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Anesthésie et analgésie seront effectuées pour les actes qui autrement auraient pu induire une douleur.
Choix des espèces
Le rongeur est reconnu comme modèle animal idéal pour l'expérimentation et la translation vers les thérapies. Les régions cérébrales, les types de neurones et les circuits neuronaux ainsi que les mécanismes cellulaires de l'addiction et de la dépression sont largement conservés entre le rongeur et l'être humain. Des souirs au stade adulte permettent de modéliser l’addiction et la dépression qui touche majoritairement la population adulte.
Altération dopaminergique dans l’addiction à l’alcool.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolés en cage individuelle et placés en cycle inversé, des rats sont conduits à boire de l'alcool au fil d'environ 80 sessions de trente minutes. Après une soixantaine de sessions d'habituation, six sessions associent la recherche d'alcool à des stimuli aversifs, pour séparer ceux qui continuent malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent. Vient ensuite une chirurgie cérébrale d'au plus quarante minutes sous anesthésie et analgésie, puis trois semaines d'attente avant l'analyse. 376 rats sont engagés dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 276 sont tués pour prélever leur cerveau, et les 100 autres, ceux qui n'ont pas assez d'appétence pour l'alcool, sont proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale.
Objectifs
Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones produisant de la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).
Bénéfices attendus
Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces qui sont inéxistantes à ce jour.
Procédures
La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.
Impact sur les animaux
L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’hebergement individuel des animaux pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la chirurgie d’injection et aux des stimuli négatifs lors der derniers jours de consommation d'alcool. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux soit pour analyse des tissues, soit pour analyse de l'activité des neurones après la mort. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt à cinquante pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).
Réduction
Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base d'expériences similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cycle inversé et seront isolé pour répondre aux besoins experimentaux du projet. Cependant, les grilles des cages ainsi que les portoirs seront ouverts, et les cages seront proches les unes des autres, permettant le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. De plus ils recevront un enrichissement supplémentaire pour pallier cette individualisation. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées quotidiennes des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des expériences.
Impact de l’origine embryonnaire de la cellule fibroblastique dans la cicatrisation sur le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à sept ou quatorze jours pour prélever les zones en cicatrisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux incisions de 2 mm sous anesthésie, l'une dans le dos, l'autre dans le palais, puis passe deux jours seule en cage, un isolement que le porteur reconnaît stressant pour un animal social. Les applications annoncées, au bénéfice de personnes brûlées ou porteuses de séquelles faciales, sont renvoyées au moyen terme, l'objet immédiat restant de comparer la cicatrisation du palais et celle de la peau. Sur le remplacement, le porteur écrit que la cicatrisation est "trop compliquée pour être reproduite en laboratoire" et qu'il faut donc l'étudier chez l'animal.
Objectifs
La gencive, muqueuse qui entoure les dents et recouvre l’os sous-jacent, est composée principalement de populations cellulaires appelées fibroblastes gingivaux (GF). Parmi ces populations, se trouvent des cellules souches gingivales (GSC) capable de se renouveler et de se transformer en différents types cellulaires. De plus, le tissu dont elles sont issues présente une cicatrisation complête, ne laissant aucune trace et se démarque par cette propriété des autres tissus conjonctifs de recouvrement (notamment de la peau). Les GSC, facilement recueillies chez les patients adultes, peuvent s'adapter à différents environnements du corps et influencer le système immunitaire, ce qui en font un outil de choix pour la thérapie cellulaire. De plus, la biopsie indolore n’entraine ni cicatrice ni problème fonctionnel. Ces cellules, qui seraient dérivées des crêtes neurales, sont utilisées avec succès en dermatologie et en cardiologie. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules participent à la guérison cutanée et comment les utiliser en thérapie. Elles seront ainsi triées selon leur origine embryonnaire et leur contribution dans la cicatrisation sera étudiée. Des modèles de souris transgéniques seront utilisés pour suivre ces cellules et comprendre leur répartition dans différents tissus. Ces recherches pourraient ouvrir de nouvelles voies pour la reconstruction des tissus après des blessures graves ou des maladies.
Bénéfices attendus
Des travaux préliminaires sur ces modèles de souris transgéniques ont permis de faire une différence sur l’origine embryologique des cellules constituant la tête, de celles à l'origine du reste du corps. Ainsi notre idée serait de montrer que l'origine particulière des fibroblastes de la gencive est la raison essentielle de la cicatrisation complête et sans traces, dans la bouche. Pour cela, nous utiliserions ces modèles de souris transgéniques afin de déterminer la distribution des cellules selon leurs origines dans les tissus qui cicatrisent parfaitement, le palais, versus un référentiel moins performant, la peau. Le projet de recherche ici présenté a pour objectif de décrire les implications du fibroblaste gingival et des cellules souches associées pendant la cicatrisation complète et quasi parfaite. Les résultats de ces recherches permettront de mieux appréhender l’utilisation des fibroblastes gingivaux dans la réparation tissulaire par thérapies cellulaires. Nous espérons aussi pouvoir identifier des molécules responsables de cette régénération. Les applications à moyens termes pourraient profiter aux personnes présentant des traumatismes faciaux avec des séquelles cutanées ou patients présentant des brûlures importantes.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour la chirurgie. Deux incisions cutanées de 2mm seront réalisées. L'une se situera dans le dos, l'autre dans le palais. Nous estimons réaliser l’ensemble de ces gestes en moins de 5 minutes pour chaque animal. Ces incisions seront réalisées sur la totalité des animaux, soit 42 souris. Un traitement analgésique de plusieurs jours sera systématiquement mis en place pour anticiper l’apparition de douleurs post opératoires possibles. Du fait d'une aggressivité possible et reconnus chez les souris après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle durant 2 jours. Les souris seront euthanasiées et les prélévements seront réalisés à 7 et 14 jours
Impact sur les animaux
A l’âge adulte, les animaux subiront un acte de chirurgie rapide impliquant deux biopsies (punch). Cet acte pourra induire des contraintes liées à l’anesthésie elle-même (stress thermique, risque de détresse respiratoire, etc.) et pourra induire une douleur post-opératoire malgré la prise en charge de la douleur associé à la cicatrisation (irritation, inflammation, etc...). De plus, la plaie créée dans le palais, ainsi que la gêne qu’elle occasionne, pourrait entraîner une perte de poids. Enfin, afin d’éviter des comportements agressifs après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement durant 2 jours ce qui impliquera un stress social pour ces animaux sociaux.
Devenir
Aux différents temps défini post-chirurgie, nous allons récupérer les zones en cicatrisation (après 7 jours de maintien) ou cicatrisées (après 14 jours de maintien) pour effectuer les analyses nécessaires afin de répondre à la question scientifique. L’euthanasie des animaux est donc de ce fait inévitable.
Remplacement
La cicatrisation est un processus complexe qui se déroule en plusieurs phases : inflammation, formation de nouveaux vaisseaux sanguins (angiogénèse) et mobilisation de cellules spécifiques. Ce processus est trop compliqué pour être reproduit en laboratoire. Pour comprendre le rôle des fibroblastes (des cellules importantes pour la cicatrisation), il faut étudier ce processus chez l'animal. Cela permet d'observer toutes les cellules et les étapes impliquées dans la cicatrisation de manière naturelle.
Réduction
À la fin de cette étude, nous analyserons les échantillons de deux manières différentes. D'abord, une analyse qualitative en histologie examinera les sites prélevés aux jours 7 et 14 sur les deux lignées transgéniques. Ensuite, une analyse quantitative aux jours 7 et 14 également, mais qui ne portera que sur l'une des deux lignées. Étant donné que le marquage fluorescent ne modifie pas l'expression génique des cellules, nous ne prévoyons pas de différences entre les résultats des deux lignées. Par une approche statistique appropriée à notre étude, nous avons déterminé la taille des groupes nous permettant d’avoir une force statistique adéquate tout en respectant les considérations éthiques en matière de nombre d'animaux. Ainsi, il nous faut comparer 7 échantillons de palais à 7 échantillons de dos pour les deux temps d’arrêt et les deux types d’approches. De plus, comparer les deux sites chirurgicaux chez le même animal renforce la validité statistique de l'étude tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. L'étude portera sur un total de 42 animaux.
Raffinement
L’ensemble de la procédure sera réalisé sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique pré et post opératoire durant une surveillance accrue de deux jours. Les deux actes chirurgicaux seront réalisés sur un temps court inférieur à 5 min. L’hébergement se fera en cages individuelles avec enrichissements (maisonnette ou tunnel plus radeau) durant 2 jours maximum et les cages positionnées côte à côte pour que les animaux se voient. Les conditions de stabulations seront conforment à la réglementation. Exceptionnellement, la litière sera faite de carrées de cellulose, moins agressif pour les plaies. Les animaux recevront en plus un régime alimentaire sous forme de gel nutritif ainsi que de l'eau par abreuvement automatique. Des points limites ont été définis sur le poids des animaux qui sera mesuré quotidiennement jusqu'à 14 jours (semaine et week-end). Un traitement analgésique sera lancé si une perte inférieure à 20 pour 100 du poids de l’animal est observée. Au delà de cette valeur, l’animal sera euthanasié pour limiter sa souffrance. La mise en évidence de signes de contamination de la plaie ou de signes cliniques observés au cours du suivi sera prise en compte (apparence, posture, appétit, poids corporel, respiration, plaie) pour l’arrêt de l’expérimentation et l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
La souris possède des similarités morphologiques avec son homologue humain, elle représente donc le modèle le plus adapté pour réaliser des plaies. De plus, dans les limites de la réglementation, ce modèle facilite l'utilisation d'un nombre suffisant d'échantillons pour permettre la collecte de données statistiquement significatives. Enfin, par rapport au rat, la disponibilité des modèles génétiquement modifiés est moins restrictive. Les outils biologiques pour l'exploration des échantillons sont plus facilement utilisables sur cette espèce. Les souris utilisées seront des souris adultes ayant terminé leur croissance. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi des animaux âgés de 3 mois. De part la difficulté à avoir assez d’animaux double mutants, nous utiliserons les souris des deux sexes. Nous essayerons de répartir au maximum les deux sexes aux deux temps d’arrets (après 7 jours et 14 jours de maintien) et que cette répartition soit similaire pour les deux lignées.