Recherche fondamentale

Une course d'endurance sur tapis, des tests de force chaque semaine pendant un mois, des mesures cardiaques et musculaires sous anesthésie : selon les groupes, 672 souris de deux lignées atteintes de myopathie vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une thérapie génique destinée à augmenter la production de cavéoline-3 dans leurs muscles, soit dans la première semaine de vie, soit après l'apparition des symptômes. Le porteur cite parmi les nuisances "l'angoisse et la douleur durant la course", le stress de l'isolement pendant douze heures de mesure d'activité et une fatigue due aux anesthésies répétées. Les souris testées sont tuées à l'issue pour prélever muscles et organes. La moitié des souriceaux nés des croisements n'auront pas le génotype recherché et seront tués, sauf ceux gardés pour de nouveaux croisements.

Objectifs

Ce projet s'intéresse à deux maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces myopathies. Le but de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une potentielle thérapie commune pour ces deux maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait fournir une preuve de concept commune pour soigner deux myopathies. En outre, cette étude nous permettra de mieux comprendre ces maladies et les acteurs impliqués.

Procédures

Dans ce projet, il y aura 4 groupes d’animaux : les groupes 1 et 3 (Myopathie 1) et les groupes 2 et 4 (Myopathie 2), qui seront soumis à différents tests musculaires et cardiaques. Groupes 1 et 2 : Les animaux recevront la thérapie génique durant la première semaine après la naissance avant l'arrivée des symptômes (prévention de la maladie). Les tests seront réalisés à l’âge attendu d’arrivée des symptômes. Groupe 1 : Les capacités cardiaques seront évaluées par deux tests cardiaques effectués consécutivement au cours de la même anesthésie (30 mins) une fois durant la vie de la souris. Les capacités sportives seront testées une fois par test d’endurance sur tapis de course (moins d’une heure). L’activité spontanée sera également surveillée sur 12h. Groupe 2 : Les capacités sportives seront testées une fois par semaine pendant 1 mois par deux tests de force (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs sous anesthésie générale) durant chacun moins d'une heure. L’activité spontanée sera surveillée sur 12h, une fois durant la vie de la souris. La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin de la caractérisation sous anesthésie générale. Groupes 3 et 4 : Les animaux recevront la thérapie génique après l’apparition du phénotype (réversion de la maladie). Groupe 3 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, mesure de force des membres postérieurs et endurance sur tapis de course) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (activité spontanée et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Groupe 4 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, test de suspension et mesure de force des membres postérieurs) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement.

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont le stress dû à l'isolement durant la mesure d'activité spontanée, l'angoisse et la douleur durant la course, ainsi que la douleur lors des injections de traitement ou d'anesthésiants. Il est possible que les animaux ressentent une fatigue physique due aux anesthésies répétées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles et organes nécessaires aux analyses moléculaires, et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies. La moitié des animaux issus des croisements ne possèderont pas les génotypes d'intérêt et seront euthanasiés s'ils ne sont pas nécessaires pour renouveller des croisements.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique d'une thérapie sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisamment proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.

Réduction

La grande majorité des tests étant peu invasifs, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.

Raffinement

Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre et un tube pour permettre la préhension des animaux avec un minimum de stress. En cas de fatigue ou difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Les animaux seront pesés une fois par semaine et observés. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour limiter son stress. Lors des tests sous anesthésie une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Le bien-être global des animaux sera surveillé quotidiennement après injection du traitement pendant une semaine. Pour les nouveau-nés, la poche de lait sera observée, car une diminution de l'alimentation peut indiquer un mal-être, et les animaux seront pesés. Des analgésiques pourront être administrés sur avis du vétérinaire si les animaux montrent des signes de douleur persistante. La zone d'injection du traitement sera surveillée et dès l'apparition de rougeurs, elle sera nettoyée avec une solution antiseptique douce. En cas d'infection importante, l'animal pourra recevoir des antibiotiques ou être euthanasié sur avis vétérinaire.

Choix des espèces

Les deux modèles de souris récapitulent le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et permettent donc d'évaluer correctement l'efficacité des traitements. Les défauts locomoteurs du premier modèle sont établis à 12 semaines après un exercice forcé et le phénotype cardiaque léger peut être détecté à 7 semaines. Pour les souris injectées avec le traitement dans les premiers jours de vie, les tests seront réalisés entre 7 et 12 semaines. Pour les souris injectées à 12 semaines, les tests seront réalisés de 11 à 16 semaines. Le deuxième modèle est plus précoce, bien que toujours léger, les tests seront donc effectués de 6 à 8 semaines ou de 6 à 12 semaines en fonction de l'injection du traitement (en prévention ou après l'apparition des symptômes).

Toute souris dont le score clinique dépasse 8 est mise à mort. 3 348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une manipulation de l'intestin de dix minutes sous anesthésie pour provoquer un iléus, l'insertion d'une bille dans le colon, des gavages au charbon, six heures d'isolement en cage individuelle et, pour certaines, l'administration pendant trois jours du microbiote fécal de patients opérés. Le porteur annonce en retour des durées d'hospitalisation raccourcies et la fin d'une mortalité liée à cette complication chirurgicale, pour laquelle aucun traitement médicamenteux n'est connu à ce jour.

Objectifs

L'ileus post opératoire est une complication survenant après une chirurgie abdominale induisant un ralentissement voire un arrêt du transit intestinal. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouvelles voies physiopathologiques de l'ileus post-opératoire et d'évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques en utilisant un modèle murin.

Bénéfices attendus

Il n'existe pas de traitement médicamenteux connu à ce jour malgré l'incidence élevée de l'ileus post opératoire chez les patients. Le bénéfice de ce projet est d'identifier et de valider des molécules thérapeutiques permettant la résolution de l'iléus. Cela permettra de réduire la durée d’hospitalisation et éviter a mortalité des patients liés à cette complication chirurgicale.

Procédures

Une manipulation intestinale durant 10 minutes permettant d’induire l’ileus post opératoire chez la souris va être réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les molécules thérapeutiques candidates vont être administrées avant ou après la chirurgie. Afin d’évaluer l’efficacité de celles-ci, la vitesse de transit des différentes portions du tractus digestif (intestin grêle et colon) va être relevée ainsi que la vitesse du transit total grâce à l’administration per os d’une solution de charbon qui va permettre de relever le temps d’apparition d’une selle noire (entre 2 et 3 heures – temps limité à 6 heures pour l’animal). La vitesse du transit dans le colon sera mesurée grâce à l’insertion intra-colique d’une bille (dont la taille est équivalente à une fécès de souris) à l’aide de vaseline et sous anesthésie. Le temps d’expulsion de la bille sera le reflet de la vitesse du transit colique (autour de 2 minutes – temps limité à 15 minutes pour l’animal). La vitesse du transit de l’intestin grêle sera ensuite mesurée 24 heures après la chirurgie grâce à l’administration per os d’une solution de charbon qui permet de visualiser à l’œil nu l’avancement du charbon dans l’intestin grêle post mortem (20 minutes après le gavage). La perméabilité intestinale va être également étudiée grâce à l’administration d’une molécule fluorescente qui est retrouvée dans le sang en quantité proportionnelle à la perméabilité intestinale. Ainsi 4h après l’administration de la molécule, du sang va être prélevé sous anesthésie. L’influence du microbiote intestinal sur l’induction de l’ileus va être étudié en administrant le microbiote fécal pendant 3 jours provenant de patient ayant développé un ileus post opératoire avant de réaliser une manipulation intestinale de la souris.

Impact sur les animaux

inconfort abdominal (constipation, ballonements, gaz) induit par la manipulation intestinale stress induit par la mise à jeun, possibles douleurs post-chirurgicales, l’isolement pendant 6 h dans une cage individuelle lors de la mesure de la motricité colique et les administrations.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés dans le but de prelever les tissus en vue d'analyse histologique, moléculaire, contractile et microbiologique.

Remplacement

Les méthodes alternatives permettant l’étude de l'ileus post-opératoire et notamment de la motilité intestinale sont inexistantes. En effet les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reconstituer l'environnement et les intéractions complexes entre les différents acteurs menant à l'ileus post opératoire. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant les approches in vitro sont indispensables en amont pour valider l’efficacité des molécules candidates.

Réduction

Les datas générées grâce à l'apafis précédent nous ont permis d’utiliser l'application EDA développée par le NC3R afin de déterminer le nombre d'animaux par groupe requis pour obtenir une analyse stastique fiable et appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins et du même âge pour obtenir des résultats robustes. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours sont conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible à l’équipe ou aux collaborateurs, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée en amont pour sélectionner des procédures à degré de sévérité légère réalisables après la chirugie ne nécessitant pas l’euthanasie de l’animal. Cela nous permet de réaliser une cinétique du transit intestinal sans euthanasie d’un groupe d’animaux à chaque temps.

Raffinement

Les souris seront mises par groupe afin d’établir une hierarchie et des contacts visuels, olfactifs, auditifs et tactiles. La surface au sol nécessaire par animal sera respectée. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. L’environnement des souris est enrichi avec a minima un igloo et du materiel de nidification tel que des serpentins et du sopalin. Le change de la litière est réalisé 1 fois tous les 15 jours. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. L’état des animaux vérifié quotidiennement, deux fois après la chirurgie. La fréquence de surveillance est augmenté si le score total >2. Lors de la chirurgie, un tapis chauffant est systématiquement utilisé, les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée et un agent analgésique est administré en période pré et post opératoire. En complément du tapis chauffant, des chaufferettes sont disposées de part et d'autre de l'animal afin d'éviter l'hypothermie. Lorsque les animaux sont réveillés ils sont remis dans leur cage avec du coton pour améliorer leur confort. Les expérimentateurs réalisant les procédures sont tous dotés du diplôme de chirurgie et appliquent les bonnes pratiques pour le suivi des compétences. L’application stricte des points limites définis au préalable sera réalisée. Tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, hypothermie, perte de poids (proportionelle au temps post chirurgie) fera l'objet d'une attention accrue et bénéficiera de soins appropriés. Une grille de scoring a été générée et adaptée aux types de procédures. Si le score total >8 alors l'animal sera euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris présente certains intérêts décisifs justifiant leur utilisation comme modèle dans ce type de projet : la physiologie digestive de la souris est très proche de celle de l'Homme et la manipulation intestinale qui a lieu lors d’une chirurgie de patient humain peut être reproduite à l’identique chez la souris.

Quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, séparés par une semaine de repos, attendent les souris adultes de ce projet. 804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, les nouveau-nés subissant d'abord une contention d'une minute pour une biopsie de la queue. L'objet déclaré est de mesurer le rôle d'une protéine dans le développement de la maladie d'Alzheimer, les tests étant censés évaluer les capacités mémorielles, sans que le porteur précise lesquels sont employés. Le choix de la souris tient à la disponibilité commerciale de lignées transgéniques d'Alzheimer, aux outils déjà validés chez cette espèce et à une durée de vie que le porteur juge adaptée au projet.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue sera prélevée. Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.

Devenir

Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé durant les biopsies pour génotypage et les phases d'expérimentation. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.

Les femelles superovulées sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, les femelles porteuses le sont après le sevrage des petits. 16 625 animaux non-humains vont être utilisés, 15 950 souris et 675 rats, 12 625 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 4 000 un niveau modéré. Ils reçoivent jusqu'à deux injections d'hormones puis une à deux injections supplémentaires, et subissent une chirurgie utérine de trente minutes sous anesthésie, avec gêne et grattage possibles les deux à trois jours suivant le réveil. Le projet couvre l'activité d'un plateau technique qui crée, décontamine et archive des lignées génétiquement modifiées pour d'autres équipes, sans question scientifique propre à ces 16 625 animaux.

Objectifs

Notre demande d’autorisation de projet comprend l’ensemble des activités de notre plateau : - La création de modèles souris et rats génétiquement modifiés. - La décontamination de lignées en utilisant la réimplantation d'une cellule fécondée dans des mères porteuses saines par microchirugie sous anesthésie générale. - L’archivage de lignées de souris et de rats congelés pour assurer leur pérennité au bénéfice de la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir développer de nouveaux modèles de souris et de rats génétiquement modifiés reproduisant les pathologies humaines et de sauvegarder les modèles déjà créés dans les projets de recherche utilisant l’expérimentation animale afin de réduire le nombre d'animaux vivants et de permettre les échanges de modèles entre les chercheurs.

Procédures

Au maximum, injections intrapéritonéales d'hormones 2 fois de moins de 1 minutes chaque. Injections sous cutanées et intrapéritonéale de moins de 1 minutes chaque 1 à 2 fois et chirurgie utérine (30 min) 1 fois .

Impact sur les animaux

Un léger stress et une douleur légère de courte durée pourraient être ressentis lors de l'injection intrapéritonéale d'anesthésique. Douleur légère liée à l’injection d'antiinflammatoire et d'anesthésique et stress léger lié à l’anesthésie gazeuse et l’hypothermie induite. Les animaux après le réveil de la chirurgie et dans les 2-3 jours suivant pourraient présenter une gêne ou grattage post opératoire. L'animal étant isolé pourrait ressentir du stress au réveil.

Devenir

> Les femelles donneuses superovulées et les femelles receveuses après le sevrage des petits seront mises à mort.

Remplacement

Le transfert d'embryons utilisé pour les différents axes de ce projet ne peut être substitué par des méthodes alternatives. Avant d'envisager une création de lignée les chercheurs seront encouragés à trouver des modèles cellulaires ou modèles animaux déjà existants.

Réduction

Compte tenu de notre expérience et de celle des collègues du domaine, le nombre de femelles superovulées et mises à mort sera réduit au maximum pour l'obtention du nombre d'embryons précoces attendus : 6 à 8 femelles souris, 2 à 4 rattes par lignée. Le nombre de femelles porteuses dépendra du nombre d'embryons obtenus entre 1 et 3 femelles réimplantées par lignée. La congélation des lignées en embryons notamment en lots expérimentaux quand cela est possible permettra d'optimiser le nombre d'accouplements nécessaires à la production d'animaux vivants

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les cages de surface réglementaire selon l'espèce avec les enrichissement disponibles et avec des congénères. L'intervention chirurgicale se fait sous anesthésie générale avec injection d'un antidouleur en pré et post opératoire. Après la chirurgie ou durant les premières semaines de vie des souris et rats pouvant présenter des phénotypes dommageables potentiels, une surveillance sera mise en place avec des points limites précis, des arbres décisionnels et des critères d’arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Un grand nombre de modèles animaux reproduisant les mutations des maladie humaines sont disponibles chez la souris et de plus en plus chez le rat. Les techniques de transfert d'embryons, congélation et manipulation génétiques dans ce cadre doivent donc se faire dans ces espèces. Les femelles donneuses d'embryons seront stimulées par des hormones ovariennes. Selon notre expérience et celle de nos collègues dans le domaine, les hormones sont plus efficaces si on utilise des femelles donneuses d'embryons à l'âge prépubère (4 à 6 semaines) pour les souris et à l'âge pubère (2 à 3 mois) pour les rattes. Les femelles reçeveuses seront en âge de procréer soit 2 à 5 mois pour les 2 espèces.

Une injection quotidienne du cinquième au vingt et unième jour de vie, puis une injection de facteur inflammatoire dans une patte arrière: c'est le sort de chacune des 3 200 souris expérimentales de ce projet sur le syndrome de l'X fragile, auxquelles s'ajoutent 350 reproductrices amputées du bout de la queue pour génotypage. Toutes sont tuées à l'issue, 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 350 un niveau léger. S'y ajoutent des tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique provoquant une douleur qui peut durer jusqu'à une heure, et 72 heures d'isolement visuel et olfactif pour mesurer l'activité jour-nuit. Le porteur prévoit de tuer sur le champ tout animal montrant paralysie, vocalisations ou convulsions, et explique qu'analgésiques et anesthésiques restent exclus d'un protocole dont la douleur est l'objet d'étude.

Objectifs

Le syndrome X fragile (FXS) est une maladie neurodéveloppementale, cause la plus fréquente (1/4 000 hommes et 1/7 000 femmes) de l'autisme avec retard mental héréditaire. Il est dû à une mutation sur le chromosome X qui entraîne l’absence de la protéine FMRP qui contrôle de nombreuses fonctions dont la quantité et la localisation de nombreuses protéines cellulaires dans les neurones. En clinique humaine, comme dans la souris génétiquement modifiée modèle de la pathologie, le FXS est associé à des troubles des comportements socio-cognitifs et sensori-moteurs, et à des défauts cellulaires de morphologie et de plasticité synaptique des neurones. Selon le génotype, on pourra distinguer des individus atteints (hommes et les femmes), mais aussi des femmes porteuses faiblement ou non symptomatiques. In vivo, l'inhibition pharmacologique d'enzymes particulières produit un phénomène de "sauvetage" des défauts sociaux-cognitifs des souris transgénique modèles de la pathologie humaine. Dans une perspective thérapeutique chez l'humain, ce projet a pour objectif de tester l'efficacité d'un traitement chronique précoce par des inhibiteurs pharmacologiques de ces enzymes dans l'enfance des souris modèle du FXS, sur les troubles sensori-moteurs caractéristiques de la pathologie et associés aux troubles socio-cognitifs. Quatre inhibiteurs seront testés, dont certains développés en collaboration, présentant des propriétés pharmacologiques différentes et ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Sur le plan de la recherche fondamentale, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes neuronaux moléculaires et les voies de transduction dans les fonctions sensorielles et sensori-motrices. Sur le plan de la recherche appliquée et clinique, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les symptômes associés au syndrome X Fragile et de proposer une nouvelle cibles thérapeutiques. Avant de proposer de tester de nouveaux composés chez l'homme, il faut en valider les effets sur un modèle de souris génétiquement modifié qui reproduit fidèlement les symptômes comportementaux et neuro-anatomiques des individus atteints de FXS.

Procédures

Les souris reproductrices (350 souris) subiront une ablation du bout de queue pour génotypage. Toutes les souris expérimentales (3200 souris) subiront un traitement chronique P5-P21 (de 5 à 21 jours après la naissance) par injection quotidienne (30 sec /souris/jour pendant 15 jours), ainsi qu'un prélèvement sanguin par veine caudale sous contention (5 min), une injection intraplantaire (30") dans une patte arrière et pour la moitié une anesthésie chimique (5 min), un prélèvement sanguin sous anesthésie (1 min) avant euthanasie (5 min), alors que l'autre moitié subira une anesthésie gazeuse avant euthanasie (5 min).

Impact sur les animaux

Bien que rares, des inflammations ou infections pourront se développer aux points de prélèvements (queue) et d’injections. Le traitement chronique sur les souriceaux (P5-P21) peut entrainer une dégradation de l'état général qui constituera un point limite. Les gestes de contention et les tests d'interaction sociale, les tests sensori-moteurs et les tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique non invasifs peuvent induire du stress, qui sera néanmoins réduit (nuisance modérée) par l’habituation préalable. Un isolement visuel et olfactif relatif de 72h sera nécessaire pour mesurer les variations d’activité durant le cycle jour-nuit. Pendant les tests comportementaux de sensibilité cutanée, une douleur cutanée transitoire ou prolongée (max 1h) sera ressentie sur la queue ou une patte arrière.

Devenir

Les souris sont génétiquement modifiées et ne peuvent être disséminées dans la nature pour adoption. De plus, elles ont subi un traitement pharmacologique, ainsi que des tests comportementaux invasifs avec injections de facteurs inflammatoires. Elles ne peuvent donc pas être conservés pour une réutilisation. Elles seront donc mises à mort en fin de protocole et permettront des prélèvements sanguins et tissulaires nécessaires aux résultats expérimentaux.

Remplacement

Les expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et des processus sensori-moteurs. Elles permettent aussi d'utiliser des souris génétiquement modifiées, transposition directe de la pathologie humaine chez l'animal. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques.

Réduction

L‘objectif de Réduction a été pris en compte car le nombre total de souris (3200) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (15 souris/condition + une sécurité optionnelle de 5 souris/lot pour compenser l’exclusion de certains animaux en cours d’étude selon les points limites prévus). Toute expérience rendue inutile par des résultats obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. En fonction de leur génotype, de leur sexe et de leur traitement pharmacologique les lots de souris seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés à la distribution statistique des données et au type de comparaison choisies (comparaison sur le même animal ou sur des animaux différents). Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souriceaux les deux génotypes mâles et des trois génotypes femelles (dont des animaux normaux) qui devront être comparés (la pathologie X-Fragile est causé par une mutation sur le chromosome X). Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées (nombre des bébés, sexes et génotypes) déjà produits et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem.

Raffinement

Pendant les expériences, un suivi quotidien sera réalisé par contrôle visuel de l'état de l'animal et de ses sites d'injection ou de prélèvement, ainsi qu’un contrôle expérimental (comportement mesuré par le test). Le poids de chaque souriceau sera relevé et, en cas de stagnation ou de décroissance de la prise de poids sur deux jours, le souriceau sera euthanasié. Les risques de rejet et de cannibalisme liés à la manipulation des souriceaux sera limité en mettant les souriceaux en contact avec l’urine de la mère avant d’être remis dans le nid. Dans le cadre de la prise en compte de leur souffrance, les animaux adultes seront habitués aux tests préalablement afin de réduire leur stress. Chaque test/intervention sera séparé au minimum d’une semaine du suivant. Si un animal est blessé ou présente des signes d’infection au site d’injection ou de prélèvement, nous l'isolerons et le soignerons jusqu'à guérison (si après une semaine l'animal est encore blessé, il sera mis à mort). Tout animal qui présenterait des signes de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement anormal (prostration, apathie…) ou d‘une pathologie quelconque serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans les protocoles qui ont pour objet d’étude la douleur.

Choix des espèces

Travailler avec des souris permet de comparer le comportement « normal » ("sauvage") avec le modèle transgénique du FXS (souris Fmr1-KO), et d'étudier les défauts de comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensori-moteurs que l'on peut retrouver chez les patients. D'autre part, de nombreux modèles comportementaux de douleur et de motricité font actuellement référence chez la souris dans le type d’étude que nous souhaitons mener. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques. Le traitement pharmacologique chronique sera réalisé de P5 à P21 (de 5 à 21 jours après la naissance), correspondant à l'enfance chez la souris, où le processus neurodéveloppemental est crucial. Les tests sensori-moteurs et sociaux seront conduits à 1 mois à l’adolescence, une période clé du développement de l’autisme, puis de 8 à 20 semaines afin d'évaluer le bénéfice du traitement pharmacologique précoce à l’âge adulte.

Injectées d'un virus adéno-associé dès l'âge de deux à quatre jours, 300 souris grandissent jusqu'à la maturité musculaire, passent trois jours d'habituation à la course puis une heure de course continue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 250 d'entre elles et modéré pour 50. La force de contraction du muscle est ensuite mesurée in situ, geste invasif pratiqué sous anesthésie générale, pour étudier deux gènes exprimés dans la zone qui relie le muscle au tendon. Les souris ne se réveillent pas de cette anesthésie et sont tuées pour que leurs muscles soient prélevés, le porteur écrivant qu'il ne les réutilisera pas, ne les remplacera pas et ne les fera pas adopter.

Objectifs

La jonction myotendineuse (JMT) est un élément essentiel du muscle squelettique qui relie le muscle au tendon. Un dysfonctionnement de la jonction myotendineuse peut endommager le tissu musculaire. Cependant, la compréhension de la JTM reste très limitée. Nous étudions ici le rôle de 2 gènes cibles, dont nous avons découvert précédemment qu'il n'était exprimé que dans les noyaux musculaires au niveau de la JMT.

Bénéfices attendus

Cette recherche permettra d'approfondir notre compréhension de la JMT et de la biologie musculaire. Jusqu'à présent, nous savons que les noyaux musculaires au niveau de la JMT expriment des groupes distincts de gènes, qui jouent un rôle important dans son établissement. Cependant, on ne sait pas si les processus qui contrôlent la stabilité de l'ARN messager ou les taux de synthèse des protéines sont également importants. Il a été démontré que nos 2 gènes cibles sont importants pour de tels processus dans d'autres organismes et tissus. Par conséquent, nos résultats impliquent que la stabilité de l'ARN messager et la synthèse des protéines sont également contrôlées de manière critique dans la zone de la JMT.

Procédures

1. Injection intrapéritonéale de MyoAAV (Virus adeno associés musculaires): Il s'agit d'interventions très rapides. L'injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, elles retourneront dans leur cage d'origine. 2.Le programme d’exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation suivi d’un jour de course de 60 min. 3.La mesure de la force de contraction musculaire in situ est un test invasif réalisé sous anesthésie générale. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale (IP) est une technique largement utilisée et n'entraîne qu'une douleur liée à l'aiguille. L'AAV (virus adeno-associé) est un outil largement utilisé pour la délivrance de gènes et présente très peu d'effets secondaires. Il est important de noter que nous utilisons un AAV sélectif pour le muscle squelettique et qui présente donc moins de toxicité que d'autres types d’AAV. La délétion de nos 2 gènes cibles pourrait entraîner des faiblesses musculaires, que nous ne pouvons pas prédire pour le moment. Nous serons donc particulièrement attentifs à l’apparition de phénotypes chez les animaux injectés avec les AAV, et les traiteront en conséquence.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

La JMT ne peut pas être reproduite dans des cellules en culture car elle nécessite la présence de muscles et de tendons matures. Par conséquent, l'expérimentation animale est essentielle et ne peut être évitée.

Réduction

Nous effectuerons l'injection de virus adeno-associés (AAV) à des nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours et évaluerons longitudinalement la fonction musculaire jusqu'à l’âge d’efficacité optimale de l’infection, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux utilisés. De même, l'utilisation d'AAV au lieu de modèles génétiques réduit le nombre total d'animaux utilisés pendant la durée du projet. Avant d'introduire nos séquences cibles grâce aux AAV chez les animaux in vivo, nous confirmerons leur efficacité dans des cellules en culture. Plusieurs tests fonctionnels seront effectués chez la même souris. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe est de 20 (10 x 2 sexes) pour les expériences de forces de préhension et la mesure de la force contractile in situ (Aurora), de 10 (5 x 2 sexes) pour l’histologie et de 10 (5 x 2 sexes) pour l’exercice excentrique afin d'obtenir une différence statistiquement significative lorsqu'un phénotype apparaît. Les tests statistiques appropriés seront utilisés pour analyser les résultats et pour comparer les différents groupes.

Raffinement

Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation visuelle du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de l’apparition d’éventuels problèmes de locomotion. Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère ou inconfort au niveau d’un membre traité dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré toutes les 12 heures et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. La mesure de la force contractile in situ sera effectuée sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur durant l’expérience. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante pour éviter l'hypothermie et un gel sera appliqué pour éviter toute sécheresse oculaire. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil.

Choix des espèces

De récents travaux in vitro de notre équipe ont permis d’identifier 2 gènes cibles comme marqueurs de la JMT. Cette jonction ne peut pas être reproduite dans des cellules en culture car elle nécessite la présence de muscles et de tendons matures. La création de lignées mutantes grâce à l’utilisation d’AAV spécifique du muscle est bien établi chez la souris et permet d’utiliser moins d’animaux que l’établissement de lignées par les méthodes de manipulations génétiques classiques. La souris est donc le choix le plus approprié. Pour administrer efficacement l'AAV à l'ensemble du corps au stade le plus précoce, il faut utiliser des nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours. Cette méthode est bien établie dans le domaine de la thérapie génique. Les tests seront effectués après la fin de la maturation musculaire, c’est-à-dire après l’âge de 8 semaine. Une étude pilote (procédure 1) permettra de déterminer cet âge avec précision, âge auquel l’infection de l’AAV muscle spécifique, et donc de la délétion de nos 2 gènes cibles, sera optimale. Les souris mâles et femelles ont des mesures par défaut différentes dans nos essais. Nous utiliserons donc les deux sexes. En outre, en raison de notre conception expérimentale consistant à injecter les AAV à des nouveau-nés de 2 à 4 jours, nous ne pouvons pas distinguer le sexe à ce stade.