Recherche fondamentale
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Identification des ganglions lymphatiques drainants de l’épididyme murin par injection d’une solution d’antigène fluorescent sous la capsule épididymaire.
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- Système immunitaire
- Système urogénital
Ouvertes sous anesthésie gazeuse pendant dix minutes pour recevoir une injection de colorant fluorescent sous la capsule de l'épididyme, 42 souris mâles vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, toutes tuées avant tout réveil. Leurs ganglions lymphatiques sont ensuite prélevés et examinés au microscope. L'étude reste purement descriptive et vise à repérer ces ganglions, que personne n'a encore décrits, première étape avant des travaux sur les infections de l'appareil reproducteur masculin. Le porteur ne mentionne comme nuisances que le stress de contention, la piqûre de l'analgésique et une à deux minutes de stress à l'induction de l'anesthésie, sans dire un mot de l'opération elle-même.
Objectifs
Environ 15% des cas d'infertilité masculine expliqués ont une origine immunologique. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes immunitaires mis en place dans les organes reproducteurs mâles avant d'envisager des traitements adaptés. Si l'environnement testiculaire est bien décrit, celui de l'épididyme reste peu étudié. L'épididyme est pourtant l'organe essentiel de la maturation et de l'acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. Les dérèglements de l'immunité qui touchent l'épididyme ont deux causes principales : des réactions auto-immunes (réponse délétère contre les spermatozoïdes) ou des réponses inflammatoires chroniques contre des pathogènes ascendants des voies uro-génitales (essentiellement des bactéries). La réponse immune est initiée par la reconnaissance d'une partie du pathogène (appelée antigène) par des cellules spécialisées, les cellules présentatrices d'antigène (CPA). Ces CPA migrent dans les ganglions drainants de l’organe où a été détecté l’antigène et le présentent à des cellules effectrices, les lymphocytes T afin de les activer. Les lymphocytes T activés sont en retour recrutés sur le site de l’infection pour éliminer les pathogènes présents. Actuellement, aucune publication ne décrit les ganglions lymphatiques drainants de l’organe alors même qu’il est le lieu d’initiation des réponses immunitaires effectrices. Notre objectif est donc d’identifier les ganglions drainants de l’épididyme murin par l’injection d’un antigène fluorescent dans l’organe et son suivi dans différents ganglions. Une étude préliminaire a permis de mettre en avant certains ganglions qui pourraient intervenir dans le drainage d'une partie de l'épididyme. Cependant, elle nous a aussi fait suspecter un drainage multiple et différentiel selon que l'antigène se trouve dans la partie proximale (tête) ou distale (queue) de l'épididyme. Nous souhaitons donc réaliser des injections d'antigène dans ces deux compartiments indépendemment. Notre première étude a également mis en évidence que seuls les temps d’analyse les plus précoces (5 à 15 minutes post-injection) permettaient d’observer une réelle fluorescence dans certains des ganglions étudiés. Cette première étape est indispensable au bon déroulement du projet qui amènera à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans les réponses aux pathogènes du tractus uro-génital et pourrait à terme permettre une prise en charge adaptée de l’infertilité masculine.
Bénéfices attendus
L’identification des ganglions drainant l’épididyme permettra par la suite d’aller étudier la réponse immunitaire qui se met en place après infection bactérienne de l’épididyme, et en particulier les dérégulations menant à des situations pathologiques comme les épididymites responsables de nombreux cas d’infertilité masculine. Cette question intéresse particulièrement les urologues et andrologues qui sont confrontés fréquemment à des patients présentant des infertilités liées à des infections ascendantes du tractus reproducteur, et en particulier liées à des épididymites, inflammations chroniques délétères de l’épididyme.
Procédures
Les animaux subiront en vigile une seule injection sous-cutanée d'analgésique qui dure seulement quelques secondes. Ensuite, les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie gazeuse au cours de laquelle sera pratiquée une unique injection sous la capsule épididymaire. L'opération chirurgicale dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Un stress dû à la contention est attendu, couplé à la douleur de la piqûre nécessaire à l’injection d’un analgésique par voie sous-cutanée. Par la suite, un stress de courte durée est attendu lors de l’induction de l’anesthésie gazeuse (1 à 2 minutes) dans la cage d’induction.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour le prélèvement des ganglions lymphatiques proches de l’épididyme et leur analyse par microscopie.
Remplacement
Le remplacement de l'expérimentation sur animaux ne peut malheureusement pas s'appliquer dans notre étude. En effet, seul le suivi de la migration in vivo de la molécule fluorescente de l’épididyme aux ganglions drainant permettra d’identifier ces derniers.
Réduction
Plusieurs critères ont été pris en compte pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires afin d’avoir une représentation biologiquement valide des ganglions drainant l’épididyme murin, dont des travaux publiés antérieurement par diverses équipes. Il apparaît que nous aurons besoin de 42 souris pour toute l’expérimentation. Notre étude étant uniquement descriptive, elle ne nécessitera pas de tests statistiques à proprement parler, d'où le faible nombre d'animaux requis.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi (maison en plastique, rouleau en carton). Avant toute manipulation de l’animal, celui-ci recevra une injection sous-cutanée d’analgésique pour compléter l’effet de l’anesthésie gazeuse au cours de la procédure. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux en les plaçant sur des tapis chauffants pour limiter le risque d’hypothermie et l’anesthésie profonde sera validée avant le début de la chirurgie.
Choix des espèces
Si la première étape de notre projet de recherche consiste à identifier les ganglions drainants de l'épididyme murin, la suite du projet portera sur l'étude approfondie de la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection du tractus reproducteur. La majorité des études portant sur le système immunitaire se fait chez la souris, aussi notre choix du modèle murin nous permettra de renforcer nos conclusions par comparaison avec les mécanismes de réponse immunitaire établis dans d'autres organes. De plus, le modèle murin nous offre une grande disponibilité d’outils moléculaires nécessaires à nos études. Enfin, de nombreuses homologies sont connues concernant les cellules et mécanismes immunitaires entre la souris et l'homme, faisant de nos études des bases solides pour d'éventuelles applications humaines. Notre étude nécessite d’avoir des animaux ayant des organes matures et fonctionnels, donc âgés de 3 à 6 mois.
Etude des mécanismes de métastase du mélanome dans le ganglion lymphatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiées au gaz, les souris reçoivent six injections dans l'oreille en deux semaines, parfois une injection intraveineuse et une injection intradermique supplémentaire dans chaque oreille. Certaines passent ensuite une à deux séances de bioluminescence par semaine, chacune sous vingt minutes d'anesthésie avec injection intrapéritonéale. 1 125 souris vont être utilisées, 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 005 un niveau léger, pour suivre la façon dont un mélanome de la peau prépare le ganglion lymphatique à recevoir ses métastases. Le porteur prévoit une possible gêne à la déglutition quand les métastases se développent dans les ganglions du cou, une gêne respiratoire quand elles gagnent les poumons, et la mise à mort de toutes les souris pour analyser ces organes.
Objectifs
Le mélanome est un cancer de la peau très agressif dont l’incidence est en augmentation en France. La moitié des patients atteints de mélanomes métastatiques sont en échec thérapeutique et nécessitent de nouveaux traitements. Les premières métastases apparaissent en général dans le ganglion lymphatique avant de se disséminer vers les organes vitaux. Le ganglion sain est un tissu immunitaire qui n’est normalement pas propice au développement tumoral. Notre projet consiste à mieux comprendre (1) comment les facteurs sécrétés par le mélanome cutané modifient à distance le ganglion pour en faire un environnement favorable au développement métastatique du mélanome, et (2) comment le microenvironnement du ganglion influence la capacité du mélanome à métastaser dans les organes secondaires. Dans ce but, nous voulons caractériser les modifications des cellules immunitaires et des fibroblastes dans des ganglions reprogrammés par les facteurs sécrétés par mélanome et étudier le potentiel métastatique dans le poumon de cellules de mélanome adaptées au microenvironnement ganglionnaire. A terme, notre projet vise à identifier des marqueurs métastatiques précoces et de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de cibler le dialogue entre les cellules tumorales et le microenvironnement de la niche ganglionnaire pour détecter précocement les rechutes des patients, voire et éviter les rechutes des patients.
Bénéfices attendus
Nos recherches visent à caractériser le rôle joué par les facteurs sécrétés par le mélanome cutané dans la mise en place d’un microenvironnement pré-métastatique inflammatoire et immunodéprimé favorable à l’invasion, la survie et la prolifération des cellules de mélanome métastatiques dans le ganglion. Nos travaux permettront de mieux comprendre les processus précoces d’établissement de la niche métastatique dans le ganglion, et notamment l’implication du dialogue entre les cellules tumorales, les fibroblastes et les lymphocytes T dans les étapes précoces de métastase du mélanome. A terme, nos travaux visent à identifier des biomarqueurs ganglionnaires ou de potentielles cibles thérapeutiques dans le dialogue entre le mélanome, les fibroblastes et les lymphocytes T, pour potentialiser l’effet des immunothérapies actuelles dans le mélanome, mais également dans d’autres cancers qui métastasent vers le ganglion lymphatique, comme le cancer du sein ou de la prostate.
Procédures
Les animaux seront soumis à 6 injections intradermiques par oreille en 2 semaines. Selon les lots d'animaux, pourront s'ajouter 1 injection intraveineuse et/ou 1 injection intradermique dans chaque oreille. Les injections durent quelques secondes et sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Certains animaux seront ensuite suivis par Bioluminescence 1 à 2 fois par semaine. Cette procédure comprend une anesthésie gazeuse de 20 min et une injection intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Possibilité de douleur minime et d'inflammation au niveau des sites d'injection au réveil de l'anesthésie. Possibilité de gène à la déglutition suite au développement de métastases dans les ganglions du cou. Possibilité de gène respiratoire suite au développement de métastases pulmonaires.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour analyser les organes (ganglions lymphatiques ou poumons).
Remplacement
Dans un souci de remplacement, nous avons débuté nos recherches par des expériences in vitro pour identifier l'impact de la co-culture de cellules de ganglions lymphatiques humains sur les cellules de mélanome et les cellules immunitaires. Les résultats très prometteurs que nous avons obtenus doivent maintenant être validés chez les animaux. En effet, l'étude de la mise en place de la niche pré-métastatique avec le dialogue à distance entre plusieurs organes (tumeur cutanée et ganglion lymphatique) et l'étude de la modification de la réponse immunitaire systémique n'est à ce jour pas compatible avec des approches in vitro et nécessite une validation chez l'animal.
Réduction
Nous avons utilisé la méthode statistique de référence pour déterminer les effectifs de nos groupes d'animaux de façon à Réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la fiabilité de nos conclusions. Notre expertise et des recherches bibliographiques nous ont permis de déterminer le nombre adéquat de cellules injectées pour obtenir une réponse chez l’animal, permettant de réduire le nombre de lots nécessaires à la réalisation du projet. Nous utiliserons également l'imagerie non invasive par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal des animaux pendant la durée des expérimentations, au lieu de multiples lots d'animaux à différents temps. Les ganglions lymphatiques ou les poumons seront systématiquement prélevés et analysés à la fin des expériences pour valoriser chaque expérience de façon optimale.
Raffinement
Pour limiter le stress, les expérimentateurs manipulent les animaux par préhension au creux de la main. Les injections (intradermiques, intrapéritonéales ou intraveineuses) sont faites sur des animaux sous anesthésie gazeuse, ce qui leur permet de ne pas stresser, tout en retrouvant toutes leurs facultés en quelques minutes. L'injection dans l'oreille est un geste très technique, mais bien maîtrisé, qui est moins invalidant pour les animaux que les injections plus classiques dans le coussinet de la patte (analyse du ganglion poplité drainant). Les animaux n'ont pas de difficulté de déplacement. La croissance des métastases dans les ganglions ou les poumons est suivie par des techniques d'imagerie non invasives, ce qui permet de détecter très précocément les métastases et de les limiter à un stade précoce. Les points limites prévus sont précoces et prédictifs. Ils sont associés à des actions correctives permettant d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, qui est systématiquement utilisée dans les études précliniques visant à étudier l'efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la souris est un animal petit, avec un cycle de vie relativement court et une natalité importante qui nous permet d’avoir des conditions d’hébergement et d’expérimentation appropriées. Nos procédures seront réalisées sur des animaux de 7 à 12 semaines, un âge auquel le système immunitaire est mature et la prise tumorale efficace d'après les données de la littérature et notre expérience.
Traitement du corticosurrénalome par une approche immunothérapeutique utilisant des cellules CAR-T chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
La moitié des souris utilisées est immunodéprimée, dépourvue de lymphocytes T et B matures, ce qui garantit selon le porteur une prise tumorale dans 100 % des cas. 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une injection sous-cutanée de cellules de corticosurrénalome puis une injection de lymphocytes modifiés par voie rétro-orbitaire, avant six mesures de tumeur au pied à coulisse ou huit échographies avec rasage des flancs. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer une douleur modérée et des métastases, et compte l'usage de souris immunodéprimées parmi ses mesures de réduction du nombre d'animaux.
Objectifs
Le carcinome corticosurrénalien (CCS), est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases au diagnostic. Le mauvais pronostic du CCS peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients de CCS à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence que la protéine CD276 est surexprimée dans les CCS de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’utiliser des lymphocytes T modifiés génétiquement (cellules CAR [Chimeric Antigenic Receptor]-T) dans le but de reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. Ces expériences seront réalisées sur un modèle simple (souris immunodéficientes) pour la preuve de concept puis dans un modèle plus complexe de souris génétiquement modifiées reproduisant les deux altérations génétiques les plus fréquemment retrouvées chez les patients porteurs des CCS agressifs.
Bénéfices attendus
Le carcinome corticosurrénalien est un cancer agressif et de mauvais pronostic, dû au manque de thérapies efficaces. La réalisation de ce projet nous permettra d’évaluer le potentiel antitumoral de lymphocytes T modifiés génétiquement pour reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. L’objectif de ces expériences est de développer une nouvelle approche thérapeutique qui permettra à terme, d’améliorer le traitement et la survie des patients.
Procédures
- Procédure 1, sur les 24 souris : Rasage sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection sous-cutanée des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection intra-veineuse des cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs au pieds à coulisse. Durée 1min, 6 fois - Procédure 2, sur les 24 souris: Injection intra-veineuse des cellules cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs par échographie sous anesthésie gazeuse + rasage des flancs. Durée 30min, 8 fois.
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1, l’injection sous-cutanée des cellules dérivées de corticosurrénalome murin, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur légère et de courte durée au site d’implantation. La mesure des tumeurs au pied à coulisse n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger dû à la contention de l’animal. L’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. Enfin la croissance tumorale peut engendrer une douleur/gène modérée. Dans la procédure 2, l’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. L’échographie, réalisée sous anesthésie gazeuse, n’engendre pas de douleur mais peut induire un stress léger. Le modèle murin de CCS avancé utilisé présente un développement tumoral et éventuellement des métastases.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer les nouvelles approches de traitement des corticosurrénalomes métastatiques.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro. Ainsi les premiers tests de spécificité et d’efficacité des cellules CAR-T CD276 seront réalisés sur une lignée de cellules dérivées d’un CCS métastatique, dans des conditions de culture optimales. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des expériences de cytométrie en flux et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. En procédure 1, l’utilisation de souris immunodéficiente permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure. Cette procédure nous permettra de vérifier que les cellules CAR-T survivent, prolifèrent et s’attaquent bien aux tumeurs le tout dans d’un modèle plus rapide et à effets indésirables moins important qu’un génotype créant des tumeurs agressives. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’établissement de notre preuve de concept. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Plus précisément, les souris immunodéficientes seront hébergées dans une zone dédiée aux animaux immunodéficients avec armoire ventilée, couvercle de cage filtrant, litière autoclavée et eau filtrée. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de batons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 individus (sauf indication contraire) pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.
Choix des espèces
Choix des espèces : Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Pour la procédure 1 nous utiliserons une souche de souris immunodéprimée, caractérisée par une absence de production de lymphocytes T et B matures. L’utilisation de cette souche permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure ce qui in fine permet de résuire le nombre d’animaux utilisés. La lignée murine utilisée pour la procédure 2 est un modèle préclinique murin pertinant de corticosurrénalome métastatique reposant sur l’invalidation surrénalienne de deux gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients portant les corticosurrénalomes les plus agressifs. Stades de développement : Pour la procédure 1 nous injecterons les cellules dérivées d’un CCS métastatique murin dans les souris à l’âge de 6 semaines, âge où le système immunitaire est mature, puis les cellules CAR-T 7 jours plus tard. La croissance tumorale sera suivie pendant 14 jours supplémentaires soit un âge final de 9 semaines au moment de l’euthanasie. Pour la procédure 2, nous avons montré que notre modèle préclinique murin développe des corticosurrénalomes agressifs à partir de 4 mois et que la dissémination métastatique est évidente à 6 mois. Nous effectuerons donc le traitement avec les cellules CAR-T à 4 mois et effectuerons le suivi longitudinal de la progression tumorale par échographe jusqu’à 6 mois.
Implication du noyau arqué et de ses afférences hépatiques dans les troubles comportementaux, métaboliques et circadiens induit par la consommation de nourriture hypercalorique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une partie des souris subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau d'une heure, l'implantation d'une fibre optique, une injection dans un ganglion nerveux et une laparotomie, actes étalés sur quinze jours. 2 832 souris vont être utilisées, 1 040 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 792 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur ne décrit pourtant que des atteintes modérées ou légères, douleur postopératoire, inflammation transitoire, stress lié à cinq jours d'isolement et à douze heures de jeûne, et il présente le surpoids provoqué par le régime hypercalorique comme "l'objet même du modèle expérimental". Les tests comportementaux d'anxiété et de dépression ne sont pas nommés, et le devenir des animaux tient en quatre mots, "Mise à mort pour prélèvement".
Objectifs
Une alimentation trop riche en graisses et sucres peut entraîner l’obésité, perturber les cycles journaliers d’activité et d’alimentation, et provoquer des troubles comme l’anxiété ou la dépression. Ces effets sont liés à une zone du cerveau, l’arc hypothalamique (ARC), qui connecte l’horloge biologique, les organes digestifs (comme le foie) et les régions gérant les émotions. Ce projet étudie comment un régime déséquilibré perturbe ces connexions, en se concentrant sur l’impact des interactions entre l’ARC et le foie sur le métabolisme, les rythmes biologiques et l’humeur.
Bénéfices attendus
L’étude longitudinale de l’implication fonctionnelle de ARC et de ses afférences hépatiques fait suite à notre étude neuroanatomique. Elle analysera le rôle de ARC et de sa connexion avec le foie dans le développement des troubles métaboliques et comportements associés à la consommation d’une nourriture hypercalorique et apportera des connaissances essentielles pour mieux comprendre les désordres alimentaires pouvant être à l’origine de maladie métaboliques telles que le diabète et l’obésité, et potentiellement permettre d’améliorer la prévention et le traitement de ces physiopathologies.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des procédures chirurgicales sous anesthésie générale (chirurgie stéréotaxique 1h, implantation de fibre optique 15 minutes, injection intra-ganglionnare 30 minutes, laparotomie 15 minutes). L’injection intra-ganglionnaire a lieu 2 semaines avant la chirurgie stéréotaxique, l’implantation de fibre optique et la laparotomie qui ont lieu en même temps. La totalité des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 semaines. Des tests comportementaux afin d'évaluer les comportements anxieux et dépressifs ainsi que l'appétance des animaux pour une nourriture grasse en fontion de leur régime habituel seront réalisés. Des prélèvements de queue sur animal vigil seront réalisés pour géntoyper les animaux transgéniques. Des prélèvements sanguins à la queue sur animal vigil seront réalisés sur une journée afin de suivre le rythme journalier de certaines hormones en lien avec la thématique comme la corticostérone, la ghréline et la leptine.
Impact sur les animaux
Le régime hypercalorique devrait entraîner un surpoids progressif des souris et un stress modéré, ce qui est l’objet même du modèle expérimental. Les différentes chirurgies peuvent induire de la douleur postopératoire modérée, un inconfort et/ou une inflammation locale transitoire au niveau des sutures. L’isolement social de 5 jours ainsi que le jeûn de 12 heures peuvent créer un stress modéré aux animaux. Les prélèvements sanguins à la queue peuvent induire une douleur transitoire aiguë et/ou une inflammation locale. Le génotypage des souris nécessite une biopsie de la queue et peut ainsi induire une douleur légère de courte durée.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant un grand nombre d’organes différents (cerveau, foie mais aussi pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre horloges circadiennes, nutrition et troubles de l’humeur nécessite donc l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organoïdes ou des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au minimum le nombre d’animaux, tout en obtenant le maximum d’informations scientifiques pour chaque animal. Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données comportementales sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 40 souris par sexe. L’approche chirurgicale de certaines procédures nécessite l’injection de 3 virus dans 3 loci différents, augmentant la probabilité d’une déficience d’un des virus ou du mauvais emplacement de l’un d’eux, ce qui a été pris en compte dans le calcul du nombre total d’animaux nécessaires à l’obtention d’une puissance statistique adaptée (taux de réussite estimé entre 50 et 75%). Les mêmes animaux seront utilisés pour pratiquer les différentes chirurgies (injections stéréotaxiques, injection dans le ganglion noueux jugulaire et brushing du foie). La combinaison de procédures comportementales avec des procédures de prélèvements sanguins et de tissus permettra de ne générer qu’une cohorte de souris par sexe pour répondre à plusieurs questions scientifiques. De plus, l’ensemble des procédures a été conçu de manière à ce que les animaux soient leurs propres contrôles : cette approche longitudinale depuis le premier jour de régime jusqu’à 3 mois après la mise en place du régime permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaire à ces expériences. Enfin, les animaux utilisés pour le test d’interaction sociale ainsi que pour la mise en place des tests de préférence alimentaire seront les animaux issus de la reproduction de notre lignée qui ne porteront pas le gène d’intérêt. Une souris interactrice sociale peut être interagir avec 3 souris test différentes.
Raffinement
Tout au long des expériences, les animaux isolés ou non sont hébergés dans un milieu enrichi (matériel de nidification, bâton de bois et tunnel) et observés quotidiennement par l’expérimentateur ou une personne compétente de façon à optimiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis. Pour les procédures impliquant l’utilisation de plusieurs tests comportementaux la même semaine, un minimum de 24 heures de délai sera laissé aux animaux entre deux tests. Pour le suivi du bien-être animal à la suite des prélèvements sanguins, une grille de score évaluant essentiellement l’état général de l’animal, son poids et sa réactivité à la manipulation, seront utilisées. Elle permettra d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur. La vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pendant et après la chirurgie. Après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale, ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal. Les animaux destinés au bilan hormonal seront issus de la reproduction de nos souches de souris transgéniques (souris ne portant pas le gène d’intérêt). Enfin, il est prévu qu’une partie des implants pour réaliser les expériences d’optogénétique soient sans fil c'est-à-dire sans aucune restriction de mouvement de l’animal. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elles pourraient être intégrées dans nos procédures.
Choix des espèces
La souris est devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable dans l’utilisation des nouveaux outils technologiques permettant entre autres l’enregistrement en temps réel et la manipulation des réseaux neuronaux, qui sont des techniques utilisées dans un certain nombre de procédures. Une partie du projet implique de cibler spécifiquement les neurones de ARC activés par une nourriture hypercalorique (ARCRH+), nous utiliserons donc des souris transgéniques Fos-Cre-Rosa et Fostm2.1(icre/ERT2)Luo/J. Ces souris transgéniques permettent l’expression de la protéine Cre couplée à la protéine fluorescente Rosa ou seule sous contrôle du promoteur du gène fos après induction de sa transcription par injection de tamoxifène, agoniste du récepteur ERT2. Cette construction unique n’existe pour le moment que chez la souris de fond génétique C57BL/6J, qui est donc la souche que nous avons sélectionnée pour l’ensemble des procédures L’étude des comportements alimentaires décrits dans ce projet nécessitant des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes et jeunes adultes seront utilisés (début des procédures à 6 ou 8 semaines).
Développement d’une méthode de thermométrie IRM in vivo
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Deux heures d'anesthésie continue à l'isoflurane, dont une heure quinze passée dans un environnement thermique modifié : 102 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, toutes tuées avant tout réveil. L'objectif tient à mettre au point une mesure de température par IRM chez le rongeur, méthode déjà utilisée en clinique humaine pour suivre les thermo-ablations de tumeurs mais peu développée chez le petit animal. Le porteur ramène les nuisances à la durée de l'anesthésie et prévoit un gel ophtalmique sur la cornée. Il justifie l'absence de remplacement par le fait qu'une température corporelle ne se mesure que sur un animal vivant, et annonce deux groupes "indispensables" pour la spectroscopie localisée sans expliquer comment il arrive à 102 souris.
Objectifs
La thermométrie par imagerie par résonance magnétique (IRM) est une des rares méthodes autorisant une cartographie in vivo de la distribution spatiotemporelle de la température de façon non invasive. Elle est actuellement utilisée en clinique pour le suivi des hyperthermies thérapeutiques focales et massives comme pour la thermo-ablation de tumeur. Elle est peu ou pas développée pour des études précliniques chez le petit animal et non adaptée à l’étude des mécanismes de régulation de la température intracorporelle où les modifications de température attendues sont de faibles amplitudes et potentiellement diffuses. L’objectif de ce projet est d’initier le développement de la thermométrie par IRM pour des applications fondamentales et précliniques et plus précisément pour le suivi d’hyperthermies faibles et diffuses, telles que celles attendues chez les mammifères homéothermes lors de challenges thermiques environnementaux. Les performances de la thermométrie IRM seront évaluées au niveau cérébral et musculaire. Ce projet s’inscrit dans la problématique d’adaptation aux changements climatiques et de compréhension des coups de chaleur.
Bénéfices attendus
Une souris est 3000 fois plus petite qu’un humain. La transposition sur le petit animal des protocoles cliniques est loin d’être triviale comme l’illustre la rareté des publications sur la thermométrie IRM en préclinique. L’objectif de ce projet est de proposer un outil de mesure non invasif de faibles variations de température chez le rongeur afin d’évaluer ce paramètre dans des modèles de animaux de dysfonctions métaboliques et/ou mitochondriales par exemple. Il permettra de doter la communauté scientifique d’une méthode nouvelle de mesure de température in situ qui sera à la disposition des équipes de recherche.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane sur une période de 2 heures et seront dans un environnement thermique adapté à l’étude sur une période de 1h15.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux seront liées à la durée d’anesthésie. Nous limiterons l’inconfort des animaux par le dépôt sur la cornée d'une goutte de gel ophtalmique.
Devenir
Les 102 souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L'expérimentation ayant pour objet l'évaluation de la température corporelle, elle ne peut être conduite que sur animal vivant.
Réduction
Les mesures de températures par imagerie de phase sur les tissus cérébraux et musculaires seront réalisées sur le même animal et durant la même acquisition en choisissant un muscle proche de la zone cérébrale afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour la spectroscopie localisée, la température est mesurée au sein d’un voxel qui doit être placé soit sur le muscle, soit sur le cerveau, deux groupes d’animaux sont donc indispensables. Il est à noter que des individus des deux sexes seront intégrés dans l’étude. Une analyse statistique sera réalisée pour évaluer les modifications des paramètres IRM observés lors des challenges.
Raffinement
Les animaux issus de l'élevage interne de l'établissement recevront les soins classiques de la structure avec régulation de température, accès sans limite à la nourriture et à l'eau, enrichissement des cages (frisotti papier, carré bois et cabanes). Lors du protocole d'imagerie, un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué et le suivi de la qualité de l’anesthésie sera évalué par mesure de la fréquence respiratoire.
Choix des espèces
Cette étude préliminaire a pour futur d'être continuée sur un modèle génétique altéré disponible chez la souris et ne peut donc être conduit que chez cette espèce. Des souris C57BL/6J seront utilisées puisqu’il s’agit du fond génétique du modèle génétiquement altéré. Il s’agira d’animaux âgés de 8 à 10 semaines ayant atteint la maturité sexuelle et immunitaire.
Etude du rôle de la GPVI, du fibrinogène et de la fibrine en thrombose artérielle et dans la thrombo-inflammation post-accident vasculaire cérébrale ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
La formation d'un gros caillot dans une artère interdit tout réveil, et les souris concernées sont tuées dès la fin de l'expérience. 576 souris vont être utilisées, 432 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 144 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent l'induction d'une thrombose de la carotide, de l'aorte abdominale ou des artérioles mésentériques pendant 30 à 45 minutes, la pose d'une sonde de mesure du flux sanguin, un accident vasculaire cérébral provoqué sous anesthésie de 30 minutes à 2 h 30, et pour certaines la pose sous la peau du dos d'un dispositif de diffusion continue. Les souris destinées à la thrombose des artérioles mésentériques ont 3 semaines, un âge choisi pour éviter les lipides entourant les vaisseaux et garantir la lésion des couches profondes de la paroi.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement qu’on appelle hémostase. Elles s’accumulent au niveau d’une lésion vasculaire, pour former un caillot qui stoppe les saignements. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade, nommé thrombose artérielle. Elle peut mener à l’occlusion du vaisseau, ce qui diminue l’apport en oxygène d’un tissu, aussi appelée ischémie. Elle est responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Dans le cadre du traitement de l’AVCi, le caillot obstruant la circulation est soit dissous par l’administration d’un médicament, soit retiré mécaniquement, ce qui permet de rétablir le flux sanguin des artères cérébrales. Cependant, ces traitements ont une efficacité modérée, due notamment à la formation de micro-caillots et à l’inflammation ayant lieu à la suite au rétablissement du flux sanguin cérébral. Ce projet, se focalise principalement sur la thrombose artérielle, l’événement pouvant déclencher les AVCi, ainsi que dans la formation de micro-caillots et l’inflammation à la suite d’un AVCi. De récents résultats montrent l’importance de la glycoprotéine VI (GPVI) dans la formation de ces micro-caillots et dans la réduction de l’efficacité des traitements de l’AVCi. Les ligands de la GPVI potentiellement présents dans ces événements sont le fibrinogène et la fibrine. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez la souris l’importance des interactions de la GPVI avec le fibrinogène et/ou la fibrine dans la thrombose artérielle, et dans l’apparition de micro-caillots et d’une inflammation à la suite du traitement de l’AVCi.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur la thrombose artérielle et l’AVC ischémique. On pourrait mettre en évidence de nouveaux mécanisme impliquant la GPVI dans la thrombose artérielle, et améliorer les traitements ciblant la GPVI pour soigner la thrombose artérielle. On pourrait mettre en évidence que l’interaction entre la GPVI avec le fibrinogène et/ou la fibrine est à l’origine de l’aggravation de l’état de certains patients après le traitement de l’AVC. Ceci ouvrira des perspectives d’amélioration des traitements ciblant la GPVI avec de potentielles nouvelles indications.
Procédures
Les animaux subiront pour l’étude de la thrombose : • Les animaux seront soumis à des injections dans la cavité abdominale (animal vigile) et intraveineuses (animal anesthésié). Dans chaque procédure l’animal vigile recevra une injection pour l’anesthésie, puis il y aura une ou deux injections de quelques secondes sur animal anesthésié avant ou après le début de la thrombose artérielle en fonction des traitements à administrer. • L’induction d’une thrombose, soit au niveau de la carotide, soit de l’aorte abdominale, soit des artérioles mésentériques à proximité des intestins. Procédure : entre 30 et 45 minutes Les animaux subiront pour l’étude de l’AVC : • Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose de la sonde permettant de visualiser le flux sanguin de l’artère cérébrale qui sera obstruée. Procédure : 10 minutes • Une induction d’un accident vasculaire cérébral (AVC) sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie intraveineuse d’un traitement. Procédure : entre 30 minutes et 2h30 selon la méthode d’induction de l’AVC • Une pose d’un dispositif sous la peau du dos pour diffusion continue du traitement. Procédure : 15 minutes
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation, nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence respiratoire et une baisse de la température corporelle provoquée par l’anesthésie. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la sonde de mesure du flux sanguin ainsi qu’un inconfort au niveau de l’incision. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la pompe permettant la diffusion continue du traitement, ainsi qu’un impact sur la mobilité et un inconfort au niveau de l’incision. Nous ne nous attendons pas à un impact du traitement sur les risques de saignements. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la chirurgie permettant d’induire l’AVC. A une réduction de la mobilité causée par l’AVC, pouvant rendre difficile l’alimentation. Egalement, à un inconfort postopératoire au niveau de l’incision.
Devenir
La formation du thrombus de grande taille dans une artère ne permet pas le réveil de l’animal. Ainsi, immédiatement après la fin de l’expérience de thrombose, l’animal sera mis à mort. 24h après la réalisation de la procédure d’AVC, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses post mortem sur les cerveaux.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet des interactions entre la GPVI plaquettaire et le fibrinogène et/ou la fibrine dans un processus complexe et intégré qu’est la thrombose artérielle et sa conséquence, l’AVC ischémique. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo. De plus, les plaquettes sont des cellules sans noyau qui ne peuvent être cultivées dans des boites, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire qui aurait pu être envisagé pour étudier une partie du processus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé entre 8 et 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux minimum 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont maitrisés, notamment les modèles de thrombose artérielle et d’AVC. Les techniques de mutation génétiques ont permis de générer des souris sur un même fond génétique (C57BL/6J) exprimant la GPVI humaine, déficiente pour le fibrinogène ou la fibrine. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. Les souris sont utilisées lorsqu’elles sont adultes (exception faite de la thrombose laser sur artérioles mésentériques) car la thrombose artérielle et les AVC touchent plus souvent les adultes que les enfants. La thrombose sur artérioles mésentériques est réalisée sur des souris de 3 semaines afin d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux, permettant ainsi de s’assurer de la lésion des couches intermédiaire et profonde de la paroi vasculaire.
Modèle de greffe localisée pour étudier l’hématopoïèse clonale et les AVC
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour savoir si des cellules sanguines mutées aggravent les lésions cérébrales après un accident vasculaire cérébral, 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux irradiations de la patte arrière espacées de 17 heures, puis une greffe de moelle osseuse par injection, un gavage de cinq jours pour activer la mutation, et des prises de sang répétées pendant deux mois. Le porteur décrit une perte de poids courante après l'irradiation et la greffe, une baisse d'activité et une réduction des interactions avec les autres souris. Aucune n'est tuée sur place au terme de ces procédures, toutes doivent être exportées vers des collaborateurs allemands qui leur infligeront les accidents vasculaires cérébraux.
Objectifs
Ce projet vise à explorer le lien possible entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et l'hématopoïèse dite clonale, une condition liée à l'âge où les cellules souches hématopoïétiques (à l’origine de toutes les cellules du sang) subissent des mutations et prolifèrent de manière déséquilibrée. Les personnes atteintes d'hématopoïèse clonale présentent un risque accru de développer des tumeurs, des AVC ou des crises cardiaques. Il reste cependant incertain que ces cellules sanguines mutées pénètrent dans le cerveau et y causent des dégâts après un accident vasculaire cérébral. Chaque année, environ 12 millions de nouveaux cas d'AVC sont recensés dans le monde, avec, au total, environ 103 millions de survivants qui doivent vivre avec les séquelles de cette affection. Dans une étude récente, 41 % des patients ayant subi un premier AVC présentaient des mutations dans leurs cellules souches hématopoïétiques, augmentant leur risque de subir un deuxième AVC ou d'autres événements vasculaires dans les trois ans suivants. Pour examiner cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour le gène appelé TET2 codant pour une enzyme importante pour la stabilité de l’hématopoïèse. Nous transplanterons la moelle osseuse de ces souris dans des souris receveuses localement irradiées sur le membre postérieur au préalable afin d’étudier la progression de l’hématopoïèse clonale à partir du site d’implantation du greffon comme pour modéliser le départ d’une hématopoïèse clonale chez l’Homme. Ces souris seront ensuite envoyées à nos collaborateurs en Allemagne pour modéliser l'AVC dont les conséquences seront graduées par gravité en fonction de la proportion de cellules clonales TET2. Les études sur les souris nous permettront de mieux comprendre les mécanismes des lésions cérébrales post-AVC, notamment l'impact des traitements sur la motricité fine, la démarche, l'équilibre, et la restauration des fonctions motrices, ainsi que sur la possibilité de traiter l'inflammation cardiaque. L'objectif global de ce projet est donc de déterminer si l'hématopoïèse clonale contribue à la gravité des AVC et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels significatifs pour la compréhension et le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des conditions liées à l'hématopoïèse clonale. 1. Amélioration de la compréhension des AVC: En explorant les liens entre l'hématopoïèse clonale et les AVC, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’aggravation des conséquences post-AVC et comment ceci est influencé par la présence de mutations sur un gène connu comme responsable de dérégulations de l’hématopoïèse (TET2). 2. Développement de nouveaux traitements: La recherche sur les souris génétiquement modifiées pour ce gène TET2 permettra d'évaluer l'impact des mutations sur les lésions cérébrales après un AVC. Ces études peuvent révéler si la taille du clone muté aggrave les conséquences de l'AVC, ce qui ouvrirait la voie à de nouveaux traitements ciblés, notamment des thérapies anti-inflammatoires adaptées aux patients présentant une proportion importante de cellules mutées pour le gène TET2.. 3. Amélioration de la prise en charge des patients: Pour les patients atteints d'hématopoïèse clonale, comprendre le rôle des cellules mutées dans les tissus cérébraux après un AVC peut améliorer les stratégies de traitement. Par exemple, en mesurant la taille des clones mutés, les médecins pourraient mieux orienter les traitements pour réduire l'inflammation et améliorer la récupération des fonctions motrices et cognitives après un AVC. 4. Contributions à la recherche sur le cancer: Étant donné que la mutation de TET2 est également courante dans les cancers de la moelle osseuse, ce projet pourrait avoir des implications pour la recherche oncologique. Les découvertes faites ici pourraient aider à développer des traitements qui ciblent non seulement les AVC mais aussi les cancers liés à ces mutations génétiques.
Procédures
Dans ce projet, nous réaliserons plusieurs interventions sur des souris pour comprendre les effets de certaines cellules sur les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Les souris seront d'abord endormies (15min) avec une injection pour les préparer à une procédure. Elles recevront ensuite deux courtes doses d’irradiation (5min) , espacées de 17 heures, pour préparer leur moelle osseuse à recevoir la greffe de nouvelles cellules. Après chaque dose de rayons, les souris seront réveillées. Deux heures après la deuxième irradiation, les souris seront brièvement endormies pour que nous puissions injecter (30 secondes par injection) les nouvelles cellules mutées pour le gène TET2. Cette méthode permet de s'assurer que ces cellules atteignent bien leur destination et commencent à se développer correctement dans la moelle osseuse des souris. Deux mois après cette intervention, nous donnerons un médicament par gavage (1 minute) aux souris pendant cinq jours pour activer la mutation de ces nouvelles cellules TET2. Nous surveillerons ensuite les souris pendant deux mois supplémentaires pour vérifier que ces cellules se développent comme prévu. Pendant cette période, nous prélèverons régulièrement de petites quantités de sang pour suivre l'évolution des cellules et vérifier l'état de santé général des souris.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées pour comprendre les effets de certaines cellules mutées sur les AVC pourraient éprouver divers désagréments et effets secondaires. Les procédures que les souris subiront, comme l'irradiation et la greffe de moelle osseuse, peuvent provoquer des douleurs temporaires et un stress. L'irradiation peut entraîner une gêne temporaire dans la zone traitée. De plus, le traitement avec un médicament peut aussi causer des douleurs passagères, et le fait de donner ce médicament aux souris peut les stresser. Après l'irradiation et la greffe, il est courant que les souris perdent un peu de poids en réaction à ces procédures. Cette perte de poids est généralement temporaire, mais nous devons surveiller les souris de près pour nous assurer qu'elles restent en bonne santé. Les souris pourraient également être moins actives et bouger moins que d'habitude pendant un certain temps après ces interventions. Elles pourraient réduire leurs activités quotidiennes, explorer moins leur environnement et interagir moins avec les autres souris. Il existe aussi des risques de complications, comme des infections ou des réactions du système immunitaire, bien que ces problèmes soient rares si les procédures sont bien contrôlées. En résumé, les souris pourraient ressentir des douleurs, du stress, une perte de poids et une diminution de leur activité pendant un certain temps en raison des interventions nécessaires pour cette étude. Nous veillerons à surveiller attentivement leur bien-être tout au long du processus.
Devenir
Tous les animaux sont prévus pour être exportés en Allemagne à nos collaborateurs pour les expériences d’AVC dans le cadre du projet européen.
Remplacement
Ce projet a pour but de comprendre le lien entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et un phénomène complexe appelé hématopoïèse clonale. Il explore comment certaines cellules sanguines, qui ont subi des mutations, interagissent avec le cerveau lors d'un AVC. A ce jour, les méthodes sans animaux ne peuvent pas reproduire ces interactions complexes. Les cultures cellulaires et les organoïdes (mini-organes cultivés en laboratoire) ne parviennent pas à imiter toutes les interactions entre les différentes parties du corps. Elles ne peuvent donc pas nous donner une vue complète des effets de l'hématopoïèse clonale sur les AVC. Les simulations informatiques et les modèles mathématiques peuvent aider à comprendre certains aspects de cette recherche. Toutefois, ces outils dépendent de données préexistantes et ne peuvent pas prédire de manière fiable les interactions biologiques complexes qui se produisent dans un organisme vivant. Par conséquent, ils ne sont pas suffisants pour répondre à nos questions de recherche. Pour vraiment comprendre comment l'hématopoïèse clonale influence la progression et les conséquences des AVC, nous devons observer ces processus dans un organisme entier. Les souris TET2 présentent des mutations génétiques spécifiques et sont essentielles pour cette étude. Elles nous permettent de modéliser les mutations et de voir leurs effets sur l'ensemble du corps, y compris le cerveau. Ces modèles animaux nous offrent une vue intégrée des interactions entre les cellules sanguines mutées et les tissus cérébraux touchés par un AVC. Cette compréhension est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. En résumé, bien que nous ayons envisagé des alternatives non animales, elles ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour ce projet, nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, tout en garantissant des résultats fiables et pertinents. D'abord, nous avons effectué des expériences préliminaires pour déterminer combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Ces expériences nous ont aidés à établir des sous-groupes d'au moins 8 à 10 souris, ce qui est crucial pour assurer la validité des résultats. Pour chaque condition expérimentale, nous avons besoin d'un minimum de 60 souris. Cela inclut 30 souris greffées avec des cellules souches mutantes TET2 et 30 avec des cellules souches non mutantes, réparties en trois sous-groupes en fonction de la réponse biologique observée. Pour réduire encore le nombre d'animaux, nous avons optimisé nos protocoles expérimentaux. Cela signifie que nous avons standardisé les procédures pour maximiser les données obtenues sur chaque souris. Nous suivons chaque animal à plusieurs moments clés au cours de l'étude. Cette approche longitudinale permet d'obtenir plus d'informations de chaque souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. Nous avons aussi pris en compte la variabilité biologique inhérente à ce type d'étude, ce qui signifie que nous avons ajusté nos chiffres pour compenser les éventuelles variations biologiques. Ces mesures permettront de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans cette recherche.
Raffinement
Pour minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales de ce projet, nous mettrons en place plusieurs mesure, basées sur les meilleures pratiques en matière de soin et d’éthique animale. Les animaux seront surveillés de manière régulière, surtout après les interventions critiques telles que l'irradiation et la transplantation de moelle osseuse. Des observations fréquentes seront réalisées pour détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de comportement anormal ou des aspects tels que la perte de poids, l’inactivité, les signes de douleur et d’autres indicateurs de bien-être. Immédiatement après les interventions, les animaux bénéficieront de soins post-opératoires complets. Cela inclut la mise en place de conditions environnementales optimales (température, humidité, nourriture et eau) pour favoriser une récupération rapide et confortable. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale pour minimiser la douleur et le stress. Les paramètres vitaux des animaux seront surveillés tout au long de l’anesthésie pour s’assurer qu’ils restent dans des plages sécuritaires. Les cages des souris seront enrichies pour fournir un environnement stimulant et réduire le stress. Cela inclut l’ajout de matériaux de nidification et de cachettes (tube carton) pour favoriser une activité physique et mentale. Un environnement enrichi contribue au bien-être général des animaux et à leur récupération post-intervention. Des points limites ont été définis pour limiter ou arrêter la douleur et une analgésie sera mise en place si nécessaire
Choix des espèces
Pour ce projet, nous avons choisi d'utiliser des souris adultes consanguines. Ces souris sont les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées dans les études sur le système hématopoïétique car leur consanguinité permet d’éviter les rejets lorsqu’on les greffe entre-elles et de limiter les variabilités expérimentales. Elles ont la particularité de pouvoir exprimer deux protéines distinctes , ce qui permet de reconnaître le greffon de l’hôte greffé. Les souris TET2 expriment le CD45.1 et sont greffées dans des souris CD45.2, ce qui permet de les suivre dans l’organisme. Nous utilisons également des lignées spéciales de souris TET2 qui portent des mutations génétiques spécifiques muettes que l’on rend fonctionnelles après la transplantation, grâce à un traitement avec un médicament appelé tamoxifène. Cela nous permettra d’étudier comment ces mutations affectent les cellules sanguines de l’hôte et leur interaction avec le cerveau. Les souris que nous utiliserons pour les greffes et les expériences seront toutes des adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix d'âge est crucial car les processus biologiques que nous étudions, tels que l'hématopoïèse (la formation des cellules sanguines), sont plus stables et prévisibles chez les souris adultes. De plus, étant donné que nos expériences peuvent durer 2 à 3 mois, il est important que les souris ne soient pas trop âgées, afin d'assurer que les résultats soient cohérents et fiables.
Elevage et gestion de souris pour Établissements Utilisateurs
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
340 000 souris vont être élevées et utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune peut subir un prélèvement de tissu à l'oreille ou à la queue entre 7 et 10 jours de vie pour le génotypage, puis un prélèvement de sang à partir de 30 jours. Les souris porteuses du gène recherché partent vers d'autres autorisations de projet, les autres sont tuées ou réutilisées, 2 500 réutilisations étant déclarées. Une partie des lignées porte un phénotype dommageable, immunodéficience, pathologie métabolique ou cancéreuse, et le porteur range l'orientation des souris sans intérêt génétique vers des séances d'entraînement et de formation sous le principe de "Remplacement".
Objectifs
Les programmes de recherche menés au sein des divers laboratoires toulousains, qu'ils relèvent du secteur public ou privé et soient sous la tutelle de différentes entités, impliquent l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Cette communauté de recherche, composée de plus de 50 équipes réparties dans sept laboratoires distincts, se consacre à des thématiques spécifiques générant des résultats validés, lesquels contribuent à une reconnaissance internationale à travers des collaborations, des succès dans l'obtention de financements et des publications. Les domaines de recherche de cette communauté toulousaine couvrent diverses disciplines, notamment la cancérologie, la santé digestive, les maladies infectieuses et inflammatoires, ainsi que les maladies métaboliques et cardiovasculaires. L'objectif de ce projet est de fournir des animaux répondant aux exigences scientifiques spécifiques de ces équipes de recherche, rendant ainsi possible la réalisation de leurs projets au sein des différents établissements expérimentaux répartis sur plusieurs sites. Les exigences scientifiques impliquent la caractérisation génotypique et/ou phénotypique des animaux pour la selection des gènes étudiés et des modèles d’intérêt, ainsi que l’utilisation d’animaux à phénotype dommageable en tant que modèles d’étude des pathologies. Ces derniers présentent des susceptibilités et des déficiences particulières, nécessitant une gestion attentive de l'élevage et de l'environnement. Il est crucial d'anticiper et de prendre en compte ces facteurs afin de prévenir l'apparition ou le développement de troubles ou de pathologies, tout en limitant la souffrance des animaux.
Bénéfices attendus
L'élevage et la gestion de souris, soumises à une caractérisation génétique et/ou phénotypique, sont d'une importance capitale pour fournir aux équipes de recherche les animaux nécessaires. La diligence apportée à l'élevage de ces individus, en étroite corrélation avec des questions scientifiques précises, forme la base des avancées scientifiques au sein de notre communauté.
Procédures
Les animaux peuvent subir un prélèvement de tissu (oreille ou queue) une unique fois entre 7 et 10 jours, pour une durée de 30 secondes maximum contention comprise. Un prélèvement de sang peut être réalisé une fois à partir de 30 jours d’âge, pour une durée de 30 secondes maximum contention comprise. Des lignées à phénotype dommageable peuvent développer des pathologies dont la prise en charge est individualisée et procédurée.
Impact sur les animaux
La méthode de génotypage, qui implique le prélèvement de tissus (notamment par encoche d'oreille ou par petit bout de queue), peut potentiellement provoquer un stress lié à la contention ainsi que de la douleur légère chez les animaux. Les prélèvements sanguins peuvent également induire du stress lié à la contention. Il est important de souligner que les animaux présentant un phénotype dommageable (de type variable comme les immunodeficiences, les pathologies métaboliques, cancereuses etc...) sont susceptibles de développer diverses pathologies et donc nécessiter une surveillance accrue.
Devenir
Tous les animaux portant les gènes d’intérêt pour les projets de recherche sont en utilisation continue vers d’autres DAP. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt sont mis à mort ou réutilisés pour d’autres projets (animaux réformés : training, collaboration avec des centres de formation).
Remplacement
Les équipes de recherche reconnaissent l'importance de la substitution des animaux dès que possible, conformément aux principes des 3R. Des alternatives sont privilégiées en priorité, telles que les méthodes mathématiques, pharmacocinétiques, les études in vitro utilisant des modèles cellulaires, ou les investigations préliminaires sur des organoïdes. Néanmoins, ces approches ne parviennent pas à reproduire la complexité des voies impliquées dans les modèles physiologiques ou physiopathologiques intégrés, tels que ceux basés sur la souris. Malgré les efforts pour promouvoir la substitution, la souris demeure un modèle essentiel, en raison de sa physiologie transposable à l'Homme et de sa proximité génétique, permettant la reproduction moléculaire et phénotypique de nombreuses pathologies humaines.
Réduction
La reproduction des animaux est soigneusement planifiée en anticipation des schémas expérimentaux des chercheurs, afin d'aligner étroitement l'élevage sur leurs besoins réels. Une gestion réfléchie de certaines lignées permet, par des croisements planifiés, d'obtenir exclusivement les génotypes d'intérêt, favorisant ainsi la Réduction. Les prélèvements invasifs sont limités aux animaux pour lesquels l'homozygotie ne peut être obtenue, et leur réalisation est restreinte à un couple d'animaux en cas de nécessité de confirmation du génotype. La production de certaines lignées d'animaux peut être optimisée en les partageant entre différents chercheurs, garantissant ainsi une utilisation maximale de tous les animaux produits, en accord avec le principe de Réutilisation. Les animaux ne présentant pas un génotype d'intérêt pour les chercheurs sont principalement orientés vers nos projets d'animaux de réforme, mettant en œuvre le principe de Remplacement après accord de la vétérinaire. Ces projets fournissent des animaux destinés à des initiatives de formation spécifique, des sessions d'entraînement ou des procédures terminales, contribuant ainsi à minimiser l'utilisation d'animaux dans des situations où leur génotype n'est pas essentiel.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes aux normes de la directive 2010/63/UE. Chaque cage est enrichie avec des accessoires spécifiques tels qu'un igloo en plastique rouge, des bâtonnets de bois et du papier essuie-tout pour la construction de nids. Leur statut sanitaire est vérifié trimestriellement. Les zootechniciens, sensibilisés aux diverses pathologies potentielles en élevage, y compris les phénotypes dommageables, prennent des mesures préventives ou administrent des traitements précoces pour éviter toute souffrance des animaux. Ils possèdent une expertise dans les gestes techniques et sont formés aux méthodes alternatives à la préhension par la queue. Des produits de soins sont disponibles et utilisés selon les recommandations du vétérinaire désigné. L’habituation des animaux à leur zootechnicien permet de diminuer le stress des animaux lié à la contention pour les prélèvements. Les personnels sont parfaitement formés à la technique de prélèvement (tissu et sang) qui, procédurée avec du matériel de chirurgie aiguisé et désinfecté, permet de limiter le stress et la douleur des animaux au maximum. La biopsie est en outre de la taille la plus réduite possible et avec hémostase si besoin. En cas de douleur un anti-inflammatoire local peut être appliqué en fonction des recommandations de la vétérinaire. La gestion des animaux à phénotype dommageable s’appuie sur un tableau recensant les caractéristiques de chaque lignée, et des actions sont mises en place au cas par cas (statut sanitaire, litière adaptée, surveillance renforcée lors d’âge critique par exemple).
Choix des espèces
Avec une homologie génique dépassant 90% entre l'Homme et la souris, la plupart des gènes humains ont leurs homologues chez la souris, et les voies métaboliques sont largement conservées entre ces deux espèces. La souris représente ainsi un modèle expérimental particulièrement intéressant en tant qu'animal génétiquement modifié. De nombreux modèles murins, qu'ils soient pathologiques ou humanisés, offrent la possibilité d'étudier la physiopathologie de diverses maladies. Ce modèle intégré permet de rendre compte de la complexité des voies impliquées dans la physiologie et la physiopathologie, avec une transposabilité à l'Homme. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour les équipes de recherche. Les souris entament leur phase de reproduction entre 6 et 8 semaines et sont maintenues dans ce processus jusqu'à l'âge moyen de 300 jours. Les prélèvements de tissu pour génotypage sont effectués entre 7 et 10 jours ; le sang, pour phénotypage, est prélevé sur des animaux âgés de 4 semaines. Les animaux issus de la reproduction sont transférés en zone d'expérimentation avant d'atteindre l'âge de 8 semaines, ou bien ils sont conservés en tant que futurs reproducteurs pour le renouvellement des accouplements. L'apparition de phénotypes dommageables est documentée et les animaux sont envoyés en zone expérimentale avant le développement des pathologies associées. Les animaux gardés pour la reproduction sont mis à mort avant ou dès l’apparition des signes cliniques.
Impact de la pression expiratoire positive en ventilation uni- pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx dans un modèle animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une mortalité de 5 à 30 % pendant l'opération, et jusqu'à 50 % au troisième jour : l'ablation d'un lobe pulmonaire pratiquée sur un rat dont un poumon est mis hors circuit tue une partie des animaux avant le terme du protocole. 102 rats Wistar mâles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement des organes. Chaque animal subit deux heures de chirurgie sous anesthésie totale et trois prélèvements sanguins de dix minutes, la ventilation sur un seul poumon pouvant provoquer un manque d'oxygène. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tués avant la fin, seuil que le porteur retient comme point limite.
Objectifs
Lors d’une lobectomie pour cancer du poumon, le poumon opéré doit être exclu, c’est à dire non ventilé pour permettre au chirurgien de réaliser une exérèse pulmonaire. La ventilation repose donc sur le poumon controlatéral, on parle alors de ventilation uni-pulmonaire (VUP). Les complications pulmonaires postopératoires sont fréquentes après une chirurgie de résection pulmonaire et ont un impact majeur sur la morbidité et de la mortalité postopératoires. L’emploi de la VUP en chirurgie thoracique se doit d’assurer une oxygénation efficace au patient sans entrainer de lésions pulmonaires induites par la ventilation, ces dernières étant associées à 20% de complications pulmonaires post-opératoire. Au cours de la dernière décennie, la généralisation de la ventilation protectrice au bloc opératoire et en réanimation a aussi été adaptée en ventilation uni pulminaire et a permis de diminuer significativement l’incidence des complications postopératoires après une chirurgie thoracique pour ablation pulmonaires. Ainsi, l’objectif principal de cette étude est d'évaluer l'impact de la PEP(pression expiratoire positive est la pression maintenue dans les voies aériennes à la fin de l’expiration lors de la ventilation mécanique) en ventilation uni - pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx pulmonaire dans un modèle de ventilation uni-pulmonaire chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une thématique forte de recherche sur l’impact de la PEP en ventilation uni-pulmonaire chez l’homme au cours d’une chirurgie d’exérèse pulmonaire ainsi qu’à l’imputabilité immédiate de la dysfonction endothéliale et du glycocalyx dans la survenue de complications post-opératoires. Les résultats de cette étude sur l’impact de la PEP sur la dysfonction endothéliale pulmonaire pourrait constituer un argument supplémentaire dans le choix des paramètres ventilatoires au cours d’une chirurgie thoracique et conforter l’importance du rôle de la préservation de la fonction endothéliale et du glycocalyx dans la prévention de complication pulmonaire induite par la ventilation mécanique.
Procédures
Les animaux subiront des prélèvements sanguins au nombre de 3 d'une durée 10 min et une chirurgicale qui est l’exclusion pulmonaire chirurgicale et lobectomie pulmonaire d'une durée de 2 heures. Pour les prélèvements et la chirurgie les animaux serons sous anesthésie totale.
Impact sur les animaux
La procédure est classée sévère. En effet, la ventilation unipulmonaire peut entraîner une hypoxémie chez l’animale et la lobectomie supérieure droite sur le poumon exclu a un taux de mortalité allant de 5 à 30% en peropératoire et pouvant aller jusqu’à 50% à J3. De plus, l'anesthésie va entrainer la perte de la chaleur corporelle de l'animal,un dessèchement oculaire . La piqûre de l'anesthésie peut entraîner une gêne lors de l'injection.
Devenir
Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude dans l’objectif de récupérer les organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles, ainsi que pour limiter l'éventuelle présence de souffrance aussi minime soit-elle.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas encore chez l'homme de biomarqueurs spécifiques pour diagnostiquer ou étudier la dysfonction endothéliale associée à l'impact de la pression expiratoire positive sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx lors d'une ventilation uni-pulmonaire. Afin de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques liés à cette problématique, des modèles chez le rat ont été développés pour montrer l'impact de la ventilation uni-pulmonaire mais aucun ne s'est encore intéressé à l'impact de la pression expiratoire positive au niveau microvasculaire. Ce modèle permet de simuler de manière représentative les conditions observées chez l'homme lors de l'application de la ventilation uni-pulmonaire. Grâce à ce modèle chez le rat, nous disposons d'une représentation fidèle de l'impact de la ventilation uni-pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx. Cette similitude avec les conditions réelles chez l'homme nous offre une opportunité unique d'étudier les effets potentiels de la pression expiratoire positive. L'utilisation des animaux est rendue nécessaire par l'absence actuelle de modèle in vitro capable de reproduire avec précision les réponses physiologiques globales induites par la ventilation uni-pulmonaire. La validation de l'impact physiologique de la pression expiratoire positive en ventilation uni-pulmonaire nécessite inévitablement l'utilisation d'un modèle animal. Cela est crucial pour obtenir une compréhension holistique des réponses biologiques, incluant des paramètres complexes qui ne peuvent être pleinement appréhendés en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Nous avons choisi d'utiliser des espèces animales élevées spécifiquement à des fins scientifiques, sélectionnées pour leur faible variation génétique entre individus. Cette caractéristique permet de réduire considérablement la variabilité des réponses biologiques, contribuant ainsi à une diminution du nombre d'animaux nécessaires pour notre étude sur l'impact de la ventilation uni-pulmonaire sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx. Le nombre d'animaux requis a été soigneusement estimé en se basant sur des études antérieures portant sur la dysfonction endothéliale menées au sein de notre unité. Nous avons mis en place une stratégie précise d'optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de l'euthanasie des animaux. Cette approche nous permettra de maximiser les informations obtenues à partir d'un nombre restreint d'animaux. Pour atteindre notre objectif principal d'évaluer l'impact de la pression expiratoire positive sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx dans le contexte de la ventilation uni-pulmonaire, nous avons estimé que 2 groupe de 51 rats a Ces choix méthodologiques sont orientés vers une utilisation efficace et éthique des animaux dans notre recherche, en maximisant les informations obtenues tout en minimisant le nombre d'individus nécessaires pour parvenir à des conclusions significatives.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Les rats perdant plus de 15% de leur poids seront euthanasiés. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en préopératoire et en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Les premiers modèles de la ventilation uni-pulmonaire ont été developpés chez le rat. Le rat Wistar est une espèce largement utilisé dans les expériences animales. Les études antérieures dans le laboratoire analysant la dysfonction endothéliale sur le rat ont dévelopé des marqueurs de dysfonction. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar âgés de 9 semaines et qui pèseront entre 400 et 500g. Ceci correspond à la plupart des études publiées sur la ventilation uni-pulmonaire chez le rat.
Impact de l’inhibition de la synthese d’aldosterone dans l’hypertension arterielle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une minipompe implantée sous la peau en quinze minutes, un régime alimentaire modifié, puis des séjours en cage à métabolisme de huit heures répétés trois fois et un de vingt-quatre heures : 336 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cinq jours de suite, un ballonnet gonflable serré sur la queue mesure leur pression artérielle pendant un quart d'heure. Le porteur attend une perte de poids, une augmentation de la diurèse, des douleurs et un risque d'infection après l'opération, et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l'anesthésie. Tous sont tués en fin de protocole pour le prélèvement du sang et des organes, l'objectif étant de comparer un nouvel inhibiteur de l'aldostérone synthase à un traitement existant.
Objectifs
L'hypertension arterielle et ses complications cardiovasculaires et rénales a une très forte prévalence en Europe et augmente avec l'age pour atteindre près de 50 pour cent après 60 ans . L'hypertension arterielle participe au cercle vicieux liant insuffisance rénale chronique (IRC) et pathologies cardiovasculaires. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre vaisseaux, rein et coeur et d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone, une hormone produite par les glandes surénales, joue un rôle important et induit inflammation et fibrose tissulaire, ce qui joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l'hypertension artérielle. L'aldostérone a également un role crucial dans la balance hydrosodée, régulant l'excretion rénale de sodium et potassium. Les objectifs du projet sont d'étudier les conséquences de l'inhibition de la synthèse d'aldostérone par un nouvel inhibiteur spécifique de l'aldostérone synthase sur la balance hydrosodée et la pression artérielle, en comparaison avec celle d'un inhibiteur du récepteur de l'aldostérone.
Bénéfices attendus
L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pour cent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes ce qui représente un cout sociétal considérable. Le nombre de décès liés à l’IRC est estimé à 1,5 million dans le monde et est la 5ieme cause de perte d’année de vie. La proportion de sujets en France ayant une qualité de vie altérée variait de 20 à 50 pour cent dans les dimensions à composante physique selon le degré d’IRC. Le but du projet est de tester l'effet d'un nouvel inhibiteur pharmacologique de l'adosterone synthase, ces résultats permettront de proposer des alternatives thérapeutiques aux patients souffrant de l'IRC.
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Une minipompe délivrant un produit sera implantée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 15 min). Certains animaux seront mis sous régimes spéciaux (animal vigile). Pour le recueil des urines (3 fois pendant 8h, une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Elle consiste à placer un ballonnet gonflable sur la queue de l’animal puis à mesurer la pression du ballonnet à laquelle le pouls est de nouveau perçu. L’euthanasie est réalisée selon une méthode réglementaire en fin de période expérimentale après prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie (1 fois, quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (implantation de la minipompe) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de l'hypertension artérielle (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial et les traitements peuvent entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress social mais les animaux seront dans la même pièce que leur congénères 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l'aldostérone et de la signalisation sous-jacente dans l'hypertension et le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre total d’animaux sera de 336 rats. Ce nombre a été calculé pour s'assurer de la faisabilité du projet pour mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique: les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après: carré de lanière kraft et batonnet en bois. Un enrichissement pour se cacher et grimper pourra être ajouté (tunnel, hutte ou équivalent en PVC ou autre). Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis. Pour réduire les nuisances, les actions suivantes seront réalisées: Lors de l’anesthésie, la température interne est suivie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour limiter l’hypothermie, et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux, une analgésie est réalisée avant-pendant-après la pose de minipompe, le stress sera minimisé par une habituation, de la nourriture molle/hydratée sera ajoutée dans la cage si perte de poids et de mobilité, le comportement des animaux sera surveillé attentivement, en référence à une grille de scoring de l’animalerie
Choix des espèces
L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés qui permet de remplacer la séquence codante d’un gène de rat par celle de l’homme. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Etude des mécanismes de la résolution d’inflammation associée à l’athérosclérose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une partie des 180 souris est dépourvue du récepteur d'une molécule lipidique, pour vérifier si cette absence aggrave l'athérosclérose et l'inflammation des artères. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, après une injection dans la queue d'une protéine qui, associée à un régime riche en graisse, déclenche l'athérosclérose. Elles reçoivent ensuite une injection dans l'abdomen, éveillées, d'un traitement ou d'un produit témoin, et subissent cinq échocardiographies sous anesthésie, une toutes les cinq semaines. Le porteur prévoit une prise de poids "importante" sous ce régime, et une douleur "comme une piqûre d'aiguille" lors des injections sur souris éveillées. Toutes sont tuées à la fin de l'étude pour prélever leurs artères et y étudier les plaques d'athérome.
Objectifs
L’athérosclérose (accumulation des plaques riches en lipides au niveau des artères) et l’inflammation chronique accélérent le vieillissement cardiovasculaire et contribuent à la mortalité et à la morbidité en France. Des molécules lipidiques considérés comme bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires, peuvent réduire l’inflammation. Ces molécules lipidiques agissent via des récepteurs spécialisés encore très peu étudiés dans le domaine de la résolution de l’inflammation et des conséquences sur les maladies cardiovasculaires. Notre hypothèse est qu'une molécule lipidique et son récepteur pourraient contribuer à limiter l’inflammation, l’athérosclérose, et le vieillissement cardiovasculaire. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si l’absence du récepteur produit l’effet inverse à savoir prolonge et/ou accentue ces phénomènes et d’identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’athérosclérose et d’inflammation vasculaires induit par la surexpression d’une protéine couplé à un régime riche en graisse, chez la souris portant ou non de le récepteur étudié. Une exploration des fonctions cardiovasculaires sera faite dans les deux groupes et nous testerons aussi l’effet d’une molécule thérapeutique qui aide à la résolution d’inflammation.
Bénéfices attendus
La réussite de cette étude permettra 1) de déterminer si le récepteur d'une molécules lipidique est important pour limiter le processus d'inflammation et le développement de l’athérosclérose et 2) d’évaluer l’efficacité d’un thérapeutique potentiel à restaurer la résolution de l’inflammation et réduire la sévérité de l’athérosclérose.
Procédures
-piqûre de 5 secondes au bout de la queue pour injecter la protéine induisant l’athérosclérose. - injection intra-péritonéale de 10 secondes d’un millilitre d’un thérapeutique ou d’un contrôle. - 5 échocardiographies (imagerie non-invasive de 30 min maximum) sous anesthésie (1 échographie toutes les 5 semaines).
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisse conduira à une prise de poids importante, mais pas à un niveau comparable à l’obésité. Il y aura peut-être une diminution de la prise alimentaire due au régime gras. Les administrations intrapéritonéales sur l’animal vigile induiront une douleur comme une piqûre d’aiguille. Une petite inflammation au site d’injection peut survenir. Les anesthésies pratiquées pour réaliser les échocardiographie peuvent induire une hypothermie, une modification de la fréquence cardiaque. L’athérosclérose qui se développera dans le temps donné ne conduit pas à une mortalité chez la souris.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude puisque les artères seront prélevées pour étudier les plaques d'athérome. L'animal est inconscient lors de sa mise à mort.
Remplacement
L'étude des mécanismes d'action d'une molécule lipidique et son récepteur se font déjà au laboratoire sur les modèles cellulaires. Nous avons également mis au point l'étude de la contraction et dilatation des artères isolées par une méthode ex-vivo. Cependant, pour étudier l'effet de l’induction d’athérosclérose sur le système cardiovasculaire, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.
Réduction
Nous faisons toutes les mesures (echocardiographie, prise de poids) sur un même animal. Des calculs statistiques permettent de prédire le nombre minimal d'animaux à utiliser pour avoir des résultats significatifs et limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées de 2 à 5 par cages ventilées. L’enrichissement du milieu se fera avec du papier plissé, des tunnels et bâtonnets de bois. Les souris sont surveillées très régulièrement (prise de poids, zones de piqûre). Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pendant l’exploration fonctionnelle cardiovasculaire et du gel ophtalmique est déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure (régime, echocardiographie sous anesthésie).
Choix des espèces
Les souris qui surexpriment la protéine et sous régime hyperlipidique développent l’athérosclérose. Des souris adultes mâles et femelles de 10 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Evaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques dans un modèle de dermatite atopique induit par l’IL23 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Une plaie nécrosée, purulente ou suintante déclenche la mise à mort immédiate, tout comme une perte de plus de 20 % du poids maintenue trois jours ou une hypothermie persistante. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis elles reçoivent une à deux administrations par jour pendant seize jours, avec des mesures d'épaisseur de peau tous les deux jours et une prise de sang hebdomadaire. Les molécules testées appartiennent à des clients de l'établissement, dont le porteur écrit ne pas connaître la composition, et le choix de la souris tient notamment à ses "faibles coûts", à sa croissance rapide et à sa facilité de transport.
Objectifs
La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.
Bénéfices attendus
Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.
Procédures
Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).
Impact sur les animaux
L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.
Remplacement
L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)
Réduction
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'excipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.