Recherche fondamentale

7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une inoculation de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse, une partie subit deux échographies et jusqu'à quatre administrations de chimiothérapie ou d'immunothérapie par semaine en état vigile, avec cachexie possible, saignements au site tumoral et sensibilité accrue aux infections pour les lignées immunodéficientes. L'objet tient en une phrase du porteur, valider in vivo l'hypothèse qu'un gène déjà repéré dans des cohortes de patients intervient dans la progression des cancers de la langue, de la tête et du cou. Le chiffre de 7 200 se déduit de groupes de vingt souris, dix mâles et dix femelles, sans que le nombre de groupes prévus soit indiqué.

Objectifs

L’importance du rôle du système immunitaire sur l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses a été démontrée. Nous avons identifié un gène qui semble être impliqué dans l’efficacité de la chimiothérapie. La perte de fonction de ce gène est associée à une survie réduite chez des patients atteints de cancer du sein et colorectal, recevant de la chimiothérapie. Nous avons mis en évidence, via des analyses rétrospectives sur des cohortes de patients, que la perte de fonction de ce gène est aussi impliquée dans la progression des cancers de la langue, de la tête et du cou. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse.

Bénéfices attendus

Les cancers de la langue, tête et cou représentent le 4 pour cent de tous les cancers dans le monde entier. En Europe, chaque année, on estime qu’un cancer de ce type sera diagnostiqué chez environ 23 hommes sur 100 000 et 4 femmes sur 100 000. Le dépistage rapide est un défi important pour la santé publique. Ce projet nous permettra de valider un gène comme un facteur diagnostic et pronostic de ces maladies.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à une inoculation de cellules tumorales (3 min/souris/injection) sous anesthésie gazeuse et à une expérience de croissance tumorale. Une partie des animaux sera soumise à 2 échographies sous anesthésie gazeuse (10 min/souris). Une partie des animaux sera soumise à des traitements de chimio- et immuno-thérapies, administrés sur l’animal vigile (4 administrations au maximum par semaine par animal, 2 min/animal). Les animaux seront euthanasiés, à la fin de la période des procédures, par une méthode réglementaire en vue des prélèvements d’organes et de tumeurs.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Par ailleurs, la croissance tumorale et l’administration de traitements peuvent entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie, apparition de saignements au site tumoral). Les souris immunodéficientes présentent une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il n’y a pas de modèles alternatifs permettant d’étudier l’efficacité des traitements anticancéreux et de confirmer leur action via l’activation du système immunitaire. Il est donc essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral et le fonctionnement du système immunitaire. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les médiateurs du système immunitaire peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 7200 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 20 souris (10 mâles et 10 femelles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Une veille bibliographique attentive et continue sera réalisée afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes, etc). Une partie des souris utilisées dans ce projet présentent un phénotype considéré comme dommageable du fait que ce soit des animaux immunodéficients. Elles seront hébergées, afin d’assurer leur protection, dans une zone d’expérimentation dédié aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous hotte. Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, gel oculaire, désinfection, ...). Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Pour éviter l’hypothermie, l’anesthésie gazeuse des animaux sera effectuée en présence de tapis chauffants. Si les souris apparaissent affaiblies pendant les procédures, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Tous les souriceaux sont tués au plus tard deux jours après leur naissance, leurs tissus étant prélevés pour analyse. 744 souris vont être utilisées dans ce projet sur la forme congénitale de la maladie de Steinert, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mesures portent sur la ventilation des nouveau-nés éveillés pendant une heure, le jour de la naissance puis le lendemain, ce qui suppose de les séparer de leur mère aussi longtemps, et le porteur reconnaît que la mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. Vingt-quatre femelles échappent à la mise à mort, gardées pour produire de nouvelles portées.

Objectifs

La dystrophie myotonique de Steinert est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 8000 en France. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire, des problèmes cardiorespiratoires, des cataractes précoces, et des troubles de l'apprentissage. La manifestation à la naissance (congénitale), la forme la plus sévère, peut se détecter dès la période prénatale par une réduction des mouvements fœtaux et un excès de liquide amniotique. À la naissance, les bébés présentent une faible tonicité musculaire, des difficultés à sucer et à avaler, et souvent des problèmes respiratoires. La maladie est due à une anomalie d’un gène spécifique caractérisée par une répétition excessive d'un motif particulier dans le gène. Plus cette répétition est longue, plus la maladie est sévère, pouvant atteindre jusqu’à 1000 répétitions chez certains patients. Le projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie, particulièrement dans sa forme sévère, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Actuellement, aucun traitement efficace n’existe. Pour étudier cette maladie, nous disposons de souris génétiquement modifiées portant le gène muté. Ces souris reproduisent certaines caractéristiques de la maladie humaine. Il s’agit alors d’identifier les mécanismes spécifiques liés à la mutation du gène et comprendre comment ces mécanismes contribuent aux symptômes sévères observés dans la forme congénitale de la maladie.

Bénéfices attendus

La maladie de Steinert est caractérisée par la répétition exagérée d'un motif spécifique. La compréhension de la conséquence de cette répétition est capitale pour mieux gérer la maladie, la progression des symptômes et leur variabilité, pour identifier d'autres gènes impliqués et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Pour les femelles gestantes : Isolement de la femelle gestante 4 jours avant la mise bas. Pour les souriceaux : Mesure de la ventilation , de la fréquence respiratoire, du volume inhalé à chaque cycle respiratoire, de la durée et du nombre d'apnées chez les souriceaux éveillés pendant 1 heure le jour de la naissance et à J+1.

Impact sur les animaux

1/Séparation maternelle le temps de réaliser l'enregistrement des paramètres ventilatoires d'une heure. 2/ La mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. 3/ Les femelles gestantes sont isolées 4 jours avant la mise bas pour permettre la nidation et réduire le stress lors de la prise en charge à la naissance.

Devenir

Tous les souriceaux sont euthanasiés au plus tard 2 jours après leur naissance. Prélèvement tissulaire postmortem pour des analyses à l'échelle des molécules. Les femelles sont ré-utilisées pour obtenir de nouvelles portées.

Remplacement

Les études sur des cultures cellulaires sont importantes dans la compréhension de la maladie. Toutefois, ces modèles sont limités car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge. Étant dans l’optique de recherche de traitement pharmacologique notamment pédiatrique, l’Agence européenne du médicament recommande l’utilisation de l’animal en développement. L’expérimentation animale ne peut alors être évitée. Dans la maladie de Steinert, il n’y a actuellement pas de traitement pharmacologique satisfaisant.

Réduction

Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur les variables observées comme la ventilation, nous avons déterminé un effectif de 30 animaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.

Raffinement

Pendant les mesures, la surveillance est constante. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux (deux premiers jours de vie) comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau (coloration du souriceau, mouvement spontané, respiration spontanée, réaction à la douleur, présence de lait dans le ventre) et le comportement de la mère envers sa portée (constitution du nid, présence de lait dans le ventre). Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (durée de la mesure, température dans les chambres de mesure) pour minimiser l'angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. Les cages des femelles gestantes isolées puis les mères avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. Par ailleurs, le personnel technique de l'animalerie effectue une vérification journalière obligatoire des espaces d'hebergement des souris et toutes les cages sont vérifiées.

Choix des espèces

L’approche sur un animal entier permet de voir les effets de la mutation dans un contexte physiologique. La souris constitue un modèle de neuro-développement humain et la souris avec modification génétique est largement utilisée dans l'analyse ou l'étude du développement d'une maladie génétique. Dans le cas de la maladie de Steinert, les modèles animaux existants sont murins. Ces modèles murins permettent alors de préciser les processus conduisant à la maladie et de tester ultérieurement les stratégies thérapeutiques. Notre investigation est au stade postnatal précoce, les deux premiers jours de vie (à la naissance (P0) et à P1).

10 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, chacun subit une chirurgie d'environ 1h30 pour prélever un greffon de périoste, la membrane qui recouvre l'os, associé à un implant en biomatériaux placé dans un muscle, puis 28 jours de suivi avec une contention que le porteur dit "répétée plusieurs fois par jour". Les lapins sont ensuite tués pour récupérer l'implant, ce qui impose de rouvrir la cicatrice et les muscles, le porteur affirmant vouloir "leur éviter toute séquelle" de ces gestes. L'application aux patients reste lointaine : la technique "pourrait être utilisée pour traiter l'arthrose", écrit-il, au terme d'une étude qu'il présente comme une "preuve de concept" sans analyse statistique. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit cet environnement musculaire, "d'où la nécessité de passer par un modèle animal".

Objectifs

L'arthrose est une maladie courante qui affecte les articulations en provoquant une détérioration du cartilage. Cela peut entraîner des douleurs et une réduction de la mobilité, en particulier chez les personnes âgées. La recherche se concentre actuellement sur la régénération du cartilage articulaire en utilisant des greffons de périoste, une membrane fibreuse qui peut être prélevée plus facilement que le cartilage lui-même. Le projet a pour objectif de développer un processus chirurgical de régénération du cartilage chez le lapin, en utilisant un implant chirurgical en biométériaux associé à un greffon de périoste. L'objectif est de réimplanter le cartilage régénéré sur une perte de substance cartilagineuse articulaire et d'évaluer sa durabilité.

Bénéfices attendus

L'arthrose est une maladie articulaire caractérisée par la détérioration progressive du cartilage qui recouvre les extrémités osseuses dans les articulations. Cette détérioration entraîne des douleurs et une diminution de la mobilité chez les personnes touchées, en particulier dans les populations vieillissantes où la fréquence de la maladie est en augmentation. En conséquence, l'arthrose est considérée comme un problème de santé publique en raison de son impact négatif sur la qualité de vie des individus affectés et des coûts associés aux soins de santé pour traiter cette maladie. L’approche chirurgicale décrite dans ce projet pourrait être utilisée pour traiter l'arthrose en permettant la réimplantation d'un nouveau cartilage sur une zone où il est détérioré, de façon similaire à ce qui est pratiqué en chirurgie humaine lors d'interventions appelées "mosaïcplasties". Il s’agit d’interventions chirurgicales où de petits morceaux de cartilage sain sont prélevés dans une zone de l'articulation non porteuse de poids et réimplantés dans les zones endommagées du cartilage, mais sur des surfaces limitées (1 à 4 cm2), en particulier du fait d’un nombre réduit de sites donneurs. Cette nouvelle technique offrirait l'avantage de pouvoir traiter des zones plus importantes de perte de cartilage, avaec un bénéfice non négligeable sur la qualité des patients.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux participeront à une seule procédure expérimentale, comprenant une anesthésie générale par injection intramusculaire (15 min), la pose d'un cathéter intraveineux au niveau de l'oreille (2 min), une intervention chirurgicale (environ 1h30) au cours de laquelle la douleur sera contrôlée par injection médicamenteuse. Au cours du suivi post-opératoire pendant 28 jours, ils seront manipulés quotidiennement par les soigneurs pour recueillir des données mais sans geste invasif (pesée, vérification de l'implant...).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, trois types de nuisances ont été identifiées. Le premier est lié à l’intervention chirurgicale, nécessaire pour le prélèvement du greffon de périoste pour laquelle l'anesthésie nécessitera des injection par voie intra-musculaire, puis la pose d'un cathéter intraveineux au niveau de l'oreille. La présence de plaies chirurgicales pourra générer de la douleur après le réveil. Le deuxième type de nuisances est lié à l’implant lui-même, situé dans un muscle, ce qui pourrait entraîner une gêne. Enfin, les manipulations quotidiennes pour la mobilisation des platines nécessiteront une contention légère des animaux mais répétée plusieurs fois par jour sur toute la durée de l’étude, cela pouvant induire un stress.

Devenir

L'implant devant être récupéré pour réaliser des analyses tissulaires, il sera nécessaire de rouvrir la cicatrice et les muscles. Les animaux seront euthanasiés pour leur éviter toute séquelle liée à ces gestes.

Remplacement

Dans le cadre de la croissance et de la régénération des os et du cartilage, l’ensemble des processus biologiques impliqués est complexe. Plusieurs équipes ont notamment démontré qu’il existe une interaction trés active entre le muscle strié et l’os au cours de la réparation osseuse. Cet aspect d’interaction positive entre le muscle et l’os est aussi retrouvée au plan clinique orthopédique où l’importance d’un environnement musculaire de qualité pour la réparation osseuse est constatée quotidiennement. C’est pourquoi l’utilisation d’un environnement tissulaire de type muscle strié squeletique autour du greffon de périoste est nécessaire pour ce projet de développement d’un dispositif innovant. En l’état des connaissances actuelles, Il n’existe pas de systéme alternatif “in vitro” susceptible de reproduire un environnement aussi riche en faveur d’un processus de construction tissulaire ostéocartilagineuse, d’où la nécessité de passer par un modèle animal.

Réduction

Une étude préalable sur cadavre sera réalisée pour vérifier la faisabilité de l’implantation. S’il s’avérait que des difficultés apparaissent, alors la procédure serait revue avant de débuter les essais sur animaux vivants. De plus il s’agit d’une étude trés préliminaire pour « preuve de concept ». L’identification histologique de la production d’un cartilage de qualité spécifiquement articulaire sera l’élément essentiel de validation de la procédure mais ne donnera pas lieu à une étude statistique particulière. Un nombre limité de 10 animaux est donc envisagé dans cette premiére étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés Après l’intervention, l’animal est transféré dans une cage dédiée, où lui seront proposés de l’eau et de la nourriture dès son réveil afin de permettre une reprise alimentaire rapide. Le fond de cage sera matelassé pour réduire les risques d’hypothermie et éviter que le lapin ne se blesse en faisant un faux mouvement pendant son réveil. Une alèse chirurgicale permettra d’absorber les urines. Les animaux resteront sous suveillance en isolement, mais avec un contact visuel avec leur congénère, pendant les 24 premières heures. Si leur état clinique le permet, ils seront remis en espace libre dès le lendemain de l’intervention. Au cours des étapes suivantes, l’état clinique des animaux sera vérifié quotidiennement et évalué à l'aide d'une grille d'observation permettant d'établir des points limites et les actions à mener (surveillance accrue, administration d'anti-douleurs, mise à mort) en fonction du score obtenu.

Choix des espèces

Le lapin est un des modéle animaux trés couramment utilisé pour la recherche sur le cartilage articulaire. Des adultes de 3 à 3,5 kg ont été choisis car leur taille est suffisante pour implanter le dispositif médical. De plus, l’équipe initiatrice du projet a déjà une expérience sur cette espèce, dont les travaux précédents avaient montré qu’il serait possible de produire du cartilage articulaire à partir de greffons de périoste, ce qui a donné lieu à ce nouveau projet.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour des analyses histologiques. Celles qui sont opérées passent 1h30 en chirurgie pour l'implantation de fibres optiques dans le cerveau, parfois de pompes sous la peau, puis deux heures de réveil. Selon les groupes, les souris sont aussi isolées de leurs congénères pour provoquer un état anxieux, ou rationnées jusqu'à 90 % de leur poids pour des tâches de conditionnement. Le projet cherche si des métabolites bactériens, moins abondants dans le sang de personnes atteintes de troubles psychiatriques, agissent sur le cerveau, des métabolites qui "pourraient protéger des altérations comportementales", écrit le porteur. Il annonce des tests comportementaux dont certains provoquent "un stress de courte durée", sans préciser lesquels.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (640).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (640) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Quinze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, chacun sur une souris maintenue une minute: 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent dix-huit semaines de régime hypergras jusqu'à l'obésité et le diabète, avec gavages au glucose, mesures de glycémie tous les quinze jours et 72 heures d'hébergement individuel réparties en quatre tests de dix-huit heures. L'objet réel est de vérifier si des "faux lipides" conçus par l'équipe agissent sur un récepteur lingual du goût du gras et coupent l'appétit. Le porteur retient la souris parce que sa lignée génétiquement modifiée n'existe que dans cette espèce, et cite aussi la disponibilité des réactifs et des "coûts limités de maintenance".

Objectifs

Des études récentes effectuées chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Le récepteur CD36 est le récepteur du gras qui est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras. Nous avons développé des faux lipides qui sont soit des analogues d’acides gras ou un extrait d’origine végétale. Ces molécules sont capables d’interagir avec le lipido-récepteur CD36 et de mimer le goût du gras comme des acides gras naturels. Cela, ouvre des perspectives de l’utilisation de ces « faux lipides » comme modulateurs du gout du gras et du comportement alimentaire Le but de cette étude est de 1-Vérifier si nos molécules agonistes de CD36 « faux lipides » sont capables d’induire la satiété et de réduire l’incidence de l’obésité. Le test de comportement « test double choix » la mesure de prise alimentaire, du poids corporel ainsi que la glycémie à jeun fourniront des éléments de réponses à ce sujet. 2-Démontrer par l’utilisation de souris qui n’expriment pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales, l’implication, in vivo, de ce récepteur lingual dans l’action des faux lipides

Bénéfices attendus

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Le récepteur du gras CD36 est responsable non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. L’altération du gout du gras conduit à une attirance excessive pour les aliments gras, favorisant ainsi l’installation de l’obésité et les maladies métaboliques associées tels que l’insulinorésistance et le diabète de type 2. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas récepteur du gras CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras. A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, qui n’exprime pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales,qui pourra servir de modèle animal pour les études ou les interrogations relatives au rôle de CD36 dans le gout du gras. A long terme ce projet nous permettra de développer de nouvelles molécules anti-obésité ciblant le récepteur du gras « CD36 »

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard ou hypergras et sera pesé de façon hebdomadaire. Des mesures de la glycémie tous les 15 jours pendant 18 semaines au niveau de la queue ainsi qu’un test tolérance au glucose en fin de protocole nécessitent une mise à jeun de 6h, un gavage au glucose (moins d’une minute) et une incision de l’extrémité de la queue, ces mesures de glycémie seront réalisées par bandelette glucomètre Ainsi pour la mesure de la glycémie, chaque souris subira un total de total 15 prélèvements d’une goutte de sang après incision de queue. Le prélèvement sera réalisé réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). Les souris seront hébergées individuellement en tout pendant 72 h (4 tests de 18h) pour réaliser un test comportemental. Un prélèvement sanguin terminal intracardiaque (sous anesthésie générale) sera réalisé avant la mise à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

- Inconfort lié à l’obésité induite par le régime alimentaire hyper-gras : l’obésité ou le surpoids peut réduire la mobilité des souris qui développent également un diabète de type 2. Nous avons limité la durée du régime alimentaire à 18 semaines. Durée optimale pour observer les effets des molécules anti-obésité limitant ainsi les inconforts liés à l’obésité. - Douleur lors des prélèvements sanguins au niveau de la queue. Les prélèvements sanguins (une goutte sur une bandelette de glycomètre) nécessitent une section de 0.5 à 1mm de l’extrémité de la queue qui peut induire une douleur et une infection locale. Les souris subiront en tout 15 prélèvements sanguins (10 prélèvements tous toutes les deux semaines pour suivre l’installation du diabète type 2 et 5 prélèvements lors du test un test de tolérance au glucose). Pour pallier à cette nuisance, nous effectuons une anesthésie locale (crème emla 5%) avant incision et nous désinfectons (solution antiseptique) la queue avant et après l’incision de même que les instruments (ciseaux) à l’alcool. - Irritation de la gorge lors des gavages : le test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage avec une solution de glucose, afin de minimiser cette irritation malgré la qualification de l’expérimentateur nous utilisons des sondes en plastique souple adéquates pour souris (38 mm longueur et 1,2 mm de diamètre de la pointe). -Stress lors des manipulations : les gavages nécessitent également une contention. Pour pallier à ce stress, nous limitions la durée de contention à quelques secondes. - Stress lors d’hébergement individuel des souris : les souris seront en hébergement individuel en tout pendant 72 h pour réaliser des tests de doubles choix (4 tests de 18h). Nous avons limité cette durée d’hébergement individuel à 18h qui représente la durée minimale pour réaliser ce test comportemental

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort..

Remplacement

L’obésité est une maladie multifactorielle impliquant l’altération du métabolisme des lipides et glucides, les dérégulations hormonales (hormones du tissu adipeux), l’activation du système immunitaire, l’inflammation. Ainsi malgré les résultats obtenus, in-vitro, le recours à l’animal est indispensable. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après une estimation statistique, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront hébergées individuellement, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo et matériau de nidification en cellulose). Les souris seront habituées à la contention pour diminuer le stress, lors des pesées et des prélèvements. Un anesthésiant local sera appliqué sur la queue lors des prélèvements sanguins et une anesthésie générale sera réalisée avant la mise à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix pour des études sur l’obésité et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (anticorps, kits de dosage etc…) et les coûts limités de maintenance contribuent au choix de modèle souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix pour notre étude. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. Des souris mâles de 4 à 5 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité. Il y’a pas de référence pour déterminer l’obésité chez la souris tels que l’indice de masse corporelle chez l’humain. Cependant les souris ayant un poids corporel au-delà de 45 g sont considérées comme obèses et développent une hyperglycémie à jeun. A la fin de l’étude, les animaux auront alors entre 22-23 semaines et seront donc adultes. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique (induites par des régimes obésogènes) telles que le diabète de type 2 normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.