Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres établissements, utilisés sur place ou mis à mort au titre de la gestion de l'élevage, 904 000 rongeurs, dont 901 000 souris et 3 000 rats, sont élevés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces animaux naissent immunodéficients, donc sans défense contre les microorganismes, et sont maintenus derrière des barrières sanitaires pour que cette fragilité ne se déclare pas. Une partie subit une biopsie sur animal vigile pour génotypage, et des femelles gestantes peuvent être transportées avant le dernier tiers de la gestation. Le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer ces effectifs, et renvoie au savoir-faire de l'établissement et à ses données historiques.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions particulières de propreté afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Le rôle du récepteur CAR dans la formation de nouveaux neurones et la plasticité du cerveau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour établir le rôle d'un récepteur dans la formation de nouveaux neurones chez l'adulte, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cœur, du foie et des reins. Chaque animal reçoit une injection quotidienne pendant huit jours et un transpondeur RFID implanté sous la peau derrière l'oreille, avant vingt-quatre heures d'observation filmée par groupes de cinq. Le porteur justifie l'effectif par un calcul donnant dix souris par groupe, répété sur quarante groupes. Les souris dépassant le score de 15 sur la grille d'évaluation sont mises à mort avant le terme prévu.
Objectifs
Dans la présente étude, Nous étudierons le rôle de une protéine présente dans plusieurs parties du cerveau, mais sa fonction exacte reste peu connue. Des études suggèrent qu’il pourrait jouer un rôle important dans la production de nouveau neurones adulte, c’est-à-dire le processus par lequel de nouveaux neurones se forment dans le cerveau adulte, surtout dans l’hippocampe, une zone clé pour la mémoire et l’apprentissage. La production de nouveau neurones adultes est cruciale pour : la mémoire et l’apprentissage, la régulation de l’humeur, la réparation du cerveau après une lésion. Ces processus sont essentiels pour la santé mentale et sont probablement impliqués dans des maladies comme la dépression, la dégénérescence neuronale (maladies neurodégénératives) et la récupération après un traumatisme cérébral. Le projet vise à : Comprendre le rôle de cette protéine dans la production de nouveaux neurones : Étudier comment cette protéine aide à former et intégrer de nouveaux neurones dans une partie du cerveau appelée hippocampe, qui est essentielle pour la mémoire. Voir comment l’absence de cette protéine affecte le cerveau : Découvrir si le manque de cette protéine impacte la capacité du cerveau à s’adapter et à apprendre, ainsi que les fonctions cognitives. Examiner son lien avec les maladies neurodégénératives : Explorer si la perte de cette protéine pourrait être associée à des maladies du cerveau comme la maladie d’Alzheimer ou d’autres formes de dégénérescence neuronale. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait aider à développer de nouveaux traitements pour les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre le fonctionnement du cerveau : Ce projet aidera à mieux connaître comment le cerveau produit de nouveaux neurones chez l’adulte et les mécanismes impliqués. Nouvelles pistes pour des traitements : Découvrir le rôle de cette protéine pourrait permettre de créer de nouveaux traitements pour des maladies comme Alzheimer ou des problèmes de mémoire. Progrès en neurosciences : Les résultats de cette recherche enrichiront nos connaissances sur la façon dont le cerveau s’adapte et se répare tout au long de la vie. Impact sur les maladies neurologiques : Les découvertes pourraient contribuer à des avancées pour soigner des maladies affectant le cerveau adulte, comme les maladies neurodégénératives
Procédures
Les souris recevront une injection chaque jour pendant 8 jours. Insertion du transpondeur RFID : sera inséré sous la peau, généralement derrière l’oreille. Test comportemental : Cinq souris sont placées dans une boîte d’observation pendant 24 heures, où elles ont accès à de la nourriture, de l’eau et des jouets. Elles sont filmées par des caméras situées au-dessus de la boîte. Grâce à un transpondeur RFID que chaque animal porte, nous sommes en mesure d’identifier et d’analyser le comportement de chaque souris de manière indépendante. Les souris recevront une injection quotidienne pendant 8 jours. Un transpondeur RFID sera inséré sous la peau, généralement derrière l’oreille. Un test comportemental sera ensuite effectué : cinq souris seront placées dans une boîte d’observation pendant 24 heures, avec accès à de la nourriture, de l’eau et des jouets. Elles seront filmées par des caméras situées au-dessus de la boîte. Grâce au transpondeur RFID, chaque souris pourra être identifiée, permettant une analyse individuelle de leur comportement. Pour le prélèvement du cerveau, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée. Après anesthésie profonde confirmée, les souris ne se réveilleront pas.
Impact sur les animaux
Injections répétées peuvent causer un stress temporaire ou un inconfort local. L’insertion de transpondeurs RFID sous la peau pourrait entraîner une douleur à court terme. Les interventions nécessitant une anesthésie générale (comme l’insertion de RFID) peuvent provoquer une légère gêne pendant la phase de réveil. La manipulation fréquente des souris pour les injections ou les observations comportementales peut générer du stress.
Devenir
Les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, conformément aux protocoles éthiques approuvés. Cette décision est justifiée par la nécessité de prélever des échantillons des différents organes (comme le cœur, le foie, les reins, etc.) afin d’effectuer des analyses approfondies à la fois sur le plan histologique, moléculaire et biochimique.
Remplacement
Malgré les efforts pour développer des modèles alternatifs, l’utilisation des souris reste essentielle dans les études sur la neurogenèse adulte en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d’étudier ces mécanismes dans un contexte vivant. Bien que des cultures de cellules souches neurales et des organoïdes cérébraux puissent être utilisés pour étudier la neurogenèse, ils ne reproduisent pas les interactions complexes du microenvironnement cérébral (comme les interactions avec les astrocytes, microglies, et les cellules vasculaires) qui sont essentielles pour comprendre la neurogenèse dans un contexte naturel. Des avancées dans les modèles informatiques permettent de simuler certains aspects de la neurogenèse, mais ces simulations sont limitées par la quantité de données disponibles sur les processus biologiques sous-jacents et par la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris ont une neurogenèse adulte active dans des régions spécifiques comme l’hippocampe, ce qui les rend très utiles pour étudier les mécanismes de la formation de nouveaux neurones. De plus, les souris sont génétiquement modifiables, ce qui permet de créer des modèles spécifiques à des moments précis et à des âges différents, pour étudier des gènes comme le récepteur CAR.
Réduction
Pour estimer le nombre d’animaux nécessaires dans notre étude, nous nous sommes basés sur des expériences précédentes et des données obtenues en laboratoire. Nous avons utilisé un outil de calcul statistique qui prend en compte la variabilité des résultats afin de déterminer le nombre optimal d’animaux. Ce calcul nous a permis de définir un nombre de 10 souris par groupe. Les données recueillies seront ensuite analysées avec des outils statistiques, et nous comparerons les résultats entre les groupes traités et les groupes placebo. Pour ce faire, nous aurons besoin de 40 groupes de 10 souris chacun, soit un total de 400 souri. Ce protocole permet de minimiser le nombre d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables et éthiques.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires pour prévenir tout impact négatif sur le bien-être des animaux seront mises en œuvre tout au long du projet. L’expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d’hébergement adaptées, un enrichissement de l’environnement, ainsi que la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse chez les animaux. Ils seront placés dans des cages avec une maison en carton et du coton, pour répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. La manipulation des animaux sera effectuée par un personnel qualifié en expérimentation animale, doté d’une expertise spécifique des procédures décrites. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera contrôlé une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures afin de réduire la douleur. Après les interventions, de la nourriture et de l’eau gélifiée seront placées au sol pour faciliter leur alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour surveiller étroitement les effets des interventions. Les animaux présentant l’un des points limites ou une note supérieure à 15 sur cette grille seront systématiquement euthanasiés.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’adolescence chez l’humain (environ 15-20 ans). Nous nous concentrons sur le rôle d’une protéine spécifique dans la production de nouveaux neurones chez l’adulte. À ce stade de leur vie, les souris présentent une activité maximale de création de nouveaux neurones, un processus qui diminue avec l’âge, tant chez la souris que chez l’humain. Nous inclurons des souris mâles et femelles car certaines régions du cerveau, ainsi que les risques, l’incidence et la gravité des maladies neurologiques, varient selon le sexe.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Implantés d'électrodes d'électroencéphalogramme dès l'âge de 14 jours, puis porteurs de mini-pompes osmotiques remplacées chaque mois, 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent trois ponctions lombaires, trois examens par résonance magnétique sous anesthésie et un test de dépression associé à une restriction alimentaire. Il s'agit de tester des esters de cétones et du lactate comme substituts au régime cétogène chez un modèle de déficit en GLUT1, maladie rare dont un quart des patients ne répond pas à ce régime. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que le modèle murin ne fait pas de crises d'épilepsie et parce que l'imagerie par résonance magnétique gagne en résolution sur un animal plus gros.
Objectifs
La diffusion du glucose à travers les barrières tissulaires est facilitée par une famille de protéines dont le transporteur de glucose de type 1 (GLUT1). Le syndrome de déficience en GLUT1 est un syndrome de défaillance énergétique cérébrale causée par une altération du transport du glucose à travers les barrières du tissu cérébral. Cette maladie rare est caractérisée par une épilepsie pédiatrique résistante aux traitements, un retard de développement et des troubles moteurs complexes. Les patients sont traités efficacement avec des thérapies diététiques cétogènes (régime riche en graisses) qui fournissent un carburant supplémentaire, à savoir des corps cétoniques (composés produits par le foie lors de la dégradation des acides gras), pour le métabolisme énergétique du cerveau. Cette thérapie est inefficace pour 1/4 des patients. Le projet vise à tester l'efficacité de l'apport de nouvelles sources énergétiques : des esters de cétones (permettant une cétose (brulûage des graisses pour produire de l'énergie) thérapeutique plus rapide que le régime cétogène) et le lactate, sur un modèle de rat génétiquement réprimé pour GLUT1.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une neuroprotection de l'administration des esters de cétones ou du lactate, permettant de s'affranchir du régime cétogène. En effet, ce régime contraignant est souvent mal vécu par les patients. Si ces stratégies s'avèrent neuroprotectrice et peuvent remplacer ce régime, des études plus approfondies pourraient permettre la mise en place d'un protocole d'administration d'esters de cétones ou de lactate, améliorant la qualité de vie de ces patients.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement EEG, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 20 min - implantation des mini-pompes osmotiques permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 10 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes - ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - examens par résonance magnétique nucléaire : examen non-invasif sous anesthésie gazeuse , réalisé 3 fois, durée : 45 min. gavage pré-IRM, réalisé 2 fois, durée 30 sec. La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours).
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue réalisée pour le génotypage entraînera une douleur légère de courte durée. L'implantation des mini-pompes osmotiques pourra entraîner une douleur modérée. Les prélèvements pour les mesures biologiques pourraient entraîner une nuisance légère. Les anesthésies (pose EEG et examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, mesurée grâce à un capteur placé sous l'animal, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser (risque faible). Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux. Lors du test de comportement de dépression, la nécessité d'une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 200)
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement d'électroencéphalogramme, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les imageries par résonance magnétique sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'imagerie par résonance magnétique est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris. Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 125 jours. Les dispositifs d'enregistrement d'électroencéphalogramme seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 125 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Evaluation du Potentiel therapeutique et neuroprotecteur d’un estrogène naturel dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une incision entre l'œil et l'oreille, l'os du crâne dégagé pour poser une sonde laser-Doppler, et l'artère cérébrale moyenne obstruée pour provoquer un accident vasculaire : 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la substance testée pendant les sept jours précédant l'opération, ou au moment où le sang est rétabli. Toutes sont tuées pour récupérer leur sang et leur cerveau. Le porteur écrit que "la chirurgie en soi n'induit pas de douleur ou de souffrance" et ne signale qu'une perte de poids d'environ 10 % dans les 48 heures, pour une intervention qui consiste à provoquer un infarctus cérébral.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aiguë d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation) pour restaurer le flux sanguin. A ce jour, il n’y a pas de traitement approuvé pour protéger le tissu cérébral. Cette étude s’inscrit dans le cadre de développement de stratégies neuroprotectrices après un accident vasculaire cérébral ischémique . Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un traitement par un estrogène naturel modulateur des récepteurs des oestrogènes qui affecte de manière minime les paramètres de coagulation, dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral. Le mode d’action unique de cet estrogène se traduit par un profil bénéfice/risque amélioré par rapport aux autres œstrogènes. Nous évaluerons l’impact du traitement sur le volume de la lésion cérébrale, de la perte des cellules neurales et des troubles neurologiques et moteurs. Nous utiliserons un modèle expérimental d’ischémie cérébrale par occlusion de l’artère cérébrale moyenne suivi de reperfusion .
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un eostrogène naturel dans un contexte d’accident vasculaire cérébral. Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances précliniques qui pourront être à la base d’une proposition de nouvelles stratégies neuroprotectrices susceptible de réduire le dommage ischémique cérébral et corriger les déficits neurologiques et moteurs après la survenue d’un accident vasculaire cérébral (AVC).
Procédures
Les souris subiront une chirurgie au niveau du cou qui dure moins de 20 min pour induire une ischémie cérébrale suivie de reperfusion.. Une substance susceptible de réduire les effets délétaires de l'ischémie ou son solvant sont injectés aux souris soit avant la chirurgie pendant 7 jours ( effet neuroprotecteur) soit après la chirurgie à la reperfusion (effet thérapeutique) La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Une incision de la peau est effectuée entre l’oeil et l’oreille gauches et l’os ducrâne est dégagé, pour poser une sonde de laser-Doppler sur la boîte crânienne afin de mesurer le débit sanguin cérébral dans le territoire de l’artère cérébrale moyenne. La peau est refermée après la pose de la sonde.
Impact sur les animaux
La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale . La chirurgie en soi n’induit pas de douleur ou de souffrance. Une perte de poids d’environ 10% peut survenir dans les 48h qui suivent la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés pour récupérer le sang et le cerveau afin de faire des analyses.
Remplacement
Ces études nécessitent des expériences in vivo utilisant des animaux. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Le projet a pour but d’étudier l’effet dans le contexte de l’ischémie cérébrale, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier (système nerveux, système vasculaire et la connexion entre les organes). Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que des conséquences physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Le modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo permet de reproduire une grande partie des signes cliniques observés chez lles patients après AVC et d’évaluer in vivo les effets sur le cerveau et sur la récupération fonctionnelle (score neurologique, coordination motrice). Actuellement, Il n’existe aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas d’étudier l’efficacité d’un traitement visant à limiter la taille des lésions cérébrales et les déficits sensori-moteurs. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d’animaux à utiliser a été déterminé en tenant compte de la sensibilité des techniques utilisées et de la variabilité attendue du modèle sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature. Le nombre d’animaux par série expérimentale a été estimé au plus juste et est réduit au minimum, de façon à mettre en évidence des différences statistiques avec un risque d’erreur moins que 5%, sur la base de notre expérience de ce modèle et de nos études antérieures.. Nous avons optimisé les techniques de façons à évaluer le maximum de paramètres sur les mêmes groupes d’animaux (tests de comportement, taille de l’infarctus, et études immunohistochimiques au niveau du cerveau sont évalués sur les même lots d’animaux.
Raffinement
Les conditions de travail pour l’utilisation des souris ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Les expériences sont réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Une attention particulaire est portée pendant la chirurgie en particulier le maintien de la température corporelle grâce à une couverture chauffante. lLs souris sont observées régulièrement (à 6h et quotidiennement après l’ischémie) - les souris sont pesées avant et quotidiennement après ischémie pour évaluer la perte de poids. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées tout le long de l’étude jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont bien établis et maitrisés. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Souris adultes (8-12 semaines) pour lesquels le modèle d’ischémie cérébrale est bien validé
Etude des cellules dendritiques dérivées de monocytes in vivo en condition inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Huit applications d'un produit provoquant une dermatite sur une oreille, un jour sur deux jusqu'au quatorzième, mise à mort le quinzième : 462 souris vont être utilisées, 182 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 280 un niveau modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. D'autres reçoivent une injection dans l'abdomen qui déclenche une inflammation, ou des allergènes d'acariens instillés dans le nez chaque jour du septième au onzième jour. Le but consiste à trouver des critères permettant de distinguer un type de cellule immunitaire d'un autre, objectif de connaissance dont le porteur tire des perspectives thérapeutiques pour l'asthme et la dermatite atopique. Aucun analgésique ne sera employé, le porteur indiquant que cela pourrait affecter les résultats de l'expérience.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de trouver une méthode pour identifier un type spécial de cellules immunitaires, appelées cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDCs), chez les souris. Ces cellules ont été découvertes il y a 30 ans par différentiation de monocytes in vitro et étaient souvent utilisées pour étudier le fonctionnement des cellules dendritiques en général et pour des essais médicaux. Cependant, des recherches récentes ont montré que les moDCs sont différentes des autres cellules dendritiques que l’on trouve dans le sang et les organes, ce qui a créé des débats sur leur existence et leur rôle dans le corps. Actuellement, il n'existe pas de méthode fiable pour distinguer les moDCs des autres types de cellules dendritiques. Cela signifie que nous ne comprenons pas encore bien comment ces moDCs se développent dans le corps. Pour résoudre ce problème, nous allons utiliser un modèle de souris avec une inflammation abdominale, où nous avons récemment découvert que les moDCs se forment. Nous allons comparer les moDCs avec d'autres types de cellules dendritiques pour établir des critères clairs qui nous permettront de les identifier. Nous testerons également ces critères dans deux modèles d'allergies (asthme et dermatite atopique), car il est possible que les moDCs jouent un rôle important dans ces maladies. En résumé, ce projet a pour but de créer une méthode fiable pour identifier les moDCs chez la souris, afin de mieux comprendre leur rôle dans différentes maladies.
Bénéfices attendus
L'étude des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDCs) et des cellules dendritiques classiques dans des zones comme l’abdomen enflammé, les poumons des personnes asthmatiques, la peau des personnes atteintes de dermatite atopique, ainsi que dans les ganglions lymphatiques voisins, devrait nous aider à comprendre les rôles spécifiques de ces cellules dans ces maladies. Ces recherches pourraient nous permettre de trouver de nouvelles façons de traiter ces affections, ce qui aiderait à soulager la douleur des patients, à améliorer leur qualité de vie, et à faciliter leur intégration à l'école, au travail et dans la société. Cela pourrait également contribuer à réduire l'impact social et économique de ces maladies.
Procédures
1er type d’intervention : Les souris vont recevoir une injection brève dans leur abdomen pour provoquer une inflammation. Trois jours plus tard, elles seront mises à mort pour que les chercheurs puissent les analyser. Un groupe de souris recevra aussi une injection courte de cellules 18 heures après l’inflammation, puis elles seront également mises à mort trois jours après pour des analyses. 2ème type d’intervention : Sous anesthésie, les souris auront une solution contenant des allergènes d’acariens instillée dans leur nez pendant quelques secondes. À partir du septième jour, elles seront exposées à ces allergènes tous les jours jusqu’au onzième jour. Le quatorzième jour, elles seront mises à mort pour des analyses. 3ème type d’intervention : Sous anesthésie, une oreille des souris sera traitée pendant quelques secondes avec une solution qui provoque une dermatite. Elles recevront ce traitement tous les deux jours, pour un total de huit fois, jusqu’au quatorzième jour. Le quinzième jour, elles seront mises à mort pour des analyses.
Impact sur les animaux
La piqûre pour l'injection dans l'abdomen des souris peut causer une légère douleur, mais celle-ci ne dure pas longtemps. Ce traitement peut aussi provoquer des effets secondaires comme une inflammation de l'abdomen, une perte de poids, un pelage en désordre et moins de mouvement dans leur cage. Pour l'inhalation d'une solution dans le nez, les souris ressentent un léger inconfort pendant le traitement. Après une semaine, elles peuvent développer des symptômes allergiques, ce qui entraîne une souffrance modérée. Quant à l'application d'un produit sur l'oreille pour provoquer une dermatite, cela se fait sans douleur grâce à l'anesthésie. Cependant, à partir du deuxième jour, cela peut causer une irritation qui entraîne une douleur modérée jusqu'à ce que les souris soient mises à mort.
Devenir
A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. Soit un total de 462 animaux.
Remplacement
Ce projet vise à mesurer différents aspects de la réponse du système immunitaire lors d'une inflammation. Comme le système immunitaire est très complexe et que de nombreuses cellules interagissent entre elles pour réagir à une inflammation, il est important d'utiliser des modèles d'études sur des organismes vivants. Cela permet d'avoir une vue d'ensemble complète et précise de ce qui se passe dans le corps.
Réduction
Nous allons réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour notre étude. Nous travaillons avec des souris ayant une génétique uniforme, ce qui nous permet de limiter chaque groupe à 8 souris pour chaque condition testée. Actuellement, nous n'avons pas trouvé de données suffisamment fiables sur certaines cellules immunitaires pour calculer précisement le nombre d'animaux nécessaires pour chaque groupe. Cependant, une approche statistique basée sur les données disponibles indique qu'avoir 8 souris par groupe devrait être suffisant. Pour les groupes qui ne reçoivent pas de traitement, nous allons réduire le nombre à 6 souris, car il y a moins de variabilité dans ces cas. Après avoir analysé les résultats de la première expérience pour chaque condition inflammatoire, nous pourrons déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour les réglages des instruments, nous n'utiliserons qu'une seule souris de chaque type. Nous prévoyons de répéter chaque expérience trois ou quatre fois. En raison des différences possibles entre les analyses in vitro et celles sur des animaux, nous répéterons chaque premier groupe expérimental quatre fois. Cela nous permettra de définir des critères précis pour identifier les différents types de cellules. Si tout se passe bien lors de la première expérience, trois répétitions par condition seront suffisantes, ce qui réduira encore le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, nous les garderons en groupe autant que possible. Ils auront accès à du matériel pour construire des nids et seront surveillés chaque jour. Nous avons mis en place des points limites pour chaque procédure. Les interventions sur les animaux seront effectuées par des professionnels qualifiés et expérimentés afin de minimiser le stress lié à ces procédures. Nous utiliserons également du gaz anesthésiant pour les endormir lors des procédures. En revanche, nous ne pourrons pas utiliser d'analgésiques, car cela pourrait affecter les résultats de l'expérience. Donc, ils ne seront pas employés dans ce projet.
Choix des espèces
Les souris sont un excellent choix pour nos études en raison de leur taille, de leur cycle de reproduction rapide et de leur génétique. Elles nous permettent de mener des expériences en direct, y compris avec des souris génétiquement modifiées. De plus, leur fonctionnement biologique est assez similaire à celui des humains, ce qui nous aide à mieux comprendre comment fonctionne notre système immunitaire. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 12 semaines, car elles sont déjà matures sur le plan de leurs défenses immunitaires. Pour éviter les différences qui pourraient affecter nos résultats, nous veillerons à ce que l'âge des souris dans chaque groupe ne varie pas de plus de 2 semaines.
Thérapie oncolytique dans un modèle de glioblastome chez la souris. Etude en imagerie TEP/TDMX
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour des analyses sur les tissus prélevés, 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, jusqu'à deux injections d'un virus modifié ou de solution salée, et deux séances d'imagerie de seize minutes sur cinq semaines. Le virus retenu se fixe 210 fois plus sélectivement sur les cellules cancéreuses que sa version d'origine, selon des essais menés en culture cellulaire. Parmi les bénéfices attendus, le porteur annonce une régression tumorale "sans perte de poids ou effet secondaire notable", alors que la liste des effets indésirables qu'il prévoit comprend la perte de poids, une nécrose au point d'injection et une encéphalite provoquée par le virus.
Objectifs
Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable ainsi que la possibilité d’administrer le virus par voie intraveineuse tout en conservant son efficacité
Procédures
Dans la procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum 3 injections sous anesthésie gazeuse de 3 minutes chacune soit 9 minutes maximum. Pas de prélèvement sur animal vigile. Dans la procédure 2 : Chaque animal aura : - 1 anesthésie de 3 minutes pour injection de cellules tumorales à J0 - 2 anesthésies de 3 minutes pour injection de virus ou solution saline - 2 anesthésies de 16 minutes pour les séances d'imagerie . Total 50 minutes maximum sur 5 semaines
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection intraveineux caudale (72h maximum) , - nécrose transitoire des tissus au niveau du site d'injection intratumoral, - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus
Devenir
a la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le Sindbis (virus non modifié) n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumoralespar rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus Sinerpedoxx (virus modifié ciblant les intégrines) permet une infection 210 fois plus sélective (que le variant Sindbis) des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des virus Sindbis et Sinerpedoxx à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire ainsi que l’impact de la voie d’administration (intraveineuse ou intratumorale) sur l’effet thérapeutique.
Réduction
L’imagerie TEP est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons ainsi 10 souris par radiotraceur à l'inclusion afin d’avoir des statistiques sur les résultats obtenus. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.
Raffinement
Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.
Choix des espèces
Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 ou 8 semaines conformément à la littérature et à notre expérience
Approche nanomédicale pour normaliser la maturation des érythrocytes dans l’anémie congénitale par ARN messager
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Porteuses d'une délétion du gène de la chaîne bêta de l'hémoglobine, les souris de ce projet naissent avec une thalassémie et une anémie aux globules rouges déformés. 486 souris vont être utilisées, 414 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 un niveau léger. 156 reçoivent des nanoparticules lipidiques chargées d'ARN messager, 44 subissent sept prélèvements sanguins sous anesthésie espacés de deux semaines, et les animaux de quatre des cinq procédures sont tués pour caractériser leur système sanguin, la cinquième servant à produire ceux des deux dernières. Le porteur reconnaît que les symptômes développés par ce modèle murin "ne sont que partiellement décrits" et comble ce vide en énumérant ceux que ressentent les patients humains.
Objectifs
L'anémie, marquée par une insuffisance de globules rouges sains, touche un quart de la population mondiale. Environ 40 à 50 % des cas ne sont pas dus à une carence en fer et peuvent indiquer des maladies congénitales rares telles que l'anémie Diamond-Blackfan, la β-thalassémie ou l'anémie de Fanconi. Les anémies congénitales, des maladies héréditaires de la moelle osseuse, entraînent une production déficiente d’érythrocytes. Les troubles héréditaires de l'hémoglobine incluent les troubles structurels (comme la drépanocytose) et de production de globine (comme la thalassémie). Les traitements incluent des molécules stimulant la production de globules rouges, des transfusions sanguines ou des transplantations de moelle osseuse, mais ils sont souvent limités en efficacité et associés à des effets secondaires graves, affectant la qualité de vie des patients et engendrant des coûts élevés pour le système de santé européen. La β-thalassémie, un trouble héréditaire, se caractérise par des anomalies de la synthèse des chaînes β de l'hémoglobine, entraînant une érythropoïèse inefficace et un déficit en érythrocytes fonctionnels. Le projet vise à tester une formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) contenant un ARNm-candidat pour améliorer l’érythropoïèse dysfonctionnelle dans la β-thalassémie et d'autres anémies non ferriques. Nous fournirons une preuve de concept sur un modèle murin de β-thalassémie applicable à d’autres anémies. Cinq procédures expérimentales seront menées : 1. Sélection de la meilleure formulation et voie d’administration des LNP chez des souris sauvages. 2. Caractérisation de la biodistribution des LNP. 3. Élevage et production des souris beta thalassémiques. 4. Évaluation in vivo de l’impact des LNP contenant l’ARNm-candidat sur l’expression du gène chez les souris. 5. Évaluation in vivo de l’impact des LNP sur le développement de l’anémie chez les souris β-thalassémiques.
Bénéfices attendus
Notre proposition de thérapie basée sur l'ARNm-candidat ciblant la moelle osseuse fait partie du plan stratégique de recherche « Horizon Europe » (2021-2024) des thérapies innovantes et avancées pour les maladies non transmissibles. Notre projet devrait constituer une amélioration considérable par rapport aux options de traitement actuelles des pathologies sanguines en termes d'efficacité et sécurité. De plus, nous fournissons des connaissances essentielles sur l’administration ciblée de polynucléotides non viraux, qui pourra être exploitée pour des thérapies cellulaires et géniques de nouvelle génération dans un contexte plus large.
Procédures
156 animaux subiront une administration de nanoparticules (2min), 8 d’entre eux auront deux acquisitions d’imagerie optique 44 autres subiront une série de 7 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 2 semaines. L’ensemble des animaux sera manipulé et pesé 2 fois par semaine afin de vérifier leur bien-être à l’aide d’une grille de score (2min).
Impact sur les animaux
Les souris beta thalassémiques présentent une anémie microcytaire (taille anormalement petite des globules rouges), une poïkilocytose (déformation des globules rouges) et une réticulocytose (taux des réticulocytes dans le sang, indice de la productivité de cellules érythrocytaires de la moelle). D'après la définition de l'OMS, l’anémie est une maladie qui se caractérise par un nombre de globules rouges ou un taux d’hémoglobine des globules rouges inférieur à la normale. Les symptômes développés par le modèle murin que nous prévoyons d'impliquer dans ce projet de mise au point de nouvelles thérapies contre l'anémie ne sont que partiellement décrits mais chez l'humain, les symptômes courants sont : fatigue, vertiges, extrémités froides, maux de tête, essoufflement à l'effort. Les prélèvements sanguins, la biopsie de queue (douleur légère de courte durée), l’administration du traitement à évaluer et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. L'ensemble des manipulations, dont l'imagerie optique, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les animaux des procédures 1, 2, 4 et 5 feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique qui nécessitera leur mise à mort. La procédure 3 a pour objectif de produire les individus impliqués dans les procédures 4 et 5.
Remplacement
L’objectif de cette étude est la manipulation thérapeutique de l'expression génétique de cellules progénitrices responsables de l’hématopoièse humaine. Afin de minimiser au maximum l'utilisation d'animaux vivants, toutes nos recherches feront d'abord l'objet d'une caractérisation détaillée des LNP et des doses in vitro à l'aide de cellules cultivées. Cependant, l’analyse préclinique de l’efficacité in vivo de nanoparticules lipidiques ne peut se faire que sur des souris, modèle mammifère de β-thalassémie, elles ne peuvent pas être remplacées par un autre modèle car sur la base de critères génétiques et hématologiques, les souris homozygotes pour l'allèle mutant représentent le premier modèle animal de bêta-thalassémie.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis (calcul basé sur un test d’effectif) pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir la caractérisation de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules lipidiques ciblant la moelle osseuse dans le contexte pathologique d’une β-thalassémie. Dès que possible, nous utiliserons l’imagerie optique par bioluminescence qui est une méthode non invasive qui permet de caractériser la cinétique de biodistribution d’agents thérapeutiques sans nécessiter la mise à mort de l’animal. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests de student adaptés à la comparaison de moyennes de 2 groupes non pairés.
Raffinement
L'hébergement des animaux est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de domes en carton et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. De plus, l’ensemble des administrations de nanoparticules lipidiques et d'imagerie sera réalisé sous anesthésie gazeuse (Vetflurane 3%).
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie hématologique. Les souris beta-thalassémiques choisies pour ce projet portent une délétion spontanée au locus du gène de la chaine β de l’hémoglobine (gène Hbb) caractérisée par une β-thalassémie, anémie microcytaire (taille anormalement petite des globules rouges). Sur la base de critères génétiques et hématologiques, ces souris représentent le premier modèle animal de bêta-thalassémie extrapolable à l’Homme. Hors procédure d’élevage, les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 10-12 semaines, âge auquel les souris présentent une anémie.
Renforcer l’immunité innée dans les poumons des porcs pour lutter contre la grippe porcine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
23 porcelets âgés de quatre semaines vont être utilisés, 15 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 8 un niveau modéré, tous tués pour des lavages broncho-alvéolaires et des prélèvements de poumons. Ils subissent une intubation pour une administration intratrachéale sous anesthésie, une nébulisation, jusqu'à quatre prises de sang et quatre écouvillons sous sédation, et une inoculation du virus de la grippe porcine qui provoque fièvre, toux et écoulement nasal. Le porteur décrit l'infection grippale du porc comme "pas très grave" et prévoit un renforcement positif à base de fraises tagada ou de pop-corn. Les bénéfices annoncés visent d'abord la filière, avec une production de viande qualifiée de "responsable, durable et rentable", la protection de la santé humaine venant ensuite.
Objectifs
La filière porcine est confrontée à un nombre croissant de défis, dans la perspective d'une production alimentaire durable et sûre. La lutte contre la grippe porcine est très difficile car les vaccins contre la grippe ne parviennent pas à conférer une immunité protectrice. La stimulation par la flagelline, un agoniste spécifique du système immunitaire inné respiratoire, est apparue comme une stratégie alternative pour favoriser la résistance aux maladies. Nous avons précédemment montré que l'administration de flagelline par voie systémique stimule les défenses immunitaires innées antibactériennes et antivirales de l'hôte dans les voies respiratoires. De plus, nous avons montré un effet protecteur de la flagelline dans un modèle d'infection de la grippe chez la souris, ce qui suggère que la flagelline pourrait également être efficace contre la grippe chez le porc. Cet effet bénéfique pourrait être attribué à son activité pro-inflammatoire et à un effet positif sur la maturation des cellules immunitaires résidentes. Nous proposons une approche de biologie systémique dans laquelle nous combinerons plusieurs nouvelles techniques (séquençage, imagerie confocale...) pour déchiffrer la complexité des réponses du porc aux infections par la grippe et les mécanismes de protection induits par la flagelline. Nous apporterons d'abord la preuve de concept que l'administration de flagelline protège contre la grippe porcine. Ensuite, nous identifierons les déterminants génétiques impliqués dans la réponse de l'hôte à la grippe et responsables de l’effet de la flagelline, et nous utiliserons des approches de machine learning pour produire un algorithme prédisant la susceptibilité des cellules à l'infection. Cette approche servira à développer des thérapies plus sûres et plus efficaces pour combattre la grippe porcine. Les résultats seront partagés avec les acteurs industriels pour assurer un transfert efficace.
Bénéfices attendus
Notre projet utilise une nouvelle stratégie pour stimuler le système immunitaire des porcs afin de lutter contre la grippe porcine. Cela répond aux besoins de la société en terme d'avoir une production de viande responsable, durable et rentable. Nous allons: • Montrer que la flagelline peut protéger les porcs contre la grippe porcine. • Étudier comment la grippe porcine affecte les cellules des poumons des porcs et comment la flagelline peut aider à renforcer leur immunité. • Trouver de nouvelles façons de combattre la grippe porcine en identifiant des voies moléculaires qui pourraient être ciblées par de nouveaux médicaments. • Développer des outils informatiques pour mieux comprendre comment les porcs réagissent à la grippe porcine et pour prédire leur susceptibilité à l'infection. Cette approche permettra de mieux prévenir la propagation de la grippe porcine et d'améliorer la santé des porcs, ce qui est important pour une production de viande durable et responsable. De plus, il est important de noter que la grippe porcine est une maladie zoonotique, ce qui signifie qu'elle peut se transmettre des animaux aux humains. En étudiant la grippe porcine et en développant de nouvelles méthodes pour la combattre, nous serons mieux préparés à faire face à une éventuelle vague de grippe porcine. Cela peut aider à prévenir une épidémie et à protéger la santé publique. En fin de compte, en améliorant la santé des porcs, nous améliorons également la santé des humains.
Procédures
Pendant la première expérimentation, nous utiliserons 8 animaux qui subiront : 2 prélèvements sanguins, sur animaux vigiles sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 1 Nébulisation sur animaux anesthésiés, 30 minutes. Dans la deuxième expérience, nous utiliserons un total de 15 animaux qui subiront : Une intubation pour réaliser une administration en intratrachéale sur animaux anesthésiés puis une nébulisation 1 heure après, 1h30 ; 4 prélèvements sanguins sur animaux sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 4 Ecouvillons sur animaux sédatés, 2 min.
Impact sur les animaux
Des expériences antérieures suggèrent que les animaux peuvent avoir une légère baisse de température après avoir récupéré de l'anesthésie et de la nébulisation de flagelline. Pour les animaux inoculés avec de la grippe ; on s'attend à ce que les animaux développent de la fièvre (mais pas trop sévère) pendant quelques jours, elle peut persister jusqu'à la fin de l'expérience (3 jours). Les symptômes typiques de la grippe porcine sont de la fièvre, de la toux, de l'écoulement nasal et des éternuements.
Devenir
Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés pour réaliser des lavages broncho-alvéolaires et différents prélèvements des poumons.
Remplacement
L'étude de l'effet de la flagelline comme thérapie dans le cas d’une infection grippale ne peut être effectuée en utilisant uniquement des lignées cellulaires in vitro. La réponse immunitaire présente un comportement complexe et dynamique qui dépend non seulement de la réponse des cellules épithéliales des voies aériennes, mais aussi de son interaction avec un grand nombre de cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, cellules T ...). En outre, la clairance de l'agent pathogène dans les voies aériennes dépend de cette réponse immunitaire, mais aussi du transport mucociliaire. Cette complexité rend presque impossible d'imiter la réponse à la flagelline in vitro. Pour ces raisons, l’utilisation des lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire la complexité de la réponse immunitaire in vivo qu’implique une interaction entre différents types de cellules.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum d'animaux qui peut nous donner un résultat scientifiquement valable. Pour la première expérimentation qui implique l'étude de l'effet pro-inflammatoire de la flagelline dans les poumons, nous utiliserons 4 porcs pour le groupe traité et 4 porcs pour le groupe de contrôle. Bien que le nombre d'animaux ne soit pas très élevé pour montrer l'effet de la flagelline, nous utiliserons une technologie qui peut être utilisée pour étudier la réponse immunitaire des cellules des voies respiratoires des porcs à l'infection par la grippe, en analysant l'expression de gènes dans chaque cellule individuelle. Cette technique permet de recueillir une grande quantité de données à partir d'un seul porc, ce qui peut réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour la deuxième expérimentation, des expériences précédentes réalisées chez les souris ont montré que 6 animaux par groupe expérimental suffisent pour observer un effet significatif de la flagelline sur la charge virale. Pour cette raison, nous utiliserons 6 porcs par groupe.
Raffinement
Des expériences et des publications antérieures utilisant des modèles expérimentaux porcins d'infection grippale montrent que l'infection grippale chez le porc n'est pas très grave. On s'attend à une légère hyperthermie quipeut être ou non associée à une toux et à des éternuements. La stimulation de la flagelline provoque une réaction inflammatoire transitoire dans les poumons (moins de 24 heures). Les porcelets seront sédatés ou sous anesthésie pour tous les actes techniques ; sous la supervision de personnel qualifié et formé. Les 8 animaux de la première expérimentation seront hébergés en groupe de 4 dans une cage de 2 m². Les 12 animaux de la seconde seront hébergés en groupe de 6 dans une cage de 4 m². Ils seront hébergés en groupe tout au long des 2 procédures. Dans chaque cage, il y aura un ballon, un nunchaku ou/et chaînes. Ils auront accès à la nourriture à volonté. Les 3 porcs témoins seront hébergés ensemble également. Une semaine d’acclimatation est prévue dans chaque expérimentation pour que les porcelets s’habituent à leur nouvel environnement. Un renforcement positif sera mis en place avec des fraises tagada ou du pop-corn. Toutes les prises de sang et écouvillons seront réalisés sur animaux sédatés.
Choix des espèces
La grippe porcine est un pathogène du porc, ce qui fait du porc l'espèce animale la plus pertinente. D'autres modèles animaux existent, comme les souris, mais pourraient produire des réponses immunitaires différentes. Les porcs seront âgés de 4 semaines à l’arrivée. A ce stade, les animaux pèsent entre 8 à 10 kg, ce qui facilite la manipulation et les anesthésies.
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 1000
Produits sur place, dans une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat, 20 000 souris et 1 000 rats âgés de 7 à 21 jours vont être identifiés et génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né reçoit un tatouage digital ou une puce sous-cutanée, puis l'extrémité de sa queue est amputée, sans anesthésie ni analgésie locale, le porteur indiquant qu'un produit appliqué au bout de la queue serait léché par la mère. Hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère et modification du comportement liée à la douleur figurent parmi les effets indésirables reconnus, présentés comme très rares. Les animaux au génotype recherché partent en expérimentation ou en reproduction, les autres sont réorientés vers d'autres projets ou vers la formation, et ceux qui ne trouvent aucun emploi sont tués.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans notre Etablissement Utilisateur, le génotypage permettant d'identifier les animaux porteurs d'une modification génétique d'intérêt. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital ou en l’implantation d’une puce d’identification, suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal âgé de 7 à 21 jours. Cette demande d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Cette demande couvre environ une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt, à la fois pour l'élevage, la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d'organes ou de tissus pour études ex vivo. L’identification par tatouage/pucage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux identifiés et génotypés sont soumis 1) à l'implantation en sous-cutané d'une puce ou en un tatouage digital ) 2) à une bisopsie du bout de la queue. L'implantattion d'une puce est réalisée une seule fois et le geste dure une dizaine de seconde. Le tatouage est réalisé une seule fois et la contention dure de 30sec à 1 min. La bisopsie de queue est réalisée une unique fois et dure 5sec.
Impact sur les animaux
le tatouage ou l'implantation d'une puce d'identification et la biopsie de queue peuvent entraîner une légère douleur. La contention de l'animal durant ces gestes peut être source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère, modification du comportement liée à la douleur.
Devenir
Les animaux ayant un génotype d'intérêt partirons en expérimentation ou seront utilisés pour perpétrer l'élevage. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt scientifique seront utilisés dès que possible dans d'autres projets ou pour formation. Les animaux ne pouvant être utilisés dans les projets, les formations ou l'élevage seront euthanasiés.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base de salive ou de poils ne permettent pas de procéder à l'identification d'animaux génétiquement modifiés de façon fiable. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements. Une erreur se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; la naissance d’animaux non viables ; l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages/puçage et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’Etablissement et l'équipe de zootechnie établissent les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’Etablissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’Etablissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Sur nouveau-nés pas de médication envisagée car tout anesthésique local serait difficilement applicable au bout de la queue et serait ensuite léché par la mère, ce qui engendrerait des effets indésirables. Dans la balance bénéfice risque, ce sont les gestes maitrisés et les instruments appropriés qui sont garant du raffinement de la procédure pour limiter toute douleur, souffrance et stress. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions misent en place n'ont pas les résultats escomptés, l'équipe de zootechnie prends la décision sans délai de mise à mort d'un animal. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée avec eau et nourriture ad libitum, dans des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Ils sont hébergés en groupe sociaux avec un enrichissement adapté pour reproduire les comportements naturels (tunnel/dômes pour se refugier, pelote de bois pour la nidification, bâtons à ronger) et leur bien-être est évalué quotidiennement par des personnels formés et compétents.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le modèle rongeur. La souris et le rat représentent une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux du rongeur permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus à l’espèce humaine. Par ailleurs, les rongeurs peuvent être manipulés génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Les rongeurs sont donc des animaux sur lesquels les évaluations comportementales dans le domaine des neurosciences sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille dont l'élevage est facilement réalisable et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l'animalerie de l'unité. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 21 jours, âge où les gestes sont réalisés plus facilement et plus rapidement car la contention est plus facile. La biopsie est également plus aisée à cet âge et moins douloureuse car le cartilage n'est pas encore complètement formé. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.
Maintien de deux lignées Gallus sélectionnées de façon divergente sur la « consommation résiduelle », un caractère représentatif de l’efficience alimentaire
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Élevées en groupe dès l'éclosion, mises en reproduction à neuf mois par prélèvement de semence chez les coqs et insémination des poules, 2 394 poules et coqs subissent une à deux prises de sang dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement au sinus occipital peut provoquer des lésions cérébrales, et l'élevage prolongé en groupe entraîne du picage et des blessures cutanées, traités par des répulsifs. Ces deux lignées, sélectionnées de façon divergente sur l'efficience alimentaire et déjà très consanguines, sont maintenues pour identifier des marqueurs utiles à l'industrie avicole. 600 individus sont réutilisés dans d'autres protocoles et 1 794 restent en élevage, les reproducteurs étant tués quand leurs descendants atteignent quinze jours.
Objectifs
Le présent projet vise à poursuivre le maintien de ces deux lignées avec un nombre suffisant de familles pour limiter au maximum l'augmentation de la consanguinité, déjà très elevée, et à continuer à caractériser leurs génome, épigénome et microbiome de manière approfondie, afin d'identifier les facteurs génétiques et non génétiques qui contribuent à l'efficience alimentaire.
Bénéfices attendus
Les lignées de poules hautes et basses représentent un modèle unique pour mieux comprendre les mécanismes génétiques et non génétiques influençant l'efficience alimentaire, un caractère très important pour l'industrie avicole. Le but final des nombreux projets en cours utilisant ces lignées est d'identifier des biomarqueurs, qu'ils soient génétiques ou non génétiques, permettant une sélection des animaux les plus efficaces, sans nécessiter de mesures individuelles de consommation. L'étude de ces lignées permet également de mieux comprendre l'impact de la sélection sur l'efficience alimentaire en ce qui concerne d'autres caractères, tels que la capacité reproductive et la réponse immunitaire, ainsi que les mécanismes d'allocation des ressources entre les différentes fonctions biologiques.
Procédures
Une à 2 prises de sang de 1 à 1.5 mL d'une durée de moins d'une minute
Impact sur les animaux
L’élevage en groupe peut entraîner des comportements agressifs. Ces comportements présentent des risques inhérents de picage entre les animaux, ce qui peut causer des blessures cutanées de gravité diverse. Les comportements de domination sont généralement plus fréquents jusqu'à ce que l'ordre social soit rétabli. Dans les élevages de longue durée comme celui-ci, une détérioration de l'état général de certains individus peut également être observée, les causes n'étant parfois déterminées qu'après une autopsie. La prise de sang peut également entraîner la formation d'un hématome, et si elle est réalisée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent survenir. Une attention particulière sera apportée lors des contentions et des manipulations des animaux que ce soit pour la réalisation des prises de sang ou les actes de reproduction, prélèvements des mâles et inséminations des femelles.
Devenir
Nous utilisons les individus pour permettre la production d'une descendance. Les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de pouvoir les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus des lignées R+ et R-(Envviron 25% des animaux sont réutiliés).
Remplacement
Ce projet vise à maintenir une population d'animaux vivants divergents sur l’effcience alimentare. La complexité du déterminisme de ce caractère nécessite une approche globale (voies métaboliques impliqués/régulation genique/control epigenetique/microbiote) et ne peut donc être abordé que par une approche sur les animaux.
Réduction
Pour conserver la variabilité génétique des lignées et gérer la consanguinité, il est nécessaire de disposer d'un nombre suffisant de familles et de procéder à des accouplements contrôlés. Les effectifs animaux mis en place au début de l'expérimentation permettent de garantir un nombre d'adultes suffisant pour maintenir la variabilité intra- et inter-lignées, tout en limitant la consanguinité et la dérive génétique. Des essais de reproduction utilisant de la semence congelée ont été menés indiquant que l'utilisation de la semence congelée ne constitue pas une stratégie de préservation viable pour ces lignées.
Raffinement
Dès l'éclosion, les animaux sont élevés en groupe tout au long de leur vie. Les cages collectives hébergeant les poules seront équipées de divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques et des bandelettes de tissu pour stimuler le jeu. Les coqs, hébergés dans des parquets au sol, bénéficieront également de divers enrichissements, comme des perchoirs et des blocs à picorer . Pour prévenir le picage, des répulsifs antipicage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision, destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite), a été développé et sera fourni aux animaliers en charge du suivi des animaux. Raffinement du prélèvement sanguin : Dans le cas de la prise de sang au niveau du sinus occipital, afin de réduire les risques de lésions cérébrales associées à cette procédure, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur l'aiguille pour éviter tout enfoncement excessif. La facilité de visualisation de ce site d'injection évitera l'arrachage douloureux des plumes pour les animaux. Une compression de 30 à 60 secondes sera effectuée pour limiter la formation d'hématomes. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour assurer une contention appropriée pendant la prise de sang, limitant ainsi les mouvements erratiques des animaux susceptibles de perturber le prélèvement. Les personnes chargées du prélèvement sanguin au sinus occipital recevront une formation spécifique à cette procédure et seront expérimentées, garantissant la fluidité des gestes. Pour la prise de sang effectuée à la veine alaire, de l'alcool à 70 % sera appliqué pour désinfecter la zone de prélèvement et profiter de ses propriétés vasodilatatrices, facilitant ainsi la ponction. De plus, un point de compression sera réalisé et deux expérimentateurs seront mobilisés.
Choix des espèces
Le projet vise à conserver les lignées qui sont un modèle de choix pour étudier les mécanismes impliqués dans l'utilisation de l'énergie ingérée chez la poule pondeuse et l'allocation des ressources entre les fonctions biologiques. La complexité du déterminisme de ce caractère nécessite une approche globale et ne peut donc être abordée que par une étude sur les animaux. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 9 mois, moment auquel ils seront mis en reproduction pour produire les poussins de la génération suivante. Lorsque leurs descendants auront 15 jours d’âge, ces reproducteurs seront euthanasiés.
Etude de l’impact d’une exposition chronique à des pesticides fréquemment détectés dans notre alimentation sur le mécanisme de cancérisation
- Recherche fondamentale
- Oncologie
288 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie profonde pour prélever un volume important de sang. Chacune reçoit une injection sous-cutanée sur animal vigile de cellules coliques humaines exposées pendant plusieurs mois à trois pesticides, puis un prélèvement dans le sinus rétro-orbital. La question posée consiste à savoir si ces cellules, déjà transformées en culture par les pesticides, forment une tumeur une fois greffées. Le porteur justifie ce passage à l'animal par le fait que ces pesticides sont commercialisés depuis trop peu de temps pour qu'une étude épidémiologique soit possible chez l'être humain.
Objectifs
Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Au cours de ces dernières années, certains facteurs environnementaux sont apparus comme une cause possible de l'augmentation de la prévalence de maladies chroniques, y compris certains cancers. In vitro nous avons observé qu’une exposition chronique de cellules non tumorales coliques pendant plusieurs mois à trois pesticides, seuls ou en cocktail provoque des changements importants et irréversibles (persistant après la levée de l’exposition). Notre objectif est de déterminer si ces altérations reflètent un mécanisme de cancérisation des cellules et si cette exposition chronique aux pesticides peut favoriser ou non le développement tumoral.
Bénéfices attendus
L’objectif est de déterminer si l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales à trois pesticides fréquemment détectés dans notre alimentation favorise ou non le développement tumoral. La mise sur le marché de ces composés est en effet encore trop récente pour permettre de mener des études épidémiologiques chez l’homme et estimer le risque que peut représenter une exposition chronique à ces composés sur la santé humaine. L’étude permettra également de valider des biomarqueurs tumoraux sanguins destinés, à terme, à améliorer le diagnostic et suivi des patients atteints de cancers
Procédures
La procédure implique au maximum une injection sous-cutanée sur animal vigile en début d’expérience (moins d'1 minute) et un prélèvement sanguin sur animal anesthésié en cours d’expérience (1-2 minutes maximum).
Impact sur les animaux
On peut s’attendre à une légère douleur de courte durée lors des injections de cellules chez l’animal vigile. On peut également s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables majeurs sauf peut-être de très rares cas de détérioration de l’état général des animaux (perte de poids, par exemple) ou de nécrose de la tumeur. Un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital au cours du suivi du développement tumoral chez l’animal anesthésié ne devrait pas non plus occasionner de nuisance particulière, si ce n’est peut-être une légère douleur ou inconfort au réveil.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde (sans réveil) et sous analgésie pour permettre le prélèvement d’un volume de sang important.
Remplacement
Nos résultats in vitro démontrent que l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales aux pesticides provoque des changements morphologiques importants et irréversibles. La question que nous posons est de savoir si ces cellules ont acquis la capacité de développer une tumeur, une question qui ne peut être résolue qu’in vivo, dans un microenvironnement complexe. Il n’y a, en effet, pas de systèmes alternatifs pour évaluer de façon fiable le processus d’initiation tumorale.
Réduction
Pour tester l’hypothèse selon laquelle l’exposition aux pesticides in vitro pourrait conférer à nos cellules une capacité à former des tumeurs lorsqu’elles sont xenogreffées chez la souris nude, nous avons évalué, à l’aide du logiciel G-Power, le nombre minimum requis de souris par groupe à 8 pour obtenir des données statistiquement valides.
Raffinement
La procédure a été optimisée au cours d’études similaires précédentes, dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés afin de détecter le moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions (injection d’analgésique et si nécessaire, euthanasie).
Choix des espèces
La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie sont nombreuses, bien documentées et bien validées. En particulier, les modèles de souris immunodéprimées sont idéaux pour la recherche sur les greffes de cellules cancéreuses et sont classiquement utilisés pour analyser la réponse tumorale. Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris agées de 6 semaines seront réparties de manière homogène entre les lots à raison de 8 souris/lot. Les souris adultes offrent en effet un modèle expérimental plus robuste, stable et pertinent pour les études de xénogreffe tumorale (plus grande facilité de manipulation, meilleure tolérance des procédures, croissance tumorale plus prévisible et plus uniforme, pertinence par rapport à la tumorigenèse humaine qui est plus fréquente chez les adultes).
Rôle des basophiles dans la cicatrisation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 5 âgées de 75 à 85 semaines, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs oreilles. Chaque animal reçoit sous anesthésie une blessure à l'emporte-pièce dans l'oreille, dont la cicatrisation est suivie jusqu'à 21 jours, certains subissant en plus trois injections intrapéritonéales puis une saignée partielle avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le projet cherche à établir le rôle de cellules immunitaires appelées basophiles dans la réparation de la peau, avec l'espoir lointain de traiter des plaies chroniques. Pour arriver à cinquante individus, le porteur compte chaque oreille comme un "individu unique" et divise ainsi par deux l'effectif déclaré.
Objectifs
Une mauvaise cicatrisation de la peau accroit les risques d’infection et de formation excessive de tissu cicatriciel. Ce problème est fréquent chez les personnes âgées. Il y a un réel besoin de comprendre comment les tissus et le système immunitaire interagissent pour contrôler les différentes étapes de la cicatrisation. La cicatrisation est contrôlée en partie par des cellules immunitaires résidentes de la peau : les macrophages. Normalement, ces macrophages réparent les tissus et les nettoient de leurs cellules mortes : ils sont appelés «M2». Lors d’une blessure, ils perdent ce statut et deviennent inflammatoires : ils sécrètent des molécules qui tuent les microbes mais qui occasionnent également des dommages collatéraux au tissu environnant. Une bonne réparation du tissu nécessite donc que les macrophages redeviennent «M2». Les basophiles sont des cellules immunitaires sanguines capables de sécréter des molécules favorisant la transformation des macrophages de la peau en macrophages M2. Des expériences préliminaires nous ont permis d’observer que des basophiles infiltraient la peau pendant les 3 premières semaines du processus de cicatrisation. Cela nous laisse penser que les basophiles ont un rôle à jouer dans la cicatrisation. Le but de ce projet est de déterminer les conséquences de la sécrétion de molécules pro-«M2» par les basophiles sur les macrophages au cours des différentes phases de la cicatrisation. Pour ce faire nous allons déléter spécifiquement les basophiles ou les molécules qu’ils sécrètent in vivo sur des souris adultes ou âgées, et observer l’évolution de la cicatrisation, de l’inflammation cutanée, et de l’activation des leucocytes de la peau. Cela permettra d’affiner notre connaissance du contrôle qu’exerce le système immunitaire sur la cicatrisation, et ainsi de mieux comprendre pourquoi la cicatrisation peut être défectueuse afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour faciliter la cicatrisation de personnes âgées.
Bénéfices attendus
La finalisation de ce projet nous permettra de démontrer formellement que les basophiles favorisent la résolution de l’inflammation et la cicatrisation de la peau dans un contexte sain mais également dans le cadre du vieillissement. Ces avancées fondamentales pourront permettre d’imaginer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la cicatrisation des plaies chroniques, qui sont un enjeu clinique majeur du 21eme siècle.
Procédures
Les animaux seront bléssés aux oreilles par un punch stérile sous anesthésie générale. La cicatrisation de leur blessure sera ensuite observée pendant de 1 à 21 jours. Certains animaux subieront trois injections péritonéales . De plus, parmi ces animaux, certains subieront une injection intravasculaire sous anesthésie, en présence d'un collyre antalgique, avant de subir une exsanguination partielle et d’être sacrifiés par dislocation cervicale toujour sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Des expériences précédentes nous ont permis d’observer que les biopsies d’oreilles ne s’infectaient quasiment jamais et n’induisaient pas de phénotype dommageable. Nous n’avons pas observé non plus de signes de démangeaisons et pensons qu’il s’agit du modèle le moins invasif possible pour étudier la cicatrisation de la peau chez la souris. Cependant, il existe un risque très rare que les oreilles des souris développent une légère infection au niveau de la blessure, qui semble associée à des combats ou des grattages importants. Notre expérience d’injection intrapéritonéale de toxine diphtérique chez la souris nous a montré qu’aux doses utilisées il n’y avait aucun effet détectable sur la santé ou le comportement des souris. L’injection intraveineuse pour le marquage intravasculaire est très bien décrit, nous l’avons déjà utilisé sans que cela n’ait entrainé un phénotype détectable chez les animaux. Il s’agit d’une procédure sous anesthésie sans réveil.
Devenir
Les analyses prévues nécessitent la mise à mort des animaux pour leur prélever leur sang et/ou leurs oreilles.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer ces animaux pour étudier le rôle des basophiles dans la cicatrisation cutanée. Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. De plus les basophiles sont des cellules circulant dans le sang. Il est donc impossible de remplacer l'étude la cicatrisation in vivo par l'étude de la cicatrisation d'explants de peau.
Réduction
L’étude de la cicatrisation au niveau de l’oreille nous permet de considérer chaque oreille comme un « individu unique » afin de diviser par deux le nombre d'animaux nécessaires. Une analyse de la puissance statistique nous apprend que la comparaison de groupes de quatre oreilles peut nous permettre d'observer une variation moyenne de 50% avec une puissance de 84%. Répéter chaque expérience une deuxième fois nous permettra de confirmer nos observations, de regrouper nos résultats et d’observer une variation moyenne de 30% avec une puissance de 80%, ce qui semble suffisant pour représenter un effet biologique concret. Il est nécessaire de rajouter une marge de 10% sur le nombre d’échantillons afin d’éviter toute place du hasard dans notre évaluation statistique. Ainsi il apparait que l’utilisation de groupes de 10 oreilles soit 5 individus serait optimale pour étudier nos variables d’intérêt. Nous estimons que cette analyse est également valable pour les individues agés.
Raffinement
Nous pouvons étudier la cicatrisation en réalisant une biopsie stérile de 2mm de diamètre sur l’oreille des souris. Cette procédure légère est couramment utilisée pour identifier les animaux en animalerie, ou pour faire des microprélèvements de peau humaine. Dans le but d’éviter de générer toute forme de douleur, cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale. La cicatrisation (inflammation, réépithélialisation, revascularisation, fibrose), le recrutement et le profil des basophiles et des macrophages et leur sécrétion de molécules peuvent être facilement observés par différentes techniques. Des modèles de souris modifiées au niveau des basophiles (déficientes ou dont les basophiles ne peuvent exprimer certains facteurs) permettront d’apporter des réponses précises à nos hypothèses en évitant d’utiliser des méthodes invasives. Les prélèvements de sang se feront uniquement post-mortem, avant de prélever d’autres organes. Nous étudierons l’influence des basophiles sur les 3 premières semaines de cicatrisation de la peau. Les interventions expérimentales sur animaux vivants se limiteront à l’administration quotidienne (orale ou intrapéritonéale) de traitements connus à des doses inoffensives, pour au maximum quatre jours consécutifs. Le bien-être de tous les individus sera relevé quotidiennement pendant ces traitements à l’aide d’une grille d’évaluation incluant une mesure de poids, l’observation de la posture (prostration, poil hérissé) du comportement et de l’évolution de la plaie. Ces différentes observations nous permettrons de déterminer le point-limite entrainant l’arrêt des expérimentations pour les individus concernés. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, et leurs organes analysés. Aucun traitement induisant la mort ou une souffrance soutenue de l’animal n’est prévu dans le présent projet. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Ils sont élevés en conditions standardisées en accord avec la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons de nidification ou tunnels en plastique) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Même si aucune des procédures ne doit induire de souffrance/mal-être manifeste de l’animal, en cas d’observation de tels signes les animaux concernés seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’utiliser des modèles animaux génétiquement modifiés qui nous permettent d’étudier le rôle du basophile in vivo. Ceux-ci n’existent qu’en modèle murin. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines (45 individus). 5 animaux seront utilisés âgés car l’intérêt de l’étude et d’observer le rôle des basophiles dans le défaut de cicatrisation associé au vieillissement (de 75 à 85 semaines).