Recherche fondamentale

Les souris de ce projet développent une maladie auto-immune, spontanément pour certaines lignées ou après induction, avec perte de poids, gonflement des ganglions et inflammation de la peau ou des articulations. 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leur sang et leurs organes. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant huit à douze semaines, une irradiation du corps entier sur animal vigile, et jusqu'à sept prélèvements sanguins mensuels. Les anticorps testés disposent déjà d'une autorisation de mise sur le marché chez l'être humain contre certains cancers du sang, ce qui permet au porteur d'annoncer une translation "extrêmement rapide" tout en qualifiant ces données murines d'"incontournables".

Objectifs

Les maladies auto-immunes (MAI) systémiques sont des maladies rares caractérisées par l’attaque du système immunitaire sur son hôte, responsable de douleurs et de lésion d’organe altérant significativement la qualité de vie des malades. Les traitements actuels reposent sur des immunosuppresseurs qui permettent d’améliorer les symptômes sans toutefois assurer de guérison, au prix d’une augmentation du risque infectieux et de maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral). De nouveaux traitements pourraient révolutionner la prise en charge des MAI. Parmis eux, de nouvelle thérapie permettant cibler les cellules responsables de la production d’anticorps pathogènes sont particulièrement interessantes. Il s’agit d’approches utilisant thérapie cellulaire par reprogrammation des globules blanc . Ces approchent semblent efficaces dans plusieurs maladies auto-immunes chez la souris et chez l’homme. Toutefois, il s’agit d’une technique couteuse, difficile à mettre en place, et qui pourrait être responsable de complications graves à long terme (cancer du sang). Ainsi, les anticorps thérapeutiques pourraient remplacer les CAR-T cells mais leur efficacité dans les maladies auto-immune n’a pas été étudiée. En outre, des traitements ciblant les interactions entre les plaquettes sanguines et cellules immunitaires, pourraient améliorer les symptômes tout en diminuant le risque cardiovasculaire et sans favoriser les infections. Ainsi, ces nouvelles thérapies pourraient répondre à des besoins urgents dans la prise en charge des patients atteints de maladie auto-immunes. Objectif global : identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies auto-immunes (MAI).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’apporter des données pré-cliniques solides visant à promouvoir l’utilisation de nouvelles thérapies à anticorps chez les patients atteints de maladies auto-immunes systémique sévère. Ces traitements ont déjà une Autorisation de Mise sur le Marché chez l’Homme dans d’autres maladies (pour traiter certains cancers du sang). De ce fait, si ce projet est concluant, la translation des résultats (évaluation de ces traitements) chez l’Homme pourra être extremement rapide, avec un bénéfice attendu majeur chez les patients atteints de maladie auto-immunes.

Procédures

→ Deux injections sous anesthésie, Durée de deux fois cinq minute comprenant l’anesthésie ou deux injections par semaine pendant 8 à 12 semaine durant 1 minute chacune → Une irradiation corps entier chez un animal vigile pour une durée de moins de trois minutes. → Un prélèvements sanguin sous anesthésie générale une fois pa rmois jusqu’à la fin de l’expérimentation (7 prélèvements maximum).

Impact sur les animaux

Le projet utilise des modèles souris spontanés ou induits caractérisés par le développement progressif d’une maladie autoimmune, responsable d’une perte de poids et d’un développement de ganglions. Les animaux subiront : > Stress due aux manipulations de la souris. > Inflammation de la peau ou des articulations due à la maladie auto-immune. > Douleur transitoire aigue et de courte durée suite aux injections de traitement et aux prélèvements

Devenir

A la fin de l'expérimentations, les animaux seront mis à mort dans l’objectif d’étudier l’impact des traitements sur la maladie auto-immune (étude du sang et des organes).

Remplacement

Les nouvelles stratégies thérapeutiques testées ici ont déjà été testées in vitro et on démontré leur efficacité sur leur mécanisme d'action. L'objectif du projet est d'étudier l'impact de ces traitement à l'échelle de l'organisme et notamment au sein des tissus affectés par la maladie auto-immune. Ces données pré-cliniques sont les dernières à acquérir avant d'envisager un traitement de patients atteints de maladie auto-immune, elles sont donc incontournables.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été déterminée en amont. Le nombre de souris nécessaire a été calculé à l’aide d’outil mathématiques pour chaque question posée afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes et fiables.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements de leur environnement permettant d’améliorer le confort des souris (papier kraft, dome, tunnels). L’état de santé des animaux sera examiné de façon hebdomadaire. Des points limites ont été définis afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques. Les injections et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour diminuer l’inconfort. Une analgésie sera mise en place lorsque nécessaire. Les souris seront acclimatées pendant minimum 7 jours à l’utilisation pour réduire le stress des manipulations. Une habituation des animaux à leur manipulation sera faite préalablement au début de l’expérimentation.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 2 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 à 18 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent, selon la lignée étudiée).

Gavées une fois par jour pendant douze semaines, soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes et à une incision du bout de la queue pour un prélèvement de sang, 5 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet consiste à reproduire chez la souris des anomalies de comportement et de transit intestinal associées à l'autisme, en administrant des métabolites bactériens à des animaux dès l'âge de quatre semaines. Le porteur annonce des batteries de tests évaluant le comportement social, les comportements répétitifs et l'anxiété, avec des durées allant de quatre minutes trente à soixante-douze heures, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un partenaire crucial pour la santé humaine. Des études récentes montrent l’existence d’un axe de communication microbiote-intestin-cerveau par lequel le microbiote peut influencer le comportement. L'autisme, avec une prévalence de 1% s'accompagne de troubles comportementaux (déficits d'intéraction sociale, stéréotypies) et de comorbidités (anxiété, dépression, hyperactivité). Aussi les patients autistes ont fréquemment des symptômes gastro-intestinaux (constipation, diarrhée, douleurs abdominales, ballonnements) associés à des altérations des abondances de certaines bactéries de leur microbiote intestinal et des petites molécules qu’elles produisent, les métabolites microbiens. Ces anomalies sont aussi reproduites dans des modèles souris d’autisme. Les causes de l’autisme sont encore méconnues, mais des dérégulations de l’axe cerveau-intestin-microbiote semblent y jouer un rôle. Cela suggère que des thérapies ciblant les bactéries du microbiote ou bien les métabolites qu’elles produisent pourraient être bénéfiques, comme par exemple le transfert de microbiote, les probiotiques et les prébiotiques. Leur efficacité reste cependant à démontrer. Des métabolites issus de la dégradation de l’alimentation par les bactéries du microbiote présentent des niveaux anormalement élevés ou bas dans l'urine, le plasma et les selles de patients autistes. Les bactéries productrices et consommatrices de ces métabolites sont aussi fréquemment dérégulées chez les patients autistes. Dans ce projet de recherche, nous allons identifier parmi ces métabolites microbiens et ces bactéries ceux et celles capables d'induire chez la souris des anomalies comportementales et/ou gastro-intestinales. Aussi, nous identifierons leur mode d'action en utilisant des approches pharmacologiques. Également, nous identifierons des métabolites et des traitements probiotiques capables de restaurer les anomalies du comportement et les troubles gastro-intestinaux dans des modèles d’autisme. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension de l’autisme et à de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un intérêt translationnel car l'étude apportera des connaissances sur les mécanismes physiologiques et neurobiologiques fondamentaux responsables des troubles du spectre de l’autisme et de l’implication du microbiote intestinal. Ce projet permettra de faire avancer les connaissances sur l'étiologie de l'autisme et pourra contribuer à valider pré cliniquement dans des modèles animaux des stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote pour les troubles du spectre de l'autisme.

Procédures

• Identification par injection sous-cutanée de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement de sang de 100µL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 12 semaines en fonction de la procédure. • Injections intrapéritonéales : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 10 jours en fonction de la procédure. • Anesthésie à l’isoflurane et imagerie sur animal anesthésié : durée 10 min ; fréquence 5 fois sur 48h en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Ce projet obéit à la règle des 3R. Cependant, certains des traitements proposés pourraient impacter le métabolisme, le comportement et\ou la physiologie intestinale des groupes d’animaux traités par rapport aux groupes témoins. Pour détecter ces changements, un suivi au moins 2 fois par semaine du poids des animaux, de leur consommation en eau et nourriture permettra d’évaluer l’état physiologique global de l’animal en réponse au traitement. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée et qui n’induisent pas de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). De plus, l’inconfort sera limité à la durée du test. Concernant l’évaluation de la physiologie intestinale, les tests provoqueront un inconfort mais limité à la durée du test. Un prélèvement sanguin sera réalisé lors du test de perméabilité intestinale, cependant un volume faible de sang sera prélevé et l’inconfort sera limité au temps nécessaire au prélèvement. Dans le cas du traitement administré par voie intrapéritonéale, une attention particulière sera portée à l’état du site d’injection (gonflement, rougeur).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques, indispensable pour une meilleure comprehension des mécanismes associés à notre contexte d'étude.

Remplacement

La littérature scientifique sur notre sujet a permis de sélectionner les métabolites microbiens, les bactéries et les substances pharmacologiques les plus pertinents, ainsi que les quantités et concentrations utilisées respectant un contexte physiologique. Avant les expérimentations sur l’animal, des expériences in vitro ont été et seront réalisées sur des cultures bactériennes permettant de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Cependant, pour évaluer l'impact du traitement avec des métabolites microbiens, des probiotiques et une substance pharmacologique à l'échelle de l'organisme entier au niveau gastro-intestinal et comportemental, le recours à l'animal sera nécessaire. En effet, l’étude du comportement animal fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et des processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car ce n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.

Réduction

Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs réalisés avec un logiciel dédié ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus pertinents. Les résultats seront analysés avec un logiciel dédié. Un total de 5832 animaux est requis pour ce projet.

Raffinement

Les paramètres suivants basés sur l'expérience de l'expérimentateur seront suivis pour nous permettre d'assurer le suivi du bien-être animal : le poids corporel, l'apparence physique, des signes cliniques objectifs tel qu’un changement de température corporelle suite à une alerte sur un animal, des comportements anormaux ou non provoqués, des réponses comportementales à des stimuli spécifiques ainsi que l'état général du site d'injection et un suivi de l’aspect des fèces indiquant ou non la présence de diarrhée. Nos conditions d’élevage comprennent une stabulation par groupes d'au moins quatre animaux, un enrichissement de l'environnement (coton pour nidifier, maison), ainsi qu'un contrôle strict de la température et de l'humidité. Un suivi quotidien des animaux est également assuré par le personnel animalier et par nous même dans le cadre des expérimentations. La majorité des procédures induiront un inconfort faible et de courte durée, sans causer de dommages. Pour les procédures affectant potentiellement le bien-être des animaux, un suivi basé sur une grille de score pourra être établi et permettra de détecter toute souffrance et de décider de la suite à donner, notamment en appliquant des points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

L'autisme cause des anomalies du comportement handicapantes. Toutes ces anomalies sont modélisables chez la souris à l’aide de batteries de tests de comportement réalisables chez la jeune souris ou l’adulte. Aussi, la physiologie intestinale de la souris (perméabilité, motilité intestinale et colonique) ne peut être appréciée que chez l'animal vivant. Les études précliniques sur l'autisme imposent donc des études in vivo, chez l’animal, afin d'identifier des mécanismes difficilement modélisables in vitro et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Puisque nous nous intéressons aux conséquences neurodéveloppementales de l’exposition aux métabolites Microbiens, nous préférons travailler dans une fenêtre où le système nerveux est encore capable d’une certaine plasticité (adolescence 4 semaines). Pour les procédures 1 et 2, nous recevrons les animaux à l'âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Nous commencerons le traitement dans la 4ème semaine et évaluerons le comportement et le tractus GI après 4 semaines de traitement, soit lorsque les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Pour les procédures impliquant un traitement pour restaurer les phénotypes induits par les métabolites microbiens (procédure 3), les animaux seront suivis jusqu'à l'âge de 14-16 semaines.

Greffées d'une tumeur sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris immunodéprimées sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et les organes. Chaque animal reçoit une injection de nanoparticules puis une séance de radiothérapie, avec une imagerie sous anesthésie par semaine pendant huit semaines au maximum. L'objectif immédiat consiste à choisir un schéma de traitement en vue d'un essai clinique, essai renvoyé au futur. Le porteur écrit que la radiothérapie "ne devrait pas engendrer d'effets indésirables" et que l'imagerie est indolore, tout en reconnaissant que le modèle de souris aux défenses immunitaires réduites constitue "une nuisance en soi".

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

Les souris chez qui l'isolement en couveuse ou les soins de blessures n'améliorent rien sont tuées. 270 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur moelle épinière ou pour des enregistrements électrophysiologiques. Chacune subit, à un âge de 12 à 24 jours, une chirurgie d'une heure à une heure trente destinée à faire exprimer des virus porteurs de transgènes dans la corne dorsale de la moelle, et 120 d'entre elles reçoivent en plus trois à cinq injections d'un activateur neuronal. Le projet porte sur les troubles sensoriels de l'autisme, et le porteur annonce des tests de comportement sensitif et cognitif sans préciser lesquels, ainsi qu'un isolement des souris jusqu'à douze heures pendant ces essais.

Objectifs

Le projet vise à caractériser le rôle des neurones inhibiteurs de la moelle épinière dans le développement des troubles sensoriels qui accompagnent les troubles du spectre de l'autisme (TSA), dans le but 1) de mettre en place de nouveaux outils de diagnostic, et 2) de mettre au point et raffiner certains traitements existants.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle des réseaux spinaux inhibiteurs dans le controle de la transmission des informations mecanosensorielles. Il pourra servir de base au développement de nouvelles approches (médicamenteuses ou non) visant à corriger ou à réduire les déficits mécanosensoriels fréquemment présents chez les individus atteints de TSA. Un bénéfice annexe du projet pourrait résider dans le développement de nouveaux test diagnostics permettant de classer les troubles autistiques et préciser leur sévérité, de façon à mettre en place des stratégies thérapeutiques adaptées.

Procédures

Les animaux (270 au total) subissent une intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h00 et 1h30 visant à exprimer des virus porteurs de transgènes dans la corne dorsale de la moelle épinière. Une partie des animaux (120) reçoit en outre des injections intrapéritonéales d'une substance pharmacologique (activateur neuronal, entre 3 et 5 injections par animal) avant d'être testés pour leur comportement sensitif et cognitif

Impact sur les animaux

L'injection spinale et/ou corticale de virus requiert une opération chirurgicale. On peut donc s'attendre à observer les effets indésirables classiquement associés aux chirurgie (douleurs post-opératoires, perte de poids, déshydratation, etc). Lors des éssais comportementaux, les animaux sont transitoirement isolés les uns des autres (maximum 12h00), ce qui peut constituer une source de stress.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort. Chaque expérience se termine par la mise à mort de l'animal, soit pour collecter les tissus (moelle épinière), soit pour des observations histologiques, soit pour des enregistrements électrophysiologiques.

Remplacement

Il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode permettant de reconstituer les réseaux neuronaux à partir de cutlures cellulaires. Il n'exitse pas actuellement de modèle permattant de molèliser par des méthodes informatiques tout ou partie de la complexité des réseaux de la moelle épinière. Le projet comporte des expériences de comportement qui ne peuvent être réalisées que dans le cadre d'une expérimentation animale.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Dans la mesure du possible, les mêmes animaux sont utilisés pour l'ensemble des expériences de comportement.

Raffinement

L'ensemble des mesures suivantes sont mises en œuvre pour réduire l'inconfort des animaux i) Surveillance quotidienne assurée par des expérimentateurs formés à l'expérimentation animale et au bien-être animal. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Les critères d’évaluation de souffrance sont l’apparence/état général ainsi que le comportement de l’animal. Tout signe de souffrance, douleur, détresse constaté lors de cette observation déclenchera une réponse immédiate et adaptée (mesures conservatoires à privilégier, par exemple : isolement temporaire de l’animal, réchauffement en couveuse, soins des blessures si bagarres entre congénères). Si aucune amélioration n'est constatée après cette intervention l’expérimentateur prendra la décision d’euthanasier l’animal (si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l’équipe des zootechniciens). iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. v) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement comprenant des tubes en carton et le matériel pour la nidification.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour étudier cette maladie. + il existe une abondante littérature sur les troubles du spectre de l'autisme chez la souris + le modèle murin Fmr1 présente des symptômes voisins de ceux rencontrés dans le modèle humain de chromosome X fragile + les lignées génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris Les expériences sont réalisées sur des animaux agés de 12 à 24 jours au momment de la chirurgie, de façon à pouvoir réaliser les enregistrements sur des animaux relativement jeunes, 3 semaines plus tard, lors de la réalisation des enregistrements.

Pour mesurer si des nanoparticules inhalées par une mère abîment les poumons de sa descendance, 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Les femelles gestantes puis allaitantes reçoivent les nanoparticules directement dans la trachée sous anesthésie, une fois par semaine pendant six semaines. Leur descendance passe des mesures de fonction pulmonaire de 5 à 45 minutes, éveillée, à quatre stades de développement, de la fin de gestation à l'âge adulte. Le porteur annonce que les souriceaux grandissent normalement, tout en prévoyant qu'un comportement maternel anormal et des anomalies de développement pourraient apparaître, et une mise à mort rapide dès l'atteinte d'un point limite.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Cependant, l'utilisation exponentielle des nanoparticules (NP) suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. Le développement pulmonaire (chez l’Homme comme chez la souris) comporte une phase prénatale et une phase post-natale allant jusqu’à un mois après la naissance chez la souris. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, systeme digestif) ait été bien décrit ces dernieres années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu etudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences a l’age adulte d’expositions périnatales a ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicite des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère a la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer a l’évaluation des risques liés a des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises a des expositions pulmonaires aux nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique realisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant de 5 à 45 minutes à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

La descendance des souris femelles exposées aux nanoparticules au cours de la gestation ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à un comportement maternel anormal. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée a leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son systeme sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible a modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de reduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque celà est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, en les hébergeant a deux par cage, en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanieres de papier. Apres le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hebergées en groupes sociaux de 5 souris maximum par cage, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront realisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise a mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modele murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la litterature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère a la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réaliées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaires jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé a 4 stades : en fin de gestation (dernier tiers), a la naissance (nouveau-ne) afin d’étudier l’impact d’une exposition prénatale, au stade juvénile afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences a long terme

Une canule de fibre optique dépassant de deux millimètres au-dessus du crâne, et le toilettage excessif qui en découle : 9 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 5 040 d'entre elles subissent deux chirurgies sous anesthésie de 30 à 90 minutes puis six séances d'enregistrement de l'activité de leurs neurones, 4 160 une chirurgie puis cinq jours d'observation de leurs comportements sociaux, et 4 800 des injections intrapéritonéales ou intrathécales. L'objet du projet est le toucher affectif, la caresse légère, et les structures cérébrales qui l'intègrent. Le porteur décrit ces chirurgies comme "extrêmement bien tolérées par les animaux", et justifie la mise à mort de toutes les souris par leur modification génétique et leur infection par des virus, qui interdisent de les replacer.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en évidence les structures responsables de l’intégration du toucher affectif et de définir leurs rôles dans les comportements pro-sociaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires du toucher léger chez la souris. Il aura des répercussions dans deux domaines. En effet, le toucher léger est altéré dans des pathologies humaines (autisme, défaillances cardiovasculaires, etc), et nos données permettront l'identification de cibles pharmacologiques pour corriger ces déficits dans l'espoir de réduire les déficits de comportement social associés. D'autre part, "la stimulation tactile affective" est une approche thérapeutique utilisée dans de nombreux domaines (gestion de la douleur, de l'anxiété, du stress chronique, soins palliatifs, contact parents-enfants, troubles du sommeil, etc..) et notre travail devra permettre de raffiner ces protocoles, et/ou de proposer des approches pharmacologiques pour alléger les symptomes de ces pathologies.

Procédures

Pour les procédures 1 à 6 : Chaque animal sera soumis à deux chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (30 à 90 minutes) puis à plusieurs sessions d’enregistrement de l'activité neuronale sur animal vigile (5 fois 10 minutes puis 1 fois 20 minutes) (5040 animaux) Pour les procédures 7 à 9 : Chaque animal sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (30 à 60 minutes), puis à l’observation automatique de leurs comportements sociaux en groupe (5 jours). (4160 animaux) Supplément pour les procédures 2, 5 et 8 : injection de produits par voie intrapéritonéale (2 minutes par animaux) (2400 animaux) Supplément pour les procédures 3, 6 et 9 : injection de produits par voie intrathécale (2 minutes par animaux) (2400 animaux)

Impact sur les animaux

Les actes chirurgicaux nécessaires à ce projet sont des actes chirurgicaux similaire à ceux utilisés par de nombreuses équipes de recherche à travers le monde et extrêmement bien tolérées par les animaux. Nous prévoyons cependant que des effets indésirables liés à ces chirurgies peuvent créer un stress dut à l’opération chirurgicale, des douleurs post-opératoires (qui sont prise en charge pharmacologiquement) ainsi qu’une gêne dut à la présence d’une canule de fibre optique dépassant de 2mm au-dessus du crane. Le stress et les douleurs peuvent entrainer une légère perte de poids qui sera monitorée. La gêne occasionnée par la présence de la fibre optique peut entrainer un toilettage excessif qui sera lui aussi évalué. Nous considérons que ces effets indésirables peuvent durer 1 semaine au maximum apres la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements histologiques seront effectués sur chaque animaux pour confirmer les résultats

Remplacement

La perception du toucher est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul, en particulier sa dimension émotionnelle. Il n’existe pas de modèles in-vitro ou de modèles mathématiques permettant de modéliser la représentation du toucher pouvant mimer une émotion, en dehors des animaux de laboratoire. De plus, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris permet d'identifier et de cibler spécifiquement des mécanismes moléculaires ou cellulaires à un niveau où l’expérimentation humaine n’atteint pas ce niveau de résolution. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques

Réduction

Chez l’homme, la dimension émotionnelle du toucher est un paramètre confondant, qui rend difficile la constitution de petites cohortes homogènes. À l’inverse, les modèles animaux sont homogènes et fournissent des résultats reproductibles. Ceci permet d'établir avec précision le nombre d'animaux nécessaire à la validation des hypothèses de travail par des tests de puissance statistique. Nous exploitons au mieux nos enlevages, puisque nous étudions mâles et femelles, et que nous étudions la majorité des génotypes produits. Ce projet propose d’utiliser plusieurs approches afin d’atteindre le même objectif, mais dès les premiers résultats prémilitaires obtenus, il sera possible de juger laquelle de ces approches est la plus efficace et donc de réduire le nombre de procédures qu’au modèle le plus efficace (viral contre génétique par exemple). De meme, ce projet propose d’aller investiguer dans plusieurs régions du cerveau et il est fort possible que certaines d’entre elles ne répondent pas nos attentes et seront donc éliminées dès les premiers résultats obtenus, réduisant encore le nombre d’animaux utilisé. Les nombres d'animaux nécessaires aux différentes procédures ont été déterminés en utilisant un logiciel libre de calcul de puissance statistique en le nourrissant des données issues d'une analyse rétrospective des résultats obtenus en utilisant les mêmes techniques par notre groupe et pas d'autre groupes à travers le monde.

Raffinement

Nos procédures requièrent que tous nos animaux soient suivis dès leur naissance. Ceci permettra de s’assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie en suivant certains paramètres définis par une fiche et grille de suivi clinique au minimum trois fois par semaine (en annexe). Cette fiche de suivi permet de déceler rapidement des signes précoces d’éventuelle douleur et ou détresse (points limites). Pour aider à la prise de décision, cette fiche contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par mise à mort. Ce suivi tout au long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitué. Cela augmentera aussi la qualité et la reproductibilité des résultats, et donc in fine diminuera le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Les tests comportementaux présents dans cette saisine n’utilisent pas d’environnements considérés comme stressant ou anxiogènes et laissent une liberté d’action maximale à l’animal en le laissant choisir de lui-même d’interagir ou non avec des textures ou un congénère, tout en limitant ce temps d’expérimentation à 20 minutes par individus. Toutes les manipulations, pharmacologiques ou génétiques, ont pour but d’améliorer les relations sociales des individus et donc d’améliorer les conditions de vie des animaux, et cela, très tôt après leurs naissances. Les cages d’hébergement sont toutes enrichies avec des boules des cotons et des maisons en plexiglass rouge. Toutes les douleurs opératoires et postopératoires seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes essentielles dans la perception et l’intégration sensorielle normale et pathologique Notre projet vise à moduler différentes voies neuronales durant les étapes tardive du développement neuronal qui ont lieu apres la naissance et durant l'adolescence pour en observer les conséquences à l'état adulte. Par conséquent, nous manipulerons les animaux dès la naissance et jusqu'à l'âge adulte.